CN113817621B - 同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株及制备方法和应用，其包含HBVs蛋白的1位至200位氨基酸，包含IFNα14的24位至190位氨基酸。本发明将两种表型整合至一个酵母菌株中，获得能够同时表面展示HBVs蛋白和分泌IFNα14蛋白的重组酵母菌株JDY52‑HBVs‑IFNα14。用于制备乙肝病毒口服疫苗，通过口服途径激发机体保护性免疫反应，并借助酵母细胞壁多糖对机体先天性免疫系统的调节作用，发挥更加有效的免疫保护。与现有的疫苗比较，口服重组酵母制剂成本低、可实现大规模放大生产，安全可靠，具有良好的应用开发前景，为乙型肝炎病毒的免疫和治疗提供选择。

Description

同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌 株及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S 蛋白的重组酿酒酵母菌株的制备方法和应用。
背景技术
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染导致的一种全世界流行的疾病，特别是在发展中国家，发病率及死亡率一直很高[1]。HBV只有3200bp，是一个相当小的病毒。其基因组共有四个ORF，编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白(L，M，S)。Core是核衣壳蛋白；Pre-core现在不知道有何功能，它对病毒的复制不是必要的，但是可能与抑制宿主的免疫反应有关；X蛋白对病毒复制是重要的，还与肝癌的发生有关； S蛋白是病毒的包膜蛋白，与病毒进入细胞有关[2]。
IFN-α2作为研究最多的亚型，已被用于治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，具有治疗时间有限、病毒学应答持续的优点，但其疗效仍相对较低。研究发现， IFN-α14是抑制HBV共价闭合环状DNA转录和HBV e抗原/HBV表面抗原产生最有效的亚型，中位抑制浓度值约为传统IFN-α2的100倍[3]。
比较成熟的异源蛋白表达系统包括酵母细胞、原核表达系统和杆状病毒昆虫细胞表达系统。相较于后两者，酵母细胞兼具成熟的翻译后修饰能力和培养周期短、安全、便捷、生产成本低等优势[4]。利用酵母表面展示技术(Yeast surface display, YSD)将外源蛋白展示于酵母细胞表面，可制备口服型保护制剂；利用酵母分泌表达蛋白技术，分泌表达治疗型蛋白，起到治疗的效果。同时酵母细胞壁多糖对机体的免疫系统具有调节作用，可抗病毒、增强免疫功能，促进免疫器官发育，因而酵母口服制剂的开发具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种同时表达IFNα14和乙肝病毒HBVs蛋白的重组酵母菌株，可将其用于口服制剂的研制。
本发明的目的之二在于提供所述口服重组酵母菌株的制备方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种同时表达IFNα14和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株， JDY52-HBVs-IFNα14，其包含HBVs蛋白的1位至200位氨基酸，包含IFNα14的 24位至189位氨基酸。
一种乙肝病毒S蛋白的截断体，优选为第1至200位氨基酸，序列特征为 SEQ IDNo.1。
一种IFNα14蛋白的截断体，优选为第24至189位氨基酸，序列特征为SEQ ID No.2。
表达所述乙肝病毒S蛋白截断体的基因，是从第1位至600位碱基，其核苷酸序列为SEQ ID No.3。构建所述重组酵母的质粒GPD-HBVs-TU，序列特征为SEQ ID No.5，由上述基因片段和POT-GPD-TU载体组成；
表达所述IFNα14蛋白截断体的基因，是从第70位至567位碱基，其核苷酸序列为SEQ ID No.4。构建所述重组酵母的质粒GPD-IFNα14-TU，序列特征为SEQ ID No.6，由上述基因片段和POT-GPD-TU载体组成。
制备所述同时表达IFNα14和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株的方法，首先制备乙肝病毒S蛋白重组酵母，将体外构建的S蛋白截断体完整转录单位 GPD-HBVs-TU，通过同源重组整合于酵母JDY52的基因组，利用Aga1-Aga2表面展示系统将S蛋白展示于酵母细胞表面；然后在已构建好的菌株JDY52-HBVs的基础上，制备IFNα14蛋白重组酵母，将体外构建的IFNα14蛋白截断体完整转录单位GPD-IFNα14-TU，通过同源重组整合于酵母JDY52-HBVs的基因组，利用α -Factor分泌系统将IFNα14蛋白分泌至细胞外；获得能够同时表面展示HBVs蛋白和分泌IFNα14蛋白的重组酵母菌株JDY52-HBVs-IFNα14。
制备同时表达IFNα14和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)乙肝病毒刺突蛋白S编码基因的PCR扩增：参考乙肝病毒基因序列AF384371.1，合成优化后的S基因，序列特征为SEQ No.3；以 pET28a(+)-HBVs质粒为模板，设计引物扩增S蛋白编码基因用于酵母载体连接；
(2)IFNα14蛋白编码基因的PCR扩增：参考IFNα14基因序列NM_002172.3，合成优化后的IFNα14基因，序列特征为SEQ No.4；以pET28a(+)-IFNα14 质粒为模板，设计引物扩增IFNα14蛋白编码基因用于酵母载体连接；
(3)Aga2基因与乙肝病毒S蛋白编码序列串联：通过BamHI单酶切线性化 POT-GPD-TU载体，无缝克隆连接S基因片段至表面展示表达载体 GPD-POT-TU上，获得重组质粒GPD-HBVs-TU，其序列特征为SEQ No.5. 重组质粒转化至E.coli DH5a中，用S基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；
(4)α-Factor基因与IFNα14蛋白编码序列串联：通过SmaI单酶切线性化POT-GPD-TU载体，无缝克隆连接IFNα14基因片段至分泌表达载体 GPD-POT-TU上，获得重组质粒GPD-IFNα14-TU，其序列特征为SEQ No.6. 重组质粒转化至E.coli DH5a中，用IFNα14基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；
(5)HBVs蛋白酵母重组菌株的构建：将重组质粒GPD-HBVs-TU与同源臂 URRs、筛选标签Leu编码序列进行酶切拼接，获得完整的包含S基因序列的重组基因，转化到酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Western blot、免疫荧光进行蛋白表达水平验证；
(6)同时表面展示HBVs蛋白和分泌IFNα14蛋白的酵母重组菌株的构建：将重组质粒GPD-IFNα14-TU与同源臂SURs、筛选标签Trp编码序列进行酶切拼接，获得完整的包含IFNα14基因序列的重组基因，转化到(5) 所得到的重组酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Western blot、免疫荧光进行蛋白表达水平验证。
所述重组酿酒酵母菌株在制备乙型肝炎病毒口服疫苗中的应用。
本发明有益效果：
本发明基于乙肝病毒主要表面抗原HBVs，可以制成HBVs蛋白截短体表面展示型口服重组酵母制剂，可实现对HBV的免疫效果；基于最有效抑制HBV 转录的IFNα14，制成了分泌表达IFNα14蛋白截短体的重组酵母制剂，可实现对HBV的治疗效果；将两种表型整合至同一酵母菌株中，通过口服途径既可以激发机体保护性免疫反应，又可对病毒携带者起到一定的治疗作用。与现有的疫苗效比，口服重组酵母制剂成本低、可实现大规模放大生产，安全可靠，具有良好的应用开发前景，为乙型肝炎病毒的免疫和治疗提供选择。
本发明中所述的同时表达IFNα14和乙肝病毒S蛋白的重组酵母制剂在国内属于首次报道，同时分泌表达和表面展示菌株构建及制剂制备具有创新性，为 HBV的防控提供新思路与制剂。
附图说明
图1：乙肝病毒S蛋白编码基因结构模式图；
图2：IFNα14编码基因机构模式图；
图3：HBVs，IFNα14基因PCR扩增结果；
图4：GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU质粒转化大肠杆菌后的转化子菌落PCR 检测结果，对照为ddH2O对照；
图5：GPD-HBVs-TU完整转录单位拼接模式图；
图6：GPD-IFNα14-TU完整转录单位拼接模式图；
图7：GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU重组酵母的基因型验证，对照为ddH2O 对照；
图8：JDY52-HBVs-IFNα14酵母菌株的HBVs蛋白表达的Western blot验证，泳道3，4和5对应3株不同的酵母转化子；
图9：JDY52-HBVs-IFNα14酵母菌株的IFNα14蛋白表达的Western blot验证，泳道3，4和5对应3株不同的酵母转化子。
具体实施方式
以下结合实例进一步阐述本发明，其中的内容不应理解为限定该发明的范围。实施例中所述试剂除特别说明，均为商业化试剂。
实施例1.GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU载体的构建
(1)HBVs和IFNα14基因的扩增
根据HBVs和IFNα14基因序列结构(图1、2所示)，设计并合成引物， TU-HBVs-F(SEQID NO.7:gacgataagg taccaggatc catgggagga tggtcatcaa agc)和TU-HBVs-R(SEQ IDNO.8:tgctggatat ctactggatc cgagtatacg tgtcaggagg aagaatc)， TU-IFNα14-F(SEQ IDNO.9:gatgtgcttc gattccccgg gtgtaacctt tcacaaacac attcact)和 TU-IFNα14-R(SEQID NO.10:atctgtaagt ctagacccgg ggtcctttct tctcagccgc tt)。根据已有报道的HBVs基因序列(Genbank号AF384371.1)和IFNα14基因序列 (Genbank号NM_002172.3)，优化并人工合成了HBVs蛋白和IFNα14蛋白的基因，并构建了pET28a(+)-HBVs质粒和pET28a(+)-IFNα14，以质粒为模板，扩增HBVs(1-200)和IFNα14(24-189)的编码基因。PCR扩增体系为：
Figure BDA0003249925630000051
使用以下PCR程序进行扩增：
Figure BDA0003249925630000052
PCR结果如图3所示，PCR产物大小为600bp和498bp。
(2)GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU载体的构建
将克隆得到的HBVs基因和IFNα14基因分别连接到实验室已构建的 POT-GPD-AgA2载体和POT-GPD-αFactor载体上[5]。POT-GPD-AgA2载体经 BamHI酶切线性化后与HBVs(1-200)基因连接，HBVs(1-200)基因N端与 Aga2连接并串联融合表达，基因C端带有载体上的His标签，IFNα14(24-189) 基因N端与αFactor连接并串联融合表达，基因C端带有载体上的His标签。利用无缝克隆试剂盒(C112-01,Vazyme)获得连接产物，并转化E.coli DH5α。大肠杆菌转化子经Amp抗性平板筛选，并用引物TU-HBVs-F(SEQ ID NO.7: gacgataaggtaccaggatc catgggagga tggtcatcaa agc)和TU-HBVs-R(SEQ ID NO.8: tgctggatatctactggatc cgagtatacg tgtcaggagg aagaatc)，TU-IFNα14-F(SEQ ID NO.9: gatgtgcttcgattccccgg gtgtaacctt tcacaaacac attcact)和TU-IFNα14-R(SEQ ID NO.10:atctgtaagt ctagacccgg ggtcctttct tctcagccgc tt)，分别进行PCR验证及测序。
结果如图4所示，PCR扩增产物大小为600bp和498bp，与预期结果一致，表明GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU质粒构建成功。
实施例2.同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株的构建及检测
(1)酵母转化片段的构建
用BsaI酶切载体GPD-HBVs-TU，同时，BsmB I酶切同源臂质粒(URR1 和URR2)和选择性标记质粒(LEU)。参照Dai课题组的实验步骤[6]，将URRs 同源臂、LEU选择性标签、GPD-HBVs-TU转录单位，按照特异性前后缀序列进行拼接，T4连接酶16℃过夜连接，拼接产物用于酵母转化。
用BsaI酶切载体GPD-IFNα14-TU，同时，BsmB I酶切同源臂质粒(SUR1 和SUR2)和选择性标记质粒(Trp)。参照Dai课题组的实验步骤[6]，将SURs 同源臂、Trp选择性标签、GPD-IFNα14-TU转录单位，按照特异性前后缀序列进行拼接，T4连接酶16℃过夜连接，拼接产物用于酵母转化。
(2)JDY52-HBVs重组酿酒酵母菌株的构建
①菌株活化：挑取JDY52单菌落接种到3mL YPD液体培养基中，30℃、 220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按1：50的比例转接到5mL新鲜的YPD 培养基中，使其初始OD为0.1～0.2，30℃、220rpm培养至OD600为0.5～0.8。 2500rpm离心5min收集5mL 菌液的菌体，并用1mL无菌水洗涤细胞，弃去上清。
②酵母转化：向离心后的菌体沉淀中加入100μL 0.1M的醋酸锂，重悬细胞，12000rpm离心20s弃去上清。加入50μL 0.1M醋酸锂，重悬细胞，12000rpm 离心20s收集菌体。然后在离心管中依次加入240μL 50％的PEG4000、36μL 1M 醋酸锂、100μg鲑鱼精DNA、2μg片段DNA，剧烈震荡至完全混匀。30℃200rpm 30min，42℃25min，6000rpm离心15s收集菌体，去除转化液，加入1mL的YPD液体培养基于30℃孵育2h，2500rpm离心5min收集菌体，用50μL去离子水重悬细胞，尽可能温和的吹吸混匀，将菌体涂布在SD-leu固体培养基表面，30℃培养箱生长2～3天，直至形成典型菌落。挑取单菌落在SD-leu平板划线纯化，同步接种至3mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm过夜培养，用于基因型验证。
③JDY52-HBVs菌株的基因型验证
选择在SD-leu培养基中生长的酵母，提取其基因组PCR验证HBVs基因是否成功整合到基因组。酵母基因组的提取方法参照文献进行[7]。取100μL培养后的菌液6000rpm离心1min弃去上清，用100μL裂解液(200mM LiOAc,1％ SDS)重悬细胞，70℃孵育5min.加入300μL无水乙醇混匀，于15000g离心3 min收集细胞碎片。70％乙醇清洗后加入50-100μL ddH2O重悬沉淀。15000g离心15s后吸取上清作为基因组模板进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：
Figure BDA0003249925630000071
使用以下PCR程序进行扩增：
Figure BDA0003249925630000072
(3)JDY52-HBVs-IFNα14重组酿酒酵母菌株的构建
挑取构建成功的JDY52-HBVs单菌落进行接种，按照(2)①②的方法将 IFNα14构建至菌株中，并按照(2)③的方法进行基因型验证。
实验结果如图7所示，JDY52-HBVs-IFNα14重组酵母菌株No.3，No.4，No.5 基因型正确。
(4)JDY52-HBVs-IFNα14菌株的表型验证
由于GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU载体插入片段的C端带有His标签，利用Western blot抗His抗体检测目的基因的表达情况。
HBVs的表达情况：收集2mL 48h的YPD培养液，6000rpm离心1min收集菌体，加入酸洗玻璃珠，60μL PEB缓冲液重悬菌体，玻璃珠法破壁5次，加入15μL 5×SDS上样缓冲液，沸水浴5min，4℃下12000rpm离心10min，小心吸取上清，8μL上清用于12％SDS-PAGE电泳。
IFNα14的表达情况：收集2mL 48h的YPD培养液，6000rpm离心1min 收集上清，通过浓缩管进行浓缩，取60μL上清液，加入15μL 5×SDS上样缓冲液，沸水浴5min，8μL上清用于12％SDS-PAGE电泳。
SDS-PAGE电泳结束后，通过湿转法将蛋白分离胶转移至与其同等大小的 PVDF膜上，转膜条件为300mA 100min；转膜完成后，在室温下，用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜1h；将膜完全浸没在用5％BSA 1:2000稀释的鼠抗His单克隆抗体(HT501,Transgene)中，4℃孵育过夜；回收一抗，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10min；用5％BSA 1:5000稀释的羊抗鼠HRP标记二抗(LK2003,Sungene Biotech)室温孵育1h；TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次；避光向PVDF膜正面滴加化学发光显色底物(34075,ThermoFisher)，通过Bio-rad 化学发光成像仪曝光，观察蛋白表达情况。
结果如图8、9所示，重组酵母菌株No.3,No.4和No.5均可表达HBVs蛋白和IFNα14蛋白。HBVs蛋白分子量理论值为25KDa，但实际观测结果为40KDa。 IFNα14蛋白分子量理论值为20KDa，但实际观测结果为25KDa。HBVs蛋白和 IFNα14蛋白有多个糖基化位点，分子量增加考虑糖基化所致。
尽管本发明内容是结合上述实施例进行说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,本发明的范围由所附权利要求书限定，其他的任何在限定范围内所作的改变或修饰，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。
References:
[1]吕迎霞,张学东,于林.乙肝五项定量检测及罕见模式分析％J检验医学与临床[J],2012, 9(14):1820-1821.
[2]常晓依,兰喜,白银梅,et al.乙型肝炎病毒的研究进展％J中国农学通报[J],2010,26(18): 6-11.
[3]Chen J,Li Y,Lai F,et al.Functional Comparison of Interferon-αSubtypes Reveals Potent Hepatitis B Virus Suppression by a Concerted Actionof Interferon-αand Interferon-γSignaling[J].Hepatology, 2021,73(2):486-502.
[4]Chen W,Georgiou G.Cell-Surface display of heterologous proteins:From high-throughput screening to environmental applications[J].BiotechnolBioeng,2002,79(5):496-503.
[5]黄金海,张丽琳,郭艳余,et al.一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法: CN111004330A[P].2020-04-14.
[6]Guo Y,Dong J,Zhou T,et al.YeastFab:the design and construction ofstandard biological parts for metabolic engineering in Saccharomycescerevisiae[J].Nucleic Acids Res,2015,43(13):e88.
[7]
Figure BDA0003249925630000091
M,Kristjuhan K,Kristjuhan A.Extraction of genomic DNA fromyeasts for PCR-based applications[J].Biotechniques,2011,50(5):325-8.
序列表
<110> 天津大学
<120> 同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株及制备方法和应用
<130> 2021.08.10
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Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
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Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
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50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
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Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His
115 120 125
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atgggaggat ggtcatcaaa gccgcgacaa ggaatgggaa caaacctttc agttcctaac 60
cctcttggat tcttcccaga ccatcaactt gatcctgcat ttggagcaaa ctcaaacaac 120
cctgattggg atttcaatcc aaacaaagat cattggcctg aagcaaacca agttggagca 180
ggagcatttg gacctggatt tacacctcct catggaggac ttcttggatg gtcacctcaa 240
gcacaaggca tactcactac cgtacctgca gcacctcctc ctgcatcaac aaacagacaa 300
tcaggaagac aacctacacc tatttcacct cctcttagag attcacatcc tcaagcaatg 360
caatggaact caacaacatt tcatcaagca cttcttgatc ctagagttag aggactttat 420
ttcccggccg gaggatcatc atcaggaaca gttaaccctg ttcctacaac agcatcacct 480
atttcatcaa tattctcccg aacaggagat cctgcaccta acatggagaa taccacatca 540
ggatttcttg gacctttact cgtacttcaa gccggattct tcctcctgac acgtatactc 600
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tgtaaccttt cacaaacaca ttcacttaac aacagaagaa cacttatgct tatggctcag 60
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gaagaatttg atggaaacca atttcagaag gcccaggcaa tttcagttct tcatgaaatg 180
atgcaacaaa catttaacct atttagtacc aagaatagtt cagcagcatg ggatgaaaca 240
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agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg 60
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agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 720
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 780
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gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1320
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1380
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggtagtcg cggtatcatt 1440
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1500
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1560
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1620
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1680
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gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1860
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1920
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1980
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 2040
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 2100
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2160
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2220
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2280
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2340
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2400
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2460
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 2520
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 2580
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag 2640
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 2700
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct 2760
cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg gccgcgaatt ccccgggtct 2820
agaggtctcg gttggcagtg actcggtctc tacctggctt cattatcaat actgccattt 2880
caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag tcaaaaaatt 2940
agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt tacacagaat 3000
atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta aatataatgg 3060
agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa aatattgttt 3120
tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga gaacaggggc 3180
acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat 3240
gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca ccttctatta 3300
ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa 3360
attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt 3420
aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt tttagtttta 3480
aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca cacataaaca aacaaagatg atgcagttac 3540
ttcgctgttt ttcaatattt tctgttattg cttcagtttt agcacaggaa ctgacaacta 3600
tatgcgagca aatcccctca ccaactttag aatcgacgcc gtactctttg tcaacgacta 3660
ctattttggc caacgggaag gcaatgcaag gagtttttga atattacaaa tcagtaacgt 3720
ttgtcagtaa ttgcggttct cacccctcaa caactagcaa aggcagcccc ataaacacac 3780
agtatgtttt taagcttctg caggctagtg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg 3840
gtggtggtgg ttctgctagc atgactggtg gacagcaaat gggtcgggat ctgtacgacg 3900
atgacgataa ggtaccagga tccatgggag gatggtcatc aaagccgcga caaggaatgg 3960
gaacaaacct ttcagttcct aaccctcttg gattcttccc agaccatcaa cttgatcctg 4020
catttggagc aaactcaaac aaccctgatt gggatttcaa tccaaacaaa gatcattggc 4080
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ctcctgcatc aacaaacaga caatcaggaa gacaacctac acctatttca cctcctctta 4260
gagattcaca tcctcaagca atgcaatgga actcaacaac atttcatcaa gcacttcttg 4320
atcctagagt tagaggactt tatttcccgg ccggaggatc atcatcagga acagttaacc 4380
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ttattattaa ataagttata aaaaaaataa gtgtatacaa attttaaagt gactcttagg 4740
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aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 4980
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cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2280
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2340
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2400
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2460
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 2520
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 2580
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag 2640
gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 2700
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct 2760
cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac ggtctcggtt ggcagtgact cggtctctac 2820
ctggcttcat tatcaatact gccatttcaa agaatacgta aataattaat agtagtgatt 2880
ttcctaactt tatttagtca aaaaattagc cttttaattc tgctgtaacc cgtacatgcc 2940
caaaataggg ggcgggttac acagaatata taacatcgta ggtgtctggg tgaacagttt 3000
attcctggca tccactaaat ataatggagc ccgcttttta agctggcatc cagaaaaaaa 3060
aagaatccca gcaccaaaat attgttttct tcaccaacca tcagttcata ggtccattct 3120
cttagcgcaa ctacagagaa caggggcaca aacaggcaaa aaacgggcac aacctcaatg 3180
gagtgatgca acctgcctgg agtaaatgat gacacaaggc aattgaccca cgcatgtatc 3240
tatctcattt tcttacacct tctattacct tctgctctct ctgatttgga aaaagctgaa 3300
aaaaaaggtt gaaaccagtt ccctgaaatt attcccctac ttgactaata agtatataaa 3360
gacggtaggt attgattgta attctgtaaa tctatttctt aaacttctta aattctactt 3420
ttatagttag tctttttttt agttttaaaa caccaagaac ttagtttcga ataaacacac 3480
ataaacaaac aaagatgatg agatttcctt caatttttac tgcagtttta ttcgcagcat 3540
cctccgcatt agctgctcca gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg 3600
ctgaagctgt catcggttac tcagatttag aaggggattt cgatgttgct gttttgccat 3660
tttccaacag cacaaataac gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg 3720
ctaaagaaga aggggtatct ctcgagaaaa gaatgagcta tgatgtgctt cgattccccg 3780
ggtgtaacct ttcacaaaca cattcactta acaacagaag aacacttatg cttatggctc 3840
agatgcgccg gatcagtccg ttcagttgcc tcaaggaccg ccacgacttc gagttccctc 3900
aagaagaatt tgatggaaac caatttcaga aggcccaggc aatttcagtt cttcatgaaa 3960
tgatgcaaca aacatttaac ctatttagta ccaagaatag ttcagcagca tgggatgaaa 4020
cacttcttga gaagttctac atagaactct ttcaacaaat gaatgatctt gaagcatgtg 4080
ttattcaaga agttggagtt gaagaaacac cgctaatgaa tgaggactct atattggccg 4140
taaagaagta ctttcaaaga atcactttgt accttatgga gaagaagtac agcccttgtg 4200
catgggaagt tgttagagca gaaattatga gatcactttc attctccacc aaccttcaga 4260
agcggctgag aagaaaggac cccgggtcta gacttacaga ttacctccgg aaccaccacc 4320
accaccacca ctgatagccg aatttcttat gatttatgat ttttattatt aaataagtta 4380
taaaaaaaat aagtgtatac aaattttaaa gtgactctta ggttttaaaa cgaaaattct 4440
tattcttgag taactctttc ctgtaggtca ggttgctttc tcaggtatag catgaggtcg 4500
ctcttattga ccacacctct accggcctct gagagagacc caagacactg cggatcgaga 4560
ccactagtac cggtctgcag ctcgaggggg ggcccggtac ccaattcgcc ctatagtgag 4620
tcgtattacg cgcgctcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc 4680
gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa 4740
gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcgac 4800
gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 4860
acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 4920
ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 4980
gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca 5040
tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 5100
ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa 5160
gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 5220
gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc 5280
atctgtgcgg tatttcacac cgcatagggt aataactgat ataattaaat tgaagctcta 5340
atttgtgagt ttagtataca tgcatttact tataatacag ttttttagtt ttgctggccg 5400
catcttctca aatatgcttc ccagcctgct tttctgtaac gttcaccctc taccttagca 5460
tcccttccct ttgcaaatag tcctcttcca acaataataa tgtcagatcc tgtagacacc 5520
acatcatcca cggttctata ctgttgaccc aatgcgtcac ccttgtcatc taaacccaca 5580
ccgggtgtca taatcaacca atcgtaacct tcatctcttc cacccatgtc tctttgagca 5640
ataaagccga taacaaaatc tttgtcgctc ttcgcaatgt caacagtacc cttagtatat 5700
tctccagtag atagggagcc cttgcatgac aattctgcta acatcaaaag gcctctaggt 5760
tcctttgtta cttcttctgc cgcctgcttc aaaccgctaa caatacctgg gcccaccaca 5820
ccgtgtgcat tcgtaatgtc tgcccattct gctattctgt atacacccgc agagtactgc 5880
aatttgactg tattaccaat gtcagcaaat tttctgtctt cgaagagtaa aaaattgtac 5940
ttggcggata atgcctttag cggcttaact gtgccctcca tggaaaaatc agtcaagata 6000
tccacatgtg tttttagtaa acaaattttg ggacctaatg cttcaactaa ctccagtaat 6060
tccttggtgg tacgaacatc caatgaagca cacaagtttg tttgcttttc gtgcatgata 6120
ttaaatagct tggcagcaac aggactagga tgagtagcag cacgttcctt atatgtagct 6180
ttcgacatga tttatcttcg tttcctgcag gtttttgttc tgtgcagttg ggttaagaat 6240
actgggcaat ttcatgtttc ttcaacacta catatgcgta tatataccaa tctaagtctg 6300
tgctccttcc ttcgttcttc cttctgttcg gagattaccg aatcaaaaaa atttcaaaga 6360
aaccgaaatc aaaaaaaaga ataaaaaaaa aatgatgaat tgaattgaaa agctgtggta 6420
tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg 6480
ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 6540
gctgtgacaa tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 6600
gcgagattaa 6610
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gacgataagg taccaggatc catgggagga tggtcatcaa agc 43
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tgctggatat ctactggatc cgagtatacg tgtcaggagg aagaatc 47
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gatgtgcttc gattccccgg gtgtaacctt tcacaaacac attcact 47
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
atctgtaagt ctagacccgg ggtcctttct tctcagccgc tt 42

Claims (4)

1.一种同时表达IFNα14和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株，JDY52-
HBVs-IFNα14，其特征在于，其包含HBVs蛋白的1位至200位氨基酸，其乙肝病毒S蛋白的截断体序列为SEQ ID No.1，包含IFNα14的24位至189位氨基酸，其IFNα14蛋白的截断体序列为SEQ ID No.2。
2.制备权利要求1所述同时表达IFNα14和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，首先制备乙肝病毒S蛋白重组酵母，将体外构建的S蛋白截断体完整转录单位GPD-HBVs-TU，其GPD-HBVs-TU序列为SEQ IDNo.5，通过同源重组整合于酵母JDY52的基因组，利用Aga1-Aga2表面展示系统将S蛋白展示于酵母细胞表面；然后在已构建好的菌株JDY52-HBVs的基础上，制备IFNα14蛋白重组酵母，将体外构建的IFNα14蛋白截断体完整转录单位GPD-IFNα14-TU，其GPD-IFNα14-TU序列为SEQ ID No.6，通过同源重组整合于酵母JDY52-HBVs的基因组，利用α-Factor分泌系统将IFNα14蛋白分泌至细胞外；获得能够同时表面展示HBVs蛋白和分泌IFNα14蛋白的重组酵母菌株JDY52-HBVs-IFNα14。
3.根据权利要求2所述制备同时表达IFNα14和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)乙肝病毒刺突蛋白S编码基因的PCR扩增：参考乙肝病毒基因序列AF384371.1，合成优化后的S基因，序列特征为SEQ No.3；以pET28a(+)-
HBVs质粒为模板，设计引物扩增S蛋白编码基因用于酵母载体连接；
(2)IFNα14蛋白编码基因的PCR扩增：参考IFNα14基因序列NM_002172.3，合成优化后的IFNα14基因，序列特征为SEQ No.4；以pET28a(+)-IFNα14质粒为模板，设计引物扩增IFNα14蛋白编码基因用于酵母载体连接；
(3)Aga2基因与乙肝病毒S蛋白编码序列串联：通过BamHI单酶切线性化POT-GPD-TU载体，无缝克隆连接S基因片段至表面展示表达载体GPD-POT-TU上，获得重组质粒GPD-HBVs-TU，其序列特征为SEQ No.5.重组质粒转化至E.coli DH5a中，用S基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；(4)α-Factor基因与IFNα14蛋白编码序列串联：通过SmaI单酶切线性化POT-GPD-TU载体，无缝克隆连接IFNα14基因片段至分泌表达载体GPD-POT-TU上，获得重组质粒GPD-IFNα14-TU，其序列特征为SEQ No.6.重组质粒转化至E.coli DH5a中，用IFNα14基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；(5)HBVs蛋白酵母重组菌株的构建：将重组质粒GPD-HBVs-TU与同源臂URRs、筛选标签Leu编码序列进行酶切拼接，获得完整的包含S基因序列的重组基因，转化到酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Western blot、免疫荧光进行蛋白表达水平验证；(6)同时表面展示HBVs蛋白和分泌IFNα14蛋白的酵母重组菌株的构建：将重组质粒GPD-IFNα14-TU与同源臂、筛选标签Trp编码序列进行酶切拼接，获得完整的包含IFNα14基因序列的重组基因，转化到(5)所得到的重组酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Western blot、免疫荧光进行蛋白表达水平验证。
4.权利要求1所述重组酿酒酵母菌株在制备乙型肝炎病毒口服疫苗中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108463229A (zh) * 2016-01-11 2018-08-28 斯坦福大学托管董事会 嵌合蛋白和免疫治疗方法
CN109381698A (zh) * 2017-08-06 2019-02-26 复旦大学 人α干扰素亚型在制备抗乙型肝炎病毒药物中的用途
CN111542340A (zh) * 2017-11-16 2020-08-14 华盛顿大学 使用HBV包膜蛋白的HBV PreS1和/或PreS2和/或S-HBsAg区域的治疗乙型肝炎病毒(HBV)的疫苗

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108463229A (zh) * 2016-01-11 2018-08-28 斯坦福大学托管董事会 嵌合蛋白和免疫治疗方法
CN109381698A (zh) * 2017-08-06 2019-02-26 复旦大学 人α干扰素亚型在制备抗乙型肝炎病毒药物中的用途
CN111542340A (zh) * 2017-11-16 2020-08-14 华盛顿大学 使用HBV包膜蛋白的HBV PreS1和/或PreS2和/或S-HBsAg区域的治疗乙型肝炎病毒(HBV)的疫苗

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