CN108463229A - 嵌合蛋白和免疫治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于免疫细胞调节的系统和免疫治疗的方法。本发明中的用于免疫细胞调节的系统包括嵌合受体多肽、嵌合衔接子多肽、基因调节多肽(GMP)，和切割部分。

Description

嵌合蛋白和免疫治疗方法
交叉引用
本申请要求2016年1月11日提交的申请号为62/277,322的美国临时申请、2016年6月17日提交的申请号为62/351,522的美国临时申请、2016年9月26日提交的申请号为62/399,902的美国临时申请、2016年9月26日提交的申请号为62/399,923的美国临时申请，以及2016年9月26日提交的申请号为62/399,939的美国临时申请的优先权，其各自通过引用整体并入本文。
背景技术
细胞活性的调节可涉及配体与膜结合受体的结合，所述膜结合受体包含胞外配体结合结构域和胞内(例如细胞质)信号传导结构域。配体和配体结合结构域之间复合物的形成，可引起受体的构象和/或化学的修饰，其可引起细胞内的信号转导。在一些情况下，受体的细胞质部分被磷酸化(例如反式磷酸化和/或自磷酸化)，这引起其活性改变。这些事件可以与次级信使和/或辅因子蛋白的募集相结合。在一些情况下，细胞质部分的变化导致与其他蛋白质(例如，辅因子蛋白和/或其他受体)结合。这些其他蛋白质可以被激活，然后在细胞内执行各种不同功能。
将一种蛋白质的胞外结构域(例如，配体结合结构域)连接至涉及信号转导的另一种蛋白质的胞内结构域(例如，信号传导结构域)，产生能够将前者的抗原识别和后者的信号转导相结合的分子(例如，嵌合受体)。这种嵌合分子(例如嵌合受体或嵌合抗原受体)可用于各种不同目的，例如用于免疫治疗中调节免疫细胞。免疫疗法可涉及修饰患者自身的免疫细胞，以表达一嵌合受体，在该嵌合受体中，任意的配体特异性被移植到免疫细胞信号传导结构域上。免疫细胞信号传导结构域可以参与激活和/或去活化免疫细胞，从而对诸如癌症等疾病作出响应。
传统的免疫治疗方法存在各种不同缺陷。所述缺陷包括：对于为了获得治疗效果而需要持续的和/或充足的免疫反应而言，来自共刺激受体的信号转导不足、修饰的免疫细胞对于患病细胞例如癌细胞的特异性不足(例如靶向但不针对肿瘤的效应和毒性)，以及副作用如细胞因子释放综合征(CRS)。在免疫细胞中的信号可涉及各种不同受体，其中包括共刺激受体。来自共刺激受体的信号不足，可能导致免疫细胞应答减少和免疫治疗效果降低。脱靶效应和副作用如细胞因子释放综合征可导致进一步的医疗并发症，包括炎症反应、器官衰竭，以及极端情况下的死亡。
概述
鉴于上述情况，对于进行免疫疗法的替代组合物和方法存在相当大的需求。本发明的组合物和方法满足了这种需求，并且还提供了额外的优点。特别地，本发明的各个不同方面提供了用于免疫细胞调节的系统。
在一个方面，本发明提供了用于免疫细胞的条件性调节的系统。所述系统包含(a)嵌合跨膜的受体多肽，其包含(i)胞外区，所述胞外区包含结合抗原的抗原相互作用结构域和(ii)胞内区，所述胞内区包含免疫细胞信号传导结构域；(b)嵌合衔接子(adaptor)多肽，所述嵌合衔接子多肽包含受体结合部分，所述受体结合部分在所述受体多肽与抗原结合后经受体修饰的情况下结合于所述受体多肽；(c)基因调节多肽(GMP)，该基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分(actuator moiety)；和(d)切割部分，当接近切割识别位点时所述切割部分切割识别位点，从而从GMP中释放出所述致动部分，其中：(i)所述切割部分形成受体多肽的胞内区的一部分，并且GMP形成嵌合衔接子多肽的一部分；(ii)所述切割部分与第二衔接子多肽形成复合物，所述第二衔接子多肽与在结合于抗原后经历受体修饰的受体多肽结合，并且所述GMP形成所述嵌合衔接子多肽的一部分；或(iii)所述切割部分形成嵌合衔接子多肽的一部分，并且GMP形成所述受体多肽的胞内区的一部分。在一些实施方式中，所述切割部分形成所述受体多肽的胞内区的一部分，并且GMP形成嵌合衔接子多肽的一部分。在一些实施方式中，所述切割部分与第二衔接子多肽形成复合物，所述第二衔接子多肽与结合于抗原后经历受体修饰的受体多肽结合，并且所述GMP形成所述嵌合衔接子多肽的一部分。在一些实施方式中，所述切割部分形成所述嵌合衔接子多肽的一部分，并且GMP形成所述受体多肽的胞内区的一部分。
在一些实施方式中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方式中，所述淋巴细胞是T细胞。在一些实施方式中，所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合于抗体。在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合于抗体的Fc结构域、Fv结构域、重链和轻链中的至少一个。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于抗体的Fc结构域。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含Fab、单链Fv(scFv)、胞外受体结构域和Fc结合结构域中的至少一个。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含Fc结合结构域，所述Fc结合结构域包括Fc受体或其片段。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含Fc结合结构域，所述Fc结合结构域包括：FcγRI(CD64)、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIA(CD32,H131)、FcγRIIA(CD32,R131)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIB-1、FcγRIIB-2、FcγRIIIA(CD16a,V158)、FcγRIIIA(CD16a,F158)、FcγRIIIB(CD16b,FcγRIIIb-NAl)、FcγRIIIB(CD16b,FcγRIIIb-NA2)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR、FcRn，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于抗原，所述抗原包括抗体，而所述抗体反过来结合于选自以下的抗原：1-40-β-淀粉状蛋白、4-1BB、5AC、5T4、激活素受体样激酶1、ACVR2B、腺癌抗原、AGS-22M6、α-胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽杆菌、BAFF、β-淀粉样蛋白、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、C5、CA-125、家犬狼疮IL31、碳酸酐酶9(CA-IX)、心肌肌球蛋白、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147(基础免疫球蛋白)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3ε、CD30、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配体、CD41、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CEA相关抗原、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艰难梭菌、凝聚因子A、CSF1R、CSF2、CTLA-4、C-X-C趋化因子受体4型、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、达比加群酯、DLL4、DPP4、DR5、大肠杆菌志贺毒素1型、大肠杆菌志贺毒素2型、EGFL7、EGFR、内毒素、EpCAM、上皮唾蛋白、ERBB3、大肠杆菌、呼吸道合胞病毒F蛋白、FAP、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白胞外结构域B、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、卷曲受体、神经节苷脂GD2、GD2、神经节苷脂GD3、磷脂酰肌醇聚糖3、GMCSF受体α链、GPNMB、生长分化因子8、GUCY2C、血球凝集素、乙肝表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、组蛋白复合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、人分散因子受体激酶、人TNF、人β-淀粉样蛋白、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE的Fc区、IGF-1受体、IGF-1、IGHE、IL-17A、IL-17F、IL-20、IL-12、IL-13、IL-17、IL-1β、IL-22、IL-23、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、ILGF2、甲型流感血凝素、甲型流感病毒血凝素、胰岛素样生长因子I受体、整联蛋白α4β7、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整联蛋白αIIbβ3、整联蛋白αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素γ诱导蛋白、ITGA2、ITGB2(CD18)、KIR2D、路易斯-Y抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-选择素(CD62L)、LTA、MCP-1、间皮素、MIF、MS4A1、MSLN、MUC1、粘蛋白CanAg、髓磷脂相关糖蛋白、肌生成抑制蛋白、NCA-90(粒细胞抗原)、神经凋亡调节蛋白酶1、NGF、N-羟乙酰神经氨酸、NOGO-A、Notch受体、NRP1、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-Rα、磷酸钠共转运蛋白、磷脂酰丝氨酸、血小板衍生生长因子受体β、前列腺癌细胞、绿脓杆菌、狂犬病病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞病毒、RHD、恒河猴因子、RON、RTN4、硬化蛋白、SDC1、选择素P、SLAMF7、SOST、鞘氨醇-1-磷酸盐、金黄色葡萄球菌、STEAP1、TAG-72、T细胞受体、TEM1、腱生蛋白C、TFPI、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、MUC1的肿瘤特异性糖基化形式、肿瘤相关钙信号转导器2、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白和VWF。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于选自下组的抗体的Fc结构域：20-(74)-(74)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)(20-(74)-(74)(milatuzumab；veltuzumab))、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)(74-(20)-(20)(milatuzumab；veltuzumab))、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿比珠单抗(abituzumab)、ABP 494(西妥昔单抗生物仿制药)(ABP 494(cetuximabbiosimilar))、阿布里单抗(abrilumab)、ABT-700、ABT-806、阿克提单抗-A(锕Ac-225林妥珠单抗)(Actimab-A(actinium Ac-225lintuzumab))、阿卡单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿达卡莫单抗(adecatumumab)、阿杜单抗(aducanumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、AFM13、阿芙土珠单抗(afutuzumab)、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、PEG化的阿拉西马单抗(alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(alirocumab)、戊妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿马昔单抗(amatuximab)、AMG228、AMG820、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、安替单抗瑞伐坦(anetumab ravtansine)、阿尼弗洛姆单抗(anifrolumab)、安鲁单抗(anrukinzumab)、APN301、APN311、阿泊珠单抗(apolizumab)、APX003/SIM-BD0801(贝伐单抗)(APX003/SIM-BD0801(sevacizumab))、APX005M、阿西莫单抗(arcitumomab)、ARX788、阿斯库昔单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、ASG-15ME、阿特珠单抗(atezolizumab)、安妥明单抗(atinumab)、ATL101、阿特利单抗(也称为托珠单抗)(atlizumab(also referred toas tocilizumab))、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维拉姆单抗(Avelumab)、B-701、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、BAY1129980、BAY1187982、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝格洛姆单抗(begelomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝拉珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)、倍他卢汀单抗(177Lu-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸特托单抗)(Betalutin(177Lu-tetraxetan-tetulomab))、贝伐单抗(bevacizumab)、BEVZ92(贝伐单抗生物仿制药)(BEVZ92(bevacizumab biosimilar))、贝佐洛单抗(bezlotoxumab)、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、比西单抗(biciromab)、双马单抗(bimagrumab)、贝美珠单抗(bimekizumab)、莫比瓦妥单抗(bivatuzumab mertansine)、BIW-8962、博纳吐单抗(blinatumomab)、布洛唑单抗(blosozumab)、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、博科齐单抗(bococizumab)、维本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、布雷瓦雷克斯单抗(BrevaRex)、布里亚明单抗(briakinumab)、溴达拉单抗(brodalumab)、溴化丙单抗(brolucizumab)、支舒巴单抗(brontictuzumab)、C2-2b-2b、康纳单抗(canakinumab)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、坎妥单抗瑞伐坦(cantuzumab ravtansine)、卡普利单抗(caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽偶联物(capromab pendetide)、卡伦单抗(carlumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CBR96-阿霉素免疫偶联物(CBR96-doxorubicin immunoconjugate)、CBT124(贝伐单抗)(CBT124(bevacizumab))、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠单抗(cedelizumab)、PEG化的塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、伯格西他土珠单抗(citatuzumabbogatox)、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、克伐他单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物(clivatuzumab tetraxetan)、CM-24、钴妥珠单抗(codrituzumab)、考土昔单抗-DM4偶联物(coltuximab ravtansine)、康妥单抗(conatumumab)、康昔单抗(concizumab)、科塔拉(碘I-131地洛妥单抗生物素)(Cotara(iodine I-131 derlotuximab biotin))、cR6261、克伦单抗(crenezumab)、DA-3111(曲妥珠单抗生物仿制药)(DA-3111(trastuzumabbiosimilar))、达塞珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达妥珠单抗(dalotuzumab)、PEG化的达匹罗单抗(dapirolizumab pegol)、达雷木单抗(daratumumab)、达雷木单抗(商品名为Enhanze)(达雷木单抗)(Daratumumab Enhanze(daratumumab))、达介素(Darleukin)、癸曲单抗(dectrekumab)、地昔单抗(demcizumab)、丹因珠单抗-MMAF偶联物(denintuzumab mafodotin)、地诺单抗(denosumab)、达妥昔单抗(Depatuxizumab)、达妥昔单抗-MMAF偶联物(Depatuxizumab mafodotin)、地洛昔单抗-生物素(derlotuximabbiotin)、地莫单抗(detumomab)、DI-B4、丁妥昔单抗(dinutuximab)、地利达莫单抗(diridavumab)、DKN-01、DMOT4039A、阿托度单抗(dorlimomab aritox)、屈西他单抗(drozitumab)、DS-1123、DS-8895、杜利他单抗(duligotumab)、杜普单抗(dupilumab)、杜伐单抗(durvalumab)、杜昔单抗(dusigitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃巴单抗(edobacomab)、依屈洛单抗(edrecolomab)、依法珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、埃尔德单抗(eldelumab)、埃格曼图姆单抗(elgemtumab)、伊洛珠单抗(elotuzumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、艾马珠单抗(emactuzumab)、依米妥珠单抗(emibetuzumab)、恩伐珠单抗(enavatuzumab)、伊凡珠单抗-维多汀偶联物(enfortumab vedotin)、PEG化恩莫单抗(enlimomab pegol)、恩比利珠单抗(enoblituzumab)、依诺珠单抗(enokizumab)、依诺替单抗(enoticumab)、恩师妥昔单抗(ensituximab)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、依他珠单抗(etaracizumab)、依曲利珠单抗(etrolizumab)、依伐单抗(evinacumab)、依福单抗(evolocumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、法鲁珠单抗(farletuzumab)、法辛单抗(fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(felvizumab)、费扎尼单抗(fezakinumab)、FF-21101、FGFR2抗体-药物偶联物(FGFR2Antibody-Drug Conjugate)、菲伯免疫蛋白(Fibromun)、非卡妥珠单抗(ficlatuzumab)、菲妥木单抗(figitumumab)、福利木单抗(firivumab)、法兰妥单抗(flanvotumab)、福利替单抗(fletikumab)、芬特妥珠单抗(fontolizumab)、福拉木单抗(foralumab)、福韦单抗(foravirumab)、FPA144、去甲美马单抗(fresolimumab)、FS102、富拉单抗(fulranumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、加利昔单抗(galiximab)、甘露单抗(ganitumab)、冈特莫单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)、格图单抗-奥佐米星偶联物(gemtuzumab ozogamicin)、吉利单抗(Gerilimzumab)、格伐克单抗(gevokizumab)、吉妥昔单抗(girentuximab)、维格列巴单抗(glembatumumab vedotin)、GNR-006、GNR-011、哥利木单抗(golimumab)、高密昔单抗(gomiliximab)、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、古塞尔库姆单抗(guselkumab)、Hu14.18K322A单抗、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、伊巴珠单抗(ibalizumab)、伊立莫单抗替西坦偶联物(ibritumomab tiuxetan)、伊鲁库单抗(icrucumab)、依达鲁单抗(idarucizumab)、IGN002、IGN523、伊戈伏单抗(igovomab)、IMAB362、IMAB362(克洛昔单抗)(IMAB362(claudiximab))、伊马单抗(imalumab)、IMC-CS4、IMC-D11、英西单抗(imciromab)、伊马曲单抗(imgatuzumab)、IMGN529、IMMU-102(钇-90-依普鲁单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物)(IMMU-102(yttrium Y-90epratuzumab tetraxetan))、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗抗体(ImmuTuneIMP701Antagonist Antibody)、INCAGN1876、依克拉单抗(inclacumab)、INCSHR1210、吲妥昔单抗瑞伐坦(indatuximab ravtansine)、维因度单抗(indusatumab vedotin)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、奥妥珠格图单抗-奥佐米星偶联物偶联物(inotuzumab ozogamicin)、英特单抗(intetumumab)、依帕非赛(Ipafricept)、IPH4102、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊拉单抗(iratumumab)、伊沙昔单抗(isatuximab)、异妥拉明单抗(Istiratumab)、伊托珠单抗(itolizumab)、衣克珠单抗(ixekizumab)、JNJ-56022473、JNJ-61610588、克利昔单抗(keliximab)、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉托唑单抗(Labetuzumab)、拉托唑单抗-格维他偶联物(Labetuzumab Govitecan)、LAG525、兰布利单抗(lambrolizumab)、拉帕单抗(lampalizumab)、L-DOS47、利勃珠单抗(lebrikizumab)、利马索单抗(lemalesomab)、仑齐鲁单抗(lenzilumab)、勒德利木单抗(lerdelimumab)、白妥昔单抗(Leukotuximab)、莱卡单抗(lexatumumab)、利比维单抗(libivirumab)、维利伐妥单抗(lifastuzumab vedotin)、利格珠单抗(ligelizumab)、利洛单抗-赛塔坦偶联物(lilotomab satetraxetan)、林妥珠单抗(lintuzumab)、利鲁单抗(lirilumab)、LKZ145、洛德昔单抗(lodelcizumab)、洛克韦单抗(lokivetmab)、莫洛伐妥单抗(lorvotuzumabmertansine)、卢卡珠单抗(lucatumumab)、PEG化的卢利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁米昔单抗(lumiliximab)、鲁曲单抗(lumretuzumab)、LY3164530、马塔单抗(mapatumumab)、马妥昔单抗(margetuximab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥单抗(matuzumab)、马维里单抗(mavrilimumab)、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551(吲哚单抗)(MEDI-551(inebilizumab))、MEDI-565、MEDI6469、美泊利单抗(mepolizumab)、迈他珠单抗(metelimumab)、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉珠单抗(milatuzumab)、米拉珠单抗-SN-38(Milatuzumab-SN-38)、明妥莫单抗(minretumomab)、米维妥昔单抗-索拉素偶联物(mirvetuximab soravtansine)、米托单抗(mitumomab)、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、莫加利单抗(mogamulizumab)、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫洛莫单抗(morolimumab)、莫他珠单抗(motavizumab)、莫昔单抗-帕多毒素偶联物(moxetumomab pasudotox)、穆罗莫纳-CD3(muromonab-CD3)、塔非那托克-塔芬毒素偶联物(nacolomab tafenatox)、纳霉单抗(namilumab)、萘妥莫单抗-衣塔芬毒素偶联物(naptumomab estafenatox)、纳妥单抗(narnatumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奈巴库单抗(nebacumab)、奈米单抗(necitumumab)、奈莫珠单抗(nemolizumab)、奈利莫单抗(nerelimomab)、奈西伐单抗(nesvacumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼沃单抗(nivolumab)、巯诺莫单抗-美培坦偶联物(nofetumomab merpentan)、10-Nov、奥比妥昔单抗(obiltoxaximab)、奥匹妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡鲁单抗(ocaratuzumab)、奥克里昔单抗(ocrelizumab)、奥杜莫单抗(odulimomab)、阿法单抗(ofatumumab)、奥拉他单抗(olaratumab)、奥昔单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、OMP-131R10、OMP-305B83、阿那妥单抗(onartuzumab)、恩妥昔单抗(ontuxizumab)、阿昔单抗(opicinumab)、阿曲单抗-莫那毒素偶联物(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥替单抗(orticumab)、奥立昔单抗(otelixizumab)、奥特鲁单抗(otlertuzumab)、OX002/MEN1309、奥索单抗(oxelumab)、奥扎尼单抗(ozanezumab)、奥索利单抗(ozoralizumab)、帕吉巴昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、潘科曼单抗(pankomab)、潘科曼单抗-GEX(PankoMab-GEX)、泛巴单抗(panobacumab)、帕撒单抗(parsatuzumab)、帕昔单抗(pascolizumab)、帕索妥昔单抗(pasotuxizumab)、帕替利单抗(pateclizumab)、帕特利单抗(patritumab)、PAT-SC1、PAT-SM6、彭布利单抗(pembrolizumab)、培马单抗(pemtumomab)、哌拉单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培昔单抗(pexelizumab)、PF-05082566(乌托单抗)(PF-05082566(utomilumab))、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、匹利珠单抗(pidilizumab)、维匹那妥单抗(pinatuzumab vedotin)、品妥莫单抗(pintumomab)、普鲁单抗(placulumab)、维波达单抗(polatuzumab vedotin)、庞尼泽单抗(ponezumab)、普利昔单抗(priliximab)、普罗昔单抗(pritoxaximab)、普鲁米单抗(pritumumab)、PRO 140、普罗信单抗(Proxinium)、PSMA ADC、奎珠单抗(quilizumab)、拉托单抗(racotumomab)、拉德鲁单抗(radretumab)、拉维夫单抗(rafivirumab)、拉潘昔单抗(ralpancizumab)、拉莫鲁单抗(ramucirumab)、雷尼珠单抗(ranibizumab)、拉克昔单抗(raxibacumab)、瑞伐珠单抗(refanezumab)、瑞伐单抗(regavirumab)、REGN1400、REGN2810/SAR439684、利昔单抗(reslizumab)、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利妥珠单抗(rilotumumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、RM-1929、RO7009789、罗巴单抗(robatumumab)、罗乐单抗(roledumab)、罗莫索单抗(romosozumab)、罗他珠单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、鲁普单抗(ruplizumab)、妥珠单抗-格维他偶联物(sacituzumab govitecan)、沙马利单抗(samalizumab)、SAR408701、SAR566658、沙利鲁单抗(sarilumab)、SAT012、沙妥单抗-喷地肽偶联物(satumomabpendetide)、SCT200、SCT400、SEA-CD40、塞库单抗(secukinumab)、塞巴坦单抗(seribantumab)、塞妥昔单抗(setoxaximab)、赛韦单抗(sevirumab)、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西布曲单抗(sibrotuzumab)、西伐单抗(sifalimumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、西妥珠单抗(simtuzumab)、西普利单抗(siplizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、维索菲妥单抗(sofituzumab vedotin)、索冷珠单抗(solanezumab)、索利单抗(solitomab)、索普昔单抗(sonepcizumab)、索妥单抗(sontuzumab)、丝塔单抗(stamulumab)、舒乐单抗(sulesomab)、苏维珠单抗(suvizumab)、SYD985、SYM004(伏妥昔单抗和莫妥昔单抗)(SYM004(futuximab and modotuximab))、Sym015、TAB08、他巴单抗(tabalumab)、塔卡珠单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物(tacatuzumab tetraxetan)、塔多珠单抗(tadocizumab)、塔利单抗(talizumab)、坦纳单抗(tanezumab)、塔尼单抗(Tanibirumab)、普利妥单抗-帕普毒素偶联物(taplitumomab paptox)、塔雷克斯顿单抗(tarextumab)、TB-403、替非珠单抗(tefibazumab)、特勒金单抗(Teleukin)、阿替莫单抗-阿利毒素偶联物(telimomabaritox)、替纳单抗(tenatumomab)、替尼昔单抗(teneliximab)、替普珠单抗(teplizumab)、四丙珠单抗(teprotumumab)、司他洛单抗(tesidolumab)、替妥洛明单抗(tetulomab)、TG-1303、TGN1412、钍-227-依普鲁单抗偶联物(Thorium-227-Epratuzumab Conjugate)、替昔单抗(ticilimumab)、替加妥单抗(tigatuzumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、维蒂索单抗(Tisotumab vedotin)、TNX-650、塔西单抗(tocilizumab)、托拉珠单抗(toralizumab)、托沙单抗(tosatoxumab)、托西单抗(tositumomab)、托维单抗(tovetumab)、曲洛单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗-厄塔毒素偶联物(trastuzumabemtansine)、TRBS07、TRC105、曲利单抗(tregalizumab)、曲美单抗(tremelimumab)、特伐单抗(trevogrumab)、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、图卡珠单抗-西莫白介素偶联物(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(tuvirumab)、U3-1565、U3-1784、乌布妥昔单抗(ublituximab)、优隆单抗(ulocuplumab)、乌洛单抗(urelumab)、乌索单抗(urtoxazumab)、乌司他单抗(ustekinumab)、伐他昔单抗-塔利素偶联物(Vadastuximab Talirine)、维凡多鲁单抗(vandortuzumab vedotin)、范蒂姆单抗(vantictumab)、维库珠单抗(vanucizumab)、伐昔单抗(vapaliximab)、伐利单抗(varlilumab)、伐他珠单抗(vatelizumab)、VB6-845、维多珠单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维森单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏罗昔单抗(volociximab)、沃塞妥单抗-马伏毒素偶联物(vorsetuzumab mafodotin)、伏妥单抗(votumumab)、YYB-101、扎鲁单抗(zalutumumab)、扎诺米单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗(zatuximab)、齐拉明单抗(ziralimumab)、和阿佐莫单抗-阿利毒素偶联物(zolimomabaritox)。
在一些实施方式中，所述胞外区域包含多个抗原相互作用结构域，其各自表现出与相同或不同抗原的结合。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于选自下组的抗原：707-AP、生物素化的分子、α-肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、亲脂素、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、细胞凋亡蛋白酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、路易斯Y(Lewis Y)、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/黑素-A(Melan-A)、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活素、存活素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。
在一些实施方式中，所述受体多肽的免疫细胞信号传导结构域包含一个主要信号传导结构域，所述主要信号传导结构域包含一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。在一些实施方式中，所述受体多肽的免疫细胞信号传导结构域包含一个主要信号传导结构域，所述主要信号传导结构域包含一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。在一些实施方式中，所述免疫细胞信号传导结构域包含选自下组的蛋白质的主要信号传导结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(又名ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含一个CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含CD3ζ的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含FcγR的信号传导结构域。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含选自下组的FcγR的信号传导结构域：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含一个FcεR的信号传导结构域。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含选自下组的FcεR的信号传导结构域：FcεRI和FcεRII(CD23)。在一些实施方式中，主要信号传导结构域包含FcαR的信号传导结构域。在一些实施方式中，主要信号传导结构域包含选自下组的FcαR的信号传导结构域：FcαRI(CD89)和Fcα/μR。
在一些实施方式中，所述免疫细胞信号传导结构域包含一个共刺激结构域。在一些实施方式中，所述免疫细胞信号传导结构域包含多个共刺激结构域。在一些实施方式中，所述共刺激结构域包含以下物质的信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体或Toll配体受体。在一些实施方式中，共刺激结构域包含选自下组的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、树突状细胞植物血凝素-1(Dectin-1)/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、伊卡洛斯(Ikaros)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。在一些实施方式中，所述共刺激结构域可操作地调节免疫细胞中的增殖信号和/或存活信号。
在一些实施方式中，所述受体包含至少一种靶向肽，其指导受体多肽转运至细胞的特定区域。在一些实施方式中，所述靶向肽指导受体多肽转运至细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、过氧化物酶体或质膜。在一些实施方式中，所述靶向肽包含核输出信号(NES)。在一些实施方式中，所述靶向肽包括质膜靶向肽。
在一些实施方式中，所述受体修饰包括化学修饰。在一些实施方式中，所述化学修饰包括磷酸化。
在一些实施方式中，所述嵌合衔接子多肽的受体结合部分包含选自下组的分子的结合结构域：ABL1、ABL2、APBA1、APBA2、APBA3、BCAR3、BLK、BLNK、BMX、BTK、CHN2、CISH、CRK、CRKL、CSK、DAPP1、DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6、DOK7、EAT-2、EPS8、EPS8L1、EPS8L2、EPS8L3、FER、FES、FGR、FRK、FRS2、FRS3、FYN、GADS、GRAP、GRAP2、GRB10、GRB14、GRB2、GRB7、HCK、HSH2D、INPP5D、INPPL1、IRS1、IRS2、IRS3、IRS4、ITK、JAK2、LAT、LCK、LCP2、LYN、MATK、NCK1、NCK2、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PLCG1、PLCG2、PTK6、PTPN11、PTPN6、RASA1、SAP、SH2B1、SH2B2、SH2B3、SH2D1A、SH2D1B、SH2D2A、SH2D3A、SH2D3C、SH2D4A、SH2D4B、SH2D5、SH2D6、SH3BP2、SHB、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、SHD、SHE、SHP1、SHP2、SLA、SLA2、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、SRC、SRMS、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUPT6H、SYK、TEC、TENC1、TLN1、TLN2、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、TXK、VAV1、VAV2、VAV3、YES1、ZAP70、X11a，其任何衍生的结合结构域、其任何变体和其片段。
在一些实施方式中，所述致动部分包含CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调控多肽、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、转录激活物样效应物相关基因调控多肽、大范围核酸酶(meganuclease)、天然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、阿尔古(Argonaute)蛋白，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。在一些实施方式中，所述致动部分包含Cas蛋白，并且所述系统还包含与Cas蛋白形成复合物的向导RNA(gRNA)。在一些实施方式中，所述致动部分包含与向导RNA形成复合物的RBP，所述向导RNA可与Cas蛋白形成复合物。在一些实施方式中，所述gRNA包含显示与靶多核苷酸有至少80％序列一致性的靶向区段。在一些实施方式中，所述Cas蛋白基本上不具有DNA切割活性。
在一些实施方式中，所述致动部分包含至少一个将致动部分引导至细胞特定区域的靶向肽。在一些实施方式中，所述靶向肽包含一个核定位信号(NLS)。
在一些实施方式中，所述受体修饰包括在多个修饰位点处的修饰，并且每个修饰位点可有效地结合于嵌合衔接子多肽和/或第二衔接子多肽。
在一些实施方式中，所述切割识别位点包含多肽序列，并且切割部分包含蛋白酶活性。
在一些实施方式中，一旦从GMP释放，所述致动部分结合于靶多核苷酸，从而通过对靶多核苷酸的物理阻碍或对有效抑制或增强靶多核苷酸的基因表达的额外因子的募集，来调节靶多核苷酸的基因表达。在一些实施方式中，所述致动部分包含有效增加靶多核苷酸的基因表达的转录激活因子。在一些实施方式中，所述致动部分包含有效降低靶多核苷酸的基因表达的转录抑制因子。
在一些实施方式中，所述靶多核苷酸包含基因组DNA。在一些实施方式中，所述靶多核苷酸包含RNA。在一些实施方式中，所述靶多核苷酸包含内源基因或内源基因产物。在一些实施方式中，所述内源基因或内源基因产物编码细胞因子。在一些实施方式中，所述细胞因子选自下组：4-1BBL、激活素βA、激活素βB、激活素βC、激活素βE、artemin蛋白(ARTN)、BAFF/BLyS/TNFSF138、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、骨形态发生蛋白1(BMP1)、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CD153/CD30L/TNFSF8、CD40L/CD154/TNFSF5、CD40LG、CD70、CD70/CD27L/TNFSF7、CLCF1、c-MPL/CD110/TPOR、CNTF、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7/Ppbp、CXCL9、EDA-A1、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Fas配体/FASLG/CD95L/CD178、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF4、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、生长分化因子1(GDF1)、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFNω/IFNW1、IL11、IL18、IL18BP、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F3/IL1RA、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1RL2、IL31、IL33、IL6、IL8/CXCL8、抑制素-A、抑制素-B、瘦素、LIF、LTA/TNFB/TNFSF1、LTB/TNFC、神经秩蛋白(neuturin)(NRTN)、OSM、OX-40L/TNFSF4/CD252、珀色芬蛋白(Persephin)(PSPN)、RANKL/OPGL/TNFSF11(CD254)、TL1A/TNFSF15、TNFA、TNF-α/TNFA、TNFSF10/TRAIL/APO-2L(CD253)、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14/LIGHT/CD258、XCL1和XCL2。在一些实施方式中，所述内源基因或内源基因产物编码免疫调节蛋白。在一些实施方式中，所述免疫调节蛋白选自下组：A2AR、B7.1、B7-H3/CD276、B7-H4/B7S1/B7x/Vtcn1、B7-H6、BTLA/CD272、CCR4、CD122、4-1BB/CD137、CD27、CD28、CD40、CD47、CD70、CISH、CTLA-4/CD152、DR3、GITR、ICOS/CD278、IDO、KIR、LAG-3、OX40/CD134、PD-1/CD279、PD2、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA/Dies1/Gi24/PD-1H(C10orf54)。在一些实施方式中，所述靶多核苷酸包含异源基因或异源基因产物。在一些实施方式中，所述异源基因或异源基因产物编码额外的嵌合跨膜受体多肽。在一些实施方式中，所述额外的嵌合跨膜受体多肽包含：(a)胞外区，所述胞外区包含一个可以结合于额外抗原的额外抗原相互作用结构域；和(b)共刺激结构域。在一些实施方式中，所述额外抗原相互作用结构域结合于选自下组的抗原：707-AP、生物素化分子、α-肌动蛋白-4、abl-bcralb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、亲脂素、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白(b-catenin)、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、细胞凋亡蛋白酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、路易斯Y、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/黑素-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活素、存活素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。在一些实施方式中，所述共刺激结构域包含选自下组的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFFR/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、树突状细胞植物血凝素-1(Dectin-1)/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、伊卡洛斯、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
在一方面，本发明提供了表达本文公开的任何系统的淋巴细胞。在一些实施方式中，所述淋巴细胞的特征在于，当受体多肽与抗原结合时，通过在切割识别位点切割而从GMP释放所述致动部分。在一些实施方式中，所述释放的致动部分与淋巴细胞中的靶多核苷酸形成复合物。
在一些实施方式中，所述致动部分与靶多核苷酸之间复合物的形成，导致淋巴细胞中基因表达的上调。在一些实施方式中，所述基因是异源基因。在一些实施方式中，所述异源基因编码额外的嵌合跨膜受体多肽。在一些实施方式中，所述额外的嵌合跨膜受体多肽包含：(a)胞外区，所述胞外区包含一个可以结合额外抗原的额外抗原相互作用结构域；和(b)共刺激结构域。在一些实施方式中，所述基因是内源基因。在一些实施方式中，所述内源基因编码细胞因子。在一些实施方式中，所述细胞因子选自下组：4-1BBL、激活素βA、激活素βB、激活素βC、激活素βE、artemin蛋白(ARTN)、BAFF/BLyS/TNFSF138、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、骨形态发生蛋白1(BMP1)、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CD153/CD30L/TNFSF8、CD40L/CD154/TNFSF5、CD40LG、CD70、CD70/CD27L/TNFSF7、CLCF1、c-MPL/CD110/TPOR、CNTF、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7/Ppbp、CXCL9、EDA-A1、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Fas配体/FASLG/CD95L/CD178、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF4、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、生长分化因子1(GDF1)、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFNω/IFNW1、IL11、IL18、IL18BP、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F3/IL1RA、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1RL2、IL31、IL33、IL6、IL8/CXCL8、抑制素-A、抑制素-B、瘦素、LIF、LTA/TNFB/TNFSF1、LTB/TNFC、神经秩蛋白(neuturin)(NRTN)、OSM、OX-40L/TNFSF4/CD252、珀色芬蛋白(Persephin)(PSPN)、RANKL/OPGL/TNFSF11(CD254)、TL1A/TNFSF15、TNFA、TNF-α/TNFA、TNFSF10/TRAIL/APO-2L(CD253)、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14/LIGHT/CD258、XCL1和XCL2。
在一些实施方式中，所述致动部分与靶多核苷酸之间复合物的形成，下调淋巴细胞中基因的表达。在一些实施方式中，所述基因是内源基因。在一些实施方式中，所述内源基因编码免疫调节蛋白。在一些实施方式中，所述免疫调节蛋白选自下组：A2AR、B7.1、B7-H3/CD276、B7-H4/B7S1/B7x/Vtcn1、B7-H6、BTLA/CD272、CCR4、CD122、4-1BB/CD137、CD27、CD28、CD40、CD47、CD70、CISH、CTLA-4/CD152、DR3、GITR、ICOS/CD278、IDO、KIR、LAG-3、OX40/CD134、PD-1/CD279、PD2、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA/Dies1/Gi24/PD-1H(C10orf54)。
在一方面，本发明提供了表达本文公开的任何系统的淋巴细胞群。在一些实施方式中，所述淋巴细胞群的特征在于：当受体多肽与抗原结合时，通过在切割识别位点切割而从GMP释放出所述的致动部分。
在一方面，本发明提供了诱导靶细胞死亡的方法。所述方法包括：将靶细胞暴露于表达本文公开的任何系统的淋巴细胞。在一些实施方式中，在将靶细胞暴露于淋巴细胞后，由淋巴细胞表达的受体多肽结合于抗原，所述抗原包括靶细胞的细胞表面抗原或由靶细胞分泌的抗原，其中受体多肽与抗原的结合激活了淋巴细胞的细胞毒性，从而诱导靶细胞的死亡。在一些实施方式中，所述靶细胞是癌细胞。在一些实施方式中，当致动部分从GMP释放时，受体多肽与抗原的结合激活了淋巴细胞的细胞毒性。
在一些实施方式中，所述致动部分通过靶多核苷酸的物理阻碍或对有效抑制或增强靶多核苷酸的基因表达的额外因子的募集，来调节靶多核苷酸的基因表达。在一些实施方式中，所述致动部分包含有效增加靶多核苷酸的基因表达的转录激活因子。在一些实施方式中，所述致动部分包含有效降低靶多核苷酸的基因表达的转录抑制因子。在一些实施方式中，所述靶多核苷酸包含基因组DNA。在一些实施方式中，所述靶多核苷酸包含RNA。
在一些实施方式中，所述受体修饰包括磷酸化。在一些实施方式中，所述受体修饰包括在多个修饰位点处的修饰，并且每个修饰有效地结合于一个嵌合衔接子多肽。
在一些实施方式中，所述致动部分包含CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调控多肽、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、转录激活物样效应物相关基因调控多肽、大范围核酸酶、天然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、阿尔古蛋白，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。在一些实施方式中，所述致动部分包含与向导RNA(gRNA)形成复合物的Cas蛋白。在一些实施方式中，所述致动部分包含与向导RNA(gRNA)形成复合物的RBP，所述向导RNA可与Cas蛋白形成复合物。在一些实施方式中，所述Cas蛋白基本上不具有DNA切割活性。
在一些实施方式中，所述切割识别位点包含多肽序列，并且切割部分包含蛋白酶活性。
在一方面，本发明提供了嵌合跨膜受体多肽。所述嵌合跨膜受体多肽包含(a)胞外区，所述胞外区包含结合于抗原的抗原相互作用结构域；和(b)胞内区，所述胞内区包含：免疫细胞信号传导结构域；和与所述免疫细胞信号传导结构域连接的基因调节多肽(GMP)，其中所述GMP包含与肽切割结构域连接的致动部分；其中一旦抗原与所述胞外区结合，通过在肽切割结构域处切割从GMP释放出所述的致动部分。
在一方面，本发明提供了嵌合跨膜受体多肽。所述嵌合跨膜受体多肽包含(a)胞外区，所述胞外区包含结合于抗原的抗原相互作用结构域；和(b)胞内区，所述胞内区包含：免疫细胞信号传导结构域；和通过肽切割结构域连接至所述免疫细胞信号传导结构域的致动部分；其中一旦抗原与所述胞外区结合，通过在肽切割结构域处切割从受体释放出致动部分。
在一方面，本发明提供了条件性调节淋巴细胞的方法。所述方法包括：使表达本文公开的任何系统的淋巴细胞与结合于嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域的抗原接触，所述接触导致免疫细胞活性的激活或失活，从而条件性地调节淋巴细胞。在一些实施方式中，免疫细胞活性选自下组：淋巴细胞的克隆扩增；淋巴细胞的细胞因子的释放；淋巴细胞的细胞毒性；淋巴细胞的增殖；淋巴细胞的分化、去分化或分化转化；淋巴细胞的运动和/或运输；淋巴细胞的衰竭和/或重新激活；以及通过淋巴细胞释放其他细胞间的分子、代谢物、化合物或其组合。在一些实施方式中，在抗原与受体多肽的抗原相互作用结构域结合后，致动部分从GMP释放，从而实现激活或失活。
在一方面，本发明提供了一种嵌合衔接子多肽。所述嵌合衔接子多肽包含(a)受体结合部分，其结合于经与抗原结合后的发生修饰的受体，所述受体包含一个具有免疫细胞信号传导结构域的胞内区；和(b)与所述受体结合部分连接的基因调节多肽(GMP)，其中所述GMP包含与切割识别位点连接的致动部分；其中一旦所述受体结合部分与发生了修饰的所述受体结合后，通过在所述切割识别位点切割从所述GMP释放出所述致动部分。在一些实施方式中，所述受体结合部分包含选自下组的分子的结合结构域：ABL1、ABL2、APBA1、APBA2、APBA3、BCAR3、BLK、BLNK、BMX、BTK、CHN2、CISH、CRK、CRKL、CSK、DAPP1、DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6、DOK7、EAT-2、EPS8、EPS8L1、EPS8L2、EPS8L3、FER、FES、FGR、FRK、FRS2、FRS3、FYN、GADS、GRAP、GRAP2、GRB10、GRB14、GRB2、GRB7、HCK、HSH2D、INPP5D、INPPL1、IRS1、IRS2、IRS3、IRS4、ITK、JAK2、LAT、LCK、LCP2、LYN、MATK、NCK1、NCK2、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PLCG1、PLCG2、PTK6、PTPN11、PTPN6、RASA1、SAP、SH2B1、SH2B2、SH2B3、SH2D1A、SH2D1B、SH2D2A、SH2D3A、SH2D3C、SH2D4A、SH2D4B、SH2D5、SH2D6、SH3BP2、SHB、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、SHD、SHE、SHP1、SHP2、SLA、SLA2、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、SRC、SRMS、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUPT6H、SYK、TEC、TENC1、TLN1、TLN2、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、TXK、VAV1、VAV2、VAV3、YES1、ZAP70、X11a，其任何衍生的结合结构域、其任何变体和其任何片段。
在一些实施方式中，所述嵌合衔接子多肽包含至少一种靶向肽，其指导嵌合衔接子多肽转运至细胞的特定区域。在一些实施方式中，所述靶向肽指导嵌合衔接子多肽转运至细胞核、细胞质、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体或质膜。
在一些实施方式中，所述靶向肽包含核输出信号(NES)。在一些实施方式中，所述NES连接至嵌合衔接子多肽的N端。在一些实施方式中，所述靶向肽包含质膜靶向肽。
在一些实施方式中，所述靶向肽与致动部分连接。在一些实施方式中，所述靶向肽包含一个核定位信号(NLS)。在一些实施方式中，所述包含NLS的靶向肽连接至致动部分的N端或C端。在一些实施方式中，所述包含与致动部分连接的NLS的靶向肽，在致动部分通过在切割识别位点处切割并从GMP中释放后，指导致动部分转运至细胞的核。
在一些实施方式中，所述致动部分包含一个CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调控多肽、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、转录激活物样效应物相关基因调控多肽、大范围核酸酶、天然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、阿尔古蛋白，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。在一些实施方式中，所述致动部分包含可与向导RNA(gRNA)形成复合物的Cas蛋白。在一些实施方式中，所述致动部分包含一个RBP，其任选地与向导RNA形成复合物，而所述向导RNA可与Cas蛋白形成复合物。在一些实施方式中，所述Cas蛋白基本上不具有DNA切割活性。
在一些实施方式中，所述致动部分通过对靶多核苷酸的物理阻碍或对有效抑制或增强靶多核苷酸的基因表达的额外因子的募集，来调节基因的表达。在一些实施方式中，所述致动部分包含有效增加靶多核苷酸的基因表达的转录激活因子。在一些实施方式中，所述致动部分包含有效降低靶多核苷酸的基因表达的转录抑制因子。
在一些实施方式中，所述切割识别位点两侧是受体结合部分和致动部分。在一些实施方式中，所述切割识别位点包含被蛋白酶识别的切割识别序列。在一些实施方式中，所述切割识别位点包含多个切割识别序列，每个切割识别序列被相同或不同的蛋白酶识别。在一些实施方式中，所述切割识别序列被选自下组的蛋白酶识别：消化肽酶、氨基肽酶、安克洛酶、血管紧张素转换酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、钙蛋白酶I、钙蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、细胞凋亡蛋白酶1、细胞凋亡蛋白酶2、细胞凋亡蛋白酶3、细胞凋亡蛋白酶4、细胞凋亡蛋白酶5、细胞凋亡蛋白酶6、细胞凋亡蛋白酶7、细胞凋亡蛋白酶8、细胞凋亡蛋白酶9、细胞凋亡蛋白酶10、细胞凋亡蛋白酶11、细胞凋亡蛋白酶12、细胞凋亡蛋白酶13、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、糜酶、糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体C1r、补体C1s、补体因子D、补体因子I、黄瓜素、二肽基肽酶IV、弹性蛋白酶(白细胞)、弹性蛋白酶(胰腺的)、蛋白内切酶Arg-C、蛋白内切酶Asp-N、蛋白内切酶Glu-C、蛋白内切酶Lys-C、肠激酶、因子Xa、无花果蛋白酶、弗林蛋白酶、颗粒酶A、颗粒酶B、HIV蛋白酶、IG酶(IGase)、激肽释放酶组织、亮氨酸氨肽酶(通用)、亮氨酸氨肽酶(胞质)、亮氨酸氨肽酶(微粒体)、基质金属蛋白酶、甲硫氨酸氨肽酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶、脯氨酸酶，链霉蛋白酶E、前列腺特异性抗原、来自灰色链霉菌的碱性蛋白酶、来自曲霉菌的蛋白酶、来自斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、来自酱油曲霉(Aspergillus sojae)的蛋白酶、蛋白酶(地衣芽孢杆菌)(碱性的或碱性蛋白酶)、来自多粘芽孢杆菌的蛋白酶、来自芽孢杆菌属的蛋白酶、来自根霉属的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶体、来自米曲霉的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨基肽酶、肾素、肾素、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、热粘蛋白、凝血酶、组织纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、类胰蛋白酶(tryptase)和尿激酶。
在一方面，本发明提供了嵌合跨膜受体多肽。所述嵌合跨膜受体多肽包含(a)胞外区，所述胞外区包含结合于抗原的抗原相互作用结构域；和(b)胞内区，其包含：免疫细胞信号传导结构域；和与所述免疫细胞信号传导结构域连接的基因调节多肽(GMP)，其中所述GMP包含与切割识别位点连接的致动部分；其中一旦所述抗原与胞外区结合后，通过在切割识别位点处切割从GMP释放出致动部分。
在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合于膜结合的抗原。在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合于非膜结合的抗原。在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合于抗体。在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合于抗体的Fc结构域、Fv结构域、重链和轻链中的至少一个。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于抗体的Fc结构域。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含Fab、单链Fv(scFv)、胞外受体结构域和Fc结合结构域中的至少一个。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含一个Fc结合结构域，所述Fc结合结构域包含一个Fc受体或其任何片段。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含一个Fc结合结构域，所述Fc结合结构域包括：FcγRI(CD64)、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIA(CD32,H131)、FcγRIIA(CD32,R131)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIB-1、FcγRIIB-2、FcγRIIIA(CD16a,V158)、FcγRIIIA(CD16a,F158)、FcγRIIIB(CD16b,FcγRIIIb-NAl)、FcγRIIIB(CD16b,FcγRIIIb-NA2)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR、FcRn，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于一抗原，所述抗原包括抗体，所述抗体反过来结合选自以下的抗原：1-40-β-淀粉状蛋白、4-1BB、5AC、5T4、激活素受体样激酶1、ACVR2B、腺癌抗原、AGS-22M6、α-胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽杆菌(Bacillus anthracis anthrax)、BAFF、β-淀粉样蛋白、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、C5、CA-125、家犬狼疮IL31、碳酸酐酶9(CA-IX)、心肌肌球蛋白、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147(基础免疫球蛋白)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3ε、CD30、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配体、CD41、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CEA相关抗原、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艰难梭菌、凝聚因子A、CSF1R、CSF2、CTLA-4、C-X-C趋化因子受体4型、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、达比加群酯、DLL4、DPP4、DR5、大肠杆菌志贺毒素1型、大肠杆菌志贺毒素2型、EGFL7、EGFR、内毒素、EpCAM、上皮唾蛋白、ERBB3、大肠杆菌、呼吸道合胞病毒F蛋白、FAP、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白胞外结构域B、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、卷曲受体、神经节苷脂GD2、GD2、神经节苷脂GD3、磷脂酰肌醇聚糖3、GMCSF受体α链、GPNMB、生长分化因子8、GUCY2C、血球凝集素、乙肝表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、组蛋白复合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、人分散因子受体激酶、人TNF、人β-淀粉样蛋白、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE的Fc区、IGF-1受体、IGF-1、IGHE、IL-17A、IL-17F、IL-20、IL-12、IL-13、IL-17、IL-1β、IL-22、IL-23、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、ILGF2、甲型流感血凝素、甲型流感病毒血凝素、胰岛素样生长因子I受体、整联蛋白α4β7、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整联蛋白αIIbβ3、整联蛋白αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素γ诱导蛋白、ITGA2、ITGB2(CD18)、KIR2D、路易斯-Y抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-选择素(CD62L)、LTA、MCP-1、间皮素、MIF、MS4A1、MSLN、MUC1、粘蛋白CanAg、髓磷脂相关糖蛋白、肌生成抑制蛋白、NCA-90(粒细胞抗原)、神经凋亡调节蛋白酶1、NGF、N-羟乙酰神经氨酸、NOGO-A、Notch受体、NRP1、穴兔、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-Rα、磷酸钠共转运蛋白、磷脂酰丝氨酸、血小板衍生生长因子受体β、前列腺癌细胞、绿脓杆菌、狂犬病病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞病毒、RHD、恒河猴因子、RON、RTN4、硬化蛋白、SDC1、选择素P、SLAMF7、SOST、鞘氨醇-1-磷酸盐、金黄色葡萄球菌、STEAP1、TAG-72、T细胞受体、TEM1、腱生蛋白C、TFPI、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、MUC1的肿瘤特异性糖基化形式、肿瘤相关钙信号转导器2、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白和VWF。
在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合选自下组的抗体的Fc结构域：20-(74)-(74)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)(20-(74)-(74)(milatuzumab；veltuzumab))、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)(74-(20)-(20)(milatuzumab；veltuzumab))、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿比珠单抗(abituzumab)、ABP 494(西妥昔单抗生物仿制药)(ABP 494(cetuximabbiosimilar))、阿布里单抗(abrilumab)、ABT-700、ABT-806、阿克提单抗-A(锕Ac-225林妥珠单抗)(Actimab-A(actinium Ac-225lintuzumab))、阿卡单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿达卡莫单抗(adecatumumab)、阿杜单抗(aducanumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、AFM13、阿芙土珠单抗(afutuzumab)、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、PEG化的阿拉西马单抗(alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(alirocumab)、戊妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿马昔单抗(amatuximab)、AMG228、AMG820、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、安替单抗瑞伐坦(anetumab ravtansine)、阿尼弗洛姆单抗(anifrolumab)、安鲁单抗(anrukinzumab)、APN301、APN311、阿泊珠单抗(apolizumab)、APX003/SIM-BD0801(贝伐单抗)(APX003/SIM-BD0801(sevacizumab))、APX005M、阿西莫单抗(arcitumomab)、ARX788、阿斯库昔单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、ASG-15ME、阿特珠单抗(atezolizumab)、安妥明单抗(atinumab)、ATL101、阿特利单抗(也称为托珠单抗)(atlizumab(also referred toas tocilizumab))、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维拉姆单抗(Avelumab)、B-701、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、BAY1129980、BAY1187982、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝格洛姆单抗(begelomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝拉珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)、倍他卢汀单抗(177Lu-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸特托单抗)(Betalutin(177Lu-tetraxetan-tetulomab))、贝伐单抗(bevacizumab)、BEVZ92(贝伐单抗生物仿制药)(BEVZ92(bevacizumab biosimilar))、贝佐洛单抗(bezlotoxumab)、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、比西单抗(biciromab)、双马单抗(bimagrumab)、贝美珠单抗(bimekizumab)、莫比瓦妥单抗(bivatuzumab mertansine)、BIW-8962、博纳吐单抗(blinatumomab)、布洛唑单抗(blosozumab)、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、博科齐单抗(bococizumab)、维本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、布雷瓦雷克斯单抗(BrevaRex)、布里亚明单抗(briakinumab)、溴达拉单抗(brodalumab)、溴化丙单抗(brolucizumab)、支舒巴单抗(brontictuzumab)、C2-2b-2b、康纳单抗(canakinumab)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、坎妥单抗瑞伐坦(cantuzumab ravtansine)、卡普利单抗(caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽偶联物(capromab pendetide)、卡伦单抗(carlumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CBR96-阿霉素免疫偶联物(CBR96-doxorubicin immunoconjugate)、CBT124(贝伐单抗)(CBT124(bevacizumab))、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠单抗(cedelizumab)、PEG化的塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、伯格西他土珠单抗(citatuzumabbogatox)、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、克伐他单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物(clivatuzumab tetraxetan)、CM-24、钴妥珠单抗(codrituzumab)、考土昔单抗-DM4偶联物(coltuximab ravtansine)、康妥单抗(conatumumab)、康昔单抗(concizumab)、科塔拉(碘I-131地洛妥单抗生物素)(Cotara(iodine I-131derlotuximab biotin))、cR6261、克伦单抗(crenezumab)、DA-3111(曲妥珠单抗生物仿制药)(DA-3111(trastuzumabbiosimilar))、达塞珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达妥珠单抗(dalotuzumab)、PEG化的达匹罗单抗(dapirolizumab pegol)、达雷木单抗(daratumumab)、达雷木单抗(商品名为Enhanze)(达雷木单抗)(Daratumumab Enhanze(daratumumab))、达介素(Darleukin)、癸曲单抗(dectrekumab)、地昔单抗(demcizumab)、丹因珠单抗-MMAF偶联物(denintuzumab mafodotin)、地诺单抗(denosumab)、达妥昔单抗(Depatuxizumab)、达妥昔单抗-MMAF偶联物(Depatuxizumab mafodotin)、地洛昔单抗-生物素(derlotuximabbiotin)、地莫单抗(detumomab)、DI-B4、丁妥昔单抗(dinutuximab)、地利达莫单抗(diridavumab)、DKN-01、DMOT4039A、阿托度单抗(dorlimomab aritox)、屈西他单抗(drozitumab)、DS-1123、DS-8895、杜利他单抗(duligotumab)、杜普单抗(dupilumab)、杜伐单抗(durvalumab)、杜昔单抗(dusigitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃巴单抗(edobacomab)、依屈洛单抗(edrecolomab)、依法珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、埃尔德单抗(eldelumab)、埃格曼图姆单抗(elgemtumab)、伊洛珠单抗(elotuzumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、艾马珠单抗(emactuzumab)、依米妥珠单抗(emibetuzumab)、恩伐珠单抗(enavatuzumab)、伊凡珠单抗-维多汀偶联物(enfortumab vedotin)、PEG化恩莫单抗(enlimomab pegol)、恩比利珠单抗(enoblituzumab)、依诺珠单抗(enokizumab)、依诺替单抗(enoticumab)、恩师妥昔单抗(ensituximab)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、依他珠单抗(etaracizumab)、依曲利珠单抗(etrolizumab)、依伐单抗(evinacumab)、依福单抗(evolocumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、法鲁珠单抗(farletuzumab)、法辛单抗(fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(felvizumab)、费扎尼单抗(fezakinumab)、FF-21101、FGFR2抗体-药物偶联物(FGFR2Antibody-Drug Conjugate)、菲伯免疫蛋白(Fibromun)、非卡妥珠单抗(ficlatuzumab)、菲妥木单抗(figitumumab)、福利木单抗(firivumab)、法兰妥单抗(flanvotumab)、福利替单抗(fletikumab)、芬特妥珠单抗(fontolizumab)、福拉木单抗(foralumab)、福韦单抗(foravirumab)、FPA144、去甲美马单抗(fresolimumab)、FS102、富拉单抗(fulranumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、加利昔单抗(galiximab)、甘露单抗(ganitumab)、冈特莫单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)、格图单抗-奥佐米星偶联物(gemtuzumab ozogamicin)、吉利单抗(Gerilimzumab)、格伐克单抗(gevokizumab)、吉妥昔单抗(girentuximab)、维格列巴单抗(glembatumumab vedotin)、GNR-006、GNR-011、哥利木单抗(golimumab)、高密昔单抗(gomiliximab)、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、古塞尔库姆单抗(guselkumab)、Hu14.18K322A单抗、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、伊巴珠单抗(ibalizumab)、伊立莫单抗替西坦偶联物(ibritumomab tiuxetan)、伊鲁库单抗(icrucumab)、依达鲁单抗(idarucizumab)、IGN002、IGN523、伊戈伏单抗(igovomab)、IMAB362、IMAB362(克洛昔单抗)(IMAB362(claudiximab))、伊马单抗(imalumab)、IMC-CS4、IMC-D11、英西单抗(imciromab)、伊马曲单抗(imgatuzumab)、IMGN529、IMMU-102(钇-90-依普鲁单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物)(IMMU-102(yttrium Y-90epratuzumab tetraxetan))、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗抗体(ImmuTuneIMP701Antagonist Antibody)、INCAGN1876、依克拉单抗(inclacumab)、INCSHR1210、吲妥昔单抗瑞伐坦(indatuximab ravtansine)、维因度单抗(indusatumab vedotin)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、奥妥珠格图单抗-奥佐米星偶联物偶联物(inotuzumab ozogamicin)、英特单抗(intetumumab)、依帕非赛(Ipafricept)、IPH4102、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊拉单抗(iratumumab)、伊沙昔单抗(isatuximab)、异妥拉明单抗(Istiratumab)、伊托珠单抗(itolizumab)、衣克珠单抗(ixekizumab)、JNJ-56022473、JNJ-61610588、克利昔单抗(keliximab)、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉托唑单抗(Labetuzumab)、拉托唑单抗-格维他偶联物(Labetuzumab Govitecan)、LAG525、兰布利单抗(lambrolizumab)、拉帕单抗(lampalizumab)、L-DOS47、利勃珠单抗(lebrikizumab)、利马索单抗(lemalesomab)、仑齐鲁单抗(lenzilumab)、勒德利木单抗(lerdelimumab)、白妥昔单抗(Leukotuximab)、莱卡单抗(lexatumumab)、利比维单抗(libivirumab)、维利伐妥单抗(lifastuzumab vedotin)、利格珠单抗(ligelizumab)、利洛单抗-赛塔坦偶联物(lilotomab satetraxetan)、林妥珠单抗(lintuzumab)、利鲁单抗(lirilumab)、LKZ145、洛德昔单抗(lodelcizumab)、洛克韦单抗(lokivetmab)、莫洛伐妥单抗(lorvotuzumabmertansine)、卢卡珠单抗(lucatumumab)、PEG化的卢利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁米昔单抗(lumiliximab)、鲁曲单抗(lumretuzumab)、LY3164530、马塔单抗(mapatumumab)、马妥昔单抗(margetuximab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥单抗(matuzumab)、马维里单抗(mavrilimumab)、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551(吲哚单抗)(MEDI-551(inebilizumab))、MEDI-565、MEDI6469、美泊利单抗(mepolizumab)、迈他珠单抗(metelimumab)、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉珠单抗(milatuzumab)、米拉珠单抗-SN-38(Milatuzumab-SN-38)、明妥莫单抗(minretumomab)、米维妥昔单抗-索拉素偶联物(mirvetuximab soravtansine)、米托单抗(mitumomab)、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、莫加利单抗(mogamulizumab)、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫洛莫单抗(morolimumab)、莫他珠单抗(motavizumab)、莫昔单抗-帕多毒素偶联物(moxetumomab pasudotox)、穆罗莫纳-CD3(muromonab-CD3)、塔非那托克-塔芬毒素偶联物(nacolomab tafenatox)、纳霉单抗(namilumab)、萘妥莫单抗-衣塔芬毒素偶联物(naptumomab estafenatox)、纳妥单抗(narnatumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奈巴库单抗(nebacumab)、奈米单抗(necitumumab)、奈莫珠单抗(nemolizumab)、奈利莫单抗(nerelimomab)、奈西伐单抗(nesvacumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼沃单抗(nivolumab)、巯诺莫单抗-美培坦偶联物(nofetumomab merpentan)、10-Nov、奥比妥昔单抗(obiltoxaximab)、奥匹妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡鲁单抗(ocaratuzumab)、奥克里昔单抗(ocrelizumab)、奥杜莫单抗(odulimomab)、阿法单抗(ofatumumab)、奥拉他单抗(olaratumab)、奥昔单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、OMP-131R10、OMP-305B83、阿那妥单抗(onartuzumab)、恩妥昔单抗(ontuxizumab)、阿昔单抗(opicinumab)、阿曲单抗-莫那毒素偶联物(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥替单抗(orticumab)、奥立昔单抗(otelixizumab)、奥特鲁单抗(otlertuzumab)、OX002/MEN1309、奥索单抗(oxelumab)、奥扎尼单抗(ozanezumab)、奥索利单抗(ozoralizumab)、帕吉巴昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、潘科曼单抗(pankomab)、潘科曼单抗-GEX(PankoMab-GEX)、泛巴单抗(panobacumab)、帕撒单抗(parsatuzumab)、帕昔单抗(pascolizumab)、帕索妥昔单抗(pasotuxizumab)、帕替利单抗(pateclizumab)、帕特利单抗(patritumab)、PAT-SC1、PAT-SM6、彭布利单抗(pembrolizumab)、培马单抗(pemtumomab)、哌拉单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培昔单抗(pexelizumab)、PF-05082566(乌托单抗)(PF-05082566(utomilumab))、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、匹利珠单抗(pidilizumab)、维匹那妥单抗(pinatuzumab vedotin)、品妥莫单抗(pintumomab)、普鲁单抗(placulumab)、维波达单抗(polatuzumab vedotin)、庞尼泽单抗(ponezumab)、普利昔单抗(priliximab)、普罗昔单抗(pritoxaximab)、普鲁米单抗(pritumumab)、PRO 140、普罗信单抗(Proxinium)、PSMA ADC、奎珠单抗(quilizumab)、拉托单抗(racotumomab)、拉德鲁单抗(radretumab)、拉维夫单抗(rafivirumab)、拉潘昔单抗(ralpancizumab)、拉莫鲁单抗(ramucirumab)、雷尼珠单抗(ranibizumab)、拉克昔单抗(raxibacumab)、瑞伐珠单抗(refanezumab)、瑞伐单抗(regavirumab)、REGN1400、REGN2810/SAR439684、利昔单抗(reslizumab)、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利妥珠单抗(rilotumumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、RM-1929、RO7009789、罗巴单抗(robatumumab)、罗乐单抗(roledumab)、罗莫索单抗(romosozumab)、罗他珠单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、鲁普单抗(ruplizumab)、妥珠单抗-格维他偶联物(sacituzumab govitecan)、沙马利单抗(samalizumab)、SAR408701、SAR566658、沙利鲁单抗(sarilumab)、SAT012、沙妥单抗-喷地肽偶联物(satumomabpendetide)、SCT200、SCT400、SEA-CD40、塞库单抗(secukinumab)、塞巴坦单抗(seribantumab)、塞妥昔单抗(setoxaximab)、赛韦单抗(sevirumab)、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西布曲单抗(sibrotuzumab)、西伐单抗(sifalimumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、西妥珠单抗(simtuzumab)、西普利单抗(siplizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、维索菲妥单抗(sofituzumab vedotin)、索冷珠单抗(solanezumab)、索利单抗(solitomab)、索普昔单抗(sonepcizumab)、索妥单抗(sontuzumab)、丝塔单抗(stamulumab)、舒乐单抗(sulesomab)、苏维珠单抗(suvizumab)、SYD985、SYM004(伏妥昔单抗和莫妥昔单抗)(SYM004(futuximab and modotuximab))、Sym015、TAB08、他巴单抗(tabalumab)、塔卡珠单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物(tacatuzumab tetraxetan)、塔多珠单抗(tadocizumab)、塔利单抗(talizumab)、坦纳单抗(tanezumab)、塔尼单抗(Tanibirumab)、普利妥单抗-帕普毒素偶联物(taplitumomab paptox)、塔雷克斯顿单抗(tarextumab)、TB-403、替非珠单抗(tefibazumab)、特勒金单抗(Teleukin)、阿替莫单抗-阿利毒素偶联物(telimomabaritox)、替纳单抗(tenatumomab)、替尼昔单抗(teneliximab)、替普珠单抗(teplizumab)、四丙珠单抗(teprotumumab)、司他洛单抗(tesidolumab)、替妥洛明单抗(tetulomab)、TG-1303、TGN1412、钍-227-依普鲁单抗偶联物(Thorium-227-Epratuzumab Conjugate)、替昔单抗(ticilimumab)、替加妥单抗(tigatuzumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、维蒂索单抗(Tisotumab vedotin)、TNX-650、塔西单抗(tocilizumab)、托拉珠单抗(toralizumab)、托沙单抗(tosatoxumab)、托西单抗(tositumomab)、托维单抗(tovetumab)、曲洛单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗-厄塔毒素偶联物(trastuzumabemtansine)、TRBS07、TRC105、曲利单抗(tregalizumab)、曲美单抗(tremelimumab)、特伐单抗(trevogrumab)、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、图卡珠单抗-西莫白介素偶联物(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(tuvirumab)、U3-1565、U3-1784、乌布妥昔单抗(ublituximab)、优隆单抗(ulocuplumab)、乌洛单抗(urelumab)、乌索单抗(urtoxazumab)、乌司他单抗(ustekinumab)、伐他昔单抗-塔利素偶联物(Vadastuximab Talirine)、维凡多鲁单抗(vandortuzumab vedotin)、范蒂姆单抗(vantictumab)、维库珠单抗(vanucizumab)、伐昔单抗(vapaliximab)、伐利单抗(varlilumab)、伐他珠单抗(vatelizumab)、VB6-845、维多珠单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维森单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏罗昔单抗(volociximab)、沃塞妥单抗-马伏毒素偶联物(vorsetuzumab mafodotin)、伏妥单抗(votumumab)、YYB-101、扎鲁单抗(zalutumumab)、扎诺米单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗(zatuximab)、齐拉明单抗(ziralimumab)、和阿佐莫单抗-阿利毒素偶联物(zolimomabaritox)。
在一些实施方式中，所述胞外区域包含多个抗原相互作用结构域，其各自表现出与相同或不同抗原的结合。
在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合于选自下组的抗原：707-AP、生物素化的分子、α-肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、亲脂素、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-ablp210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、细胞凋亡蛋白酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、路易斯Y(Lewis Y)、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/黑素-A(Melan-A)、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活素、存活素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。
在一些实施方式中，所述免疫细胞信号传导结构域包含一个主要信号传导结构域，所述主要信号传导结构域包含一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。在一些实施方式中，所述免疫细胞信号传导结构域包含一个主要信号传导结构域，所述主要信号传导结构域包含一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。在一些实施方式中，所述免疫细胞信号传导结构域包含选自下组的蛋白质的主要信号传导结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(又名ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含一个CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含CD3ζ的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含一个FcγR信号传导结构域。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含选自下组的FcγR的信号传导结构域：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含一个FcεR信号传导结构域。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含选自下组的FcεR的信号传导结构域：FcεRI和FcεRII(CD23)。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含一个FcαR信号传导结构域。在一些实施方式中，所述主要信号传导结构域包含选自下组的FcαR的信号传导结构域：FcαRI(CD89)和Fcα/μR。
在一些实施方式中，所述免疫细胞信号传导结构域包含一个共刺激结构域。在一些实施方式中，所述免疫细胞信号传导结构域包含多个共刺激结构域。在一些实施方式中，所述共刺激结构域包含以下物质的信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体或Toll配体受体。在一些实施方式中，所述共刺激结构域包含选自下组的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、树突状细胞植物血凝素-1(Dectin-1)/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、伊卡洛斯(Ikaros)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。在一些实施方式中，所述共刺激结构域可调节免疫细胞的增殖信号和/或存活信号。
在一些实施方式中，所述致动部分包含CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调控多肽、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、转录激活物样效应物相关基因调控多肽、大范围核酸酶、天然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、阿尔古蛋白，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。在一些实施方式中，所述致动部分包含与向导RNA(gRNA)形成复合物的Cas蛋白。在一些实施方式中，所述致动部分包含一个RBP，其任选地与向导RNA(gRNA)形成复合物，而所述向导RNA可与Cas蛋白形成复合物。在一些实施方式中，所述Cas蛋白基本上不具有DNA切割活性。
在一些实施方式中，所述致动部分通过对靶多核苷酸的物理阻碍或对有效抑制或增强靶核酸的基因表达的额外因子的募集，来调节基因的表达。在一些实施方式中，所述致动部分包含有效增加靶多核苷酸的基因表达的转录激活因子。在一些实施方式中，所述致动部分包含有效降低靶多核苷酸的基因表达的转录抑制因子。
在一些实施方式中，所述切割识别位点两侧是免疫细胞信号传导结构域和致动部分。在一些实施方式中，所述切割识别位点包含被蛋白酶识别的切割识别序列。在一些实施方式中，所述切割识别位点包含多个切割识别序列，每个切割识别序列被相同或不同的蛋白酶识别。在一些实施方式中，所述切割识别序列被选自下组的蛋白酶识别：消化肽酶、氨基肽酶、安克洛酶、血管紧张素转换酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、钙蛋白酶I、钙蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、细胞凋亡蛋白酶1、细胞凋亡蛋白酶2、细胞凋亡蛋白酶3、细胞凋亡蛋白酶4、细胞凋亡蛋白酶5、细胞凋亡蛋白酶6、细胞凋亡蛋白酶7、细胞凋亡蛋白酶8、细胞凋亡蛋白酶9、细胞凋亡蛋白酶10、细胞凋亡蛋白酶11、细胞凋亡蛋白酶12、细胞凋亡蛋白酶13、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、糜酶、糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体C1r、补体C1s、补体因子D、补体因子I、黄瓜素、二肽基肽酶IV、弹性蛋白酶(白细胞)、弹性蛋白酶(胰腺的)、蛋白内切酶Arg-C、蛋白内切酶Asp-N、蛋白内切酶Glu-C、蛋白内切酶Lys-C、肠激酶、因子Xa、无花果蛋白酶、弗林蛋白酶、颗粒酶A、颗粒酶B、HIV蛋白酶、IG酶(IGase)、激肽释放酶组织、亮氨酸氨肽酶(通用)、亮氨酸氨肽酶(胞质)、亮氨酸氨肽酶(微粒体)、基质金属蛋白酶、甲硫氨酸氨肽酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶，脯氨酸酶，链霉蛋白酶E、前列腺特异性抗原、来自灰色链霉菌的碱性蛋白酶、来自曲霉菌的蛋白酶、来自斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、来自酱油曲霉(Aspergillus sojae)的蛋白酶、蛋白酶(地衣芽孢杆菌)(碱性的或碱性蛋白酶)、来自多粘芽孢杆菌的蛋白酶、来自芽孢杆菌属的蛋白酶、来自根霉属的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶体、来自米曲霉的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨基肽酶、肾素、肾素、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、热粘蛋白、凝血酶、组织纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、类胰蛋白酶(tryptase)和尿激酶。在一些实施方式中，所述嵌合跨膜受体多肽还包含至少一种靶向肽，其指导受体转运至细胞的特定区域。在一些实施方式中，所述靶向肽指导受体转运至细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、过氧化物酶体或质膜。在一些实施方式中，所述靶向肽包含核输出信号(NES)。在一些实施方式中，所述靶向肽包含质膜靶向肽。
在一些实施方式中，所述靶向肽与致动部分连接。在一些实施方式中，所述靶向肽包含一个核定位信号(NLS)。在一些实施方式中，所述包含NLS的靶向肽连接至致动部分的N端或C端。在一些实施方式中，所述包含与致动部分连接的NLS的靶向肽，在致动部分通过在切割识别位点处切割并从GMP中释放后，指导致动部分转运至细胞的核。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。
附图的简要说明
本发明的新特征在所附的权利要求书中有具体阐述。通过参考以下详细描述，可获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施例以及附图，其中：
图1显示了一个示例性的嵌合跨膜受体多肽，它包含一个抗原相互作用结构域、一个免疫细胞信号传导结构域和基因调节多肽(GMP)。
图2显示了一个示例性嵌合跨膜受体多肽，它包含至少一个共刺激结构域。
图3A显示了一个示例性的嵌合受体多肽，它包含致动部分，所述致动部分包含RNA结合蛋白，其任选地与向导核酸(例如，sgRNA)形成复合物。
图3B显示了一个包含嵌合跨膜受体多肽的示例性系统，所述嵌合跨膜受体多肽包含一个抗原相互作用结构域、一个免疫细胞信号传导结构域和基因调节多肽(GMP)以及包含切割部分的嵌合衔接子多肽。
图4A-D示意性地说明了在一个包含经历磷酸化的受体的系统中，致动部分从GMP的释放；图4E-H示意性地说明了在一个包含经历构象变化的受体的系统中，致动部分从GMP的释放
图5显示了包含至少一个靶序列的示例性嵌合跨膜受体多肽。
图6A显示了示例性嵌合衔接子多肽，它包含受体结合部分和基因调节多肽(GMP)的。
图6B显示了示例性的嵌合衔接子多肽，它包含致动部分，所述致动部分包含RNA结合蛋白，其任选地与向导核酸(例如，sgRNA)形成复合物。
图7显示了一个示例性的系统，它包含嵌合衔接子多肽的以及包含有切割部分的嵌合跨膜受体多肽，所述嵌合衔接子多肽包含受体结合部分和基因调节多肽(GMP)。
图8A-D示意性地说明了在一个包含经历磷酸化的受体的系统中，致动部分从GMP的释放；图8E-H示意性地说明了在一个包含经历构象变化的受体的系统中，致动部分从GMP的释放
图9显示了一个示例性的系统，它包含嵌合衔接子多肽、包含有切割部分的第二衔接子多肽和嵌合跨膜受体多肽，其中所述嵌合衔接子多肽包含一个受体结合部分和基因调节多肽(GMP)。
图10A-D示意性地说明了在一个包含至少两个衔接子多肽和经历了磷酸化的受体的系统中，致动部分从GMP的释放；图10E-H示意性地说明了在一个包含至少两种衔接子多肽和一个可变构型的受体的系统中，致动部分从GMP的释放。
图11显示了包含至少一个靶序列的示例性嵌合衔接子多肽。
图12A-D示意性地说明了一个系统，其中切割识别位点包含一段内含肽序列；图12E-H显示了另一种系统设置方式，其中切割识别位点包含一段内含肽序列。
图13A-D示意性地说明了一个的系统，其中切割识别位点包含二硫键；图13E-H显示了另一种系统设置方式，其中切割识别位点包含二硫键。
图14说明了本文公开的系统用于抑制淋巴细胞中的IL-1。
图15说明了本文公开的系统用于抑制淋巴细胞中的PD-1。
图16说明了使用本文公开的系统，在免疫细胞中表达来自外源质粒的第二嵌合受体。
图17显示了根据Makarova，K.S.等人，“更新的CRISPR-Cas系统的进化分类，”NatRev Microbiol(2015)13：722-736中的图2改编的示意图，它提供了CRISPR-Cas系统亚型的基因组基因座的体系结构。
图18A-D示意性地说明了在包含至少两个衔接子多肽的系统中，致动部分从GMP的释放。
图19显示了一个系统的示意图，其中GMP形成第一嵌合跨膜受体多肽的一部分，而切割部分形成第二嵌合跨膜受体多肽的一部分。
图20显示了通过蛋白质印迹分析，在蛋白酶存在情况下，将dCas9-KRAB结构域从嵌合受体切割下来。
图21显示了通过蛋白质印迹分析，在衔接蛋白酶存在的情况下，将dCas9-KRAB结构域从嵌合受体切割下来。
发明详述
除非另有说明，否则本文公开的一些方法的实践采用在本领域技术范围内的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术。参见例如Sambrook和Green，《分子克隆：实验室手册》，第4版(2012)；《分子生物学最新方法丛书》(F.M.Ausubel等人编写)；《酶学方法丛书》(学术出版社)；《PCR2：实用方法》(M.J.麦克弗森，B.D.Hames和G.R.泰勒编写(1995))，Harlow和Lane编写(1988)；《抗体：实验室手册》，以及《动物细胞培养：基本技术和专业应用手册》，第6版(R.I.Freshney编写(2010))。
如说明书和权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数形式。例如，术语“一嵌合跨膜受体多肽”包括多个嵌合跨膜受体多肽。
术语“约”或“近似”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或多于1个标准偏差内。或者，“约”可以表示给定值的高达20％，高达10％，高达5％或高达1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以指数值的一个数量级以内，优选在5倍以内，更优选在2倍以内。如果在申请和权利要求书中描述了特定的值，除非另有说明，否则应当假定术语“约”在特定值的可接受的误差范围内。
如本文所用，“细胞”通常可以指生物细胞。细胞可以是活体的基本结构、功能和/或生物单元。细胞可以来源于具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性实例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物的细胞、原生动物的细胞、来自植物的细胞(例如来自农作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、黄玉米、小麦、种子、西红柿、大米、木薯、甘蔗、南瓜、干草、马铃薯、棉花、大麻、烟草、开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类植物、石松类植物、角苔类植物、苔类植物、苔藓植物)、海藻细胞(例如布朗葡萄藻、莱茵衣藻、微拟球藻、蛋白核小球藻、小叶马尾藻或其它)、海藻(如海带)、真菌细胞(例如，酵母细胞、蘑菇的细胞)、动物细胞、无脊椎动物的细胞(例如果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)，脊椎动物的细胞(例如鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物)，哺乳动物的细胞(例如猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人类灵长动物、人类等)等。有些情况下，细胞可以不是来源于天然生物体(例如细胞可以是合成的，有时称为人造细胞)。
如本文所用，术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或其片段。作为例子，抗原可以是一配体，该配体可以被选择性结合剂例如受体所结合。作为另一个例子，抗原可以是一抗原性分子，它可以被选择性结合剂例如免疫蛋白(例如抗体)所结合。抗原还可以指一分子或其片段，它能够在动物中使用以产生能够结合于该抗原的抗体。
如本文所用，术语“抗体”是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。术语抗体包括抗体(例如单克隆和多克隆抗体)以及其衍生物、变体和片段。抗体包括但不限于：不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(如IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig's)。其衍生物、变体或片段可以指一功能性衍生物或片段，它保留相应抗体的(例如完整的和/或部分的)结合特异性。抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、微型抗体、双抗体(diabodies)和单域抗体(“sdAb”或“纳米抗体”或“骆驼抗体”)。术语抗体包括：已被优化、工程化或化学偶连的抗体和抗体的抗原结合片段。已被优化的抗体的实例包括亲和力成熟的抗体。已被工程改造的抗体的实例包括Fc优化的抗体(例如，在片段可结晶区域中优化的抗体)和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
如本文所用，术语“Fc受体”或“FcR”通常指可结合于抗体的Fc区的受体或其任何衍生物、变体或片段。在某些实施方式中，FcR结合于IgG抗体(γ受体，FcγR)，并包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、和FcγRIII(CD16)亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似氨基酸序列，但它们主要在其胞质结构域有所差异。术语“FcR”还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn。
如本文所用，术语“核苷酸”通常指碱基-糖-磷酸盐复合物。核苷酸可以包括合成的核苷酸。核苷酸可以包括合成的核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷酸，如腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)，以及脱氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP，或它们的衍生物。这些衍生物可以包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及在含有它们的核酸分子上赋予核酸酶抗性的核苷酸衍生物。本文使用的术语核苷酸，可以指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTPs)及其衍生物。二脱氧核糖核苷三磷酸的代表性实例可以包括但不限于：ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的或通过公知技术被可检测地标记的。标记也可以通过量子点进行。可检测标记可以包括：例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可以包括但不限于：荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2'7'-二甲氧基-4'5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N，N，N'，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)、级联蓝、俄勒冈绿、德克萨斯红、花青素和5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光标记的核苷酸的具体实例可以包括：可从加州福斯特城的珀金埃尔默公司购得的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP和[dROX]ddTTP；可从伊尔阿灵顿高地的阿美沙姆公司购得的FluoroLink牌号的脱氧核苷酸、FluoroLink Cy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink X-dCTP、FluoroLinkCy3-dUTP和FluoroLink Cy5-dUTP；可从印第安纳州印第安纳波利斯的勃林格曼曼海姆公司购得的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP和荧光素-15-2′-dATP；以及可从俄勒冈州尤金的分子探针公司购得的染色体标记核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、级联蓝-7-UTP、级联蓝-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈绿488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基若丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、德克萨斯红-5-UTP德克萨斯红-5-dUTP和德克萨斯红-12-dUTP。核苷酸也可以通过化学修饰来示踪或标记。化学修饰的单核苷酸可以是生物素-dNTP。生物素化的dNTP的一些非限制性实例可以包括：生物素-dATP(例如生物素-N6-ddATP、生物素-14-dATP)、生物素-dCTP(例如生物素-11-dCTP、生物素-14-dCTP)和生物素-dUTP(例如生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP、生物素-20-dUTP)。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，指任何长度的聚合形式的核苷酸，可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或其类似物，可以是单链、双链或者多股的形式。多核苷酸对于细胞可以是外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。多核苷酸可以包含一种或多种类似物(例如改变的主链、糖或核碱基)。如果存在的话，可以在组装聚合物之前或之后进行对核苷酸结构的修饰。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异核酸、吗啉、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、3'-脱氧腺苷、7-脱氮-GTP、荧光团(例如与糖基相连的罗丹明或荧光素)、含有巯基的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫尿核苷、假尿素、二氢尿苷、辫苷(queuosine)和肌苷。多核苷酸的非限制性实例包括：编码性或非编码性的基因或基因片段、由连锁分析定义的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)的无细胞多核苷酸、核酸探针和引物。核苷酸序列可以被非核苷酸组分打断。
如本文所用，术语“基因”指核酸(例如DNA，如基因组DNA和cDNA)及其相应的核苷酸序列，它们涉及编码RNA转录物。如本文所用，有关基因组DNA的术语包括插入的非编码区以及调节区，并且可以包括5'和3'末端。在一些用途中，该术语包括转录序列，包括5'和3'非编码区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录区域将包含编码多肽的“开放读码框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如“开放读码框”或“编码区”)。在一些情况下，基因不编码多肽，例如，核糖体RNA基因(rRNA)和转运RNA(tRNA)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录的序列，而且还包括非转录区，其包括上游和下游的调控区，增强子和启动子。基因可以指在生物基因组的天然位置上的“内源基因”或天然基因。基因可以指“外源基因”或非天然基因。非天然基因可以指通常不在宿主生物体中发现但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。非天然基因也可以指不在生物基因组中天然位置的基因。非天然基因还可以指包含突变、插入和/或缺失(例如，非天然序列)的天然存在的核酸或多肽序列。
如本文所用，术语“靶多核苷酸”和“靶核酸”是指由本发明的致动部分靶向的核酸或多核苷酸。靶多核苷酸可以是DNA(例如内源性或外源性)。DNA可以指用于产生mRNA转录物的模板和/或用于调控基于DNA模板的mRNA转录的各种调控区。靶多核苷酸可以是更大多核苷酸的一部分，例如染色体或染色体的一个区域。靶多核苷酸可以指染色体外的序列(例如附加序列、微环序列、线粒体序列、叶绿体序列等)或染色体外序列的一个区域。靶多核苷酸可以是RNA。RNA可以是例如可用作编码蛋白质的模板的mRNA。包含RNA的靶多核苷酸可以包括调节来自mRNA模板的蛋白质翻译的各种调控区。靶多核苷酸可编码基因产物(例如，用于编码RNA转录物的DNA或用于编码蛋白质产物的RNA)，或包含调控基因产物表达的调控序列。通常，术语“靶序列”是指靶核酸单链上的核酸序列。靶序列可以是基因、调控序列、基因组DNA、包括cfDNA和/或cfRNA的无细胞核酸、cDNA、融合基因，和包括mRNA、miRNA、rRNA等的RNA中的一部分序列。靶多核苷酸在被致动部分靶向时，可导致改变的基因表达和/或活性。靶多核苷酸在被致动部分靶向时，可导致经编辑过的核酸序列。靶核酸可以包含通过单核苷酸取代从而与核酸样品中的任何其他序列不相关的核酸序列。靶核酸可包含一核酸序列，其通过2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸取代从而与核酸样品中的任何其它序列不相关。在一些实施方式中，取代可以不发生在距离靶核酸的5'末端的5、10、15、20、25、30或35个核苷酸内。在一些实施方式中，取代可以不发生在距离靶核酸的3'末端的5、10、15、20、25、30、35个核苷酸内。
术语“表达”是指从DNA模板转录多核苷酸(例如转录成mRNA或其他RNA转录物)的一个或多个过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中的mRNA剪接。关于表达的“上调”通常指，相对于其野生型中表达水平，多核苷酸(例如RNA，如mRNA)和/或多肽序列的表达水平增加，而“下调“通常是指，相对于其野生型中表达水平，多核苷酸(例如RNA，如mRNA)和/或多肽序列的表达水平降低。
如本文所用，术语“互补”、“互补物”、“互补的”和“互补性”通常指与给定序列完全互补并可杂交的序列。在某些情况下，如果与给定区域杂交的序列中的碱基序列能够与其结合体的碱基序列互补结合，例如形成A-T、A-U、G-C和G-U碱基对，则与给定核酸杂交的序列称为给定分子的“互补物”或“反向互补物”。通常，可与第二序列杂交的第一序列，与第二序列特异性或选择性杂交，使得与第二序列或第二序列组的杂交(例如在给定的一组条件下热力学更稳定，例如作为本领域通常使用的严格条件)相对于在杂交反应期间与非靶序列的杂交是优选的。典型地，可杂交序列在其各自长度的全部或一部分之间具有一定程度的序列互补性，例如25％-100％的互补性，包括至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列互补性。序列同一性，例如为了评估互补百分比的目的，可以通过任何合适的比对算法来测量，包括但不限于：尼德曼-翁施算法(参见例如www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html上可用的EMBOSS尼德比对器，可任选地使用默认设置)、BLAST算法(参见例如blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上可用的BLAST比对工具，可任选地使用默认设置)或史密斯-沃特曼算法(参见例如www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html上可用的EMBOSS沃特比对器，可任选地使用默认设置)。最佳比对可以使用选定算法的任何合适参数(包括默认参数)来评估。
互补性可以是绝对互补或基本互补/充分互补。两个核酸之间的绝对互补性意味着两个核酸可以形成双链体，其中双链体中的每个碱基通过沃森-克里克配对与互补碱基结合。基本互补/充分互补可意指一条链中的序列与相反链中的序列不是完全和/或完美的互补，但是在两条链的碱基之间发生足够的结合从而在一套杂交条件(如盐浓度和温度)下形成稳定的杂交复合物。这些条件可以通过使用序列和标准数学计算来预测杂交链的Tm或通过使用常规方法的对Tm进行经验测定来预测。
如本文所用，关于表达或活性的术语“调控”是指改变表达或活性的水平。调控可以发生在转录水平和/或翻译水平。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过肽键连接的至少两个氨基酸残基的聚合物。所述术语不意味着聚合物的特定长度，也不意味着试图暗示或区分该肽是使用重组技术、化学或者酶促合成的还是天然存在产生的。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及包含至少一种修饰的氨基酸的氨基酸聚合物。在某些情况下，聚合物可以被非氨基酸所中断。所述术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，以及具有或不具有二级和/或三级结构(例如结构域)的蛋白质。这些术语还包括：例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、氧化和任何其他操作(例如与标记组分偶联)而加以修饰的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“氨基酸残基”和“氨基酸”通常指天然和非天然氨基酸，包括但不限于：经修饰的氨基酸和氨基酸类似物。经修饰的氨基酸可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸，其经化学修饰以包括天然不存在于氨基酸上的基团或化学组分。氨基酸类似物可以指氨基酸衍生物。术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸。
当在本文中关于多肽使用时，术语“衍生物”，“变体”和“片段”是指与野生型多肽相关的多肽，例如在氨基酸序列、结构(例如二级和/或三级)、活性(例如酶活性)和/或功能方面。与野生型多肽相比，多肽的衍生物、变体和片段可以包含一个或多个氨基酸变异(例如突变、插入和缺失)、截短、修饰或组合。
如本文所用，术语“百分比(％)同一性”是指，在比对并引入缺口(如果需要)后以实现最大百分比同一性后，候选序列的氨基酸(或核酸)残基与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比(即，对于最佳比对可以在候选序列和参考序列中的一个或两个序列中引入缺口，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。为了确定百分比同一性，比对可以用本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可用的计算机软件，例如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。两条序列之间的百分比同一性，可以通过使用BLAST比对测试序列和比较序列来计算，其通过确定测试序列中与比较序列的相同位置中氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数量，并将相同氨基酸或核苷酸的数量除以比较序列中氨基酸或核苷酸的数量。
如本文所用，术语“基因调节多肽”或“GMP”是指一多肽，它包含至少一个能够调控基因的表达或活性和/或编辑核酸序列的致动部分。GMP可以包含不涉及调控基因表达的额外肽序列，例如切割识别位点、接头序列、靶向序列等。
如本文所用，术语“致动部分”是指一部分(元件)，它可调控基因的表达或活性和/或编辑一核酸序列，无论是外源的还是内源的。致动部分可以在转录水平和/或翻译水平调节基因的表达。致动部分可以在转录水平调节基因表达，例如通过调节从DNA(如染色体DNA或cDNA)产生mRNA。在一些实施方式中，致动部分招募至少一种结合特定DNA序列的转录因子，从而控制从DNA转录成mRNA的遗传信息转录速率。致动部分本身可以与DNA结合并通过物理障碍调节转录，例如防止诸如RNA聚合酶和其他相关蛋白之类的蛋白在DNA模板上组装。致动部分可以在翻译水平调节基因的表达，例如通过调节基于mRNA模板产生蛋白质。在一些实施方式中，致动部分通过影响mRNA转录物的稳定性来调节基因表达。在一些实施方式中，致动部分通过编辑一核酸序列(例如基因组的区域)来调节基因的表达。在一些实施方式中，致动部分通过编辑mRNA模板来调节基因的表达。在某些情况下，编辑核酸序列可能会改变潜在的基因表达模板。
本文所指的Cas蛋白可以是一类蛋白或多肽。Cas蛋白可以指核酸酶。Cas蛋白可以指内切核糖核酸酶。Cas蛋白可以指经任何修饰的(例如缩短的、突变的、延长的)Cas蛋白多肽序列或同源物。Cas蛋白可以进行密码子优化。Cas蛋白可以是Cas蛋白的密码子优化同源物。Cas蛋白可以是酶促失活的、部分活性的、组成型活化的、完全活化的，诱导型活化的和/或活性更高的(例如活性高于野生型的蛋白质或多肽同源物)。Cas蛋白可以是Cas9。Cas蛋白可以是Cpf1。Cas蛋白可以是C2c2。Cas蛋白(例如变体、突变、酶促失活的和/或条件性酶促失活的定点突变多肽)可以结合于靶核酸。Cas蛋白(例如变体、突变、酶促失活的和/或条件性酶促失活的内切核糖核酸酶)可以结合于靶RNA或DNA。
如本文所用，术语“crRNA”通常可以指一核酸，它具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％与野生型的示例性crRNA(例如来自化脓性链球菌的crRNA)的序列同一性和/或序列相似性。crRNA通常可以指一核酸，它具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％与野生型的示例性crRNA(例如来自化脓性链球菌的crRNA)的序列同一性和/或序列相似性。crRNA可以指修饰的形式的crRNA，它可以包含核苷酸改变(例如缺失、插入、或取代、变体、突变、或嵌合体)。crRNA可以是在一段至少6个连续核苷酸上与野生型示例性crRNA(例如来自酿脓链球菌的crRNA)序列具有至少约60％序列同一性的核酸。例如，crRNA序列可以在一段至少6个连续的核苷酸的序列上与与野生型示例性crRNA(例如来自酿脓链球菌的crRNA)序列有至少约60％相同、至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。
如本文所用，术语“tracrRNA”通常可以指一核酸，它在序列与野生型示例性tracrRNA序列(例如来自化脓性链球菌的tracrRNA)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％的序列同一性和/或序列相似性。tracrRNA可以指一核酸，它在序列与野生型示例性tracrRNA序列(例如，来自化脓性链球菌的tracrRNA)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的序列同一性和/或序列相似性的核酸。tracrRNA可以指修饰的形式的tracrRNA，它可以包含核苷酸改变(例如缺失、插入、或取代、变体、突变、或嵌合体)。tracrRNA可以指在一段至少6个连续核苷酸的序列上可以与野生型示例性tracrRNA(例如，来自化脓性链球菌的tracrRNA)序列至少约60％相同的核酸。例如，tracrRNA序列在一段至少6个连续的核苷酸序列上与野生型示例性tracrRNA(例如，来自化脓性链球菌的tracrRNA)序列至少约60％相同、至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或至少约100％相同。
如本文所用，“向导核酸”可指可以与另一核酸杂交的核酸。向导核酸可以是RNA。向导核酸可以是DNA。可以将向导核酸设计为位点特异性地与核酸序列结合。待靶向的核酸(即靶核酸)可以包含核苷酸。向导核酸可以包含核苷酸。靶核酸的一部分可以与向导核酸的一部分互补。双链中与向导核酸互补并杂交的靶多核苷酸链可称为互补链。与互补链互补的双链靶多核苷酸链，因此可能与向导核酸不互补，可称为非互补链。向导核酸可以包含一条多核苷酸链并且可以被称为“单向导核酸”。向导核酸可以包含两条多核苷酸链并且可以被称为“双向导核酸”。如果没有另外说明，术语“向导核酸”可以是包括性的，指的是单向导核酸和双向导核酸。
向导核酸可以包含可称为“核酸靶向区段”或“核酸靶向序列”的区段。核酸靶向区段可以包含可称为“蛋白质结合区段”或“蛋白质结合序列”或“Cas蛋白结合区段”的子区段。
如本文所用，对于肽而言，术语“切割识别位点”是指肽位点，在该肽位点可以进行化学键(例如肽键或二硫键)的切割。切割可以通过各种方法实现。肽键的切割可以被促进，通过例如酶如蛋白酶或通过蛋白质剪接(例如内含子)来进行。二硫键的切割可以通过例如酶，如氧化还原酶来促进。
如本文所用，术语“靶向序列”是指一段核苷酸序列和相应的氨基酸序列，其编码靶向多肽，所述靶向多肽介导蛋白质定位(或保留)至某个亚细胞位置，例如质膜或给定的细胞器膜、细胞核、细胞质、线粒体、内质网(ER)、高尔基体、叶绿体、质外体、过氧化物酶体或其他细胞器。例如，靶向序列可以利用核定位信号(NLS)将蛋白质(例如，受体多肽或衔接头多肽)定位至细胞核；利用核输出信号(NES)将蛋白质定位至细胞的细胞核外，例如定位到细胞质外；利用线粒体靶向信号将蛋白质定位至线粒体；利用ER保留信号将蛋白质定位至内质网(ER)；利用过氧化物酶体靶向信号将蛋白质定位至过氧化物酶体；利用膜定位信号将蛋白质定位至质膜；或其组合。
如本文所用，“融合(物)”可以指包含一个或多个非天然序列(例如部分)的蛋白质和/或核酸。融合物可以包含一个或多个相同的非天然序列。融合物可以包含一个或多个不同的非天然序列。融合物可以是嵌合体。融合物可以包含核酸亲和标签。融合可以包含条形码序列。融合物可以包含肽亲和标签。融合物可以提供定点多肽的亚细胞定位(例如用于靶向细胞核的核定位信号(NLS)、用于靶向线粒体的线粒体定位信号、用于靶向叶绿体的叶绿体定位信号、内质网(ER)保留信号等)。融合物可提供可用于追踪或纯化的非天然序列(例如亲和标签)。融合物可以是小分子，如生物素或染料如Alexa荧光染料、青色素3染料、青色素5染料。
融合物可以指任何具有功能效应的蛋白质。例如，融合蛋白可包含甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光裂合酶活性或糖基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、豆蔻酰化活性、重构活性、蛋白酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、合成酶活性、合成酶活性、或脱豆蔻酰化(demyristoylation)活性。效应蛋白可以修饰基因组座。融合蛋白可以是Cas蛋白中的融合。融合蛋白可以是Cas蛋白中的非天然序列。
如本文所用，“非天然”可以指在天然核酸或蛋白质中未发现的核酸或多肽序列。非天然可以指亲和标签。非天然可以指融合物。非天然的可以指包含突变、插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列。非天然序列可表现出和/或编码出一活性，该活性可以是与非天然序列融合的核酸和/或多肽序列也表现出的活性(例如酶活性、甲基转移酶活性、乙酰转移酶活性、激酶活性、泛素化活性等)。非天然核酸或多肽序列可通过基因工程连接至天然存在的核酸或多肽序列(或其变体)，以产生编码嵌合核酸和/或多肽的嵌合核酸和/或多肽序列。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，指脊椎动物，优选哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于：鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物。也包括体内或体外培养获得的生物实体的组织、细胞及其子代。
如本文所用，术语“治疗”和“治疗”是指用于获得有益或预期结果的方法，包括但不限于治疗效果和/或预防效果。例如，治疗可以包括施用本文公开的系统或细胞群。治疗效果是指治疗中一种或多种疾病、病症或症状的任何治疗相关的改善或效果。为了预防效果，可以将组合物施用于有患特定疾病、病症或症状的风险的受试者或表现出疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使疾病、病状或症状可能还没有表现出来。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指组合物的量，例如包含免疫细胞如淋巴细胞(例如T淋巴细胞和/或NK细胞)的组合物，其包含本发明的系统，足以在施用于有需要的受试者后产生期望的活性。在本发明的上下文中，术语“治疗有效量的”是指组合物的数量足以延迟表现、阻止进展、解除或缓解由本发明方法治疗的病症的至少一种症状。
在一方面，本公开提供了用于条件性调节免疫细胞的系统。一个示例性系统包含(a)嵌合跨膜受体多肽，其包含(i)胞外区，所述胞外区包含可结合于抗原的抗原相互作用域和(ii)胞内区，所述胞内区包含免疫细胞信号传导结构域，(b)嵌合衔接子多肽，其包含一个受体结合部分，当受体多肽在结合于抗原后发生修饰时，所述受体结合部分结合于嵌合跨膜受体多肽，(c)基因调节多肽(GMP)，它包含一个与切割识别位点连接的致动部分，和(d)切割部分，仅当切割部分靠近切割识别位点时，所述切割部分切割所述切割识别位点，从而将致动部分从GMP释放出，其中(i)GMP形成受体的胞内区域的一部分，并且切割部分形成衔接子多肽的一部分，(ii)GMP形成衔接子多肽的一部分，并且切割部分形成受体的胞内区域的一部分，或(iii)切割部分与第二衔接子多肽形成复合物，所述第二衔接子多肽与嵌合跨膜受体多肽结合以响应受体的修饰，并且GMP形成嵌合衔接子多肽的一部分。
本系统的嵌合跨膜受体多肽、嵌合衔接子多肽、基因调节多肽(GMP)和切割部分，可以以各种构型排列。在示例性构型中，GMP作为嵌合跨膜受体多肽的胞内区域的一部分，并且切割部分作为嵌合衔接子多肽的一部分。示例性构型的嵌合跨膜受体多肽可以包含(a)胞外区，其包含可结合于抗原的抗原相互作用结构域；和(b)胞内区，其包含(i)免疫细胞信号传导结构域；和(ii)与所述免疫细胞信号传导结构域连接的基因调节多肽(GMP)，其中所述GMP包含与切割识别位点连接的致动部分；其中仅在抗原结合于包含抗原相互作用结构域的嵌合跨膜受体多肽的胞外区时，通过切割所述切割识别位点，将致动部分从GMP释放出。
在图1所示的说明性实施例中，受体的胞外区可包含抗原相互作用域101，并且胞内区可包含(i)免疫细胞信号传导结构域102和(ii)GMP，其包含与切割识别位点104连接的致动部分103。
嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域，可以包含任何可以结合于抗原的蛋白质或分子。本文公开的嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域，可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、或其功能性衍生物、变体或片段，其中包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、微抗体、双抗体和单结构域抗体，例如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科动物来源的纳米抗体的可变结构域(VHH)。在一些实施方式中，抗原相互作用域包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和scFv中的至少一个。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含抗体模拟物。抗体模拟物是指能够以与抗体相当的亲和力结合于靶分子的分子，并且包括单链结合分子、基于细胞色素b562的结合分子、纤连蛋白或纤连蛋白样支架蛋白(例如阿德内丁蛋白(adnectin))、脂质体支架、杯芳烃(calixarene)支架、A-结构域和其他支架分子。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含一个跨膜受体，或其任何衍生物、变体或片段。例如，抗原相互作用结构域可以包含至少一个跨膜受体的配体结合结构域。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含人源化抗体。人源化抗体可以使用多种技术来生产，包括但不限于：CDR嫁接、表面改构(veneering)或表面重构、链改组(shuffling)和其他技术。可以选择人源可变结构域，包括轻链和重链，以降低人源化抗体的免疫原性。在一些实施方式中，嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域包含人源化抗体的片段，其以高亲和力结合于抗原并具有其他有利的生物学特性，例如降低的和/或最小的免疫原性。人源化抗体或抗体片段可以保留与相应的非人源化抗体相似的抗原特异性。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含一个单链可变片段(scFv)。scFv分子可以通过使用柔性接头(例如多肽接头)将免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)区域连接在一起来产生。可以根据各种不同方法来制备scFv。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域被工程化以结合于特定靶抗原。例如，抗原相互作用结构域可以是工程化的scFv。包括scFv的抗原相互作用结构域可以使用多种方法进行工程改造，所述方法包括但不限于：展示文库如噬菌体显示库、酵母显示库、基于细胞的显示库(例如哺乳动物细胞)、蛋白质-核酸融合技术、核糖体显示库，和/或大肠杆菌周质显示库。在一些实施方式中，工程改造的抗原相互作用结构域，可以以比类似抗体或未经过改造的抗体更高的亲和力结合于抗原。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于多种抗原，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗原。抗原相互作用结构域可以结合于两种相关抗原，例如两种亚型的肉毒杆菌毒素(例如，肉毒杆菌神经毒素亚型A1和亚型A2)。抗原相互作用结构域可以结合两种不相关的蛋白质，例如受体酪氨酸激酶erbB-2(也称为Neu、ERBB2和HER2)和血管内皮生长因子(VEGF)。能够结合于两种抗原的抗原相互作用结构域，可以包含工程改造的在抗体的不同但重叠位点处结合于两个不相关蛋白质靶标的抗体。在一些实施方式中，结合于多种抗原的抗原相互作用结构域包含双特异性抗体分子。双特异性抗体分子可具有对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变区序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变区序列。在一些实施方式中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)。第一和第二表位可以重叠。在一些实施方式中，第一和第二表位不重叠。在一些实施方式中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)。在一些实施方式中，双特异性抗体分子包含一个重链可变区序列和一个轻链可变区序列，它们对第一表位具有结合特异性；以及一个重链可变区序列和一个轻链可变区序列，它们对第二表位具有结合特异性。在一些实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一些实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。
在一些实施方式中，嵌合跨膜受体多肽的胞外区域包含多个抗原相互作用结构域，例如至少2个抗原相互作用结构域(例如至少3、4、5、6、7、8、9或10个抗原相互作用结构域)。多种抗原相互作用结构域可以表现出对相同或不同抗原的结合。在一些实施方式中，胞外区包含至少两个抗原相互作用结构域，例如串联连接的至少两个scFv。在一些实施方式中，两个scFv片段通过肽接头连接。
嵌合跨膜受体多肽的胞外区的抗原相互作用结构域，可以结合于膜结合的抗原，例如细胞(例如靶细胞)的胞外表面的抗原。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于非膜结合(例如非膜结合)的抗原，例如由细胞(例如靶细胞)分泌的胞外抗原或位于细胞(例如靶细胞)的细胞质中的抗原。抗原(例如膜结合和非膜结合)可以与疾病相关，如病毒、细菌和/或寄生虫感染；炎性和/或自身免疫性疾病；或肿瘤例如癌症和/或肿瘤。可以被本发明的系统的嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域结合的抗原的非限制性例子，包括但不限于：1-40-β-淀粉状蛋白、4-1BB、5AC、5T4、707-AP、激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、激活素受体2B型(ACVR2B)、激活素受体样激酶1(ALK1)、腺癌抗原、亲脂素、肾上腺素受体β3(ADRB3)、AGS-22M6、α叶酸受体、α-胎蛋白(AFP)、AIM-2、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、雄激素受体、血管生成素2、血管生成素3、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3(CD276)、炭疽杆菌、B细胞激活因子(BAFF)、B淋巴瘤细胞、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、印记调节因子兄弟(BORIS)、C242抗原、C5、CA-125、癌抗原125(CA-125或MUC16)、癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、心肌肌球蛋白、CCCTC-结合因子(CTCF)、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD123、CD125、CD140a、CD147(基础免疫球蛋白)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD171、CD179a、CD18、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD24、CD25(IL-2受体的α链)、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3ε、CD30、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、CD319(SLAMF7)、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配体、CD41、CD44v7、CD44v8、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD80、CD97、CEA-相关抗原、CFD、ch4D5、X染色体开放阅读框61(CXORF61)、紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、艰难梭菌、凝聚因子A、CLCA2、集落刺激因子1受体(CSF1R)、CSF2、CTLA-4、C-型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、C-型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)、C-X-C趋化因子受体4型、细胞周期蛋白B1、细胞色素P4501B1(CYP1B1)、cyp-B、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、达比加群酯、DLL4、DPP4、DR5、大肠杆菌志贺毒素-1型、大肠杆菌志贺毒素-2型、胞外ADP-核糖基转移酶4(ART4)、含EGF样元件的粘蛋白样激素受体样蛋白2(EMR2)、EGF样多结构域蛋白7(EGFL7)、突变型延伸因子2(ELF2M)、内毒素、肝配蛋白A2、肝配蛋白B2、肝配蛋白A型受体2、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、上皮唾蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、上皮糖蛋白2(EGP-2)、上皮糖蛋白40(EGP-40)、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、大肠杆菌、位于染色体12p上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)、呼吸道合胞病毒的F蛋白、FAP、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、受体样蛋白5(FCRL5)、胎儿乙酰胆碱受体、纤维蛋白IIβ链、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、纤连蛋白胞外结构域-B、FGF-5、Fm样酪氨酸激酶3(FLT3)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、叶酸受体β、Fos相关抗原1、卷曲蛋白受体、岩藻糖基GM1、G250、G蛋白偶联受体(GPR20)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、神经节苷脂G2(GD2)、GD3神经节苷脂、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、GMCSF受体α链、GPNMB、GnT-V、生长分化因子8、GUCY2C、热休克蛋白70-2突变型(mut hsp70-2)、血凝素、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、globoH糖苷酰胺的六糖部分(GloboH)、HGF、HHGFR、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、组蛋白复合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、HST-2(FGF6)、人乳头瘤病毒E6(HPV E6)、人乳头瘤病毒E7(HPV E7)、人分散因子受体激酶、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、人TNF、ICAM-1(CD54)、iCE、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgE、IgE的Fc区、IGF-1、IGF-1受体、IGHE、IL-12、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、A型流感血球凝集素、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、胰岛素样生长因子2(ILGF2)、整合素α4β7、整合素β2、整合素α2、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整合素αIIbβ3、整合素αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素γ诱导蛋白、白细胞介素11受体α(IL-11Rα)、白介素13受体亚单位α-2(IL-13Ra2或CD213A2)、肠羧基酯酶、激酶结构域区域(KDR)、KIR2D、KIT(CD117)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、豆荚蛋白、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、路易斯-Y抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-选择素(CD62L)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座K9(LY6K)、淋巴细胞抗原75(LY75)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、淋巴毒素-α(LT-α)或肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF或MMIF)、M-CSF、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、MCP-1、黑色素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)、黑色素瘤睾丸抗原-2(MAD-CT-2)、黑素瘤细胞凋亡抑制因子(ML-IAP)、黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)、间皮素、粘蛋白1、细胞表面相关蛋白(MUC1)、MUC-2、粘蛋白CanAg、髓磷脂相关糖蛋白、肌肉生长抑制素、N-乙酰葡萄糖胺转移酶V(NA17)、NCA-90(粒细胞抗原)、神经生长因子(NGF)、神经凋亡调节蛋白酶1、神经细胞粘附分子(NCAM)、神经突生长抑制剂(例如NOGO-A、NOGO-B、NOGO-C)、神经毡蛋白-1(NRP1)、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D、Notch受体、O-乙酰基-DG2神经节苷脂(OAcGD2)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、癌胚抗原(h5T4)、由断裂簇区域(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)、穴兔、OX-40、oxLDL、p53突变体、配对的盒蛋白Pax-3(PAX3)、配对的盒蛋白Pax-5(PAX5)、泛连接蛋白3(PANX3)、磷酸钠共转运蛋白、磷脂酰丝氨酸、胎盘特异性蛋白1(PLAC1)、血小板衍生生长因子受体α(PDGF-Rα)、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、聚唾液酸、前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)、前列腺酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)、由T细胞1识别的黑素瘤抗原(MelanA或MART1)、P15、P53、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺癌细胞、前列腺特异性蛋白(prostein)、蛋白酶丝氨酸21(睾丸素或PRSS21)、蛋白酶体(前体、巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、绿脓杆菌、狂犬病病毒糖蛋白、RAGE、Ras同系物家族成员C(RhoC)、核因子κ-B配体的受体激活剂(RANKL)、晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、肾泛素1(RU1)、肾泛素2(RU2)、呼吸道合胞病毒、Rh血型D抗原、恒河猴因子、肉瘤易位断点、硬化蛋白(SOST)、选择素P、唾液酸路易斯粘附分子(sLe)、精子蛋白17(SPA17)、鞘氨醇-1-磷酸、由T细胞1、2和3识别的鳞状细胞癌抗原(SART1、SART2和SART3)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、金黄色葡萄球菌、STEAP1、存活素、多配体蛋白聚糖1(SDC1)+A314、SOX10、存活素、存活素-2B、滑膜肉瘤、X断点2(SSX2)、T细胞受体、TCRΓ可变读码框蛋白(TARP)、端粒酶、TEM1、腱生蛋白C、TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)、促甲状腺激素受体(TSHR)、组织因子通路抑制因子(TFPI)、Tn抗原((TnAg)或(GalNAcα-Ser/Thr))、TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRG、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、肿瘤抗原CTAA16.88、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关蛋白(TEM7R)、肿瘤蛋白质p53(p53)、肿瘤特异性糖基化MUC1、肿瘤相关钙信号转导子2、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)+A327、TWEAK受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1或糖蛋白75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)、尿路上皮特异蛋白2(UPK2)、血管内皮生长因子(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、波形蛋白、V-myc禽骨髓细胞瘤病病毒致癌基因神经母细胞瘤同源物(MYCN)、血管假性血友病因子(VWF)、肾母细胞瘤蛋白(WT1)、X抗原家族成员1A(XAGE1)、β-淀粉样蛋白和κ-轻链。
在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合于选自下组的抗原：707-AP、生物素化的分子、α-肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、亲脂素、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-ablp210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、细胞凋亡蛋白酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、路易斯Y、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/黑素-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活素、存活素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于一抗原，所述抗原包括抗体，例如与细胞表面蛋白或多肽结合的抗体。被抗体结合的细胞表面蛋白质或多肽可以包括与疾病(如病毒、细菌和/或寄生虫造成的感染)相关的抗原；炎性和/或自身免疫性疾病；或肿瘤例如癌症和/或肿瘤。在一些实施方式中，抗体结合于肿瘤相关抗原(例如蛋白质或多肽)。在一些实施方式中，本文公开的嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域可结合于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体或其功能衍生物、变体或片段，包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fv、scFv、微抗体，双抗体(diabody)和单结构域抗体，例如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科动物来源的纳米抗体的可变结构域(VHH)。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域可以结合于Fab、Fab'、αF(ab')2、Fc、Fv和scFv中的至少一个。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于抗体的Fc结构域。
在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域结合于选自下组的抗体：20-(74)-(74)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)(20-(74)-(74)(milatuzumab；veltuzumab))、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)(74-(20)-(20)(milatuzumab；veltuzumab))、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿比珠单抗(abituzumab)、ABP494(西妥昔单抗生物仿制药)(ABP 494(cetuximabbiosimilar))、阿布里单抗(abrilumab)、ABT-700、ABT-806、阿克提单抗-A(锕Ac-225林妥珠单抗)(Actimab-A(actinium Ac-225lintuzumab))、阿卡单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿达卡莫单抗(adecatumumab)、阿杜单抗(aducanumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、AFM13、阿芙土珠单抗(afutuzumab)、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、PEG化的阿拉西马单抗(alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(alirocumab)、戊妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿马昔单抗(amatuximab)、AMG228、AMG820、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、安替单抗瑞伐坦(anetumab ravtansine)、阿尼弗洛姆单抗(anifrolumab)、安鲁单抗(anrukinzumab)、APN301、APN311、阿泊珠单抗(apolizumab)、APX003/SIM-BD0801(贝伐单抗)(APX003/SIM-BD0801(sevacizumab))、APX005M、阿西莫单抗(arcitumomab)、ARX788、阿斯库昔单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、ASG-15ME、阿特珠单抗(atezolizumab)、安妥明单抗(atinumab)、ATL101、阿特利单抗(也称为托珠单抗)(atlizumab(also referred toas tocilizumab))、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维拉姆单抗(Avelumab)、B-701、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、BAY1129980、BAY1187982、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝格洛姆单抗(begelomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝拉珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)、倍他卢汀单抗(177Lu-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸特托单抗)(Betalutin(177Lu-tetraxetan-tetulomab))、贝伐单抗(bevacizumab)、BEVZ92(贝伐单抗生物仿制药)(BEVZ92(bevacizumab biosimilar))、贝佐洛单抗(bezlotoxumab)、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、比西单抗(biciromab)、双马单抗(bimagrumab)、贝美珠单抗(bimekizumab)、莫比瓦妥单抗(bivatuzumab mertansine)、BIW-8962、博纳吐单抗(blinatumomab)、布洛唑单抗(blosozumab)、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、博科齐单抗(bococizumab)、维本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、布雷瓦雷克斯单抗(BrevaRex)、布里亚明单抗(briakinumab)、溴达拉单抗(brodalumab)、溴化丙单抗(brolucizumab)、支舒巴单抗(brontictuzumab)、C2-2b-2b、康纳单抗(canakinumab)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、坎妥单抗瑞伐坦(cantuzumab ravtansine)、卡普利单抗(caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽偶联物(capromab pendetide)、卡伦单抗(carlumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CBR96-阿霉素免疫偶联物(CBR96-doxorubicin immunoconjugate)、CBT124(贝伐单抗)(CBT124(bevacizumab))、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠单抗(cedelizumab)、PEG化的塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、伯格西他土珠单抗(citatuzumabbogatox)、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、克伐他单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物(clivatuzumab tetraxetan)、CM-24、钴妥珠单抗(codrituzumab)、考土昔单抗-DM4偶联物(coltuximab ravtansine)、康妥单抗(conatumumab)、康昔单抗(concizumab)、科塔拉(碘I-131地洛妥单抗生物素)(Cotara(iodine I-131derlotuximab biotin))、cR6261、克伦单抗(crenezumab)、DA-3111(曲妥珠单抗生物仿制药)(DA-3111(trastuzumabbiosimilar))、达塞珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达妥珠单抗(dalotuzumab)、PEG化的达匹罗单抗(dapirolizumab pegol)、达雷木单抗(daratumumab)、达雷木单抗(商品名为Enhanze)(达雷木单抗)(Daratumumab Enhanze(daratumumab))、达介素(Darleukin)、癸曲单抗(dectrekumab)、地昔单抗(demcizumab)、丹因珠单抗-MMAF偶联物(denintuzumab mafodotin)、地诺单抗(denosumab)、达妥昔单抗(Depatuxizumab)、达妥昔单抗-MMAF偶联物(Depatuxizumab mafodotin)、地洛昔单抗-生物素(derlotuximabbiotin)、地莫单抗(detumomab)、DI-B4、丁妥昔单抗(dinutuximab)、地利达莫单抗(diridavumab)、DKN-01、DMOT4039A、阿托度单抗(dorlimomab aritox)、屈西他单抗(drozitumab)、DS-1123、DS-8895、杜利他单抗(duligotumab)、杜普单抗(dupilumab)、杜伐单抗(durvalumab)、杜昔单抗(dusigitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃巴单抗(edobacomab)、依屈洛单抗(edrecolomab)、依法珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、埃尔德单抗(eldelumab)、埃格曼图姆单抗(elgemtumab)、伊洛珠单抗(elotuzumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、艾马珠单抗(emactuzumab)、依米妥珠单抗(emibetuzumab)、恩伐珠单抗(enavatuzumab)、伊凡珠单抗-维多汀偶联物(enfortumab vedotin)、PEG化恩莫单抗(enlimomab pegol)、恩比利珠单抗(enoblituzumab)、依诺珠单抗(enokizumab)、依诺替单抗(enoticumab)、恩师妥昔单抗(ensituximab)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、依他珠单抗(etaracizumab)、依曲利珠单抗(etrolizumab)、依伐单抗(evinacumab)、依福单抗(evolocumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、法鲁珠单抗(farletuzumab)、法辛单抗(fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(felvizumab)、费扎尼单抗(fezakinumab)、FF-21101、FGFR2抗体-药物偶联物(FGFR2Antibody-Drug Conjugate)、菲伯免疫蛋白(Fibromun)、非卡妥珠单抗(ficlatuzumab)、菲妥木单抗(figitumumab)、福利木单抗(firivumab)、法兰妥单抗(flanvotumab)、福利替单抗(fletikumab)、芬特妥珠单抗(fontolizumab)、福拉木单抗(foralumab)、福韦单抗(foravirumab)、FPA144、去甲美马单抗(fresolimumab)、FS102、富拉单抗(fulranumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、加利昔单抗(galiximab)、甘露单抗(ganitumab)、冈特莫单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)、格图单抗-奥佐米星偶联物(gemtuzumab ozogamicin)、吉利单抗(Gerilimzumab)、格伐克单抗(gevokizumab)、吉妥昔单抗(girentuximab)、维格列巴单抗(glembatumumab vedotin)、GNR-006、GNR-011、哥利木单抗(golimumab)、高密昔单抗(gomiliximab)、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、古塞尔库姆单抗(guselkumab)、Hu14.18K322A单抗、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、伊巴珠单抗(ibalizumab)、伊立莫单抗替西坦偶联物(ibritumomab tiuxetan)、伊鲁库单抗(icrucumab)、依达鲁单抗(idarucizumab)、IGN002、IGN523、伊戈伏单抗(igovomab)、IMAB362、IMAB362(克洛昔单抗)(IMAB362(claudiximab))、伊马单抗(imalumab)、IMC-CS4、IMC-D11、英西单抗(imciromab)、伊马曲单抗(imgatuzumab)、IMGN529、IMMU-102(钇-90-依普鲁单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物)(IMMU-102(yttrium Y-90epratuzumab tetraxetan))、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗抗体(ImmuTuneIMP701Antagonist Antibody)、INCAGN1876、依克拉单抗(inclacumab)、INCSHR1210、吲妥昔单抗瑞伐坦(indatuximab ravtansine)、维因度单抗(indusatumab vedotin)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、奥妥珠格图单抗-奥佐米星偶联物偶联物(inotuzumab ozogamicin)、英特单抗(intetumumab)、依帕非赛(Ipafricept)、IPH4102、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊拉单抗(iratumumab)、伊沙昔单抗(isatuximab)、异妥拉明单抗(Istiratumab)、伊托珠单抗(itolizumab)、衣克珠单抗(ixekizumab)、JNJ-56022473、JNJ-61610588、克利昔单抗(keliximab)、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉托唑单抗(Labetuzumab)、拉托唑单抗-格维他偶联物(Labetuzumab Govitecan)、LAG525、兰布利单抗(lambrolizumab)、拉帕单抗(lampalizumab)、L-DOS47、利勃珠单抗(lebrikizumab)、利马索单抗(lemalesomab)、仑齐鲁单抗(lenzilumab)、勒德利木单抗(lerdelimumab)、白妥昔单抗(Leukotuximab)、莱卡单抗(lexatumumab)、利比维单抗(libivirumab)、维利伐妥单抗(lifastuzumab vedotin)、利格珠单抗(ligelizumab)、利洛单抗-赛塔坦偶联物(lilotomab satetraxetan)、林妥珠单抗(lintuzumab)、利鲁单抗(lirilumab)、LKZ145、洛德昔单抗(lodelcizumab)、洛克韦单抗(lokivetmab)、莫洛伐妥单抗(lorvotuzumabmertansine)、卢卡珠单抗(lucatumumab)、PEG化的卢利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁米昔单抗(lumiliximab)、鲁曲单抗(lumretuzumab)、LY3164530、马塔单抗(mapatumumab)、马妥昔单抗(margetuximab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥单抗(matuzumab)、马维里单抗(mavrilimumab)、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551(吲哚单抗)(MEDI-551(inebilizumab))、MEDI-565、MEDI6469、美泊利单抗(mepolizumab)、迈他珠单抗(metelimumab)、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉珠单抗(milatuzumab)、米拉珠单抗-SN-38(Milatuzumab-SN-38)、明妥莫单抗(minretumomab)、米维妥昔单抗-索拉素偶联物(mirvetuximab soravtansine)、米托单抗(mitumomab)、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、莫加利单抗(mogamulizumab)、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫洛莫单抗(morolimumab)、莫他珠单抗(motavizumab)、莫昔单抗-帕多毒素偶联物(moxetumomab pasudotox)、穆罗莫纳-CD3(muromonab-CD3)、塔非那托克-塔芬毒素偶联物(nacolomab tafenatox)、纳霉单抗(namilumab)、萘妥莫单抗-衣塔芬毒素偶联物(naptumomab estafenatox)、纳妥单抗(narnatumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奈巴库单抗(nebacumab)、奈米单抗(necitumumab)、奈莫珠单抗(nemolizumab)、奈利莫单抗(nerelimomab)、奈西伐单抗(nesvacumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼沃单抗(nivolumab)、巯诺莫单抗-美培坦偶联物(nofetumomab merpentan)、10-Nov、奥比妥昔单抗(obiltoxaximab)、奥匹妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡鲁单抗(ocaratuzumab)、奥克里昔单抗(ocrelizumab)、奥杜莫单抗(odulimomab)、阿法单抗(ofatumumab)、奥拉他单抗(olaratumab)、奥昔单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、OMP-131R10、OMP-305B83、阿那妥单抗(onartuzumab)、恩妥昔单抗(ontuxizumab)、阿昔单抗(opicinumab)、阿曲单抗-莫那毒素偶联物(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥替单抗(orticumab)、奥立昔单抗(otelixizumab)、奥特鲁单抗(otlertuzumab)、OX002/MEN1309、奥索单抗(oxelumab)、奥扎尼单抗(ozanezumab)、奥索利单抗(ozoralizumab)、帕吉巴昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、潘科曼单抗(pankomab)、潘科曼单抗-GEX(PankoMab-GEX)、泛巴单抗(panobacumab)、帕撒单抗(parsatuzumab)、帕昔单抗(pascolizumab)、帕索妥昔单抗(pasotuxizumab)、帕替利单抗(pateclizumab)、帕特利单抗(patritumab)、PAT-SC1、PAT-SM6、彭布利单抗(pembrolizumab)、培马单抗(pemtumomab)、哌拉单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培昔单抗(pexelizumab)、PF-05082566(乌托单抗)(PF-05082566(utomilumab))、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、匹利珠单抗(pidilizumab)、维匹那妥单抗(pinatuzumab vedotin)、品妥莫单抗(pintumomab)、普鲁单抗(placulumab)、维波达单抗(polatuzumab vedotin)、庞尼泽单抗(ponezumab)、普利昔单抗(priliximab)、普罗昔单抗(pritoxaximab)、普鲁米单抗(pritumumab)、PRO 140、普罗信单抗(Proxinium)、PSMA ADC、奎珠单抗(quilizumab)、拉托单抗(racotumomab)、拉德鲁单抗(radretumab)、拉维夫单抗(rafivirumab)、拉潘昔单抗(ralpancizumab)、拉莫鲁单抗(ramucirumab)、雷尼珠单抗(ranibizumab)、拉克昔单抗(raxibacumab)、瑞伐珠单抗(refanezumab)、瑞伐单抗(regavirumab)、REGN1400、REGN2810/SAR439684、利昔单抗(reslizumab)、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利妥珠单抗(rilotumumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、RM-1929、RO7009789、罗巴单抗(robatumumab)、罗乐单抗(roledumab)、罗莫索单抗(romosozumab)、罗他珠单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、鲁普单抗(ruplizumab)、妥珠单抗-格维他偶联物(sacituzumab govitecan)、沙马利单抗(samalizumab)、SAR408701、SAR566658、沙利鲁单抗(sarilumab)、SAT012、沙妥单抗-喷地肽偶联物(satumomabpendetide)、SCT200、SCT400、SEA-CD40、塞库单抗(secukinumab)、塞巴坦单抗(seribantumab)、塞妥昔单抗(setoxaximab)、赛韦单抗(sevirumab)、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西布曲单抗(sibrotuzumab)、西伐单抗(sifalimumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、西妥珠单抗(simtuzumab)、西普利单抗(siplizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、维索菲妥单抗(sofituzumab vedotin)、索冷珠单抗(solanezumab)、索利单抗(solitomab)、索普昔单抗(sonepcizumab)、索妥单抗(sontuzumab)、丝塔单抗(stamulumab)、舒乐单抗(sulesomab)、苏维珠单抗(suvizumab)、SYD985、SYM004(伏妥昔单抗和莫妥昔单抗)(SYM004(futuximab and modotuximab))、Sym015、TAB08、他巴单抗(tabalumab)、塔卡珠单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物(tacatuzumab tetraxetan)、塔多珠单抗(tadocizumab)、塔利单抗(talizumab)、坦纳单抗(tanezumab)、塔尼单抗(Tanibirumab)、普利妥单抗-帕普毒素偶联物(taplitumomab paptox)、塔雷克斯顿单抗(tarextumab)、TB-403、替非珠单抗(tefibazumab)、特勒金单抗(Teleukin)、阿替莫单抗-阿利毒素偶联物(telimomabaritox)、替纳单抗(tenatumomab)、替尼昔单抗(teneliximab)、替普珠单抗(teplizumab)、四丙珠单抗(teprotumumab)、司他洛单抗(tesidolumab)、替妥洛明单抗(tetulomab)、TG-1303、TGN1412、钍-227-依普鲁单抗偶联物(Thorium-227-Epratuzumab Conjugate)、替昔单抗(ticilimumab)、替加妥单抗(tigatuzumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、维蒂索单抗(Tisotumab vedotin)、TNX-650、塔西单抗(tocilizumab)、托拉珠单抗(toralizumab)、托沙单抗(tosatoxumab)、托西单抗(tositumomab)、托维单抗(tovetumab)、曲洛单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗-厄塔毒素偶联物(trastuzumabemtansine)、TRBS07、TRC105、曲利单抗(tregalizumab)、曲美单抗(tremelimumab)、特伐单抗(trevogrumab)、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、图卡珠单抗-西莫白介素偶联物(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(tuvirumab)、U3-1565、U3-1784、乌布妥昔单抗(ublituximab)、优隆单抗(ulocuplumab)、乌洛单抗(urelumab)、乌索单抗(urtoxazumab)、乌司他单抗(ustekinumab)、伐他昔单抗-塔利素偶联物(Vadastuximab Talirine)、维凡多鲁单抗(vandortuzumab vedotin)、范蒂姆单抗(vantictumab)、维库珠单抗(vanucizumab)、伐昔单抗(vapaliximab)、伐利单抗(varlilumab)、伐他珠单抗(vatelizumab)、VB6-845、维多珠单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维森单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏罗昔单抗(volociximab)、沃塞妥单抗-马伏毒素偶联物(vorsetuzumab mafodotin)、伏妥单抗(votumumab)、YYB-101、扎鲁单抗(zalutumumab)、扎诺米单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗(zatuximab)、齐拉明单抗(ziralimumab)、和阿佐莫单抗-阿利毒素偶联物(zolimomabaritox)。在特定的实施方式中，抗原相互作用结构域结合前述抗体的Fc结构域。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于抗体，所述抗体反过来结合选自下组的抗原：1-40-β-淀粉状蛋白、4-1BB、5AC、5T4、激活素受体样激酶1、ACVR2B、腺癌抗原、AGS-22M6、α-胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽杆菌、BAFF、β-淀粉样蛋白、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、C5、CA-125、家犬狼疮IL31、碳酸酐酶9(CA-IX)、心肌肌球蛋白、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147(基础免疫球蛋白)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3ε、CD30、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配体、CD41、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CEA相关抗原、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艰难梭菌、凝聚因子A、CSF1R、CSF2、CTLA-4、C-X-C趋化因子受体4型、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、达比加群酯、DLL4、DPP4、DR5、大肠杆菌志贺毒素1型、大肠杆菌志贺毒素2型、EGFL7、EGFR、内毒素、EpCAM、上皮唾蛋白、ERBB3、大肠杆菌、呼吸道合胞病毒F蛋白、FAP、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白胞外结构域B、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、卷曲受体、神经节苷脂GD2、GD2、神经节苷脂GD3、磷脂酰肌醇聚糖3、GMCSF受体α链、GPNMB、生长分化因子8、GUCY2C、血球凝集素、乙肝表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、组蛋白复合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、人分散因子受体激酶、人TNF、人β-淀粉样蛋白、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IGF-1受体、IGF-1、IGHE、IL-17A、IL-17F、IL-20、IL-12、IL-13、IL-17、IL-1β、IL-22、IL-23、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、ILGF2、甲型流感血凝素、甲型流感病毒血凝素、胰岛素样生长因子I受体、整联蛋白α4β7、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整联蛋白αIIbβ3、整联蛋白αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素γ诱导蛋白、ITGA2、ITGB2(CD18)、KIR2D、路易斯-Y抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-选择素(CD62L)、LTA、MCP-1、间皮素、MIF、MS4A1、MSLN、MUC1、粘蛋白CanAg、髓磷脂相关糖蛋白、肌生成抑制蛋白、NCA-90(粒细胞抗原)、神经凋亡调节蛋白酶1、NGF、N-羟乙酰神经氨酸、NOGO-A、Notch受体、NRP1、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-Rα、磷酸钠共转运蛋白、磷脂酰丝氨酸、血小板衍生生长因子受体β、前列腺癌细胞、绿脓杆菌、狂犬病病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞病毒、RHD、恒河猴因子、RON、RTN4、硬化蛋白、SDC1、选择素P、SLAMF7、SOST、鞘氨醇-1-磷酸盐、金黄色葡萄球菌、STEAP1、TAG-72、T细胞受体、TEM1、腱生蛋白C、TFPI、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、MUC1的肿瘤特异性糖基化形式、肿瘤相关钙信号转导器2、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白和VWF。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域可以结合于抗体模拟物。如本文别处所述，抗体模拟物可以以与抗体相当的亲和力结合于靶分子。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域可以结合于本文其他地方描述的人源化抗体。在一些实施方式中，嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域可以结合于人源化抗体的片段。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域可以结合于单链可变片段(scFv)。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域结合于合适的哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊或猴)的免疫球蛋白(例如IgG、IgA、IgM或IgE)的Fc区。合适的Fc结合结构域可以源自天然存在的蛋白质，例如哺乳动物Fc受体或某些细菌蛋白质(例如蛋白质A和蛋白质G)。另外，Fc结合结构域可以是合成多肽，它经特别工程化从而以所期望的亲和力和特异性结合于本文所述的任何Ig分子的Fc区。例如，这种Fc结合结构域可以是特异性结合于免疫球蛋白的Fc区的抗体或其抗原结合片段。实例包括但不限于：单链可变片段(scFv)、结构域抗体和纳米抗体。或者，Fc结合结构域可以是特异性结合于Fc区的合成肽，例如Kunitz结构域、小模块免疫药物(SMIP)、阿德内丁蛋白(adnectin)、阿维默(avimer)、亲和体、DARP蛋白(DARPin或)、抗卡林蛋白(anticalin)，其可以通过在肽文库筛选与Fc的结合活性来鉴定。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含一个Fc结合结构域，所述Fc结合结构域包含哺乳动物Fc受体的胞外配体结合结构域。Fc受体通常是在许多免疫细胞(包括B细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞)表面表达的细胞表面受体，并且表现出对抗体的Fc区的特异性结合。在一些情况下，Fc受体与抗体的Fc区的结合可触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应。用于构建本文所述的嵌合跨膜受体多肽的Fc受体，可以是天然存在的多态性变体，例如与野生型对应物相比，具有不同的(例如，增加或减少)对Fc区的亲和力的变体。或者，Fc受体可以是野生型对应物的功能变体，其携带改变对Ig分子的Fc区的结合亲和力的一个或多个突变(例如，至多10个氨基酸残基取代)。在一些实施方式中，突变可以改变Fc受体的糖基化模式并因此改变对Fc结构域的结合亲和力。
表1列出了Fc受体胞外结构域中的多态性例子(参见，如Kim等.,J.Mol.Evol.53:1-9,2001)
表1 Fc受体中的示例性多态性
氨基酸序号 19 48 65 89 105 130 134 141 142 158
FCR10 R S D I D G F Y T V
P08637 R S D I D G F Y I F
S76824 R S D I D G F Y I V
J04162 R N D V D D F H I V
M31936 S S N I D D F H I V
M24854 S S N I E D S H I V
X07934 R S N I D D F H I V
X14356(FcγRII) N N N S E S S S I I
M31932(FcγRI) S T N R E A F T I G
X06948(FcαεI) R S E S Q S E S I V
Fc受体通常可以基于其能够结合的抗体的同种型来分类。例如，Fc-γ受体(FcγR)通常与IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)结合；Fc-α受体(FcαR)通常与IgA抗体结合；Fc-ε受体(FcεR)通常与IgE抗体结合。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含Fcγ受体或其任何衍生物、变体或片段。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含Fc结合结构域，其包含FcR，其选自FcγRI(CD64)、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包含同种异型H131和R131的FcγRIIA(CD32)、包括FcγRIIB-1和FcγRIIB-2的FcγRIIB(CD32)、包含同种异型V158和F158的FcγRIIIA(CD16a)、包含同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIB(CD16b)、其任何衍生物、变体及片段。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包括Fcε受体或其任何衍生物、变体或片段。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包括选自FcεRI、FcεRII(CD23)、其任何衍生物、变体及片段的FcR。在一些实施方式中，所述抗原相互作用结构域包括Fcα受体或其任何衍生物、变体或片段。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包括选自FcαRI(CD89)、Fcα/μR、其任何衍生物、变体和其中任何一种的FcR。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包括选自FcRn、其任何衍生物、变体及片段的FcR。用于嵌合跨膜受体多肽的Fc受体的配体结合结构域的选择可能取决于各种因素，例如与抗体的同种型结合所需的Fc结合结构域和结合相互作用所需的亲和力。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含CD16的胞外配体结合结构域，其可包含可以调节对Fc结构域的亲和力的天然存在的多态性(polymorphism)。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含在位置158处(例如缬氨酸或苯丙氨酸)引入多态性的CD16的胞外配体结合结构域。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域在改变其糖基化状态及其对Fc结构域的亲和力的条件下产生。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含结合修饰的CD16的胞外配体结合结构域，使嵌入它的嵌合跨膜受体多肽对IgG抗体亚型(subset)具有特异性。
例如，可以引入增加或降低对IgG亚型(例如，IgG1)的亲和力的突变。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含CD32的胞外配体结合结构域，其可包含可以调节对Fc结构域的亲和力的天然存在的多态性。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含结合修饰的CD32的胞外配体结合结构域，使嵌入它的嵌合跨膜受体多肽对IgG抗体亚型具有特异性。例如，可以引入增加或减少对IgG亚型(例如，IgG1)的亲和力的突变。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含CD64的胞外配体结合结构域，其可以包含可对Fc结构域的亲和力进行调节的天然存在的多态性。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域在改变其糖基化状态及其对Fc结构域的亲和力的条件下产生。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含含有修饰的CD64胞外配体结合结构域，修饰使得嵌合跨膜受体多肽对IgG抗体亚组具有特异性。例如，可以引入增强或减弱对IgG亚型(例如，IgG1)的亲和力的突变。
在其它实施方式中，抗原相互作用结构域包含能够结合IgG分子Fc区的天然存在的细菌性蛋白质、或其任何衍生物、变体或片段(例如蛋白质A、蛋白质G)。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含蛋白质A或其任何衍生物、变体或片段。蛋白质A是指最初在细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁中发现的42kDa表面蛋白质。它由五个域组成，每个域可折叠成三螺旋束，并且能够通过与大多数抗体的Fc区以及人VH3家族抗体的Fab区的相互作用来结合IgG。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含蛋白G或其任何衍生物、变体或片段。蛋白质G是指一种约60-kDa的蛋白质，其在结合哺乳动物IgG Fab和Fc区的C组和G组链球菌细菌中表达。虽然天然蛋白G也结合白蛋白，但是经工程化的重组变体则用来消除白蛋白结合。
也可以使用组合生物学或定向进化方法从头创建抗原相互作用结构域。从蛋白骨架开始(例如，来源于IgG的scFv、来源于Kunitz型蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域、锚蛋白重复序列、来自蛋白质A的Z结构域、脂质运载蛋白、纤连蛋白III型结构域、来源于Fyn的SH3结构域，或其它)，表面上一组残基的氨基酸侧链可以进行随机取代以创建一个大型的变体骨架文库。从大型文库中，可以通过首先选择结合来分离对于靶标如Fc结构域具有亲和力的变体，随后通过噬菌体、核糖体或细胞展示进行扩增。可以使用多轮选择和扩增来分离对靶标亲和力最高的蛋白质。示例性的Fc结合肽可以包含如ETQRCTWHMGELVWCEREHN(SEQ IDNO:19)、KEASCSYWLGELVWCVAGVE(SEQ ID NO:20)或DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:21)所示的氨基酸序列。
本文所述的任何Fc结合物可以对抗体的Fc结构域具有合适的结合亲和力。结合亲和力是指表观结合常数或KA。KA是解离常数KD的倒数。本文所述的嵌合跨膜受体多肽的Fc受体结构域的胞外配体结合结构域对于抗体的Fc区可能有至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M或更低的结合亲和力KD。在一些实施方式中，与抗原相互作用结构域与另一种抗体、抗体的同种型或其亚型结合亲和力相比，结合抗体Fc区的抗原相互作用结构域对抗体、抗体的同种型或其亚型具有高结合亲和力。
在一些实施方式中，与Fc受体的胞外配体结合结构域与另一种抗体、抗体的同种型或其亚型的结合相比，Fc受体的胞外配体结合结构域对抗体、抗体的同种型或其亚型具有特异性。具有相对高亲和力结合的Fcγ受体包括CD64A、CD64B和CD64C。具有相对低亲和力结合的Fcγ受体包括CD32A、CD32B、CD16A和CD16B。具有相对高亲和力结合的Fcε受体包括FcεRI，具有相对低亲和力结合的Fcε受体包括FcεRII/CD23。
可通过多种方法确定Fc受体或其任何衍生物、变体或片段或包含了Fc结合结构域的嵌合跨膜受体多肽的结合亲和力或结合特异性，所述方法包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振和光谱学。
在一些实施方式中，包含Fc受体胞外配体结合结构域的抗原相互作用结构域包括与天然存在的Fcγ受体、Fcα受体、Fcε受体或FcRn的胞外配体结合结构域的氨基酸序列至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)相同的氨基酸序列。两个氨基酸序列的“同一性百分比”或“同一性％”可以使用Karlin和Altschul，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:2264-68,1990的算法来确定，并根据Karlin和Altschul美国科学院院报90:5873-77,1993进行修正。这种算法被纳入Altschul等，分子生物学(Mol.Biol).215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50、字长＝3，以获得与本公开内容的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以使用如Altschul等，核酸研究(NucleicAcids Res).25(17):3389-3402,1997所述进行缺口比对(Gapped BLAST)。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如，XBLAST和NBLAST)。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含Fc结合结构域，其包含Fc受体的胞外配体结合结构域的变体。在一些实施方式中，Fc受体的变体胞外配体结合结构域可以包含相对于对照胞外配体结合结构域的氨基酸序列的多达10个氨基酸残基变体(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)。在一些实施方式中，由于基因的多态性，变体可以是天然存在的变体。在其他实施方式中，变体可以是非天然存在的修饰分子。例如，可以将突变引入Fc受体的胞外配体结合结构域以改变其糖基化模式，并由此改变其与相应Fc结构域的结合亲和力。
在一些实施方式中，抗原相互作用结构域包含选自如本文所述的CD16A、CD16B、CD32A、CD32B、CD32C、CD64A、CD64B、CD64C或其变体、片段或衍生物的Fc受体的Fc结合。相对于本文所述的CD16A，CD16B，CD32A，CD32B，CD32C，CD64A，CD64B，CD64C的细胞外配体结合结构域的氨基酸序列，Fc受体的胞外配体结合结构域可以包含多达10个氨基酸残基变体(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)。相对于不包含突变的Fc受体结构域来说，Fc受体的胞外配体结合结构域的氨基酸残基突变可能会导致对Fc受体结构域结合抗体、抗体的同种型或其亚型的结合亲和力的增加。例如，Fc-γ受体CD16A残基158的突变可导致Fc受体与抗体Fc区的结合亲和力增加。在一些实施方式中，突变是在Fcγ受体CD16A的残基158处将苯丙氨酸置换为缬氨酸。在Fc受体的胞外配体结合结构域中可以进行各种合适的替代或额外的突变，其可以增强或减少对分子(如抗体)Fc区的结合亲和力。
包含抗原相互作用结构域的胞外区可以与胞内区连接，例如通过跨膜部分。在一些实施方式中，跨膜区包含多肽。连接嵌合跨膜受体胞外区域和胞内区域的跨膜多肽可以有任何合适的多肽序列。在一些情况下，所述跨膜多肽包含内源或野生型跨膜蛋白跨膜部分的多肽序列。在一些实施方式中，相比于内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分，所述跨膜多肽包含至少具有1个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)氨基酸取代、缺失和插入的多肽序列。在一些实施方式中，跨膜多肽包含非天然多肽序列，例如多肽接头序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施方式中，跨膜多肽将信号从受体的胞外区域传递到胞内区域，例如指示配体结合的信号。
受试者(机体)系统的嵌合跨膜受体多肽胞内区域的免疫细胞信号传导结构域可以包含主信号结构域。主信号结构域可以是参与免疫细胞信号传导的任何信号传导结构域或其衍生物、变体或片段。例如，信号域涉及以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。主信号结构域可以包含Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)，CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κ、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70的信号传导结构域。在一些实施方式中，主信号结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。包含ITAM的主信号结构域可以包括由6-8个氨基酸分隔的氨基酸序列YxxL/I的两个重复序列，其中每个x独立地为任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。当抗原相互作用结构域与抗原结合时，可以通过例如磷酸化来修饰包含ITAM的主要信号结构域。磷酸化的ITAM可以作为其他蛋白质的对接位点，例如涉及各种信号传导途径的蛋白质。在一些实施方式中，主信号域包含修饰的ITAM域，例如突变的、截短的和/或优化的ITAM结构域，其与天然ITAM结构域相比，活性已经改变(例如增加或减少)。
在一些实施方式中，主信号结构域包含FcγR信号结构域(例如ITAM)。FcγR信号结构域可以选自FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。在一些实施方式中，主信号结构域包含FcεR信号结构域(例如ITAM)。FcεR信号结构域可以选自FcεRI和FcεRII(CD23)。在一些实施方式中，主信号结构域包含FcαR信号结构域(例如ITAM)。FcαR信号结构域可以选自FcαRI(CD89)和Fcα/μR。在一些实施方式中，主信号结构域包含CD3ζ信号结构域。在一些实施方式中，主信号域包含CD3ζ的ITAM。
在一些实施方式中，主信号结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序或ITIM。包含ITIM的主信号结构域可以包括在免疫系统的一些抑制性受体的细胞质尾部中发现的保守氨基酸序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)。包含ITIM的信号结构域可以进行修饰，例如通过Src激酶家族成员(例如Lck)的酶进行磷酸化。磷酸化后，其它蛋白质，包括酶，可以被募集到ITIM。这些其它蛋白质包括但不限于诸如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2的酶，称为SHIP的肌醇磷酸酶，以及具有一个或多个SH2结构域的蛋白质(例如ZAP70)。主信号域可以包括BTLA、CD5、CD31、CD66a、CD72、CMRF35H、DCIR、EPO-R、FcγRIIB(CD32)、Fc类受体蛋白2(FCRL2)、Fc类受体蛋白3(FCRL3)、Fc类受体蛋白4(FCRL4)、Fc类受体蛋白5(FCRL5)、Fc类受体蛋白6(FCRL6)、蛋白质G6b(G6B)、白细胞介素4受体(IL4R)、易位相关免疫球蛋白超家族受体(IRTA1)、易位相关免疫球蛋白超家族受体2(IRTA2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL1(KIR2DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL2(KIR2DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL3(KIR2DL3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL5(KIR2DL5)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL1(KIR3DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL2(KIR3DL2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LIR1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(LIR2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3(LIR3)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员5(LIR5)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员8(LIR8)、白细胞相关免疫球蛋白类受体1(LAIR-1)、肥大细胞功能相关抗原(MAFA)、NKG2A、天然细胞毒性触发受体2(NKp44)、NTB-A、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PILR、SIGLECL1、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素2(SIGLEC2或CD22)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素2(SIGLEC2或CD22)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素3(SIGLEC3或CD33)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素5(SIGLEC5或CD170)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素6(SIGLEC6)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素10(SIGLEC10)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素11(SIGLEC11)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素4(SIGLEC4)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素8(SIGLEC8)、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素9(SIGLEC9)、血小板和内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、信号调节蛋白(SIRP 2)、和信号阈值调节跨膜接头1(SIT)的信号域(例如，ITIM)。在一些实施方式中，主信号结构域包含修饰的ITIM结构域，例如突变的、截短的和/或优化的ITIM结构域，其与天然ITIM结构域相比，活性已经改变(例如增加或减少)。
在一些实施方式中，免疫细胞信号域包含多个主要信号域。例如，免疫细胞信号结构域可以包含至少2个主要信号结构域，例如至少2、3、4、5、7、8、9或10个主要信号传导结构域。在一些实施方式中，免疫细胞信号结构域包含至少2个ITAM结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个ITAM结构域)。在一些实施方式中，免疫细胞信号结构域包含至少2个ITIM结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个ITIM结构域)(例如至少2个主要信号结构域)。在一些实施方式中，免疫细胞信号结构域包含ITAM和ITIM结构域。
嵌合跨膜受体多肽胞内区域的免疫细胞信号结构域可以包括共刺激结构域。在一些实施方式中，共刺激结构域(例如来自共刺激分子)可以为免疫细胞信号传导提供共刺激信号，例如来自ITAM和/或ITIM结构域的信号，例如用于免疫细胞的激活和/或失活。在如图2所示的嵌合跨膜受体的示例性构型中，免疫细胞信号结构域202包含主要信号结构域202a和至少一个共刺激结构域202b。受体的胞内区域还包括含有与切割识别位点204连接的致动部分203的GMP。在一些实施方式中，共刺激结构域对于调节免疫细胞中的增殖和/或存活信号是可操作的。在一些实施方式中，共刺激信号结构域包含MHC I类蛋白、MHC II类蛋白、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA或Toll配体受体。在一些实施方式中，共刺激结构域包含选自下组分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFRSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS-CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNFRII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。在一些实施方式中，免疫细胞信号结构域包含多个共刺激结构域，例如至少两个，例如至少3、4或5个共刺激结构域。
免疫细胞信号结构域可以与基因调节多肽(GMP)连接。GMP可以包含连接至切割识别位点的致动部分。所述驱动致动部分可包含核酸酶(例如，DNA核酸酶和/或RNA核酸酶)、核酸酶缺陷型(例如DNA核酸酶和/或RNA核酸酶)或与野生型核酸酶、其衍生物、变体或其片段相比核酸酶活性降低的经修饰的核酸酶。致动部分可以调节基因的表达和/或活性或编辑核酸序列(例如，基因和/或基因产物)。在一些实施方式中，致动部分包含DNA核酸酶，例如工程化的(例如，可编程或可靶向的)DNA核酸酶，以诱导靶DNA序列的基因组编辑。在一些实施方式中，致动部分包含RNA核酸酶，例如工程化的(例如，可编程或可靶向的)RNA核酸酶以诱导编码靶RNA序列。在一些实施方式中，致动部分的核酸酶活性降低或最低。核酸酶活性降低或最低的致动部分可以通过靶多核苷酸的物理阻碍或通过恢复有效抑制或增强靶多核苷酸表达的其他因子来调节基因的表达和/或活性。在一些实施方式中，致动部分包含源自DNA核酸酶的不含核酸酶DNA的结合蛋白，其可以诱导转录激活或抑制靶DNA序列。在一些实施方式中，致动部分包含源自RNA核酸酶的不含核酸酶RNA的结合蛋白，其可以诱导转录激活或抑制靶RNA序列。致动部分可以调节无论外源还是内源基因的表达或活性和/或编辑核酸序列。
任何合适的核酸酶都可以用于致动部分。合适的核酸酶包括但不限于，CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活剂样效应物核酸酶(TALEN)；内切酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关的RNA结合蛋白；重组酶；转座酶；Argonaute蛋白；其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。
基因的调控可以是任何目的基因。预计涵盖本文所述基因的遗传同源物。例如，基因可以表现出与本文公开基因的某种同一性和/或同源性。因此，预计可以修饰显示或展现约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同源性(核酸或蛋白质水平上)的基因。还预计可以修饰显示或展现约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性(核酸或蛋白质水平上)的基因。
在一些实施方式中，致动部分包含CRISPR相关(Cas)蛋白或在非天然存在的CRISPR(成簇规则间隔短回文重复)/Cas(CRISPR相关)系统中起作用的Cas核酸酶。在细菌中，该系统可以提供针对外源DNA的适应性免疫(Barrangou，R.等，“CRISPR提供对原核生物病毒的获得性抗性，”Science(2007)315：1709-1712；Makarova，KS等，“CRISPR-Cas系统的发展和分类，”Nat Rev Microbiol(2011)9：467-477；Garneau，J.E.等，“CRISPR/Cas细菌免疫系统切割噬菌体和质粒DNA，”Nature(2010)468：67-71；Sapranauskas，R.等，“嗜热链球菌CRISPR/Cas系统在大肠杆菌中提供免疫力(The Streptococcus thermophilusCRISPER/CAS system provides immunity in Escherichia coli)，”Nucleic Acids Res(2011)39：9275-9282)。
在包括不同哺乳动物、动物、植物和酵母在内的各种生物中，CRISPR/Cas系统(例如，修饰的和/或未修饰的)可以用作基因组工程工具。CRISPR/Cas系统可以包含与Cas蛋白复合的向导核酸，例如向导RNA(gRNA)，用于靶向调节基因表达和/或活性或核酸编辑。RNA引导的Cas蛋白(例如Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶)可以以序列依赖性方式特异性结合靶多核苷酸(例如DNA)。如果Cas蛋白具有核酸酶活性，可以切割DNA(Gasiunas，G.等，“Cas9-crRNA核糖核蛋白复合物在细菌中介导针对适应性免疫的特异性DNA切割(Cas9-crRNaribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptiveimmunity in bacteria)，”《美国科学院院报》(2012)109：E2579-E2 86；Jinek，M.等，“在细菌适应性免疫中的程序化双RNA向导的DNA内切酶(A programmable dual-RNA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity)”《科学》(Science),(2012)337：816-821；Sternberg，SH等，“CRISPR RNA向导的内切核酸酶Cas9的DNA审查(DNA interrogationby the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9)”，《自然》(Nature)(2014)507：62；Deltcheva，E.等，“CRISPR RNA通过反式编码的小RNA和宿主因子RNA酶III成熟(CRISPERRNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III)，”《自然》(2011)471：602-607)，并已广泛用于各种生物体和模型系统中的可编程基因组编辑(Cong，L.等，“用CRISPR Cas系统的多重基因组工程(Multiplexgenome engineering usingCRISPR Cas system)，”《科学》(2013)339：819-823；Jiang，W.等，“使用CRISPR-Cas系统对RNA进行细菌基因组编辑(RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems)，”Nat.Biotechnol.(2013)31：233-239；Sander，JD&Joung，J.K，“用于编辑、调控和靶向基因组的CRISPR-Cas系统(CRISPR-Cas systems for editing,regulatingand targeting genomes)”，Nature Biotechnol.(2014)32：347-355)。
在一些情况下，将Cas蛋白突变和/或修饰以产生核酸酶缺陷蛋白或相对于野生型Cas蛋白具有低核酸酶活性的蛋白。核酸酶缺陷蛋白可保留结合DNA的能力，但可能缺乏或具有低核酸切割活性。包含Cas核酸酶(例如保留野生型核酸酶活性、核酸酶活性降低和/或缺乏核酸酶活性)的致动部分可以在CRISPR/Cas系统中起作用以调节靶基因或蛋白质的水平和/或活性(例如，减少、增加或消除)。Cas蛋白可以与靶多核苷酸结合并通过物理障碍阻止转录或编辑核酸序列以产生非功能性基因产物。
在一些实施方式中，致动部分包含与向导核酸，如向导RNA(gRNA)形成复合物的Cas蛋白。在一些实施方式中，致动部分包含与单向导核酸，如单向导RNA(sgRNA)形成复合物的Cas蛋白。在一些实施方式中，致动部分包含任选地与向导核酸，如向导RNA(例如sgRNA)复合的RNA结合蛋白(RBP)，其能够与Cas蛋白形成复合物。
图3A概略性地说明包含嵌合受体多肽的系统，其中致动部分包含任选地与向导核酸(例如sgRNA)复合的RNA结合蛋白300a。从RNA结合蛋白(RBP)释放后，例如，通过向导核酸从RBP解离或在切割识别位点300c进行切割，向导核酸可以与Cas蛋白300b形成复合物，其可操作的用于调节基因表达和/或活性或编辑核酸序列。在一些实施方式中，致动部分包含来自DNA核酸酶的不含核酸酶DNA的结合蛋白，其可以诱导转录激活或抑制靶DNA序列。在一些实施方式中，致动部分包含源自RNA核酸酶的不含核酸酶RNA的结合蛋白，其可以诱导转录激活或抑制靶RNA序列。例如，致动部分可以包含缺乏切割活性的Cas蛋白。
任何合适的CRISPR/Cas系统都可以使用。CRISPR/Cas系统可以使用各种命名系统。Makarova，K.S.等，“更新的CRISPR-Cas系统的进化分类(An updated ecolutionaryclassification of CRISPR-Cas system)”，Nat Rev Microbiol(2015)13：722-736和Shmakov，S.等，“多样化2类CRISPR-Cas系统的发现和功能特征(Discovery andFunctional Characterization of Diverse Class 2CRISPR-Cas system)”Mol Cell(2015)60：1-13提供了示例性的命名系统。CRISPR/Cas系统可以是I型、II型、III型、IV型、V型、VI型系统或任何其他合适的CRISPR/Cas系统。本文使用的CRISPR/Cas系统可以是1类、2类或任何其他适当分类的CRISPR/Cas系统。1类或2类确定可以基于编码效应子模块的基因。1类系统通常具有多亚基crRNA效应复合物，而2类系统通常具有单一蛋白质，例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3或crRNA效应复合物。1类CRISPR/Cas系统可以使用多种Cas蛋白的复合物进行调控。1类CRISPR/Cas系统可包含例如I型(例如I、IA、IB、IC、ID、IE、IF、IU)、III型(例如III、IIIA、IIIB、IIIC、IIID)、和IV型(例如，IV、IVA、IVB)CRISPR/Cas类型。2类CRISPR/Cas系统可以使用单独的大Cas蛋白来进行调控。2类CRISPR/Cas系统可以包含例如II型(例如II、IIA、IIB)和V型CRISPR/Cas类型。CRISPR系统可以彼此互补，和/或可以借助反式功能单位来促进CRISPR基因座的定位。图17显示了根据图2Makarova，K.S.等，“更新的CRISPR-Cas系统的进化分类，”Nat Rev Microbiol(2015)13：722-736改编的一个图示，为CRISPR-Cas系统亚型提供基因组基因座的体系结构。
包含Cas蛋白的致动部分可以是1类或2类Cas蛋白。Cas蛋白可以是I型、II型、III型、IV型、V型或VI型Cas蛋白。Cas蛋白可以包含一个或多个结构域。结构域的非限制性实例包括向导核酸识别和/或结合结构域、核酸酶结构域(例如DNA酶或RNA酶结构域、RuvC、HNH)、DNA结合结构域、RNA结合结构域、解旋酶结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域和二聚化结构域。向导核酸识别和/或结合结构域可以与向导核酸相互作用。核酸酶结构域可以包含用于核酸切割的催化活性。核酸酶结构域可能缺乏催化活性以防止核酸切割。Cas蛋白可以是与其它蛋白或多肽融合的嵌合Cas蛋白。Cas蛋白可以是各种Cas蛋白的嵌合体，例如包含来自不同Cas蛋白的结构域。
Cas蛋白的非限制性例子包括c2c1、C2c2、c2c3、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1或Csx12)、Cas10、Cas10d、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Cpf1、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4CasC、Cscl1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx1O、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966及其同源物或修饰形式。
Cas蛋白可以来自任何合适的生物体。非限制性实例包括酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属(Streptococcus sp.)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinae spiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromo genes)、绿色产色链霉菌o(Streptomycesviridochromogenes)、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、酸热脂环酸杆菌(AlicyclobacHlus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒还原芽孢杆菌(Bacillusselenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales bacterium)、嗜樟脑单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌属(Polaromonas sp.)、海洋固氮蓝藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆菌属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、极端制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜热丙酸菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色异色菌(Allochromatiumvinosum)、海杆菌属(Marinobacter sp.)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus halophilus)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus watsoni)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、串花状丝线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶螺旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属(Arthrospira sp.)、螺旋藻属(Lyngbyasp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、移动石孢菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、海洋无核绿藻(Acaryochloris marina)、纤毛菌属(Leptotrichia shahii)和新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)。在一些方面，生物体是化脓性链球菌(S.pyogenes)。在一些方面，生物体是金黄色葡萄球菌(S.aureus)。在一些方面，生物体是嗜热链球菌(S.thermophilus)。
Cas蛋白可以来源于多种细菌物种，包括但不限于：韦永氏球菌属(Veillonellaatypical)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、龈沟产线菌(Filifactor alocis)、穆雷单菌(Solobacterium moorei)、卡图斯粪球菌(Coprococcus catus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、杜尔丹尼蛋白胨菌(Peptoniphilus duerdenii)、三冈粪链菌(Catenibacterium mitsuokai)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、无害利斯特菌(Listeria innocua)、假间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、氨基酸肠球菌(Acidaminococcus intestine)、齿龈欧氏菌(Olsenella uli)、北原酒球菌(Oenococcuskitaharae)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、移动支原体(Mycoplasma mobile)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)、犬支原体(Mycoplasma canis)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、芽孢菌亚种棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis subsp.Torquens)、营养泥杆菌(Ilyobacterpolytropus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、嗜粘蛋白艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、微小迷踪菌(Elusimicrobium minutum)、嗜硝酸盐水杆菌(Nitratifractor salsuginis)、球形刺毛菌(Sphaerochaeta globus)、产琥珀酸菌亚种产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes subsp.Succinogenes)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、普氏菌(Prevotella micans)、栖瘤胃普雷沃菌(Prevotella ruminicola)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、少食胞菌(Aminomonas paucivorans)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、海洋古螺旋菌暂定种(Candidatus Puniceispirillum marinum)、蚯蚓肾寄生菌(Verminephrobactereiseniae)、丁香罗尔斯通菌(Ralstonia syzygii)、芝江沟鞭玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)、固氮螺菌属(Azospirillum)、汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、弯曲杆菌亚种空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni subsp.Jejuni)、雪貂螺杆菌(Helicobactermustelae)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、嗜酸菌(Acidovorax ebreus)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、肠道罗斯菌(Roseburia intestinalis)、脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、多杀菌亚种多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida subsp.Multocida)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、变形杆菌(proteobacterium)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、人粪类萨特菌(Parasutterella excrementihominis)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、和新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)。
本文所用的Cas蛋白可以是野生型或Cas蛋白的修饰形式。Cas蛋白可以是野生型或经修饰的Cas蛋白的活性变体、无活性变体或片段。相对于野生型Cas蛋白，Cas蛋白可以包含氨基酸改变，例如缺失、插入、取代、变体、突变、融合、嵌合体或其任何组合。Cas蛋白可以是与野生型示例性Cas蛋白具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性或序列相似性的多肽。Cas蛋白可以是与野生型示例性Cas蛋白具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。变体或片段可以包含与野生型或修饰的Cas蛋白或其部分具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性或序列相似性。尽管缺乏核酸切割活性，变体或片段可以靶向于向导核酸复合的核酸基因座。
Cas蛋白可以包含一个或多个核酸酶结构域，例如DNase结构域。例如，Cas9蛋白可以包含RuvC样核酸酶结构域和/或HNH样核酸酶结构域。RuvC和HNH结构域可以分别切割不同的双链DNA以在DNA中产生双链断裂。Cas蛋白可以仅包含一个核酸酶结构域(例如，Cpf1包含RuvC结构域但缺少HNH结构域)。
Cas蛋白可以包含与野生型Cas蛋白的核酸酶结构域(例如RuvC结构域、HNH结构域)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％的序列同一性或序列相似性的氨基酸序列。
可以对Cas蛋白进行修饰以优化调节基因表达。可以修饰Cas蛋白以增加或降低核酸结合亲和力、核酸结合特异性和/或酶活性。也可以修饰Cas蛋白以改变蛋白质的任何其它活性或性质，例如稳定性。例如，可以对Cas蛋白的一个或多个核酸酶结构域进行修饰、缺失或失活，或可以截短Cas蛋白以去除对蛋白质功能不重要的结构域或优化(例如，增强或减少)Cas蛋白质的活性用于调节基因表达。
Cas蛋白可以是融合蛋白。例如，可将Cas蛋白融合至切割结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制结构域。Cas蛋白也可以与增加或降低稳定性的异源多肽融合。融合结构域或异源多肽可位于N端、C端或Cas蛋白内部。
Cas蛋白可以以任何形式提供。例如，可以以蛋白质的形式提供Cas蛋白，如单独的Cas蛋白或与向导核酸复合的Cas蛋白。可以以编码Cas蛋白的核酸的形式提供Cas蛋白，如RNA(例如信使RNA(mRNA))或DNA。
编码Cas蛋白的核酸可以进行密码子优化以在特定的细胞或生物体内有效翻译成蛋白质。
编码Cas蛋白的核酸可以稳定整合到细胞的基因组中。编码Cas蛋白的核酸与细胞中有活性的启动子可操作地连接。编码Cas蛋白的核酸可以与表达构建体中的启动子可操作地连接。表达构建体可以包括能够指导基因或其他目的核酸序列(例如Cas基因)表达的任何核酸构建体，并且其可以将这种目的核酸序列转移至靶细胞。
在一些实施方式中，Cas蛋白是死亡Cas蛋白。死亡Cas蛋白可以是缺乏核酸切割活性的蛋白。
Cas蛋白可以包含野生型Cas蛋白的修饰形式。野生型Cas蛋白的修饰形式可以包含降低Cas蛋白的核酸切割活性的氨基酸改变(例如缺失、插入或取代)。例如，Cas蛋白的修饰形式可以有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的野生型Cas蛋白的核酸切割活性(例如来自化脓性链球菌的Cas9)。Cas蛋白的修饰形式可以不具有实质性的核酸切割活性。当Cas蛋白质是不具有实质性核酸切割活性的修饰形式时，其可以被称为酶促无活性和/或“死亡”(缩写为“d”)。死亡Cas蛋白(例如，dCas、dCas9)可以与靶多核苷酸结合，但不能切割靶多核苷酸。在一些方面，死亡Cas蛋白质是死亡Cas9蛋白质。
dCas9多肽可以与单向导RNA(sgRNA)结合以激活或抑制靶DNA的转录。可以将sgRNA导入表达工程嵌合受体多肽的细胞中。在一些情况下，这些细胞含有靶向相同核酸的一种或多种不同的sgRNA。在其他情况下，sgRNA靶向细胞中的不同核酸。向导RNA靶向的核酸可以是在细胞如免疫细胞中表达的任何核酸。靶向的核酸可以是参与免疫细胞调节的基因。在一些实施方式中，核酸与癌症相关。与癌症相关的核酸可以是细胞周期基因、细胞应答基因、细胞凋亡基因或吞噬作用基因。重组向导RNA可被CRISPR蛋白、不含核酸酶CRISPR蛋白、其变体、其衍生物或其片段识别。
酶失活可以指以序列特异性方式与多核苷酸中的核酸序列结合的多肽，但可能不能切割靶多核苷酸。酶失活的定点多肽可以包含酶失活的结构域(例如核酸酶结构域)。非酶活性可以指没有活性。非酶活性也可以指基本上没有活性。非酶活性还可以指本质上没有活性。与野生型示例性的活性(例如，核酸切割活性、野生型Cas9活性)相比，非酶活性可以指小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于6％、小于7％、小于8％、小于9、或小于10％的活性。
Cas蛋白的一个或多个核酸酶结构域(例如，RuvC、HNH)可以缺失或突变，从而不再具有功能或包含降低的核酸酶活性。例如，在包含至少两个核酸酶结构域(例如Cas9)的Cas蛋白中，如果其中一个核酸酶结构域缺失或突变，则所产生的被称为切口酶的Cas蛋白可在双链DNA内的CRISPR RNA(crRNA)识别序列处产生单链断裂，但不会产生双链断裂。这种切口酶可以切割互补链或非互补链，但可能不能都切割。如果Cas蛋白的所有核酸酶结构域(例如Cas9蛋白中的RuvC和HNH核酸酶结构域；Cpf1蛋白中的RuvC核酸酶结构域)都缺失或突变，则所得到的Cas蛋白可能不具有裂解双链DNA两条链的能力或有所降低。可以将Cas9蛋白转变成切口酶的突变的例子是是酿脓链球菌Cas9的RuvC结构域中的D10A(在Cas9第10位的天冬氨酸变成丙氨酸)突变。来自酿脓链球菌Cas9的HNH结构域中的H939A(氨基酸位置839处的组氨酸变成丙氨酸)或H840A(氨基酸位置840处的组氨酸变成丙氨酸)可将Cas9转变成切口酶。可以将Cas9蛋白质转化为死亡Cas9的突变的例子是来自酿脓链球菌Cas9的HNH结构域中的RuvC结构域中的D10A(Cas9第10位的天冬氨酸到丙氨酸)突变和H939A(氨基酸位置839处的组氨酸变成丙氨酸)或H840A(氨基酸位置840处的组氨酸变成丙氨酸)。
相对于野生型蛋白质，死亡Cas蛋白可以包含一个或多个突变。该突变可导致野生型Cas蛋白的多个核酸切割结构域的一个或多个中的核酸切割活性小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。该突变可导致多个核酸切割结构域中的一个或多个保留切割靶核酸互补链的能力但降低其切割靶核酸非互补链的能力。该突变可导致多个核酸切割域中的一个或多个保留切割靶核酸非互补链的能力但降低其切割靶核酸互补链的能力。该突变可导致多个核酸切割结构域中的一个或多个缺乏切割靶核酸互补链和非互补链的能力。在核酸酶结构域中待突变的残基可以对应于核酸酶的一个或多个催化残基。例如，野生型示例性酿脓链球菌Cas9多肽，例如Asp10、His840、Asn854和Asn856中的残基可以突变以使多个核酸切割域(例如，核酸酶域)中的一个或多个失活。例如，如通过序列和/或结构比对确定的，Cas蛋白的核酸酶结构域中待突变的残基可对应于野生型酿脓链球菌Cas9多肽中的残基Asp10、His840、Asn854和Asn856。
作为非限制性实例，残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986和/或A987(或任何Cas蛋白的相应突变)可以被突变。例如，D10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A和/或D986A。可以是除丙氨酸替代以外的突变。
D10A突变可以与一个或多个H840A、N854A或N856A突变组合，以产生基本上缺乏DNA切割活性的Cas9蛋白(例如死亡Cas9蛋白质)。H840A突变可以与D10A、N854A或N856A突变中的一种或多种相结合以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。N854A突变可以与一种或多种H840A、D10A或N856A突变组合以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。N856A突变可以与H840A、N854A或D10A突变中的一种或多种相结合以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。
在一些实施方式中，Cas蛋白是2类Cas蛋白。在一些实施方式中，Cas蛋白是II型Cas蛋白。在一些实施方式中，Cas蛋白是Cas9蛋白、Cas9蛋白的修饰形式或衍生自Cas9蛋白。例如，缺乏切割活性的Cas9蛋白。在一些实施方式中，Cas9蛋白质是来自酿脓链球菌的Cas9蛋白(例如SwissProt保藏号Q99ZW2)。在一些实施方式中，Cas9蛋白是来自金黄色葡萄球菌的Cas9(例如SwissProt保藏号J7RUA5)。在一些实施方式中，Cas9蛋白是来自酿脓链球菌或金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白的修饰形式。在一些实施方式中，Cas9蛋白是来自酿脓链球菌或金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白。例如，化脓性链球菌或缺乏切割活性的金黄色葡萄球菌Cas9蛋白。
Cas9通常可以指与野生型示例性Cas9多肽具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列相似性的多肽(例如来自化脓性链球菌的Cas9)。Cas9可以指与野生型示例性Cas9多肽(例如来自化脓性链球菌)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。Cas9可以指野生型或包含氨基酸改变，例如，缺失、插入、取代、变体、突变、融合、嵌合或其任何组合的Cas9蛋白的修饰形式。
在一些实施方式中，致动部分包含“锌指核酸酶”或“ZFN”。ZFN是指切割结构域(例如FokI的切割结构域)与至少一个锌指基序(例如至少2、3、4或5个锌指基序)之间的融合物，所述锌指基序可以结合多核苷酸例如DNA和RNA。在两个单独ZFN的多核苷酸中的某个位置以特定的方向和间隔进行异二聚化可以导致多核苷酸的切割。例如，与DNA结合的ZFN可以诱导DNA中的双链断裂。为了使两个切割结构域二聚化并切割DNA，两个独立的ZFN可以以相隔一定距离的方式将C末端的DNA相对链结合。在一些情况下，锌指结构域和切割结构域之间的接头序列可能需要每个结合位点的5'边缘被约5-7个碱基对分开。在一些情况下，切割结构域与每个锌指结构域的C端融合。示例性的ZFN包括但不限于，在Urnov等，NatureReviews Genetics，2010,11：636-646；Gaj等，Nat Methods，2012,9(8)：805-7；美国专利号6,534,261；6,607,882；6,746,838；6,794,136；6,824,978；6,866,997；6,933,113；6,979,539；7,013,219；7,030,215；7,220,719；7,241,573；7,241,574；7,585,849；7,595,376；6,903,185；6479626；和美国公开号2003/0232410和2009/0203140中描述的那些。
在一些实施方式中，包含ZFN的致动部分可以在靶多核苷酸例如DNA中产生双链断裂。DNA中的双链断裂可导致DNA断裂修复，其能够引入基因修饰(例如核酸编辑)。DNA断裂修复可以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)发生。在HDR中，可以提供包含靶DNA的同源臂侧翼位点的供体DNA修复模板。在一些实施方式中，ZFN是锌指切口酶，其诱导位点特异性单链DNA断裂或切口，从而导致HDR。锌指切口酶的描述见如Ramirez等，NuclAcids Res，2012,40(12)：5560-8；Kim等，Genome Res，2012,22(7)：1327-33。在一些实施方式中，ZFN结合多核苷酸(例如DNA和/或RNA)但不能切割多核苷酸。
在一些实施方式中，含有ZFN的致动部分的切割结构域包含野生型切割结构域的修饰形式。切割结构域的修饰形式可以包含氨基酸改变(例如缺失、插入或取代)，降低了切割结构域的核酸切割活性。例如，裂解结构域的修饰形式可以具有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的野生型切割结构域的核酸切割活性。切割结构域的修饰形式可以不具有实质的核酸切割活性。在一些实施方式中，切割结构域是酶促无活性的。
在一些实施方式中，致动部分包含“TALEN”或“TAL效应物核酸酶”。TALEN是指工程转录激活物样效应物核酸酶，其通常含有DNA结合串联重复和切割结构域的中心结构域。TALEN可以通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生。在一些情况下，DNA结合串联重复序列包含33-35个氨基酸，并且在12和13位含有两个可识别至少一个特定DNA碱基对的高变氨基酸残基。转录激活物样效应物(TALE)蛋白可以与核酸酶融合，如野生型或突变的FokI内切核酸酶或FokI的催化结构域。在TALEN中使用了几种FokI突变，例如提高裂解特异性或活性。这样的TALEN可以被设计成结合任何所需的DNA序列。TALEN可用于通过在靶DNA序列中产生双链断裂来产生基因修饰(例如，核酸序列编辑)，进而经历NHEJ或HDR。在一些情况下，提供单链供体DNA修复模板以促进HDR。TALEN及其用于基因编辑的详细描述见如美国专利8,440,431；8,440,432；8,450,471；8,586,363；和8,697,853；Scharenberg等，Curr Gene Ther，2013,13(4)：291-303；Gaj等，Nat Methods，2012,9(8)：805-7；Beurdeley等，Nat Commun，2013,4：1762；和Joung和Sander，Nat Rev Mol CellBiol，2013,14(1)：49-55。
在一些实施方式中，工程化TALEN以降低核酸酶活性。在一些实施方式中，TALEN的核酸酶结构域包含野生型核酸酶结构域的修饰形式。核酸酶结构域的修饰形式可以包含降低核酸酶结构域的核酸切割活性的氨基酸改变(例如缺失、插入或取代)。例如，核酸酶结构域的修饰形式可以具有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的野生型核酸酶结构域的核酸切割活性。核酸酶结构域的修饰形式不具有实质的核酸切割活性。在一些实施方式中，核酸酶结构域是酶促无活性的。
在一些实施方式中，转录激活物样效应物(TALE)蛋白与可调节转录且不包含核酸酶的结构域融合。在一些实施方式中，转录激活物样效应物(TALE)蛋白被设计为起转录激活剂的作用。在一些实施方式中，转录激活物样效应物(TALE)蛋白被设计为起转录抑制的作用。例如，转录激活物样效应物(TALE)蛋白的DNA结合结构域可以融合(例如连接)到一个或多个转录激活结构域，或融合到一个或多个转录抑制结构域。转录激活结构域的非限制性例子包括单纯疱疹VP16激活结构域和VP16激活结构域的四聚体重复序列，例如VP64激活域。转录抑制结构域的非限制性实例包括Krüppel结合盒结构域。
在一些实施方式中，致动部分包含大范围核酸酶。大范围核酸酶通常指可以高度特异性的稀有内切核酸酶或归巢内切核酸酶。大范围核酸酶可识别至少12个碱基对长度的DNA靶位点，例如长度为12至40个碱基对、12至50个碱基对或12至60个碱基对。大范围核酸酶可以是模块化DNA结合核酸酶，例如包含了内切酶的至少一个催化结构域和对核酸靶序列具有特异性的至少一个DNA结合结构域或蛋白质的任何融合蛋白。DNA结合结构域可以含有至少一个识别单链或双链DNA的基序。大范围核酸酶可以是单体或二聚体。在一些实施方式中，大范围核酸酶是天然存在的(可在自然中发现的)或野生型的，在其它情况下，大范围核酸酶是非天然的、人造的、工程化的、合成的、合理设计的或人造的。在一些实施方式中，本公开内容的大范围核酸酶包括I-CreI大范围核酸酶、I-CeuI大范围核酸酶、I-MsoI大范围核酸酶、I-SceI大范围核酸酶、其变体、其衍生物及其片段。有用的大范围核酸酶及其在基因编辑中的应用的详细描述在Silva等，Curr Gene Ther，2011,11(1)：11-27；Zaslavoskiy等，BMC Bioinformatics，2014,15：191；Takeuchi等，美国科学院院报，2014,111(11)：4061-4066和美国专利号7,842,489；7,897,372；8,021,867；8,163,514；8,133,697；8,021,867；8,119,361；8,119,381；8,124,36；和8,129,134中可以找到。
在一些实施方式中，大范围核酸酶的核酸酶结构域包含野生型核酸酶结构域的修饰形式。核酸酶结构域的修饰形式可以包含降低核酸酶结构域的核酸切割活性的氨基酸改变(例如，缺失、插入或取代)。例如，核酸酶结构域的修饰形式可以具有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的野生型核酸酶结构域的核酸切割活性。核酸酶结构域的修饰形式可以不具有实质的核酸切割活性。在一些实施方式中，核酸酶结构域是酶促无活性的。在一些实施方式中，大范围核酸酶可以结合DNA但不能切割DNA。
在一些实施方式中，致动部分与一个或多个转录抑制结构域、激活物结构域、表观遗传结构域、重组酶结构域、转座酶结构域、翻转结构域、切口酶结构域或其任何组合融合。激活剂结构域可以包含位于蛋白质羧基末端的一个或多个串联激活结构域。在一些情况下，致动部分包括位于蛋白质羧基末端的一个或多个串联抑制结构域。非限制性的示例性激活结构域包括GAL4、单疱疹激活结构域VP16、VP64(单疱疹激活结构域VP16的四聚体)、NF-κBp65亚基、EB病毒R反式激活因子(Rta)，并在Chavez等，Nat Methods，2015,12(4)：326-328和美国专利申请公开号20140068797中描述。非限制性的示例性抑制结构域包括Kox1的KRAB(Krüppel相关盒)结构域、Mad mSIN3相互作用结构域(SID)、ERF阻遏蛋白结构域(ERD)，并在Chavez等，Nat Methods，2015,12(4)：326-328和美国专利申请公开号20140068797中描述。在一些实施方式中，致动部分包含位于蛋白质氨基末端的一个或多个串联阻遏蛋白结构域。
致动部分也可以与增加或降低稳定性的异源多肽融合。融合结构域或异源多肽可以位于致动部分的N端、C端或内部。
致动部分可包含易于追踪或纯化的异源多肽，例如荧光蛋白、纯化标签或表位标签。荧光蛋白的例子包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、祖母绿、阿扎米绿、单体阿扎米绿(Monomeric Azami Green)、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如YFP、eYFP、柠檬黄、金星、YPet、PhiYFP、ZsYellowl)、蓝色荧光蛋白(例如eBFP、eBFP2、蓝铜矿、mKalamal、GFPuv、蓝宝石、T-蓝宝石)、青色荧光蛋白(例如eCFP、蔚蓝的、CyPet、AmCyanl、Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-表达、DsRed2、DsRed-单体、HcRed-串联、HcRed1、AsRed2、eqFP611、m树莓、m草莓、Jred)、橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、单体Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)以及任何其他合适的荧光蛋白。标签的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、血凝素(HA)、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、SI、T7、V5、VSV-G、组氨酸(His)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和钙调蛋白。
致动部分可以通过切割切割识别位点而从GMP中释放。GMP的切割识别位点可以在免疫细胞信号结构域和嵌合跨膜受体多肽中的致动部分的侧面。切割部分可以识别和/或切割切割识别位点，例如，当接近切割识别位点时。切割部分可以包含多肽序列。切割部分可以形成嵌合衔接子多肽的一部分。切割部分可形成嵌合衔接子多肽的N端、C端或内部部分。在一些实施方式中，切割部分与嵌合衔接子多肽复合。切割部分可以与嵌合衔接子多肽的N端、C端或内部复合。图3B显示了所述系统的各种组件的示例性排布。GMP的切割识别位点304侧接免疫细胞信号结构域302和致动部分303，切割部分306形成嵌合衔接子多肽305的一部分。
图4A-D示意性地显示了从GMP释放致动部分。图4A显示了抗原与跨膜嵌合受体多肽的结合。跨膜嵌合受体多肽包含具有抗原相互作用结构域401的胞外区域和包含GMP的胞内区域。胞内区域还包含免疫细胞信号结构域。GMP包括连接至切割识别位点402b的致动部分402a。作为对抗原结合的响应，受体通过受体胞内区域的磷酸化403被修饰(图4B)。受体修饰(如磷酸化)后，将包含受体结合部分的衔接蛋白募集至受体，如图4C所示。受体包含切割部分404；切割部分可以与接头复合或连接，例如通过肽键和/或肽接头连接至受体结合部分。当接近切割识别位点时，切割部分可切割识别位点以从GMP释放致动部分，如图4D所示。释放后，致动部分可进入细胞核以调节靶基因的表达和/或活性或编辑核酸序列。图4E-H显示了一个类似的系统，其中受体修饰包括构象变化。在一些实施方式中，衔接蛋白与膜结合(例如作为膜结合蛋白)。
在一些实施方式中，当切割部分接近切割识别位点时仅切割识别位点。切割识别位点可以包含作为蛋白酶的识别序列的多肽序列。切割部分可以包含识别多肽序列的蛋白酶活性。包含蛋白酶活性的切割部分可以是蛋白酶或其任何衍生物、变体或片段。蛋白酶是指任何进行蛋白水解的酶，其中多肽被切割成更小的多肽或氨基酸。各种蛋白酶适合用作切割部分。一些蛋白酶可能是高度混杂的使得许多蛋白质底物被水解。一些蛋白酶可以是高度特异性的并且仅切割具有特定序列的底物，例如，切割识别序列或肽切割结构域。在一些实施方式中，切割识别位点包含多个切割识别序列，并且每个切割识别序列可以被包含蛋白酶活性(例如，蛋白酶)的相同或不同切割部分识别。可以用作切割部分的序列特异性蛋白酶包括但不限于，C超家族A蛋白酶，例如C1、C2、C6、C10、C12、C16、C19、C28、C31、C32、C33、C39、C47、C51、C54、C58、C64、C65、C66、C67、C70、C71、C76、C78、C83、C85、C86、C87、C93、C96、C98和C101家族，包括木瓜蛋白酶(番木瓜)、菠萝蛋白酶(菠萝)、组织蛋白酶K(地钱)和钙蛋白酶(智人)；CD超家族蛋白酶，例如C11、C13、C14、C25、C50、C80和C84家族：例如半胱天冬酶-1(褐家鼠)和分离酶(酿酒酵母)；CE超家族蛋白酶，例如C5、C48、C55、C57、C63和C79家族，包括腺苷(人类腺病毒2型)的；CF超家族蛋白酶，包括焦谷氨酰-肽酶I(解淀粉芽孢杆菌)的C15家族；CL超家族蛋白酶，例如C60和C82家族，包括分选酶A(金黄色葡萄球菌)；CM超家族蛋白酶，例如包括丙型肝炎病毒肽酶2(丙型肝炎病毒)的C18家族；CN超家族蛋白酶，例如包括辛德比斯病毒型nsP2肽酶(辛德比斯病毒)的C9家族；CO超家族蛋白酶，例如包括二肽基肽酶VI(球形芽孢杆菌，Lysinibacillus sphaericus)的C40家族；CP超家族蛋白酶，例如包括DeSI-1肽酶(小鼠，Mus musculus)的C97家族；PA超家族蛋白酶，例如包括TEV蛋白酶(烟草蚀刻病毒)的C3、C4、C24、C30、C37、C62、C74和C99家族；PB超家族蛋白酶，例如，包括酰胺磷酸核糖基转移酶前体(智人)的C44、C45、C59、C69、C89和C95家族；PC超家族蛋白酶，包括γ-谷氨酰水解酶(褐家鼠，Rattus norvegicus)的C26和C56家族；PD超家族蛋白酶，例如包括Hedgehog蛋白(果蝇，Drosophila melanogaster)的C46家族；PE超家族蛋白酶，例如包括DmpA氨肽酶(苍白杆菌，Ochrobactrum anthropi)的P1家族；其它蛋白酶，例如C7、C8、C21、C23、C27、C36、C42、C53和C75家族。另外的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶，例如SB超家族的那些，例如包括枯草杆菌蛋白酶(地衣芽孢杆菌)的S8和S53家族；SC超家族的那些，例如包括脯氨酰寡肽酶(野猪，Sus scrofa)的S9，S10，S15，S28，S33和S37家族；SE超家族的那些，例如包括D-Ala-D-Ala肽酶C(大肠杆菌)的S11，S12和S13家族；SF超家族的那些，例如包括信号肽酶I(大肠杆菌)的S24和S26家族；SJ超家族的那些，例如包括lon-A肽酶(大肠杆菌)的S16，S50和S69家族；SK超家族的那些，例如包括Clp蛋白酶(大肠杆菌)的S14，S41和S49家族；SO超家族的那些，例如包括噬菌体K1F内唾液酸酶CIMCD自切割蛋白(肠杆菌噬菌体K1F)的S74家族；SP超家族的那些，例如包括核孔蛋白145(智人)的S59家族；SR超家族的那些，例如包括乳铁蛋白(智人)的S60家族；SS超家族的那些，包括胞壁质四肽酶LD-羧肽酶(铜绿假单胞菌)的S66家族；ST超家族的那些，例如包括菱形-1(黑腹果蝇)的S54家族；PA超家族的那些，包括胰凝乳蛋白酶A(牛，Bos taurus)的S1、S3、S6、S7、S29、S30、S31、S32、S39、S46、S55、S64、S65和S75家族；PB超家族的那些，例如包括青霉素G酰基转移酶前体(大肠杆菌)的S45和S63家族；PC超家族的那些，例如包括二肽酶E(大肠杆菌)的S51家族；PE超家族的那些，例如包括DmpA氨肽酶(Ochrobactrum anthropi)的P1家族；那些未指定的，例如家族S48、S62、S68、S71、S72、S79和S81苏氨酸蛋白酶，例如PB超家族氏族的那些，例如包括古细菌蛋白酶体，β组分(嗜酸热原体)的T1、T2、T3和T6家族；和那些超家族PE氏族，例如，包括鸟氨酸乙酰转移酶(酿酒酵母)的T5家族；天冬氨酸蛋白酶，例如BACE1、BACE2；组织蛋白酶D；组织蛋白酶E；凝乳酶；天冬氨酸蛋白酶A；猪笼草蛋白酶；胃蛋白酶；阮酶(plasmesin)；早老蛋白；肾素；和HIV-1蛋白酶，以及金属蛋白酶，例如外肽酶、金属表肽酶；内肽酶和金属内肽酶。切割识别序列(例如，多肽序列)可以被本文公开的任何蛋白酶识别。
在一些实施方式中，切割识别位点包含被蛋白酶识别的切割识别序列(例如，多肽序列或肽切割结构域)，蛋白酶选自下组：无色肽酶、氨肽酶、安克洛酶、血管紧张素转化酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、钙蛋白酶I、钙蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶13、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、胃促胰酶、糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体C1r、补体C1s、补体因子D、补体因子I、黄瓜素、二肽基肽酶IV、弹性蛋白酶(白细胞)、弹性蛋白酶(胰腺)、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C、肠激酶、因子Xa、无花果蛋白、弗林蛋白酶、粒酶A、粒酶B、HIV蛋白酶、IGase、激肽释放酶组织、亮氨酸氨肽酶(一般)、亮氨酸氨肽酶(胞质溶胶)、亮氨酸氨肽酶(微粒体)、基质金属蛋白酶、甲硫氨酸氨肽酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶、脯氨酸酶、链霉蛋白酶E、前列腺特异性抗原、来自灰曲霉链霉菌的嗜碱蛋白酶、来自曲霉的蛋白酶、来自斋藤曲霉的蛋白酶、来自酱油曲霉的蛋白酶、蛋白酶(地衣芽孢杆菌)(碱性或碱性蛋白酶)、来自芽孢杆菌属的蛋白酶、来自根霉属的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶体、来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨肽酶、凝乳酶、肾素、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、组织纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、类胰蛋白酶和尿激酶。
表2列出了可用于本公开系统的示例性蛋白酶和相关的识别序列。
表2.示例性蛋白酶和相关的识别序列
选择用作切割部分的蛋白酶可以基于需要的特性来选择，如肽键选择性、某些pH值下的活性、分子量等。表3中提供了示例性蛋白酶的性质。
表3.示例性蛋白酶和蛋白酶特性
在一些实施方式中，切割识别位点包含内含肽序列的第一部分，其与内含肽序列的第二部分反应以释放致动部分。可以使用异源分裂内含肽系统来促进致动部分从嵌合受体多肽释放。致动部分可以共价连接至内含肽序列的第一部分。致动部分可以通过其N端或C端连接至内含肽序列的第一部分。内含肽序列的第二部分可以是嵌合衔接子多肽的一部分。内含肽序列的第二部分可以当做切割部分。内含肽序列的第一部分或第二部分可以是N端内含肽、C端内含肽或可促进致动部分释放的内含肽的任何其他合适部分。内含肽序列可以来自任何合适的来源。第一部分和第二部分可以来自相同或不同的来源(例如生物体、蛋白质)。
在图12A所示的说明性示例中，嵌合受体多肽包含致动部分1201经由肽键共价连接(例如，在其N端或C端)至内含肽序列1202的第一部分，其包含N端内含肽。如图12B所示，致动部分-N端内含肽融合蛋白可与包含C端内含肽的内含肽序列1203的第二部分接触，例如与衔接子多肽连接的内含肽序列的第二部分。如图12C所示，内含肽序列的第一和第二部分的这种接触可导致位点特异性切割(例如，在致动部分和N端内含子之间的位点)，从而释放致动部分，如图12D所示。在图12E-H所示的可选构型中，致动部分与衔接子多肽而不是受体多肽相连接和/或复合。在另一个说明性实例中，致动部分可以通过肽键共价连接(例如，在其N端或C端)至包含C端内含肽的内含肽的第一部分。致动部分-C端内含肽融合体可与包含N端内含肽的内含肽序列的第二部分接触。内含子的第一部分和第二部分的这种接触可以导致位点特异性切割(例如，在致动部分和C端内含子之间的合适位点)，由此释放致动部分。
在一些实施方式中，切割识别位点包含二硫键。二硫键可将致动部分连接至嵌合受体多肽。二硫键可以在致动部分的一个或多个半胱氨酸和受体之间形成。半胱氨酸可以被工程化到致动部分或受体中。半胱氨酸可以是天然或野生型序列的一部分。半胱氨酸可以存在于连接有致动部分或受体的连接肽中。通过改变例如，二硫键氧化还原条件的改变可以促进二硫键的切割。氧化还原条件的改变可导致二硫键还原成硫醇并释放致动部分。含有氧化还原剂(可催化二硫键还原)的切割部分可以促进二硫键的切割。氧化还原剂可以是酶或其任何衍生物、变体或片段。酶可以是氧化还原酶。氧化还原酶的例子包括蛋白质-二硫化物还原酶、硫氧还蛋白、谷氧还蛋白、硫醇二硫化物氧化还原酶(例如DsbA，BdbA-D，MdbA和SdbA)和谷胱甘肽二硫化物还原酶。氧化还原剂可以来自任何合适的来源，包括原核生物和真核生物。可以提供辅因子(例如，烟酰胺辅因子、黄素及其衍生物和类似物)以实现酶的最佳活性。在图13A所示的说明性实例中，嵌合受体多肽包含通过二硫键连接的致动部分1301。二硫键可以被包含酶，如氧化还原酶的切割部分1302切割，例如与衔接子多肽和/或连接的氧化还原酶复合，如图13B所示。如图13C所示，二硫键的切割可以释放致动部分。释放后，致动部分可以易位至细胞核，细胞核可用于操作调节基因表达和/或活性或编辑核酸序列，如图13D所示。图13E-H显示了可选构型，其中所述致动部分与所述衔接子多肽复合和/或连接，并且所述切割部分(例如氧化还原酶)与所述受体连接。
在一些实施方式中，嵌合跨膜受体多肽包含至少一个靶向序列，其向导受体转运至细胞的特定区域。靶向序列可用于指导靶向序列所连接的多肽与细胞特定区域的转运。例如，靶向序列可以利用核定位信号(NLS)将受体引导至细胞核，利用细胞核的输出信号(NES)、线粒体、内质网(ER)、高尔基体、叶绿体、质外体、过氧化物酶体、质膜、细胞膜或各细胞的各种细胞器的膜。在一些实施方式中，靶向序列包含核输出信号(NES)并将多肽引导至核外，例如导向细胞的细胞质。靶向序列可以利用各种核输出信号将多肽导向细胞质。核输出信号通常是靶向蛋白质的疏水性残基的短氨基酸序列(例如至少约2、3、4或5个疏水性残基)，其通过核孔复合物使用核运输从细胞核输出至细胞质。并非所有的NES底物都可以从核内组成性地输出。在一些实施方式中，靶向序列包含核定位信号(NLS，例如SV40NLS)并将多肽引导至细胞核。靶向序列可以利用各种核定位信号(NLS)将多肽引导至细胞核。NLS可以是单组序列或双组序列。
NLS的非限制性实例包括衍生自以下的NLS序列：具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ IDNO:2)的SV40病毒大T抗原的NLS；来自核质蛋白的NLS(例如具有序列KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:3)的核质蛋白二分体NLS)；具有氨基酸序列PAAKRVKLD(SEQ ID NO:4)或RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:5)的c-myc NLS；具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:6)的hRNPA1 M9 NLS；来自importin-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRVVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:7)；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ ID NO:8)和PPKKARED(SEQ ID NO:9)；人p53的序列PQPKKKPL(SEQ ID NO:10)；小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:11)；流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQID NO:12)和PKQKKRK(SEQ ID NO:13)；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:14)；小鼠Mx1蛋白质的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO:15)；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:16)；和类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方式中，靶向序列包含膜靶向肽并将多肽引导至细胞器的质膜或膜。膜靶向序列可以提供嵌合跨膜受体多肽转运至细胞表面膜或其他细胞膜。与细胞膜相关的分子含有促进膜结合的某些区域，这样的区域可以结合到膜靶向序列中。例如，一些蛋白质在N-末端或C-末端含有被酰化的序列，并且这些酰基部分促进膜结合。这样的序列可以被酰基转移酶识别并且经常符合特定的序列基序。某些酰化基序能够用单个酰基部分(通常接着是几个带正电荷的残基(例如人c-Src)以改善与阴离子脂质头部基团的结合)进行修饰，而其他酰化基序能够用多个酰基部分进行修饰。例如，蛋白酪氨酸激酶Src的N-末端序列可以包含单个肉豆蔻酰基部分。双酰化区域位于某些蛋白激酶的N端区域内，例如Src家族成员的子集(例如Yes、Fyn、Lck)和G蛋白α亚基。这种双重酰化区域通常位于这些蛋白质的前十八个氨基酸内，并符合序列基序Met-Gly-Cys-Xaa-Cys(SEQ ID NO:18)，其中Met被切割，Gly被N-酰化且一个Cys残基被S-酰化。Gly通常是肉豆蔻酰化的，而Cys可以是棕榈酰化的。符合序列基序Cys-Ala-Ala-Xaa的酰化区(也称为“CAAX盒”)，其可以用C15或C10异戊二烯基部分从G蛋白γ亚基的C-末端修饰，也可以使用其它蛋白质修饰。这些和其它酰化基序包括，例如，Gauthier-Campbell等，细胞分子生物学(Molecular Biology of the Cell)15：2205-2217(2004)；Glabati等，Biochem.(303)697-700(1994)和Zlakine等，细胞科学期刊(Cell Science)110：673-679(1997)中讨论的那些，并且可以并入靶向序列中以诱导膜定位。
在某些实施方式中，将来自含有酰化基序的蛋白质天然序列并入靶向序列中。例如，在一些实施方式中，可将Lck、Fyn或Yes或G蛋白α亚基，如这些蛋白质的前25个或更少的N-末端氨基酸(如，具有任选突变的所述天然序列的约5-20个氨基酸，约10-19个氨基酸，或约15-19个氨基酸)的N端部分并入嵌合多肽的N端内。在某些实施方式中，可以将含有CAAX盒基序列的G蛋白γ亚基的约25个或更少的氨基酸的C末端序列(例如，具有任选突变的所述天然序列的约5至约20个氨基酸、约10至约18个氨基酸或约15至约18个氨基酸)可连接至嵌合多肽的C端。
可以使用任何膜靶向序列。在一些实施例中，这样的序列包括但不限于，豆蔻酰化靶向序列、棕榈酰化靶向序列、异戊烯化序列(即法尼基化、香叶基香叶酰化、CAAX盒)、蛋白质-蛋白质相互作用基序或来自受体的跨膜序列(利用信号肽)。例子包括，如tenKlooster，J.P.等，细胞生物学(2007)99,1-12；Vincent，S.等，自然生物技术(NatureBiotechnology)21：936-40,1098(2003)讨论的那些。
存在其他蛋白质结构域，其可以增加各种膜的蛋白质沉积。例如，在超过200种通常参与细胞内信号转导的人蛋白中发现约120个氨基酸同源(PH)结构域。PH结构域可以结合膜内的各种磷脂酰肌醇(PI)脂质(例如PI(3,4,5)-P3、PI(3,4)-P2、PI(4,5)-P2)，因此可以在募集蛋白质到不同的膜或细胞室中起关键作用。通常PI脂质的磷酸化状态受到调节，例如通过PI-3激酶或PTEN，因此，膜与PH结构域的相互作用可能不如酰基脂质那样稳定。
在一些实施方式中，将多肽引导至细胞膜的靶向序列可以利用膜锚定信号序列。各种膜锚定序列是可用的。例如，可以使用各种膜结合蛋白的膜锚定信号序列。序列可以包括：1)I类整合膜蛋白如IL-2受体β链和胰岛素受体β链；2)II类整合膜蛋白如中性内肽酶；3)III型蛋白，如人细胞色素P450NF25；和4)IV型蛋白如人P-糖蛋白。
在一些实施方式中，嵌合受体多肽连接至可协助蛋白质折叠的多肽折叠结构域。在一些实施方式中，致动部分与细胞穿透结构域连接。例如，细胞穿透结构域可以来源于HIV-1TAT蛋白，TLM细胞穿透模体来源于人类乙肝病毒、MPG、Pep-1、VP22，细胞穿透肽来源于单纯疱疹病毒或多聚精氨酸肽序列。细胞穿透结构域可位于N端、C端或致动部分内的任何位置。
靶向序列可以连接至嵌合受体多肽的任何适当区域，例如在N端、C端或受体内部区域。在一些实施方式中，至少两个靶向序列与受体连接。在图5所示的示例性嵌合受体多肽中，第一靶向序列501a可以与受体的胞外区连接，第二靶向序列501b可以与受体的胞内区连接，例如与GMP连接。当受体与多个靶向序列连接时，例如针对细胞不同位置的靶向序列，受体的最终定位可以通过靶向序列的相对强度来确定。例如，如果NES比NLS强，则具有包含NES的导向序列和包含NLS的导向序列的受体可定位至细胞质。或者，如果NLS比NES更强，即使受体上存在核定位信号和核输出信号，受体也可以定位于细胞核。靶向序列可以包含如NLS和NES的多个拷贝，以微调细胞定位的程度。
在一些情况下，靶向序列与致动部分连接。通过切割切割识别位点从GMP中释放致动部分后，靶向序列可将致动部分导向与受体不同的细胞位置。例如，嵌合跨膜受体可以包含将受体引导至质膜的第一靶向序列，致动部分可以分别包含引导定位至细胞核的第二靶向序列。起初，由于第一靶向序列，致动部分(形成受体的一部分)可以定位于质膜。通过切割切割识别位点从GMP释放致动部分之后，致动部分可通过第二靶向序列的靶向定位于细胞核。在一些实施方式中，致动部分在切割识别位点切割后易位至细胞核。
当受体多肽在与抗原结合后发生修饰时，嵌合衔接子多肽与嵌合跨膜受体多肽的结合可使切割部分接近切割识别位点。识别位点的切割可以从GMP中释放致动部分。释放后，致动部分可与靶多核苷酸复合，例如在细胞质或细胞核中。致动部分与靶多核苷酸的复合可以调节至少一个基因的表达和/或活性或编辑核酸序列。
在另一个示例性构型中，GMP形成嵌合衔接子多肽的一部分，并且裂解部分形成嵌合跨膜受体多肽的胞内区域的一部分。示例性构型的嵌合衔接子多肽可以包含(a)结合与抗原结合后经过修饰的受体的受体结合部分，所述受体包含含有免疫细胞信号结构域的胞内区；和(b)与所述受体结合部分连接的基因调节多肽(GMP)，其中所述GMP包含与切割识别位点连接的致动部分；其中只有在受体结合部分与修饰受体结合后，通过切割切割识别位点才能从GMP释放致动部分。如图6A所示，示例性嵌合衔接子多肽可包含与GMP 602连接的受体结合部分601。GMP可以包含连接至切割识别位点604的致动部分603。
嵌合衔接子多肽的受体结合部分可以是能结合受体的任何蛋白质、其衍生物、其变体或其片段。受体结合部分可以结合如响应于抗原结合而经受体修饰的嵌合跨膜受体。受体结合部分可以包含结合配体(例如蛋白质)的结合结构域，该结合结构域被募集到已经经受体修饰的受体。在一些实施方式中，受体修饰包括受体的至少一个区域中的构象变化。在一些实施方式中，受体修饰包含化学修饰、例如磷酸化或去磷酸化。在一些实施方式中，受体修饰包括在多个修饰位点处的修饰，并且每个修饰位点有效地结合衔接子多肽。在一些情况下，受体结合部分结合免疫细胞信号结构域。受体结合部分可以结合例如主信号传导结构域和/或共刺激结构域。当受体包含ITAM或ITIM结构域时，受体结合部分可包含募集至磷酸化ITAM或ITIM的结合配偶体(例如蛋白质)或其任何衍生物、变体或片段。
能够结合磷酸化底物，如磷酸化的ITAM和/或ITIM的结合配偶体(例如蛋白质)包括但不限于，分子，如同源2(SH2)结构域和磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域蛋白。含有SH2结构域的蛋白质的例子包括：ABL1、ABL2、BCAR3、BLK、BLNK、BMX、BTK、CHN2、CISH、CRK、CRKL、CSK、DAPP1、EAT-2、FER、FES、FGR、FRK、FYN、GADS、GRAP、GRAP2、GRB10、GRB14、GRB2、GRB7、HCK、HSH2D、INPP5D、INPPL1、ITK、JAK2、LCK、LCP2、LYN、MATK、NCK1、NCK2、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PLCG1、PLCG2、PTK6、PTPN11、PTPN6、RASA1、SAP、SH2B1、SH2B2、SH2B3、SH2D1A、SH2D1B、SH2D2A、SH2D3A、SH2D3C、SH2D4A、SH2D4B、SH2D5、SH2D6、SH3BP2、SHB、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、SHD、SHE、SHP1、SHP2、SLA、SLA2、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、SRC、SRMS、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUPT6H、SYK、TEC、TENC1、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、TXK、VAV1、VAV2、VAV3、YES1和ZAP70。包含PTB结构域的蛋白质的例子包括：APBA1、APBA2、APBA3、EPS8、EPS8L1、EPS8L2、EPS8L3、TENC1、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6、DOK7、FRS2、FRS3、IRS1、IRS2、IRS3、IRS4、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、TLN1、TLN2和X11a。在一些实施方式中，受体结合部分包含含有SH2结构域和/或PTB结构域的蛋白质，或其任何衍生物、变体或片段。在一些实施方式中，受体结合部分包含ZAP70的受体结合结构域。在一些实施方式中，受体结合部分包含募集至修饰受体的共刺激分子或其任何衍生物、变体或片段。
在一些构型中，所述系统的嵌合衔接子多肽可以包含基因调节多肽(GMP)。如本文别处所述，GMP可包含连接至切割识别位点的致动部分。致动部分可以包含核酸酶(例如DNA核酸酶和/或RNA核酸酶)、修饰的核酸酶(例如DNA核酸酶和/或RNA核酸酶)，其与如本文其他地方所述的野生型核酸酶、其变体、其衍生物或其片段相比有核酸酶缺陷或核酸酶活性降低。致动部分可以调节基因的表达和/或活性或编辑核酸(例如，基因和/或基因产物)的序列。致动部分可以调节无论是外源还是内源基因的表达或活性和/或编辑核酸序列。在一些实施方式中，致动部分包含DNA核酸酶，例如工程化的(例如，可改造或可靶向的)DNA核酸酶，以诱导靶DNA序列的基因组编辑。在一些实施方式中，致动部分包含RNA核酸酶，例如工程化(例如，可改造或可靶向的)RNA核酸酶，以诱导编码靶RNA序列。在一些实施方式中，致动部分的核酸酶活性降低或最小。核酸酶活性降低或最小的致动部分可以通过靶多核苷酸的物理阻碍或募集额外的有效因子来调节基因的表达和/或活性以抑制或增强靶多核苷酸的表达。在一些实施方式中，致动部分包含源自DNA核酸酶的无核酸酶DNA结合蛋白，所述DNA核酸酶可以诱导转录激活或抑制靶DNA序列。在一些实施方式中，致动部分包含源自RNA核酸酶的无核酸酶RNA结合蛋白，所述RNA核酸酶可以诱导转录激活或抑制靶RNA序列。在一些实施方式中，致动部分包含缺乏切割活性的Cas蛋白。
任何合适的核酸酶都可以用于致动部分。合适的核酸酶包括但不限于，CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽、和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活剂样效应物核酸酶(TALEN)；大范围核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关的RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；阿尔古蛋白；其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。
在一些实施方式中，致动部分包含与向导核酸(如向导RNA)形成复合物的Cas蛋白。在一些实施方式中，致动部分包含任选与向导核酸复合的RNA结合蛋白(RBP)，如向导RNA，其能够与Cas蛋白形成复合物。图6B显示了示例性的嵌合衔接子多肽，其中致动部分包含任选与向导核酸复合的RNA结合蛋白600a。从RNA结合蛋白(RBP)释放后，例如通过从RBP解离向导核酸或在切割识别位点的切割，向导核酸可以与用于调节基因表达和/或活性或编辑核酸序列的Cas蛋白600b形成复合物。在一些实施方式中，致动部分包含源自DNA核酸酶的无核酸酶DNA结合蛋白，其可以诱导转录激活或抑制靶DNA序列。在一些实施方式中，致动部分包含源自RNA核酸酶的无核酸酶RNA结合蛋白，其可以诱导转录激活或抑制靶RNA序列。在一些实施方式中，致动部分可以包含缺乏切割活性的Cas蛋白。
在一些实施方式中，切割识别位点侧接受体结合部分和致动部分。通过切割部分对切割识别位点进行切割，可以从GMP中释放致动部分。例如，当接近切割识别位点时，切割部分可识别和/或切割切割识别位点。切割部分可以包含多肽序列。在一些构型中，切割部分形成嵌合跨膜受体多肽的一部分。切割部分可以形成受体的N端、C端或内部部分。切割部分可以与N端、C端或受体的内部复合。在图7所示的示例性构型中，切割识别位点703侧接受体结合部分701和致动部分704，并且切割部分706形成嵌合跨膜受体多肽705的一部分。
图8A-D示意性地显示了从GMP释放致动部分。图8A显示了抗原与跨膜嵌合受体多肽的结合。跨膜嵌合受体多肽包含具有抗原相互作用结构域805的胞外区和包含切割结构部分806的胞内区。切割部分可以与受体复合或者例如通过肽键和/或肽接头与受体连接。GMP形成嵌合衔接子多肽的一部分。与受体结合部分801连接的GMP包括连接至切割识别位点802b的致动部分802a。响应于抗原结合，受体通过受体胞内区域中的磷酸化803进行修饰(图8B)。在受体修饰(例如磷酸化)后，如图8C所示，将嵌合衔接子多肽募集至受体。受体包含切割部分806。当接近切割识别位点时，切割部分可切割识别位点以从而自GMP释放致动部分，如图8D所示。释放后，致动部分可进入细胞核以调节靶基因的表达和/或活性或编辑核酸序列。图8E-H显示了类似的系统，其中受体修饰包含构象变化。在一些实施方式中，嵌合衔接子蛋白与膜结合(例如，作为膜结合蛋白)。
在其它构型中，当受体多肽在与抗原结合后经过修饰，切割部分与第二衔接子多肽复合，所述第二衔接子多肽与嵌合跨膜受体多肽结合。在图9所示的示例性构型中，切割识别位点903侧接受体结合部分901和致动部分904，并且切割部分906形成第二衔接子多肽907的一部分。
图10A-D示意性地显示了从GMP释放致动部分。图10A显示了抗原与跨膜嵌合受体多肽的结合。跨膜嵌合受体多肽包含具有抗原相互作用结构域和胞内区的胞外区。包含与切割识别位点连接的致动部分的GMP形成了嵌合衔接子多肽的一部分。切割识别位点1002b侧接受体结合部分1001和致动部分1002a。响应于抗原结合，受体被胞内区域中的磷酸化1003修饰(图10B)。在受体修饰(例如磷酸化)后，嵌合衔接子多肽被募集至受体，如图10B所示。包含切割部分1006的第二衔接子多肽1007也被募集至经修饰的受体(图10C)。切割部分可以与第二衔接子多肽复合或者例如通过肽键和/或肽接头连接至接头。当接近切割识别位点时，切割部分可切割识别位点以从GMP释放致动部分，如图10D所示。释放后，致动部分可进入细胞核以调节靶基因的表达和/或活性或编辑核酸序列。图10E-H显示了具有另一种构型的系统，其中嵌合衔接子多肽包含所述切割部分，第二衔接子多肽包含所述致动部分。在一些实施方式中，嵌合衔接子多肽与膜结合(例如，作为膜结合蛋白)。在一些实施方式中，第二衔接子多肽与膜结合(例如，作为膜结合蛋白)。
图18A-D示意性地显示了在包含第一膜拴衔接子和第二胞质衔接子的系统中释放致动部分。图18A显示了包含膜束缚结构域1801a(例如CAAX)的第一膜拴衔接子、蛋白酶识别位点1801b(例如TEV)、和具有嵌合跨膜受体1802的致动部分1801c。嵌合跨膜受体可作为支架功能并且包含至少两个衔接子结合位点(例如，EGFR或受体酪氨酸激酶(RTK))。如图18B所示，一个衔接子结合位点可以与膜拴衔接子相关联。在一些情况下，膜拴衔接子的结合取决于抗原与受体的结合。在一些系统中，膜拴衔接子位于受体附近，并且结合可能不取决于抗原与受体的结合。如图18B和18C所示，抗原与受体的相互作用可将包含胞质受体结合部分1803a和蛋白酶1803b的第二衔接子蛋白募集至受体的其他衔接子结合位点。包含蛋白酶的第二衔接子蛋白在被募集到跨膜受体时可以切割膜拴分子的蛋白酶识别位点1801b，从而释放致动部分1801c，如图18D所示。
在一些实施方式中，当接近切割识别位点时，切割部分仅在识别位点切割。在一些实施方式中，切割识别位点包含作为蛋白酶(例如，肽切割结构域)的识别序列的多肽序列。切割部分包含识别多肽序列的蛋白酶活性。包含蛋白酶活性的切割部分可以包含任何蛋白酶，包括但不限于本文其它地方描述的蛋白酶或其任何衍生物、变体或片段。在一些实施方式中，切割识别位点包含多个切割识别序列，并且每个切割识别序列可以被包含蛋白酶活性(例如蛋白酶)的相同或不同切割部分识别。
在一些实施方式中，切割识别位点包含内含肽序列的第一部分，其与内含肽序列的第二部分反应以释放致动部分。异源分裂内含肽系统可以用于促进致动部分从嵌合衔接子肽释放。致动部分可以共价连接内含肽序列的第一部分。致动部分可以通过其N端或C端连接内含肽序列的第一部分。切割部分可以包含内含肽序列的第二部分。内含肽序列的第一部分或第二部分可以是N端内含肽、C端内含肽或内含肽的任何其它可以促进致动部分释放的合适部分。内含肽序列可以来自任何合适的来源。第一部分和第二部分可以来自相同或不同的来源(例如生物体，蛋白质)。在说明性实例中，致动部分可经由肽键共价连接(例如，在其N端或C端)至内含子序列的第一部分，其包含N端内含肽。致动部分-N端内含肽融合体可与包含C端内含肽的内含肽序列的第二部分接触。内含肽序列的第一和第二部分的这种接触可导致位点特异性切割(例如，在致动部分和N端内含子之间的位点)，从而释放致动部分。在另一个说明性实例中，致动部分可以通过肽键共价连接(例如，在其N端或C端)至包含C端内含肽的内含肽的第一部分。致动部分-C端内含肽融合体可与包含N端内含肽的内含肽序列的第二部分接触。内含子的第一部分和第二部分的这种接触可以导致位点特异性切割(例如，在致动部分和C端内含子之间的合适位点)，从而释放致动部分。
在一些实施方式中，切割识别位点包含二硫键。二硫键可将致动部分连接至嵌合衔接子多肽中的受体结合部分。二硫键可以在致动部分的一个或多个半胱氨酸和受体结合部分之间形成。半胱氨酸可以工程化到致动部分或受体结合部分。半胱氨酸可以是致动部分或受体结合部分的天然或野生型序列的一部分。半胱氨酸可以存在于与致动部分或受体结合部分相连的连接肽中。通过例如，改变二硫键的氧化还原条件可以促进二硫键的切割。氧化还原条件的改变可导致二硫键还原成硫醇并释放致动部分。可以通过包含可导致二硫键还原的氧化还原剂的切割部分来促进二硫键的切割。氧化还原剂可以是酶或其任何衍生物、变体或片段。酶可以是氧化还原酶。氧化还原酶的实例包括蛋白质-二硫化物还原酶、硫氧还蛋白、谷氧还蛋白、硫醇二硫化物氧化还原酶(例如DsbA、BdbA-D、MdbA、SdbA)和谷胱甘肽二硫化物还原酶。氧化还原剂可以来自任何合适的来源，包括原核生物和真核生物。可以提供辅因子(例如，烟酰胺辅因子、黄素及其衍生物和类似物)以实现酶的最佳活性。
在一些实施方式中，嵌合衔接子多肽包含至少一个靶向序列，其引导衔接子转运至细胞的特定区域。例如，靶向序列可以利用核定位信号(NLS)将衔接子引导至细胞核，利用核输出信号(NES)、线粒体、内质网(ER)、高尔基体、叶绿体、质外体、过氧化物酶体、质膜、或各种细胞器的膜引导至细胞核外(例如，到细胞质)。在一些实施方式中，靶向序列包含核输出信号(NES)并将嵌合衔接子多肽引导至细胞核的外部。在一些实施方式中，靶向序列包含核定位信号(NLS)并将衔接子引导至细胞核。靶向序列可以利用各种核定位信号(NLS)将衔接子引导至细胞核。在一些实施方式中，靶向序列包含膜靶向肽并将衔接子引导至细胞器的质膜或膜。如前所述，靶向序列可以利用膜锚定信号序列将衔接子引导至膜。各种膜锚定序列是可用的。
靶向序列可以连接到嵌合衔接子多肽的任何适当区域，例如在多肽的N末端或C末端或衔接子的内部区域。在一些实施方式中，至少两个靶向序列连接至衔接子。例如，如图11所示，第一靶向序列1101a可以连接至衔接子的受体结合部分，并且第二靶向序列1101b可以连接至衔接子的GMP，例如连接至致动部分。当衔接子与多个靶向序列连接时，例如针对细胞不同位置的靶向序列时，衔接子的最终定位可以通过靶向序列的相对强度来确定。例如，如果NES比NLS强，具有包含了NES的导向序列和包含NLS的导向序列的衔接子可以定位于胞质溶胶。或者，如果NLS比NES更强，则即使衔接子上存在核定位信号和核输出信号，衔接子也可以定位到细胞核。靶向序列可以包含例如NLS和NES的多个拷贝，以微调细胞定位的程度。
在一些情况下，靶向序列与致动部分连接。在通过对切割识别位点进行切割并从GMP释放致动部分后，靶向序列可将致动部分引导至不同于衔接子的细胞位置。例如，嵌合衔接子多肽可以包含将衔接子引导至细胞质的第一靶向序列，致动部分可以分别包含引导定位至细胞核的第二靶向序列。起初，由于第一靶向序列，致动部分(形成衔接子的一部分)可以定位于细胞质。在通过切割切割识别位点从GMP释放致动部分之后，致动部分可以通过第二靶向序列的靶向定位至细胞核。在一些实施方式中，致动部分在切割识别序列切割后易位至细胞核。
在一些实施方式中，靶向序列包含膜靶向肽并将多肽引导至细胞器的质膜或膜。膜靶向序列可以将嵌合跨膜受体多肽转运至细胞表面膜或其他细胞膜。可以使用本文先前描述的任何合适的膜靶序列。
在一些实施方式中，嵌合衔接子多肽连接至可协助蛋白质折叠的多肽折叠结构域。在一些实施方式中，致动部分可以与细胞穿透结构域连接。例如，细胞穿透结构域可以来源于HIV-1TAT蛋白，TLM细胞穿透基序来源于人乙型肝炎病毒、MPG、Pep-1、VP22细胞穿透肽来源于单纯疱疹病毒或多聚精氨酸肽序列。细胞穿透结构域可位于N端、C端或致动部分内的任何位置。
本发明系统的致动部分从嵌合衔接子多肽或嵌合跨膜受体多肽释放后，可以通过靶多核苷酸的物理阻碍或募集有效抑制或增强靶多核苷酸表达的额外因子来结合靶多核苷酸并调节靶多核苷酸的表达和/或活性。在一些实施方式中，致动部分包含有效增加靶多核苷酸表达的转录激活因子。致动部分可以包含有效降低靶多核苷酸表达的转录抑制物。在一些实施例中，致动部分可以编辑核酸序列。
在一些实施方式中，靶多核苷酸包含基因组DNA。在一些实施方式中，靶多核苷酸包含质粒的区域，例如携带外源基因的质粒。在一些实施方式中，靶多核苷酸包含RNA，例如mRNA。在一些实施方式中，靶多核苷酸包含内源基因或基因产物。致动部分可以包括核定位信号的一个或多个拷贝，其允许驱动器在从GMP切割后移位到细胞核中。
在另一个示例性配置中，GMP形成嵌合跨膜受体多肽的一部分，切割部分形成嵌合跨膜多肽的一部分。在一些实施方式中，具有切割部分的嵌合跨膜多肽包含抗原相互作用结构域，可以类似地被称为跨膜受体多肽。在一些情况下，该跨膜受体多肽包含免疫细胞信号结构域。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域与包含GMP的嵌合跨膜受体多肽结合相同的抗原。在一些实施方式中，抗原相互作用结构域与包含GMP的嵌合跨膜受体多肽结合不同的抗原。在一些实施方式中，嵌合跨膜多肽不包含抗原相互作用结构域，可被称为跨膜蛋白。如前所述，GMP可包含连接至切割识别序列的致动部分。为了响应抗原与嵌合跨膜受体多肽的结合，包含切割部分的嵌合跨膜受体多肽可以与包含GMP的嵌合跨膜多肽(例如，受体或非受体)聚簇和/或相互作用。两个多肽之间的聚簇和/或相互作用可使GMP接近切割部分，从而允许切割部分切割切割识别位点。包含切割部分的跨膜蛋白可以在配体结合到嵌合跨膜受体多肽的胞外区时与包含GMP的嵌合跨膜受体多肽聚簇和/或相互作用。在一些实施方式中，嵌合跨膜多肽包含T细胞受体复合物的分子或其任何衍生物、变体或片段。在一些实施方式中，嵌合跨膜多肽(例如受体或非受体)包含能够与另一种跨膜多肽(例如受体或非受体)聚集和/或寡聚的分子或其任何衍生物，变体或片段。图19显示了一个系统，其中GMP形成第一嵌合跨膜受体多肽1901的一部分，切割部分形成第二嵌合跨膜受体多肽1902的一部分。当抗原与第一和第二受体多肽的胞外抗原结合结构域结合时，第一和第二嵌合跨膜受体多肽可聚簇，使切割部分1905接近切割识别位点1903。切割部分能够切割并释放来自受体的致动部分1904(例如，任选与sgRNA复合的Cas9，如dCas9)。
本公开的系统和组合物可用于各种应用。例如，本公开的系统和方法可用于调节基因表达和/或细胞活性的方法中。一方面，本文公开的系统和组合物用于调节免疫细胞中的基因表达和/或细胞活性的方法中。使用所述系统调节的免疫细胞可用于多种应用，包括但不限于治疗疾病和病症的免疫疗法。可以使用本公开的修饰的免疫细胞治疗疾病和病症，包括炎性病症、癌症和感染性疾病。在一些实施方式中，免疫疗法用于治疗癌症。
可将所述系统引入各种免疫细胞中，包括参与免疫应答的任何细胞。在一些实施方式中，免疫细胞包含粒细胞，如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞；肥大细胞；可以发展成巨噬细胞的单核细胞；抗原呈递细胞如树突细胞；和淋巴细胞如天然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞和T细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是免疫效应细胞。免疫效应细胞是指可以响应刺激而执行特定功能的免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是可诱导细胞死亡的免疫效应细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞是NK细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方式中，T细胞是活化的T细胞。T细胞包括幼稚和记忆细胞(例如中枢记忆或TCM、效应记忆或TEM和效应记忆RA或TEMRA)、效应细胞(例如细胞毒性T细胞或CTL或Tc细胞)、辅助细胞(例如Th1、Th2、Th3、Th9、Th7、TFH)、调节性细胞(例如Treg和Tr1细胞)、天然杀伤T细胞(NKT细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)、αβT细胞、γδT细胞和类似的独特类别的T细胞谱系。基于细胞表面存在蛋白，T细胞可分为两大类：CD8+T细胞和CD4+T细胞。表达所述系统的T细胞可以执行多种功能，包括杀死感染的细胞和激活或募集其它免疫细胞。CD8+T细胞被称为细胞毒性T细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。表达所述系统的CTL可以参与识别并去除病毒感染的细胞和癌细胞。CTL具有特定的区室或颗粒，其含有引起细胞凋亡(例如程序性细胞死亡)的细胞毒素。CD4+T细胞可以细分为四个亚组-Th1、Th2、Th17和Treg，其中“Th”指“T辅助细胞”，尽管可能存在附加的亚组。Th1细胞可以协调针对细胞内微生物，尤其是细菌的免疫应答。它们可以产生和分泌能够提醒和激活其它免疫细胞的分子，如吞噬细菌的巨噬细胞。Th2细胞通过提醒B细胞、粒细胞和肥大细胞参与协调抗细胞外病原体如蠕虫(寄生虫)的免疫应答。Th17细胞可以产生白细胞介素17(IL-17)，这是一种激活免疫细胞和非免疫细胞的信号分子。Th17细胞对募集嗜中性粒细胞很重要。
一方面，本公开提供表达所述系统的免疫细胞(例如，如本文所述的受体多肽、衔接子多肽、基因调节多肽(GMP)和切割部分中的至少一种)。在一些实施方式中，免疫细胞是淋巴细胞。当在免疫细胞中表达时，所述系统可用于有条件地调节免疫细胞的某些活性。表达所述系统的免疫细胞，如淋巴细胞可以参与细胞介导的免疫以消除患病细胞和/或病原体。
在一些实施方式中，本公开的淋巴细胞的特征在于，只有当嵌合跨膜受体多肽与抗原结合时，致动部分才通过在切割识别位点切割从GMP释放。当致动部分从GMP释放时，致动部分可以与淋巴细胞中的靶多核苷酸复合。致动部分与淋巴细胞中靶多核苷酸的复合可导致淋巴细胞中靶多核苷酸(例如，基因)的上调或增加表达。在一些实施方式中，致动部分调控包含内源基因或基因产物的靶多核苷酸的表达和/或活性。内源基因或基因产物可以参与免疫应答。例如，致动部分可导致内源基因如细胞因子的表达增加。细胞因子表达的增加可以有助于有效的免疫应答和/或降低与免疫应答相关的不良治疗效果。
在一些实施方式中，致动部分调节细胞因子的表达和/或活性。改变细胞因子表达的方法可用于调节免疫细胞和/或调节免疫应答，例如。改变T细胞的活化，改变NK细胞活化水平，以及免疫治疗中的各种其它免疫细胞活性。细胞因子表达的调节可以通过各种机制来完成。在一些实施方式中，致动部分调控了来自靶多核苷酸的细胞因子的表达和/或活性或编辑核酸序列，例如编码细胞因子的基因组DNA的核酸序列。在一些实施方式中，致动部分调控来自靶多核苷酸的细胞因子受体的表达和/或活性或编辑核酸序列，例如编码细胞因子受体的基因组DNA的核酸序列。由致动部分调节和/或编辑的靶多核苷酸可以包含内源基因或基因产物，例如内源性细胞因子或细胞因子受体基因(例如DNA)或基因产物(例如RNA)。在一些实施例中，致动部分改变了细胞因子或细胞因子受体的表达(例如，上调和/或下调)。在一些实施方式中，致动部分编辑编码细胞因子或细胞因子受体的核酸序列。编辑核酸序列可产生非功能性基因产物，例如截短的和/或框架外的蛋白质产物。
细胞因子是指细胞释放的可能影响细胞行为的蛋白质(例如趋化因子、干扰素、淋巴因子、白细胞介素和肿瘤坏死因子)。细胞因子由许多细胞产生，包括免疫细胞如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。特定的细胞因子可以由多种类型的细胞产生。细胞因子可以参与产生全身或局部免疫调节作用。
某些细胞因子可以起到促炎细胞因子的作用。促炎细胞因子是指涉及诱导或放大炎症反应的细胞因子。促炎细胞因子可以与免疫系统的各种细胞一起工作，如嗜中性粒细胞和白细胞，以产生免疫应答。某些细胞因子可以起到抗炎细胞因子的作用。抗炎细胞因子指涉及减少炎症反应的细胞因子。在某些情况下，抗炎细胞因子可以调节促炎细胞因子应答。一些细胞因子可以起到促炎和抗炎细胞因子的作用。
在一些实施方式中，具有促炎症功能的细胞因子的表达可以在免疫细胞中上调。例如，上调具有促炎症功能的细胞因子的表达可以用于在免疫疗法中刺激针对靶细胞的免疫应答。然而，在某些情况下，过量的促炎细胞因子会导致不利影响，如体内慢性全身性的亢进。在一些实施方式中，具有促炎症功能的细胞因子的表达被下调。这种下调可以减少和/或最小化有害影响。
在一些实施方式中，具有抗炎功能的细胞因子的表达可以上调。如果炎症反应引起有害作用，则上调具有抗炎功能的细胞因子的表达可能是有用的，例如，减少和/或最小化炎症反应。在一些实施方式中，具有抗炎功能的细胞因子的表达可以下调。如果需要，这种下调在需要时可以增加和/或增强炎症反应。
可由本公开的系统和组合物调节的细胞因子的例子包括但不限于，淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)等糖蛋白激素；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α；抑制素基质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；FLT-3L；干细胞因子(SCF)；骨诱导因子；干扰素(IFN)如IFN-α、IFN-β、IFN-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；巨噬细胞刺激因子(MSP)；白细胞介素(ILs)如IL-1、IL-1a、IL-1b、IL-1RA、IL-18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-20；肿瘤坏死因子如CD154、LT-β、TNF-α、TNF-β、4-1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCE；和其他多肽因子，包括LIF、制瘤素M(OSM)和试剂盒配体(KL)。细胞因子受体是指结合细胞因子的受体蛋白质。细胞因子受体可以是膜结合的和可溶的。
在一些实施方式中，致动部分调节白细胞介素(IL-1)家族成员(例如配体)、IL-1受体家族成员、白细胞介素-6(IL-6)家族成员(例如配体)、IL-6受体、白细胞介素-10(IL-10)家族成员(例如配体)、IL-10受体、白细胞介素-12(IL-12)家族成员(例如配体)、IL-12受体、白细胞介素-17(IL-17)家族成员(例如配体)或IL-17受体的表达和/或活性。
在一些实施方式中，致动部分调节细胞因子的表达和/或活性，包括但不限于，白细胞介素-1(IL-1)家族成员或相关蛋白；肿瘤坏死因子(TNF)家族成员或相关蛋白；干扰素(IFN)家族成员或相关蛋白；白细胞介素-6(IL-6)家族成员或相关蛋白；和趋化因子或相关蛋白。在一些实施方式中，致动部分调节表达和/或活性，所述致动部分选自下组：IL18、IL18BP、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F3/IL1RA、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1RL2、IL1F9、IL33、BAFF/BLyS/TNFSF138,4-1BBL、CD153/CD30L/TNFSF8、CD40LG、CD70、Fas配体/FASLG/CD95L/CD178、EDA-A1、TNFSF14/LIGHT/CD258、TNFA、LTA/TNFB/TNFSF1、LTB/TNFC、CD70/CD27L/TNFSF7、TNFSF10/TRAIL/APO-2L(CD253)、RANKL/OPGL/TNFSF11(CD254)、TNFSF12、TNF-α/TNFA、TNFSF13、TL1A/TNFSF15、OX-40L/TNFSF4/CD252、CD40L/CD154/TNFSF5、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA7、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFNA8、IFNA5/IFNaG、IFNω/IFNW1、CLCF1、CNTF、IL11、IL31、IL6、瘦素、LIF、OSM、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7/Ppbp、CXCL9、IL8/CXCL8、XCL1、XCL2、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4和FAM19A5。
在一些实施方式中，致动部分调节细胞因子受体的表达和/或活性，包括但不限于，白细胞介素-1(IL-1)受体家族成员或相关蛋白；肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员或相关蛋白；干扰素(IFN)受体家族成员或相关蛋白；白细胞介素-6(IL-6)受体家族成员或相关蛋白；和趋化因子受体或相关蛋白。在一些实施方式中，致动部分调节细胞因子受体的表达和/或活性，所述致动部分选自下组：IL18R1、IL18RAP、IL1R1、IL1R2、IL1R3、IL1R8、IL1R9、IL1RL1、SIGIRR、4-1BB、BAFFR、TNFRSF7、CD40、CD95、DcR3、TNFRSF21、EDA2R、EDAR、PGLYRP1、TNFRSF19L、TNFR1、TNFR2、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF14、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF25、LTBR、TNFRSF4、TNFRSF8、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、CNTFR、IL11RA、IL6R、LEPR、LIFR、OSMR、IL31RA、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CXCR1、CXCR2、ARMCX、BCA-1/CXCL1、CCL1、CCL12/MCP-、CCL13/MCP-、CCL15/MIP-5/MIP-1δ、CCL16/HCC-4/NCC、CCL17/TAR、CCL18/PARC/MIP-、CCL19/MIP-3、CCL2/MCP-、CCL20/MIP-3α/MIP3、CCL21/6Ckin、CCL22/MD、CCL23/MIP、CCL24/嗜酸性粒细胞趋化因子-2/MPIF-、CCL25、CCL26/嗜酸性粒细胞趋化因子-、CCL27、CCL3、CCL4、CCL4L1/LAG、CCL5、CCL6、CCL8/MCP-、CXCL10/Crg、CXCL12/SDF-1、CXCL14、CXCL15、CXCL16/SR-、CXCL2/MIP-、CXCL3/GRO、CXCL4、CXCL6/GCP-、CXCL9、FAM19A4、曲动蛋白、I-309/CCL1/TCA-、IL-8、MCP-3、NAP-2/PPBP、XCL2、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7/RDC-1、IL8Ra/CXCR1和IL8Rb/CXCR2。
在一些实施方式中，致动部分调节活化素(例如活化素βA、活化素βB、活化素βC和活化素βE)；抑制素(例如，抑制素-A和抑制素-B)；活化素受体(例如1型激活素受体、2型活化素受体)；骨形态发生蛋白(例如，BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10和BMP15)；BMP受体；生长分化因子(例如GDF1、GDF2、GDF3、GDF4、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11和GDF15)；胶质细胞衍生的神经营养因子家族配体(例如神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、神经营养因子(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN))；GDNF家族受体；和c-MPL/CD110/TPOR的表达和/或活性。
可以使用多种方法评估细胞因子的产生。细胞因子的产生可以通过测定生长有经修饰免疫细胞的细胞培养基(例如体外生产)或从具有修饰的免疫细胞的受试者获得的血清(例如，体内生产)中存在一种或多种细胞因子来评估。细胞因子水平可以使用任何合适的测定法以各种合适的单位，包括浓度，进行定量。在一些实施方式中，检测细胞因子蛋白。在一些实施方式中，检测细胞因子的mRNA转录物。细胞因子测定的例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫荧光测定、放射免疫测定、平行检测样品中各种细胞因子的抗体阵列、珠阵列、定量PCR、微阵列等。其他合适的方法可以包括蛋白质组学方法(2-D凝胶、MS分析等)。
在一些实施方式中，内源基因或基因产物编码免疫调节蛋白。免疫调节蛋白包括蛋白质，如免疫检查点受体，当它们与其同源配体结合时，可以增强和/或抑制免疫细胞信号，包括但不限于免疫细胞的激活信号和抑制信号。在一些情况下，驱动器可以改变调节蛋白的表达(例如，上调和/或下调)。在一些实施方式中，驱动器编辑编码调节蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，内源基因或基因产物编码分子，如A2AR、B7.1、B7-H3/CD276、B7-H4/B7S1/B7x/Vtcn1、B7-H6、BTLA/CD272、CCR4、CD122、4-1BB/CD137、CD27、CD28、CD40、CD47、CD70、CISH、CTLA-4/CD152、DR3、GITR、ICOS/CD278、IDO、KIR、LAG-3、OX40/CD134、PD-1/CD279、PD2、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA/Dies1/Gi24/PD-1H(C10或f54)。
在一些实施方式中，靶多核苷酸包含异源基因或基因产物。异源基因或基因产物可以编码蛋白质，例如额外的嵌合跨膜受体多肽。在一些实施方式中，额外的嵌合跨膜受体多肽包含(a)胞外区，其包含特异性结合额外抗原的额外抗原相互作用结构域；和(b)共刺激域。额外的抗原相互作用结构域可以结合任何合适的抗原。额外的抗原相互作用结构域可以结合之前所述的抗原。额外的抗原相互作用结构域可以与嵌合受体多肽结合相同的抗原或不同的抗原。额外的抗原相互作用结构域可以包含任何合适的抗原相互作用结构域。额外的抗原相互作用结构域可以是本文其它地方所述的任何抗原相互作用结构域。例如，额外的抗原相互作用结构域可以包含单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体(例如scFv)、微型抗体、双抗体、单结构域抗体(“sdAb”或“纳米抗体”或“骆驼科动物”)或Fc结合结构域。在一些实施方式中，额外的抗原相互作用结构域包含拟抗体。
额外的嵌合跨膜受体多肽可以包含共刺激结构域。共刺激结构域可以是之前所述的任何共刺激结构域。共刺激结构域可以提供共刺激信号。这种共刺激信号在一些情况下可以在表达主体系统的免疫细胞中提供增殖和/或存活信号。在一些实施方式中，嵌合跨膜受体多肽的免疫细胞信号结构域和额外的嵌合跨膜受体多肽包含至少一个共刺激结构域。包含共刺激结构域的额外的嵌合跨膜受体的表达可以提供足够的细胞信号传导以产生持久的和/或足够的免疫应答。
在一些实施方式中，嵌合跨膜受体多肽的免疫细胞信号结构域不包括共刺激结构域，而额外的嵌合跨膜受体多肽包含至少一个共刺激结构域。第一抗原与嵌合跨膜受体多肽胞外区的结合可导致切割识别位点的切割以释放致动部分。然后致动部分可以与靶多核苷酸复合，例如编码额外的嵌合跨膜受体多肽的多核苷酸，并调节额外的嵌合跨膜受体多肽的表达。额外的嵌合跨膜受体多肽包含(i)特异性结合不同于第一抗原的抗原的额外的抗原相互作用结构域和(ii)可有助于免疫细胞的有效免疫应答的共刺激结构域。由于共刺激结构域位于另外的嵌合跨膜受体多肽上，直到两种受体都结合抗原，才能产生有效的免疫应答。这样，免疫细胞的调节取决于两种抗原的存在，从而增加免疫细胞调节(例如激活和/或失活)的特异性。在一些实施方式中，共刺激结构域(例如在嵌合跨膜受体多肽上，在另外的嵌合跨膜受体多肽上和/或在两种受体上)的放置影响了条件性免疫细胞调节的特异性。例如，免疫细胞可以表达包含具有胞外区域的嵌合跨膜受体多肽的系统，所述嵌合跨膜受体多肽具有包含抗原相互作用结构域的胞外区，和包含经由切割识别位点连接至致动部分的免疫细胞信号传导结构域的细胞内区域。由于许多细胞类型表达重叠抗原(例如细胞表面蛋白等)，取决于至少两种抗原存在的条件性活化可以增加免疫细胞活化的阈值。
一方面，本公开提供了用于淋巴细胞的条件性调节的方法。在一些实施方式中，该方法包括使本文公开的淋巴细胞与特异性结合受体的抗原相互作用结构域的抗原接触或暴露。这种接触影响了免疫细胞活性的激活或失活，从而有条件地调节淋巴细胞。在一些实施方式中，免疫细胞活性选自下组：淋巴细胞克隆性扩增；淋巴细胞释放细胞因子；淋巴细胞的细胞毒性；淋巴细胞的增殖；淋巴细胞的分化、去分化或转分化；淋巴细胞的移动和/或转运；淋巴细胞的耗竭和/或重新激活；并通过淋巴细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或其组合。
在一些实例中，本公开内容的系统和组合物用免疫表达时可杀死靶细胞。一方面，表达所述系统的免疫细胞或免疫细胞群可诱导靶细胞的死亡。杀死靶细胞可用于多种应用，包括但不限于，治疗期望消除细胞群或期望抑制其增殖的疾病或病症。在一些实施方式中，诱导靶细胞死亡的方法包括将靶细胞暴露于表达本文公开的系统的免疫细胞或免疫细胞群。在一些实施方式中，免疫细胞是淋巴细胞，例如T细胞或NK细胞。将靶细胞暴露于淋巴细胞后，由淋巴细胞表达的受体可以结合靶细胞的膜结合抗原或靶细胞的非膜结合抗原，并且暴露影响淋巴细胞的细胞毒性的活化，从而诱导靶细胞的死亡。
淋巴细胞，例如表达所述系统的细胞毒性T细胞可以诱导靶细胞的凋亡。当所述系统在免疫细胞如T细胞中表达时，可用于调节T细胞的克隆扩增、细胞表面上活化标记的表达、分化成效应细胞、诱导细胞毒性或细胞因子分泌、诱导凋亡及其组合。在细胞毒性T细胞中表达的所述系统可以改变(i)细胞毒素如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素的释放和/或(ii)通过T细胞和靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导细胞凋亡，从而触发靶细胞的破坏。当在自然杀伤(NK)细胞中表达时，所述系统可介导NK细胞杀死靶细胞。自然杀伤(NK)细胞被激活后，可靶向并杀死异常细胞，如病毒感染和致瘤细胞。所述系统可调节存储在NK细胞的分泌性溶酶体内的细胞毒性分子的产生和/或释放，其可导致靶细胞的特异性杀伤。在一些实施方式中，(i)表达所述系统的抗原特异性细胞毒性T细胞(例如淋巴细胞)可在其表面展示外源抗原表位的细胞中诱导细胞凋亡，如病毒感染的细胞、具有细胞内细菌的细胞和展示肿瘤抗原的癌细胞；(ii)表达所述系统的巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)可破坏病原体；和/或(iii)表达所述系统的其他免疫细胞可以分泌各种细胞因子以促进另外的免疫应答。
免疫细胞如T细胞和NK细胞的细胞毒性的激活是指诱导细胞变成细胞毒性的生物学状态的变化。这种改变包括活化标志物的改变表达、细胞因子的产生、和增殖。这些变化可以由主要的刺激信号产生。共刺激信号可以放大初级信号的幅度并在初始刺激后抑制细胞死亡，导致更持久的活化状态，因此具有更高的细胞毒性能力。细胞毒性可以指抗体依赖性细胞毒性。
在表达本文公开的系统的免疫细胞中，受体可以响应于抗原结合而发生受体修饰。受体修饰可以包含构象变化和/或化学修饰。化学修饰可以包括例如受体的至少一个氨基酸残基的磷酸化或去磷酸化。在一些实施方式中，受体修饰包括在多个修饰位点处的修饰，并且每个修饰对于结合衔接子蛋白是有效的。在将免疫细胞上的嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域与靶细胞的抗原(膜结合或非膜结合)结合后，致动部分从GMP释放以实现免疫细胞活性的激活或失活，例如淋巴细胞的细胞毒性。
从GMP释放的致动部分可以通过调节靶多核苷酸，如DNA(例如基因组DNA和/或cDNA)和RNA(例如mRNA)的表达来影响淋巴细胞细胞毒性的活化。在一些实施方式中，致动部分通过靶多核苷酸的物理阻碍或募集另外的有效因子来调节靶多核苷酸的表达，以抑制或增强来自靶多核苷酸的基因表达。在一些实施方式中，致动部分包含有效增加靶多核苷酸表达的转录激活因子。在一些实施方式中，致动部分包含有效降低靶多核苷酸表达的转录抑制物。
在一些实施方式中，靶多核苷酸包含基因组DNA，例如基因组区域。在一些实施方式中，靶多核苷酸包含质粒区域，例如携带外源基因的质粒。在一些实施方式中，靶多核苷酸包含RNA。致动部分可以包括核定位信号序列的一个或多个拷贝，该信号序列允许该结构域在从GMP切割后易位至细胞核中。
使用本发明的系统和方法可以杀死多种靶细胞。该方法可应用的目标细胞包括各种细胞类型。靶细胞可以在体外。靶细胞可以在体内。靶细胞可以是离体的。靶细胞可以是分离的细胞。靶细胞可以是生物体内的细胞。靶细胞可以是生物体。靶细胞可以是细胞培养中的细胞。靶细胞可以是细胞集合中的一个。靶细胞可以是哺乳动物细胞或衍生自哺乳动物细胞。靶细胞可以是啮齿动物细胞或衍生自啮齿动物细胞。靶细胞可以是人类细胞或衍生自人类细胞。靶细胞可以是原核细胞或衍生自原核细胞。靶细胞可以是细菌细胞或可以衍生自细菌细胞。靶细胞可以是古细胞或衍生自古细胞。靶细胞可以是真核细胞或衍生自真核细胞。靶细胞可以是多能干细胞。靶细胞可以是植物细胞或衍生自植物细胞。靶细胞可以是动物细胞或衍生自动物细胞。靶细胞可以是无脊椎动物细胞或衍生自无脊椎动物细胞。靶细胞可以是脊椎动物细胞或衍生自脊椎动物细胞。靶细胞可以是微生物细胞或衍生自微生物细胞。靶细胞可以是真菌细胞或衍生自真菌细胞。靶细胞可以来自特定的器官或组织。
靶细胞可以是干细胞或祖细胞。靶细胞可以包括干细胞(例如成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干(iPS)细胞)和祖细胞(例如心脏祖细胞、神经祖细胞等)。靶细胞可以包括哺乳动物干细胞和祖细胞，包括啮齿动物干细胞、啮齿动物祖细胞、人干细胞、人祖细胞等。克隆细胞可以包含细胞的子代。靶细胞可以包含靶核酸。靶细胞可以在活的生物体中。靶细胞可以是基因修饰的细胞。靶细胞可以是宿主细胞。
靶细胞可以是全能干细胞，然而，在本公开的一些实施方式中，可以使用术语“细胞”，但可能不指全能干细胞。靶细胞可以是植物细胞，但是在本公开的一些实施方式中，可以使用术语“细胞”，但可能不涉及植物细胞。靶细胞可以是多能细胞。例如，靶细胞可以是能够在造血细胞谱系中分化为其他细胞的多能造血细胞，但可能不能分化成任何其他非造血细胞。靶细胞可能会发育成为一个完整的生物体。靶细胞可能或可能不能发育成整个生物体。靶细胞可能是一个完整的生物体。
靶细胞可以是原代细胞。例如，原代细胞的培养物可以传代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多次。细胞可以是单细胞生物。细胞可以在培养基中生长。
靶细胞可以是病变细胞。病变细胞可能有改变的代谢、基因表达和/或形态学特征。病变细胞可以是癌细胞、糖尿病细胞和凋亡细胞。病变细胞可以是来自患病对象的细胞。示例性疾病可以包括血液病、癌症、代谢病症、眼部病症、器官病症、肌肉骨骼病症、心脏病等。
如果靶细胞是原代细胞，它们可以通过任何方法从个体收获。例如，白细胞可以通过清血法、白细胞去除疗法、密度梯度分离等方法收集。来自组织，如皮肤、肌肉、骨髓、脾脏、肝脏、胰腺、肺、肠、胃等的细胞可以通过活组织检查收获。可以使用适当的溶液来分散或悬浮收获细胞。这种溶液通常可以是平衡盐溶液(例如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克氏平衡盐溶液等)，连同低浓度的可接受的缓冲液,方便地补充胎牛血清或其它天然存在的因子。缓冲液可以包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。细胞可以立即使用，或者储存起来(例如冷冻)。冷冻细胞可以解冻并可以重复使用。细胞可以在DMSO、血清、中盐缓冲液(例如10％DMSO、50％血清、40％缓冲培养基)、和/或用于在冷冻温度下保存细胞的其他一些常用溶液中冷冻。
可以是靶细胞的细胞的非限制性实例包括但不限于，淋巴细胞，如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞(参见例如US20080241194)；骨髓细胞，如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞/多分叶核中性粒细胞(hypersegmented neutrophil))、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(副甲状腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体(松果体细胞)细胞；神经系统细胞，包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、巨细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞(Boettchercell)和垂体(促性腺激素、皮质激素、甲状腺激素、生长激素、乳酸激素)；呼吸系统的细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、噬尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、周细胞；消化系统细胞，包括胃(胃主细胞、壁细胞)、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝脏(肝细胞、枯否细胞)、软骨/骨/肌肉；骨细胞，包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿(成牙骨质细胞、成釉细胞)；软骨细胞，包括成软骨细胞、软骨细胞；皮肤细胞，包括毛细胞、角质形成细胞、黑素细胞(痣细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足细胞、近肾小球细胞、肾小球内系膜细胞/肾小球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞、黄斑密度细胞；生殖系统细胞，包括精子、足细胞、莱氏细胞、卵子；和其他细胞，包括脂肪细胞、成纤维细胞、肌腱细胞、表皮角质形成细胞(分化表皮细胞)、表皮基底细胞(干细胞)、指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)、髓质毛细胞细胞、皮质毛杆状细胞、角质毛杆状细胞、角质毛根鞘细胞、赫胥黎层毛根鞘细胞、亨利氏层毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛细胞基质细胞(干细胞)、湿层状屏障上皮细胞、角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的复层鳞状上皮的表面上皮细胞，角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道上皮细胞的基底细胞(干细胞)，尿路上皮细胞(膀胱和尿道内皮)、外分泌分泌上皮细胞、唾液腺粘液细胞(富含多糖的分泌物)、唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌物)、舌头的味腺细胞(洗涤味蕾)、乳腺细胞(乳汁分泌)、泪腺细胞(泪液分泌)、耳中的蜡质腺细胞(蜡质分泌)、外泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)、外泌汗腺透明细胞(小分子分泌)。大汗腺汗腺细胞(气味分泌物、性激素敏感)、眼睑摩尔细胞腺体(专门的汗腺)、皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌)、鼻子的鲍曼腺体细胞(清洗嗅上皮)、十二指肠的布伦纳腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊细胞(分泌精液成分，包括用于精子游动的果糖)、前列腺细胞(分泌精液成分)、白癜风腺细胞(粘液分泌)、巴托林氏腺细胞(阴道润滑剂分泌)、Littre细胞腺体(粘液分泌)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)、呼吸道和消化道的分离杯状细胞(粘液分泌)、胃粘液细胞(粘液分泌)、胃腺发酵细胞(胃蛋白酶原分泌)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)、小肠潘氏细胞(溶菌酶分泌)、肺II型肺细胞(表面活性剂分泌)、肺的克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、生长激素细胞、催乳素细胞、促甲状腺细胞、促性腺细胞、促皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞的神经分泌细胞、肠道和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、副甲状腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸的莱氏细胞、卵巢卵泡内膜细胞、卵巢破裂卵泡的黄体细胞、颗粒状黄体素细胞、茶黄素细胞、肾小球细胞(肾素分泌)、肾脏黄斑致密化细胞、代谢和储存细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾脏、I型肺细胞(肺内衬空气间隙)、胰管细胞(泡心细胞)、无横纹导管细胞(汗腺、唾液腺、乳腺等)、导管细胞(精囊、前列腺等)，上皮细胞衬砌内部闭合体腔、具有推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞(血红细胞)、巨核细胞(血小板前体)，单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞(骨中)、树突细胞(淋巴组织)、小神经胶质细胞(中枢神经系统)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、干细胞和用于血液和免疫系统(各种类型)的定向祖细胞、多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞、感觉传递细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑色素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵原细胞/卵母细胞、精细胞、精母细胞、精原细胞(精母细胞的干细胞)、精子、哺育细胞、卵巢卵泡细胞、支持细胞(睾丸中)、胸腺上皮细胞、间质细胞和间质肾细胞。
特别感兴趣的是癌细胞。在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。癌细胞的非限制性实例包括癌症细胞，包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端黑色素瘤、肢端汗腺瘤、急性嗜酸粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性成髓细胞性白血病、急性髓细胞性树突细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性髓样瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、肺泡软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、甲状腺未分化癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管平滑肌脂肪瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底样癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、贝利尼管癌、胆道癌、膀胱癌、胚细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、布伦纳肿瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、布朗瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发部位的癌症、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、未知原发部位癌、癌肉瘤、卡斯尔曼氏病、中枢神经系统胚胎肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性单核细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增殖性疾病、慢性嗜中性白血病、透明细胞瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、德戈斯病、隆起性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、促结缔组织小圆细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良神经上皮瘤、胚胎癌、内胚层窦瘤、内膜癌、子宫内膜癌、子宫内膜瘤、肠病相关T细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食道癌、成神经管细胞瘤、尤因家族肿瘤、尤因家族肉瘤、尤因肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、乳房外佩吉特病、输卵管癌、寄生胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、胚细胞瘤、妊娠绒毛膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、骨巨细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、大脑胶质瘤、血管球瘤、胰高血糖素、性腺、颗粒细胞瘤、毛细胞性白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎症性乳腺癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、青少年髓单核细胞白血病、卡波西肉瘤、卡波西肉瘤、肾癌、克拉特金肿瘤、克鲁肯贝格肿瘤、喉癌、喉癌、斑状恶性黑色素瘤、白血病、白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性周围神经鞘瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性氚核瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵隔生殖细胞肿瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、成神经管细胞瘤、成神经管细胞瘤、髓质上皮瘤、黑素瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、转移性鳞状上皮癌伴隐匿性原发性、转移性尿路上皮癌、混合苗勒氏肿瘤、单核细胞白血病、口腔癌、粘液瘤、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、真菌性真菌病、蕈样真菌病、骨髓增生异常症、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、骨髓肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、鼻咽癌、赘生物、神经细胞瘤、成神经细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼部肿瘤、少突星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺佩吉特病、胰腺癌、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中间分化的松果体实质瘤、成神经细胞瘤、垂体腺瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚胎瘤、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层肿瘤、前列腺癌、腹膜假性粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、在15号染色体上涉及NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、里氏转化、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、支持-间质细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、性索间质肿瘤、Sezary综合征、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、烟尘疣、脊髓肿瘤、脊柱肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表性扩散黑素瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、表面上皮-间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞性白血病、畸胎瘤、终末淋巴癌、睾丸癌、卵泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖器新生物、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、佛纳莫里森综合征、疣状癌、视觉通路胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、沃辛氏瘤、维尔姆斯肿瘤及其组合。在一些实施方式中，靶向癌细胞表示癌细胞群体内的亚群，例如癌症干细胞。在一些实施方式中，癌症是造血谱系的，例如淋巴瘤。抗原可以是肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，靶细胞形成肿瘤。用本文方法治疗的肿瘤可使肿瘤稳定生长(例如，一个或多个肿瘤的大小增加不超过1％、5％、10％、15％或20％、和/或不转移)。在一些实施方式中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周。在一些实施方式中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月。在一些实施方式中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年。在一些实施方式中，肿瘤的大小或肿瘤细胞的数量减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方式中，肿瘤被完全消除或降低到检测水平以下。在一些实施方式中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周保持无肿瘤(例如缓解)。在一些实施方式中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月保持无肿瘤。在一些实施方式中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年保持无肿瘤。
靶细胞的死亡可以通过任何合适的方法来确定，包括但不限于，在治疗之前和之后对细胞计数，或测量与活细胞或死细胞(例如活的或死的靶细胞)相关的标记物的水平。细胞死亡程度可以通过任何合适的方法来确定。在一些实施方式中，相对于起始条件确定细胞死亡程度。例如，个体可具有已知起始量的靶细胞，例如已知大小的起始细胞团或已知浓度的循环靶细胞。在这种情况下，细胞死亡程度可表示为治疗后存活细胞与起始细胞群的比率。在一些实施方式中，细胞死亡程度可以通过合适的细胞死亡试验来确定。可以使用多种细胞死亡试验，而且可以利用各种检测方法。检测方法的例子包括但不限于细胞染色、显微镜检查、流式细胞术、细胞分选及其组合。
当肿瘤在完成治疗期后进行手术切除时，可以通过测量被切除的坏死组织(即死亡)的百分比来确定减小肿瘤大小的治疗效果。在一些实施方式中，如果切除组织的坏死百分比大于约20％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)，则治疗是有效的。在一些实施方式中，切除坏死组织的百分比为100％，即不存在或检测不到活的肿瘤组织。
将靶细胞暴露于本文公开的免疫细胞或免疫细胞群体可以在体外或体内进行。将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群通常是指，使靶细胞与免疫细胞接触和/或足够接近，使得靶细胞的抗原(例如，膜结合或非膜结合的)可以结合免疫细胞中表达的嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域。通过共培养靶细胞和免疫细胞，可以在体外将免疫细胞或免疫细胞群暴露于靶细胞。靶细胞和免疫细胞可以共培养，例如，作为贴壁细胞或者作为悬浮液。靶细胞和免疫细胞可以在各种合适类型的细胞培养基中共培养，例如补充剂、生长因子、离子等。在一些情况下，通过将免疫细胞给予受试者，例如人受试者，并使免疫细胞通过循环系统定位于靶细胞，就可以完成在体内将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群。在一些情况下，可以将免疫细胞递送至靶细胞所在的直接区域，例如通过直接注射。
暴露可以经历任何合适的时间长度，例如至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或更长。
在本文的方面的各种实施例中，多个致动部分同时在同一个细胞中使用。在一些实施方式中，包含Cas蛋白的致动部分可以与包含锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、RNA结合蛋白(RBP)、CRISPR相关RNA结合蛋白、重组酶、翻转酶、转座酶或Argonaute蛋白的第二致动部分同时使用。在一些实施方式中，包含ZFN的致动部分可与包含Cas蛋白、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、RNA结合蛋白(RBP)、CRISPR相关RNA结合蛋白、重组酶、翻转酶、转座酶或Argonaute蛋白的第二致动部分同时使用。在一些实施方式中，包含TALEN的致动部分可与包含Cas蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA结合蛋白(RBP)、CRISPR相关RNA结合蛋白、重组酶、翻转酶、转座酶或Argonaute蛋白的第二致动部分同时使用。在一些实施方式中，包含大范围核酸酶的致动部分可与包含Cas蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、RNA结合蛋白(RBP)、CRISPR相关RNA结合蛋白、重组酶、翻转酶、转座酶或Argonaute蛋白的第二致动部分同时使用。在一些实施方式中，包含RNA结合蛋白(RBP)的致动部分可与包含Cas蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、CRISPR相关RNA结合蛋白、重组酶、翻转酶、转座酶或Argonaute蛋白的第二致动部分同时使用。在一些实施方式中，包含CRISPR相关RNA结合蛋白的致动部分可与包含Cas蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、RNA结合蛋白(RBP)、重组酶、翻转酶、转座酶或Argonaute蛋白的第二致动部分同时使用。在一些实施方式中，包含重组酶的致动部分可与包含Cas蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、RNA结合蛋白(RBP)、CRISPR相关RNA结合蛋白、翻转酶、转座酶或Argonaute蛋白的第二致动部分同时使用。在一些实施方式中，包含翻转酶的致动部分可与包含Cas蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、RNA结合蛋白(RBP)、CRISPR相关RNA结合蛋白、重组酶、转座酶或Argonaute蛋白的第二致动部分同时使用。在一些实施方式中，包含转座酶的致动部分可与包含Cas蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、RNA结合蛋白(RBP)、CRISPR相关RNA结合蛋白、重组酶、翻转酶或Argonaute蛋白的第二致动部分同时使用。在一些实施方式中，包含Argonaute蛋白的致动部分可与包含Cas蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、RNA结合蛋白(RBP)、CRISPR相关RNA结合蛋白、重组酶、翻转酶或转座酶的第二致动部分同时使用。
在一些实施方式中，在同一细胞中同时使用多个致动部分以同时调节相同靶DNA或不同靶DNA上不同位置的转录。在一些实施方式中，致动部分包含Cas核酸酶。多种CRISPR/Cas复合物可以使用具有靶向不同核酸的多个引导核酸的单个来源或类型的Cas蛋白。或者，多种CRISPR/Cas复合物可以使用直系同源Cas蛋白(例如，来源于不同生物的死亡Cas9蛋白：如来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌、无害李斯特菌、脑膜炎双球菌)来靶向多个核酸。
在一些实施方式中，使用多个致动部分来调节至少两个靶多核苷酸的表达和/或活性或编辑至少两个靶多核苷酸的核酸序列。该至少两个靶多核苷酸可以包含相同或不同的基因或基因产物。在一些实施方式中，至少两种细胞因子或其组合的表达被上调、下调。在一些实施方式中，至少两种免疫调节蛋白或其组合的表达被上调、下调。在一些实施方式中，细胞因子和免疫调节蛋白的表达发生改变。例如，细胞因子和免疫调节蛋白的表达都增加。细胞因子和免疫调节蛋白的表达可以降低。细胞因子的表达可以增加，而免疫调节蛋白的表达可以降低，反之亦然。
在一些实施方式中，内源基因和外源基因的表达被改变。例如，除了改变包含额外的嵌合受体的外源基因的表达之外，可以改变内源基因如细胞因子或免疫调节蛋白的表达。调节本文讨论的靶多核苷酸的表达可以以任何期望的多种组合进行复用。
在一些实施方式中，可以在同一细胞中同时使用多种向导核酸以同时调节相同靶DNA或不同靶DNA上不同位置的转录。在一些实施方式中，两种或更多种向导核酸靶向相同的基因或转录物或基因座。在一些实施方式中，两种或更多种向导核酸靶向不同的无关基因座。在一些实施方式中，两种或更多种向导核酸靶向不同但相关的基因座。
两种或更多种向导核酸可以同时存在于相同的表达载体上。两种或更多种向导核酸可以在相同的转录控制下。在一些实施方式中，两个或更多个(例如3个或更多、4个或更多、5个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多、40个或更多、45个或更多、或50个或更多)向导核酸同时在靶细胞中表达(来自相同或不同的载体)。表达的向导核酸可以被死亡Cas蛋白质不同地识别(例如来自不同细菌的dCas9蛋白，如化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌、无害利斯特氏菌和脑膜炎奈瑟球菌)。
为了表达多个向导核酸，可以使用由核酸内切酶(例如，Csy4内切核糖核酸酶可以用于处理向导RNA)介导的人工向导核酸加工系统。例如，可将多个向导RNA串联成前体转录物上的串联阵列(例如，从U6启动子表达)，并通过Csy4特异性RNA序列分开。共表达的Csy4蛋白可以将前体转录物切割成多个向导RNA。由于所有向导RNA都是从前体转录本加工而来的，因此可以将类似的dCas9结合的浓度标准化。
可以与本公开的方法和组合物一起使用的启动子包括，例如，在真核、哺乳动物、非人哺乳动物或人细胞中有活性的启动子。启动子可以是诱导型或组成型活性启动子。可选地或另外地，启动子可以是组织或细胞特异性的。
合适的真核启动子(即在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性实例可以包括那些来自早期巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)、人类延伸因子-1启动子(EF1)、包含与鸡β-活性启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂交构建体、鼠干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)和小鼠金属硫蛋白-I。启动子可以是真菌启动子。启动子可以是植物启动子。可以找到植物启动子的数据库(例如，PlantProm)。表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包括用于扩增表达的合适序列。
在一些实施方式中，靶多核苷酸可以包含一种或多种疾病相关基因和多核苷酸以及信号传导生化途径相关基因和多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括与信号传导生物化学途径相关的序列，例如信号传导生化途径相关基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关基因或多核苷酸。“疾病相关”基因或多核苷酸是指，与非疾病对照的组织或细胞相比，在源自受疾病影响的组织的细胞中以异常水平或异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。在一些实施方式中，它是以异常高水平表达的基因。在一些实施方式中，它是以异常低水平表达的基因。改变的表达可以与疾病的发生和/或进展相关联。疾病相关基因也指具有突变或遗传变异的基因，其直接负责或与疾病的病因学反应的基因连锁不平衡。转录或翻译的产品可能是已知的或未知的，并且可能处于正常或异常水平。
疾病相关基因和多核苷酸的实例可从McKusick-Nathans遗传医学研究所，约翰斯霍普金斯大学(马里兰州巴尔的摩)和国家生物技术信息中心，国家医学图书馆(马里兰州贝塞斯达)获得，可在万维网上找到。表4和5中提供了与某些疾病和病症相关的示例性基因。表6中列出了信号传导生物化学途径相关基因和多核苷酸的实例。
这些基因和途径中的突变可导致产生不适当的蛋白质或影响功能的数量不正确的蛋白质。
表4.
表5
表6
本文方面的各种实施方式的靶多核苷酸可以是DNA或RNA(例如，mRNA)。靶多核苷酸可以是单链或双链的。靶多核苷酸可以是基因组DNA。靶多核苷酸可以是细胞内源性或外源性的任何多核苷酸。例如，靶多核苷酸可以是位于真核细胞核内的多核苷酸。靶多核苷酸可以是编码基因产物(例如蛋白质)的序列或非编码序列(例如，调控多核苷酸)。
靶多核苷酸序列可以包含长度为20个核苷酸的靶核酸或原间隔序列(protospacer sequence)(即由向导核酸的间隔区识别的序列)。原间隔序列的长度可以小于20个核苷酸。原间隔序列的长度可以是至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。原间隔序列的长度可以是至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。原间隔序列可以是紧接PAM第一个核苷酸5'端的16、17、18、19、20、21、22或23个碱基。原间隔序列可以是紧接PAM序列最后一个核苷酸3'端的16、17、18、19、20、21、22或23个碱基。原间隔序列可以是紧接PAM序列第一个核苷酸5'端的20个碱基。原间隔序列可以是PAM最后一个核苷酸3'端的20个碱基。靶核酸序列可以是PAM的5'端或3'端。
原间隔序列可以包括存在于靶多核苷酸中的核酸序列，所述靶多核苷酸可以与向导核酸的核酸靶向区段结合。例如，原间隔序列可以包括被设计为与向导核酸具有互补性的序列。原间隔序列可以包含任何多核苷酸，其可以位于例如细胞的细胞核或细胞质中，或细胞的细胞器内，例如线粒体或叶绿体。原间隔序列可以包括Cas蛋白的切割位点。原间隔序列可以与Cas蛋白的切割位点相邻。
Cas蛋白可以在可与向导核酸的核酸靶向序列结合的序列内或外的位点结合靶多核苷酸。结合位点可以包括Cas蛋白可以产生单链断裂或双链断裂的核酸的位置。
靶核酸与Cas蛋白的位点特异性结合可以发生在根据向导核酸和靶核酸之间的碱基配对互补确定的位置。靶核酸与Cas蛋白的位点特异性结合可以发生在靶核酸中由称为原间隔序列相邻基序(PAM)的短基序确定的位置。PAM可以在原间隔序列两侧，例如在原间隔序列的3'末端。例如，Cas9的结合位点可以是PAM序列上游或下游的约1至约25，或约2至约5，或约19至约23个碱基对(例如，3个碱基对)。Cas(例如Cas9)的结合位点可以是PAM序列上游的3个碱基对。Cas(例如Cpf1)的结合位点可以是(+)链上的19个碱基和(-)链上的23个碱基。
不同的生物包含不同的PAM序列。不同的Cas蛋白识别不同的PAM序列。例如，在酿脓链球菌中，PAM包含序列5'-XRR-3'，其中R可以是A或G，其中X是任何核苷酸，并且X紧接着间隔序列靶向的靶核酸序列的3'端。酿脓链球菌Cas9(SpyCas9)的PAM序列可以是5'-XGG-3'，其中X是任何DNA核苷酸并且紧接着靶DNA非互补链的原间隔序列3'端。Cpf1的PAM可以是5'-TTX-3'，其中X是任何DNA核苷酸并紧接着CRISPR识别序列的5'端。
向导核酸的靶序列可以通过生物信息学方法鉴定，例如，在与PAM序列相邻的靶序列内定位序列。向导核酸的最佳靶序列可以通过实验方法来鉴定，例如，测试多个向导核酸序列以鉴定具有最高靶向活性和最低脱靶活性的序列。靶序列的位置可以通过所需的实验结果来确定。例如，靶标原间隔序列可以位于启动子中以激活或抑制靶基因。靶标原间隔序列可以在编码序列内，例如5'端组成型表达外显子或编码已知结构域的序列。靶标原间隔序列可以是基因组内的独特序列以减少脱靶效应。用于确定和排列潜在靶标原间隔序列的许多公开可用的算法在本领域中是已知的并且可以使用。
在一些方面，本文的系统可以调节与遗传疾病或医学病症相关的至少一种基因的表达。各种遗传疾病在国立卫生研究院的网站上遗传疾病主题部分下进一步描述，(网站在health.nih.gov/topic/GeneticDisorders)。
显而易见的是，本系统可用于靶向任何感兴趣的多核苷酸序列。但是，对示例性的基因不再穷举。
在本文方面的各个实施方式中，所述系统可用于选择性调节宿主细胞(例如免疫细胞)中靶核酸的转录(例如，减少或增加)。靶核酸转录的选择性调节可以减少或增加靶核酸的转录，但可能不会实质上调节非靶核酸或脱靶核酸的转录，例如，与不存在致动部分(例如向导核酸/酶促失活的或酶促降低的Cas蛋白复合物)的情况下非靶核酸的转录水平相比，非靶核酸的转录可以小于1％，小于5％，小于10％，小于20％，小于30％，小于40％或小于50％。例如，与不存在致动部分(例如向导核酸/酶促失活的或酶促降低的Cas蛋白复合物)的情况下靶核酸的转录水平相比，靶核酸转录的选择性调节(例如减少或增加)可以减少或增加靶核酸的转录为至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约为40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％或大于90％。
在一些实施方式中，本文提供了用于增加靶核酸转录的方法。与不存在致动部分(例如向导核酸/酶失活的或酶促还原的Cas蛋白复合物)的情况下靶DNA的转录水平相比，靶核酸的转录可以增加至少约1.1倍，至少约1.2倍，至少约1.3倍，至少约1.4倍，至少约1.5倍，至少约1.6倍，至少约1.7倍，至少约1.8倍，至少约1.9倍，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约3倍，至少约3.5倍，至少约4倍，至少约4.5倍，至少约5倍，至少约6倍，至少约7倍，至少约8倍，至少约9倍，至少约10倍，至少约12倍，至少约15倍，至少约20倍，至少约50倍，至少约70倍或至少约100倍。靶核酸转录的选择性增加增加了靶核酸的转录，但是可能不会实质上增加非靶DNA的转录，例如，与不存在致动部分(例如向导核酸/酶促失活的或酶促降低的Cas蛋白复合物)的情况下非靶向DNA的转录水平相比，非靶核酸的转录如果增加，则增加小于约5倍，小于约4倍，小于约3倍，小于约2倍，小于约1.8倍，小于约1.6倍，小于约1.4倍，小于约1.2倍或小于约1.1倍。
在一些实施方式中，本文提供了用于减少靶核酸转录的方法。与不存在致动部分(例如向导核酸/酶失活的或酶促还原的Cas蛋白复合物)的情况下靶DNA的转录水平相比，靶核酸的转录可以减少至少约1.1倍，至少约1.2倍，至少约1.3倍，至少约1.4倍，至少约1.5倍，至少约1.6倍，至少约1.7倍，至少约1.8倍，至少约1.9倍，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约3倍，至少约3.5倍，至少约4倍，至少约4.5倍，至少约5倍，至少约6倍，至少约7倍，至少约8倍，至少约9倍，至少约10倍，至少约12倍，至少约15倍，至少约20倍，至少约50倍，至少约70倍或至少约100倍。靶核酸转录的选择性减少减少了靶核酸的转录，但是可能不会实质上减少非靶DNA的转录，例如，与不存在致动部分(例如向导核酸/酶促失活的或酶促降低的Cas蛋白复合物)的情况下非靶向DNA的转录水平相比，非靶核酸的转录如果减少，则减少小于约5倍，小于约4倍，小于约3倍，小于约2倍，小于约1.8倍，小于约1.6倍，小于约1.4倍，小于约1.2倍或小于约1.1倍。
转录调节可以通过将致动部分(例如酶促失活的Cas蛋白)融合至异源序列来实现。异源序列可以是合适的融合配偶体，例如通过直接作用于靶核酸或与靶核酸有关的多肽(例如组蛋白或其他DNA结合蛋白)，而提供间接增加、减少或以其他方式调节转录的活性的多肽。合适的融合配偶体的非限制性实例包括提供甲基转移酶活性、脱甲基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酰化活性、脱腺苷酰化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、豆蔻酰化活性或去豆蔻酰化活性的多肽。
合适的融合配偶体包括直接增加靶核酸转录的多肽。例如，转录激活物或其片段、募集转录激活物的蛋白或其片段、或小分子/药物应答转录调节物。合适的融合配偶体包括直接减少靶核酸转录的多肽。例如，转录抑制物或其片段、募集转录抑制物的蛋白或其片段、或小分子/药物应答转录调节物。
异源序列或融合配偶体可以融合至致动部分(例如死亡Cas蛋白)的C端，N端或内部部分(即，除N或C端以外的部分)。融合配偶体的非限制性实例包括转录激活物、转录抑制物、组蛋白赖氨酸甲基转移酶(KMT)、组蛋白赖氨酸脱甲基酶、组蛋白赖氨酸乙酰转移酶(KAT)、组蛋白赖氨酸脱乙酰酶、DNA甲基化酶(腺苷或胞嘧啶修饰)、CTCF、外周募集元件(例如Lamin A，Lamin B)和蛋白质对接元件(例如FKBP/FRB)。
转录激活物的非限制性实例包括GAL4、VP16、VP64和p65亚结构域(NFκB)。
转录抑制物的非限制性实例包括Kruippel相关盒(KRAB或SKD)、Mad mSIN3相互作用结构域(SID)和ERF阻遏结构域(ERD)。
组蛋白赖氨酸甲基转移酶(KMT)的非限制性实例包括KMT1家族成员(例如SUV39H1、SUV39H2、G9A、ESET/SETDB1、Clr4、Su(var)3-9)，KMT2家族成员(例如hSET1A、hSET1B、MLL1-5、ASH1和同系物(Trx、Trr、Ash1))，KMT3家族(SYMD2、NSD1)，KMT4(DOT1L和同系物)，KMT5家族(Pr-SET7/8、SUV4-20H1和同系物)，KMT6(EZH2)和KMT8(例如RIZ1)。
组蛋白赖氨酸脱甲基酶(KDM)的非限制性实例包括KDM1家族成员(LSD1/BHC110、Splsd1/Swm1/Saf11 0、Su(var)3-3)，KDM3家族成员(JHDM2a/b)，KDM4家族成员(JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D和同系物(Rph1))，KDM5家族成员(JARID1A/RBP2、JARID1B/PLU-1、JARIDIC/SMCX、JARID1D/SMCY和同系物(Lid、Jhn2、Jmj2)和KDM6家族成员(例如UTX、JMJD3)。
KAT的非限制性实例包括KAT2家族成员(hGCN5、PCAF和同系物(dGCN5/PCAF、Gcn5)，KAT3家族成员(CBP、p300和同系物(dCBP/NEJ))，KAT4，KAT5，KAT6，KAT7，KAT8和KAT13。
在一些实施方式中，包含死亡Cas蛋白或死亡Cas融合蛋白的致动部分被向导核酸靶向靶核酸中的特定位置(即，序列)并表现出位点特异性调节，例如阻断RNA聚合酶结合启动子(例如，其可以选择性地抑制转录激活功能)，和/或修饰局部染色质状态(例如，当使用融合序列时，其可以修饰靶核酸或修饰与靶核酸相关的多肽)。在某些情况下，这些改变是暂时的(例如，转录抑制或激活)。在某些情况下，这些改变是可遗传的(例如，当对靶DNA或与靶DNA相关的蛋白(例如核小体组蛋白)进行表观遗传修饰时)。
在一些实施方式中，向导核酸可包含蛋白结合区段以将异源多肽募集至靶核酸以调节靶核酸的转录。异源多肽的非限制性实例包括提供甲基转移酶活性、脱甲基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酰化活性、脱腺苷酰化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、豆蔻酰化活性或去豆蔻酰化活性的多肽。向导核酸可以包含蛋白结合区段以募集转录激活因子、转录抑制子、或其片段。
在一些实施方式中，通过使用向导核酸进行基因表达调节，所述向导核酸被设计用于靶向靶核酸的调控元件，例如转录响应元件(例如启动子、增强子)，上游激活序列(UAS)和/或疑似能够控制靶DNA表达的未知或已知功能的序列。
在本文方面的各个实施方式中，本文提供了向导核酸。向导核酸(例如，向导RNA)可以与Cas蛋白结合并将Cas蛋白靶向靶多核苷酸内的特定位置。向导核酸可以包含核酸靶向区段和Cas蛋白结合区段。
向导核酸可以指能够与另一核酸(例如，细胞基因组中的靶多核苷酸)杂交的核酸。向导核酸可以是RNA，例如，向导RNA。向导核酸可以是DNA。向导核酸可以包含DNA和RNA。向导核酸可以是单链的。向导核酸可以是双链的。向导核酸可以包含核苷酸类似物。向导核酸可以包含修饰的核苷酸。可以对向导核酸进行编程或设计以与核酸的位点特异性序列结合。
向导核酸可以包含一个或多个修饰以提供具有新的或增强的特征的核酸。向导核酸可以包含核酸亲和标签。向导核酸可以包含合成的核苷酸、合成的核苷酸类似物、核苷酸衍生物和/或修饰的核苷酸。
向导核酸可包含核酸靶向区域(例如间隔区域)，例如在5'末端或3'末端或其附近的与靶多核苷酸中的原间隔序列互补的区域。向导核酸的间隔区可以通过杂交(即碱基配对)以序列特异性的方式与原间隔序列相互作用。原间隔序列可位于靶多核苷酸中原间隔序列相邻基序(PAM)的5'端或3'端。间隔区的核苷酸序列可以变化，并确定向导核酸可以与之相互作用的靶核酸内的位置。可以设计或修饰向导核酸的间隔区以与靶核酸内的任何所需序列杂交。
向导核酸可以包含两个单独的核酸分子，其可以被称为双向导核酸。向导核酸可以包含单个核酸分子，其可以被称为单向导核酸(例如，sgRNA)。在一些实施方式中，所述向导核酸是包含融合的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的单向导核酸。在一些实施方式中，所述向导核酸是包含crRNA的单向导核酸。在一些实施方式中，所述向导核酸是包含crRNA但缺乏tracrRNA的单向导核酸。在一些实施方式中，所述向导核酸是包含非融合crRNA和tracrRNA的双向导核酸。示例性的双向导核酸可以包含crRNA样分子和tracrRNA样分子。示例性单向导核酸可以包含crRNA样分子。示例性单向导核酸可以包含融合的crRNA样和tracrRNA样分子。
crRNA可以包含向导核酸的核酸靶向区段(例如，间隔区)和可以形成一半的向导核酸的Cas蛋白结合区段的双链双链体的一段核苷酸。
tracrRNA可以包含形成另一半的gRNA的Cas蛋白结合区段的双链双链体的一段核苷酸。crRNA的一段核苷酸可与tracrRNA的一段核苷酸互补并杂交形成向导核酸的Cas蛋白结合结构域的双链双链体。
crRNA和tracrRNA可以杂交形成向导核酸。crRNA还可提供与靶核酸识别序列(例如原间隔序列)杂交的单链核酸靶向区段(例如间隔区)。可以将包括间隔区的crRNA或tracrRNA分子的序列设计成特异于要使用的向导核酸的种类。
在一些实施方式中，向导核酸的核酸靶向区域的长度可以在18至72个核苷酸之间。向导核酸的核酸靶向区域(例如，间隔区)的长度可以为约12个核苷酸至约100个核苷酸。例如，向导核酸的核酸靶向区域(例如，间隔区)的长度可以约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约40nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约12nt至约18nt、从约12nt至约17nt、约12nt至约16nt或从约12nt至约15nt。或者，DNA靶向区段的长度可以约18nt至约20nt、约18nt至约25nt、约18nt至约30nt、约18nt至约35nt、约18nt至约40nt、约18nt至约45nt、约18nt至约50nt、约18nt至约60nt、约18nt至约70nt、约18nt至约80nt、约18nt至约90nt、约18nt至约100nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt、约20nt至约60nt、约20nt至约70nt、约20nt至约80nt、约20nt至约90nt或约20nt至约100nt。核酸靶向区域的长度可以是至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。核酸靶向区域(例如，间隔区序列)的长度可以是至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。
在一些实施方式中，向导核酸的核酸靶向区域(例如，间隔区)长度为20个核苷酸。在一些实施方式中，向导核酸的核酸靶向区域长度为19个核苷酸。在一些实施方式中，向导核酸的核酸靶向区域长度为18个核苷酸。在一些实施方式中，向导核酸的核酸靶向区域长度为17个核苷酸。在一些实施方式中，向导核酸的核酸靶向区域长度为16个核苷酸。在一些实施方式中，向导核酸的核酸靶向区域长度为21个核苷酸。在一些实施方式中，向导核酸的核酸靶向区域长度为22个核苷酸。
与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的向导核酸的核苷酸序列的长度可以例如至少约12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt。与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的向导核酸的核苷酸序列的长度可以约12nt至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt或约20nt至约60nt。
可通过鉴定感兴趣区域内的PAM并选择PAM所需大小的上游或下游的区域作为原间隔序列来鉴定原间隔序列。可以通过确定原间隔序列区域的互补序列来设计相应的间隔区序列。
间隔区序列可以使用计算机程序(例如，机器可读代码)来识别。计算机程序可以使用变量，诸如预测的解链温度、二级结构形成和预测的退火温度、序列同一性、基因组背景(genomic context)、染色质开放性(chromatin accessibility)、％GC、基因组发生频率、甲基化状态、SNP的存在等。
核酸靶向序列(例如，间隔区序列)与靶核酸(例如原间隔序列)之间的互补百分比可以是至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。核酸靶向序列和靶核酸之间的互补百分比可以是至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％％、至少97％、至少98％、至少99％或100％超过约20个连续核苷酸。
向导核酸的Cas蛋白结合区段可以包含彼此互补的两段核苷酸(例如，crRNA和tracrRNA)。彼此互补的两段核苷酸(例如，crRNA和tracrRNA)可以通过插入的核苷酸(例如，在单向导核酸的情况下为接头)共价连接。彼此互补的两段核苷酸(例如crRNA和tracrRNA)可以杂交形成Cas蛋白结合区段的双链RNA双链体或发夹，从而形成茎环结构。crRNA和tracrRNA可以通过crRNA的3'末端和tracrRNA的5'末端共价连接。或者，tracrRNA和crRNA可通过tracrRNA的5'末端和crRNA的3'末端共价连接。
向导核酸的Cas蛋白结合区段的长度可以约10个核苷酸至约100个核苷酸，例如约10个核苷酸(nt)至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt、或约90nt至约100nt。例如、向导核酸的Cas蛋白结合区段的长度可以约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt。
向导核酸的Cas蛋白结合区段的dsRNA双链体可具有约6个碱基对(bp)至约50bp的长度。例如，蛋白结合区段的dsRNA双链体的长度可约6bp至约40bp、约6bp至约30bp、约6bp至约25bp、约6bp至约20bp、约6bp至约15bp、约8bp至约40bp、约8bp至约30bp、约8bp至约25bp、约8bp至约20bp或约8bp至约15bp。例如、Cas蛋白结合区段的dsRNA双链体的长度可约8bp至约10bp、约10bp至约15bp、约15bp至约18bp、约18bp至约20bp、约20bp至约25bp、约25bp至约30bp、约30bp至约35bp、约35bp至约40bp或约40bp至约50bp。在一些实施方式中，Cas蛋白结合区段的dsRNA双链体可以具有36个碱基对的长度。杂交形成蛋白结合区段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的互补百分比可以至少约60％。例如，杂交形成蛋白结合区段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的互补百分比可以至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％。在某些情况下，杂交形成蛋白结合区段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的互补百分比为100％。
接头(例如，连接单向导核酸中的crRNA和tracrRNA)可具有约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，接头的长度可以约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3个核苷酸(nt)至约80nt、约3个核苷酸(nt)至约70nt、约3个核苷酸(nt)至约60nt、约3个核苷酸(nt)至约50nt、约3个核苷酸(nt)至约40nt、约3个核苷酸(nt)至约30nt、约3个核苷酸(nt)至约20nt或约3个核苷酸(nt)至约10nt。例如、接头的长度可以约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt。在一些实施方式中，靶向DNA的RNA的接头是4nt。
向导核酸可以包括提供额外的所需特征(例如修饰或调节的稳定性；亚细胞靶向；用荧光标记追踪；蛋白或蛋白复合物的结合位点等)的修饰或序列。这种修饰的实例包括，例如5'帽(例如，7-甲基鸟苷酸帽(m7G))；3'聚腺苷酸尾巴(即，3'poly(A)尾)；核糖开关序列(例如，以允许蛋白和/或蛋白复合物的调节稳定性和/或调节开放性)；稳定性控制序列；形成dsRNA双链体(即发夹)的序列)；将RNA靶向亚细胞位置(例如细胞核，线粒体，叶绿体等)的修饰或序列；提供用于跟踪(例如，直接缀合至荧光分子、缀合至有利于荧光检测的部分，允许荧光检测的序列等)的修饰或序列；提供蛋白(例如作用于DNA的蛋白质，包括转录激活因子、转录抑制子、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶及其组合)结合位点的修饰或序列。
向导核酸可以包含一个或多个修饰(例如碱基修饰、骨架修饰)，以提供具有新的或增强的特征(例如，改善的稳定性)的核酸。向导核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖的组合物。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。这种杂环碱基的两种最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含戊呋喃糖的那些核苷，所述磷酸基团可以与糖的2'，3'或5'羟基部分连接。在形成向导核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合物。进而，所述线性聚合物的各个末端可以进一步连接形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。另外，线性化合物可具有内部核苷酸碱基互补性，因此可以一定方式折叠以产生完全或部分双链化合物。在向导核酸内，磷酸基团通常称为形成向导核酸的核苷间骨架。向导核酸的键或骨架可以是3'至5'磷酸二酯键。
向导核酸可以包含修饰的骨架和/或修饰的核苷间键。修饰的骨架包括在骨架中保留磷原子的骨架和骨架中不含磷原子的骨架。
其中含有磷原子的合适的修饰的向导核酸骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(例如3'-亚烃基膦酸酯、5'-亚烃基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯)、氨基磷酸酯(包括3'-氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、磷二酰胺(phosphorodiamidates)、硫代氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯，硒代磷酸酯和具有正常3'-5'键、2'-5'连接类似物的硼代磷酸酯，以及那些具有反向极性，其中一个或多个核苷酸间键是3'-3'，5'-5'或2'-2'键。具有反向极性的合适的向导核酸在3'最多的核苷酸间键处包含单个3'-3'键(即其中核碱基缺失或在该处被羟基基团取代的单个反向核苷残基)。也可以包括各种盐(例如氯化钾或氯化钠)、混合盐和游离酸形式。
向导核酸可以包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键，特别是-CH2-NH-O-CH2-,-CH2-N(CH3)-O-CH2-(即亚甲基(甲亚氨基)或MMI骨架)，-CH2-O-N(CH3)-CH2-,-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯核苷酸间键表示为-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-)。
向导核酸可以包含吗啉代骨架结构。例如，核酸可以包含代替核糖环的6-元吗啉代环。在这些实施方式的一些中，磷二酰胺或其他非磷酸二酯核苷间键代替磷酸二酯键。
向导核酸可包含多核苷酸骨架，所述多核苷酸骨架通过短链烷基或环烷基核苷间键，混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成。这些骨架包括具有吗啉代(morpholino)键(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；核糖乙酰(riboacetyl)骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸盐和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的N，O，S和CH2组分的骨架。
向导核酸可以包含核酸模拟物。术语“模拟物”适用于包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键两者均被非呋喃糖基替换的多核苷酸，仅替换呋喃糖环也可以被称为糖替代物。杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分可以保留与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可以被含酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架替代。保留核苷酸并将其直接或间接结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。PNA化合物中的骨架可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，其给予PNA含酰胺骨架。杂环碱基部分可以直接或间接结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。
向导核酸可以包含连接的吗啉代单元(即吗啉代核酸)，其具有连接到吗啉代环的杂环碱基。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子型吗啉代的寡聚化合物与细胞蛋白具有较少不需的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是向导核酸的非离子模拟物。吗啉代类中的多种化合物可以使用不同的连接基团连接。另一类多核苷酸模拟物可以称为环己烯基核酸(CeNA)。通常存在于核酸分子中的呋喃糖环可以被环己烯基环取代。可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体，并使用亚磷酰胺化学法将其用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增加DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸可以与核酸互补物形成复合物，具有与天然复合物相似的稳定性。另一种修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2'-羟基与糖环的4'碳原子连接，从而形成2'-C，4'-C-氧亚甲基键，由此形成双环糖部分。所述键可以是桥连2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH2-)基团，其中n是1或2。LNA以及LNA类似物显示与互补核酸非常高的双链热稳定性(Tm＝+3至+10℃)，对3'-核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性。
向导核酸可以包含一个或多个取代的糖部分。合适的多核苷酸可以包含选自以下的糖取代基：OH，F，O-、S-或N-烷基，O-、S-或N-烯基，O-、S-或N-炔基，或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。特别合适的是O((CH2)nO)mCH3,O(CH2)nOCH3,O(CH2)nNH2,O(CH2)nCH3,O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2，其中n和m为1至约10。糖取代基可以选自：C1-C10低级烷基，取代的低级烷基，烯基，炔基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或O-芳烷基，SH,SCH3,OCN,Cl,Br,CN,CF3,OCF3,SOCH3,SO2CH3,ONO2,NO2,N3,NH2,杂环烷基，杂环烷芳基，氨基烷基氨基，多烷基氨基，取代的甲硅烷基，RNA切割基团，报告基团，嵌入剂，改善向导核酸的药代动力学性质的基团，或改善向导核酸的药效学性质的基团，和具有相似性质的其他取代基。合适的修饰可以包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE，即烷氧基烷氧基)。另一种合适的修饰可以包括2'-二甲基氨基氧乙氧基(即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE)和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其他合适的糖取代基可包括甲氧基(-O-CH3)，氨基丙氧基(--O CH2CH2CH2NH2)，烯丙基(-CH2-CH＝CH2)，-O-烯丙基(--O--CH2—CH＝CH2)和氟(F)。2'-糖取代基可以处于阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。合适的2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。类似的修饰也可以在寡聚化合物上的其他位置，特别是3'末端核苷或2'-5'连接的核苷酸上的糖的3'位置，和5'末端核苷酸的5'位置。寡聚化合物还可以具有糖模拟物，例如环丁基部分取代戊呋喃糖。
向导核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰”或“天然”核碱基可包括嘌呤碱基(例如腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))和嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶U))。修饰的核碱基可以包括其他合成和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可以包括三环嘧啶如吩恶嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并恶嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4-苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹子，如取代的吩恶嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4(b)(1,4)苯并恶嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3'，2'：4,5)吡咯并(2,3-d)嘧啶-2-酮)。
杂环碱基部分可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮取代的那些核碱基。核碱基可用于增加多核苷酸化合物的结合亲和性。这些核碱基包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代可以使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃，并且是合适的碱基取代(例如，当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时)。
向导核酸的修饰包括化学连接至向导核酸的一个或多个部分或偶联物，其可以增强向导核酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这些部分或偶联物包括与官能团例如伯羟基或仲羟基基团共价结合的偶联物基团。偶联物基团包括但不限于嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物药效学性质的基团和增强寡聚物药物动力学性质的基团。偶联物基团包括但不限于胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强降解抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。增强药代动力学性质的基团包括改善核酸摄取、分布、代谢或排泄的基团。偶联物部分可以包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂肪族链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯)，多胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。
修饰可以包括“蛋白转导结构域”或PTD(即细胞穿透肽(CPP))。所述PTD可以指促进穿过脂质双分子层、微胶粒(micelle)、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或有机或无机化合物。PTD可以连接到另一个分子，其范围可以从小的极性分子到大的大分子和/或纳米颗粒，并且可以促进分子穿过膜，例如从细胞外空间到细胞内空间，或胞质溶胶到一个细胞器内。PTD可以共价连接至多肽的氨基末端。PTD可以共价连接至多肽的羧基末端。PTD可以共价连接至核酸。示例性的PTD可以包括但不限于最小的肽蛋白转导结构域；包含足以直接进入细胞的许多精氨酸(例如3,4,5,6,7,8,9,10或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列，VP22结构域，果蝇触角足蛋白转导结构域，截短的人降钙素肽，聚赖氨酸和运输蛋白，3个精氨酸残基到50个精氨酸残基的精氨酸均聚物。PTD可以是可激活的CPP(ACPP)。ACPP可以包含经由可切割接头连接至匹配的聚阴离子(例如Glu9或“E9”)的聚阳离子CPP(例如，Arg9或“R9”)，其可以将净电荷降低至接近零，从而抑制粘附并摄入细胞。经接头切割，聚阴离子可被释放，局部暴露聚精氨酸及其固有的粘附性，从而“活化”ACPP以穿过膜。
向导核酸可以以任何形式提供。例如，可以以RNA的形式提供向导核酸，作为两个分子(例如，单独的crRNA和tracrRNA)或作为一个分子(例如sgRNA)。向导核酸可以以与Cas蛋白形成复合物的形式提供。向导核酸也可以以编码RNA的DNA的形式提供。编码向导核酸的DNA可以编码单向导核酸(例如，sgRNA)或单独的RNA分子(例如，单独的crRNA和tracrRNA)。在后一种情况下，编码向导核酸的DNA可以作为分别编码crRNA和tracrRNA的单独的DNA分子分别提供。
编码向导核酸的DNA可以稳定整合到细胞的基因组中，并且任选地可操作地连接到在细胞中有活性的启动子。编码向导性核酸的DNA可以与表达构建体中的启动子可操作地连接。
向导核酸可以通过任何合适的方法来制备。例如，可以使用例如T7RNA聚合酶通过体外转录来制备向导核酸。向导核酸也可以是通过化学合成制备的合成产生的分子。
向导核酸可以包含用于增加稳定性的序列。例如，向导核酸可以包含转录终止子片段(即，转录终止序列)。转录终止子片段的总长度可以约10个核苷酸至约100个核苷酸、例如约10个核苷酸(nt)至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt、或约90nt至约100nt。例如、转录终止子片段的长度可以约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt。转录终止序列可以在真核细胞或原核细胞中起作用。
本文公开的嵌合受体多肽和衔接子多肽的各种结构域(例如抗原相互作用结构域、免疫细胞信号传导结构域(例如主要信号传导结构域和共刺激结构域)、受体结合部分、致动部分、切割部分等)可以通过化学键(例如酰胺键或二硫键)；小的有机分子(例如烃链)；氨基酸序列(例如肽接头(例如，长度约3-200个氨基酸的氨基酸序列)、或者小的有机分子和肽接头的组合物)连接。肽接头可提供所需的灵活性，以允许所需的嵌合多肽的表达、活性和/或构象定位。肽接头可以具有任何合适的长度以连接至少两个感兴趣的结构域，并且优选设计为足够柔性以便允许其连接的一个或两个结构域的正确折叠和/或功能和/或活性。肽接头的长度至少为3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、90、95或100个氨基酸。在一些实施方式中，肽接头的长度约0至200个氨基酸，约10至190个氨基酸，约20至180个氨基酸，约30至170个氨基酸，约40至160个氨基酸，约50至150个氨基酸，约60至140个氨基酸，约70至130个氨基酸，约80至120个氨基酸，约90至110个氨基酸。在一些实施方式中，接头序列可以包含内源性蛋白序列。在一些实施方式中，接头序列包含甘氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸残基。在一些实施方式中，接头可以含基序，例如GS，GGS，GGGGS，GGSG或SGGG的多个或重复基序。接头序列可以包括任何天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或其组合。
在本文各方面的各个实施方式中，所述系统在细胞或细胞群中表达。细胞，例如免疫细胞(例如包括T细胞和NK细胞的淋巴细胞)可以来自受试者。受试者的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。可以衍生细胞的来自受试者的样品的实例包括但不限于皮肤、心脏、肺、肾、骨髓、乳腺(breast)、胰腺、肝脏、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、前列腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿液、胃和消化液、眼泪、粪便、精液、阴道液、肿瘤组织间质液、眼液、汗液、粘液、耳垢、油、腺分泌物、脊髓液、头发、指甲、血浆、鼻拭子或鼻咽冲洗液、脊髓液、脑脊髓液、组织、咽拭子、活组织切片、胎盘液、羊水、脐带血、突出液(emphatic fluids)、腔液、唾液、脓液、微生物群、胎粪、母乳和/或其他排泄物或身体组织。
在本文各方面的各个实施方式中，免疫细胞包含淋巴细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞是自然杀伤细胞(NK细胞)。在一些实施方式中，淋巴细胞是T细胞。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞，骨髓，淋巴结组织，脾脏组织，脐带和肿瘤。在一些实施方式中，可以使用任何数量的可用的T细胞系。免疫细胞如淋巴细胞(例如细胞毒性淋巴细胞)可优选为自体细胞，但也可使用异体细胞。可以使用许多技术如Ficoll分离从采集自受试者的一个单位血液中获得T细胞。来自个体循环血液的细胞可以通过血浆分离置换法(apheresis)或白细胞分离术(leukapheresis)获得。血浆分离置换产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。可以洗涤血浆分离置换法收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基(如磷酸盐缓冲盐水(PBS))中用于随后的处理步骤。洗涤后，细胞重悬浮在各种生物相容性缓冲液中，如不含钙、不含镁的PBS。或者，可以去除血浆分离置换法样本中不需要的成分，并将细胞直接重新悬浮在培养基中。样本可以由受试者直接提供，或通过一个或多个中间体，例如样本收集服务提供者或医疗提供者(例如医生或护士)间接提供。在一些实施方式中，从外周血白细胞分离T细胞包括裂解红细胞，并通过例如离心(例如PERCOLTM梯度离心)从单核细胞分离外周血白细胞。
特定的T细胞亚群，如CD4+或CD8+T细胞，可通过正选或负选技术进一步分离。例如，可以使用针对负向选择的细胞所特有的表面标记的抗体组合来完成T细胞群的负选。一种合适的技术包括通过负磁性免疫粘附进行细胞分选，其利用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物。例如，为了分离CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。负选过程可用于生产主要为同类的所需T细胞群。在一些实施方式中，组合物包含两种或更多种(例如2、3、4、5种或更多种)不同种类的T细胞的混合物。
在一些实施方式中，免疫细胞是富集的细胞群的成员。一种或多种所需的细胞类型可以通过任何合适的方法富集，其非限制性实例包括处理细胞群以引起扩增和/或分化成所需的细胞类型，处理以阻止不需要的细胞类型的生长，处理以杀死或裂解不需要的细胞类型，纯化所需细胞类型(例如基于一种或多种细胞表面标记，在亲和柱上纯化以保留所需或不需要的细胞类型)。在一些实施方式中，富集的细胞群是富含细胞毒性淋巴细胞的细胞群，其选自细胞毒性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、细胞溶解T细胞、CD8+T细胞和杀伤T细胞)、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。
为了通过正选或负选分离所需的细胞群，可以改变细胞的浓度和表面(例如，诸如珠子的颗粒)。在某些实施方式中，可能需要显著降低珠子和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，可以使用20亿个细胞/mL的浓度。在一些实施方式中，使用10亿个细胞/mL的浓度。在一些实施方式中，使用大于1亿个细胞/mL。可以使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百万个细胞/mL的细胞浓度。在又一个实施方式中，可以使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/mL的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可以使用125或150百万个细胞/mL的浓度。使用高浓度可导致细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。
细胞(例如免疫细胞)可以用本文所述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染。细胞可以被转染，如同其在受试者中天然发生的那样。细胞可以被取自或衍生自受试者并被转染。细胞可以衍生自取自受试者的细胞，例如细胞系。在一些实施方式中，用本文所述的一种或多种载体转染的细胞用于建立新的细胞系，其包含一种或多种载体衍生序列。在一些实施方式中，用所述系统的各种组分瞬时转染(例如通过瞬时转染一种或多种载体，或用RNA转染)，并通过CRISPR复合物的活性进行修饰的细胞，被用于建立新的细胞系，其包含含有修饰但缺乏任何其他外源序列的细胞。
可以使用任何合适的递送方法将本文的组合物和分子(例如，多肽和/或编码多肽的核酸)引入宿主细胞，如免疫细胞中。所述系统的各种组分可以同时或暂时分开递送。在一些实施方式中，将包含Cas蛋白和/或嵌合受体和/或衔接子的致动部分，与向导序列组合，并且任选地与向导序列复合，递送至细胞例如免疫细胞。所述方法的选择取决于转化的细胞的类型和/或转化发生的环境(例如体外、离体或体内)。
递送方法可包括接触靶多核苷酸或将一个或多个核酸导入细胞(或细胞群如免疫细胞)中，所述核酸包含编码本文组合物(例如，致动部分如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、嵌合衔接子、向导核酸等)的核苷酸序列。包含编码本文组合物的核苷酸序列的合适核酸可包括表达载体，其中包含编码本文一种或多种组合物(例如，致动部分如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、嵌合衔接子、向导核酸等)的核苷酸序列的表达载体是一种重组表达载体。
递送方法或转化的非限制性实例包括，例如病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀法、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射和纳米颗粒介导的核酸递送。
在一些方面，本文提供了包括将本文所述的一种或多种多核苷酸，或一种或多种载体，或其一种或多种转录物，和/或一种或多种由其转录的蛋白质递送至宿主细胞的方法。在一些方面，本文进一步提供了由这些方法产生的细胞，以及包含这些细胞或由这些细胞产生的生物体(如动物、植物或真菌)。在一些实施方式中，将Cas蛋白和/或嵌合受体和/或衔接子，与向导序列组合，并任选地与向导序列复合，被递送至细胞。
基于常规的病毒和非病毒的基因转移方法可用于将核酸导入到哺乳动物细胞或靶组织中。这样的方法可以用于将编码本文组合物的核酸施用于培养的或宿主生物体的细胞中。非病毒载体递送系统可以包括DNA质粒、RNA(例如本文描述的载体的转录物)、裸核酸和与递送载体(例如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统可以包括DNA和RNA病毒，其可以在递送至细胞后具有游离态或整合基因组。
核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸偶联物、裸DNA、人工病毒粒子和DNA的药剂增强的摄取。可以使用适用于多核苷酸的高效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质。可递送至细胞(例如体外或离体给药)或靶组织(例如体内给药)。可使用制备的脂质：核酸复合物(包括靶向脂质体如免疫脂质复合物)。
基于RNA或DNA病毒的系统可用于靶向体内特定细胞并将病毒有效载荷运输至细胞核。病毒载体可以直接施用(体内)，或者可以用于体外处理细胞，并且任选地施用(离体)所述改造的细胞。基于病毒的系统包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法可以整合在宿主基因组中，这可以导致插入的转基因长期表达。在许多不同的细胞类型和靶组织中可以观察到高转导效率。
逆转录病毒的趋向性可以通过结合外来包膜蛋白来改变，从而扩大靶细胞的潜在靶标群体。慢病毒载体是可以转导或感染非分裂细胞并产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择可取决于靶组织。逆转录病毒载体可以包含顺式作用的长末端重复序列，其具有高达6-10kb的外源序列的包装能力。最小的顺式作用LTR可足以用于载体的复制和包装，其可用于将治疗性基因整合入靶细胞中以提供永久性转基因表达。逆转录病毒载体可以包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的载体。
可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的系统可以导致转基因的瞬时表达。基于腺病毒的载体可以在细胞中具有高转导效率并且可以不需要细胞分裂。使用基于腺病毒的载体可以获得高滴度和表达水平。腺相关病毒(“AAV”)载体可用于将靶核酸转导细胞，例如在体外生产核酸和肽，以及用于体内和离体基因治疗的步骤中。
包装细胞可用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这些细胞可以包括293细胞(例如用于包装腺病毒)和Psi2细胞或PA317细胞(例如用于包装逆转录病毒)。病毒载体可以通过生产将核酸载体包装到病毒颗粒中的细胞系来产生。载体可以含有包装和随后整合入宿主所需的最小病毒序列。载体可以含有被待表达的多核苷酸的表达盒替换的其他病毒序列。可以通过包装细胞系反式提供缺失的病毒功能。例如，AAV载体可以包含来自AAV基因组的包装和整合到宿主基因组中所需的ITR序列。病毒DNA可以在细胞系中包装，所述细胞系可以含有编码其他AAV基因(即rep和cap，但缺乏ITR序列)的辅助质粒。细胞系也可以被作为辅助物的腺病毒感染。辅助病毒可以促进AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因的表达。通过例如热处理(腺病毒比AAV更敏感)可以降低腺病毒的污染。可以使用其他将核酸递送至细胞的方法，例如，如US20030087817中所述，通过引用将其并入本文。
宿主细胞可以用本文所述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染。细胞可以被转染，正如其在受试者中天然发生的那样。细胞可以被取自或衍生自受试者并被转染。细胞可以衍生自取自受试者的细胞，例如细胞系。在一些实施方式中，用本文所述的一种或多种载体转染的细胞用于建立新的细胞系，其包含一种或多种载体衍生序列。在一些实施方式中，用本文的组合物瞬时转染(例如通过瞬时转染一种或多种载体，或用RNA转染)，并通过致动部分如CRISPR复合物的活性进行修饰的细胞，被用于建立新的细胞系，其包含含有修饰但缺乏任何其他外源序列的细胞。
与宿主细胞相容的任何合适的载体可以与本文的方法一起使用。用于真核宿主细胞的载体的非限制性实例包括pXT1、pSG5(StratageneTM)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(法玛西亚PharmaciaTM)。
在一些实施方式中，编码向导核酸和/或Cas蛋白或嵌合体的核苷酸序列可操作地连接至调控元件，例如转录调控元件，例如启动子。转录调控元件可以在真核细胞(例如哺乳动物细胞)或原核细胞(例如细菌或古细菌细胞)中起作用。在一些实施方式中，编码向导核酸和/或Cas蛋白或嵌合体的核苷酸序列可操作地连接至多个调控元件，所述多个调控元件允许编码向导核酸和/或Cas蛋白或嵌合体的核酸序列在原核和/或真核细胞中的表达。
根据所利用的宿主/载体系统，许多合适的转录和翻译调控元件(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)中的任何一种可用于表达载体中(例如U6启动子，H1启动子等；参见上文)(参见例如Bitter等(1987)酶学方法(Methods inEnzymology)，153：516-544)。
在一些实施方式中，本文的组合物(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、嵌合衔接子、向导核酸等)可作为RNA提供。在这种情况下，本文的组合物(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、嵌合衔接子、向导核酸等)可以通过直接化学合成来产生或可以从DNA体外转录。可以使用RNA聚合酶(例如T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶等)在体外合成本文的组合物(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、嵌合衔接子、向导核酸等)。一旦合成，所述RNA就可以直接接触靶DNA，或者可以使用任何合适的将核酸导入细胞(例如显微注射、电穿孔、转染等)的技术将所述RNA导入到细胞中。
可以使用合适的转染技术将编码向导核酸(作为DNA或RNA导入)和/或Cas蛋白或嵌合体(作为DNA或RNA导入)的核苷酸提供给细胞；见例如Angel和Yanik(2010)PLoS ONE 5(7)：e11756，以及市售的TransMessenger.RTM.试剂来自Qiagen，Stemfect.TM。来自Stemgent的RNA转染试剂盒和来自Mirus Bio LLC的TransIT.-mRNA转染试剂盒。另见Beumer等人(2008)通过直接胚胎注射锌指核酸酶在果蝇中高效基因靶向。PNAS105(50):19821-19826。可以在DNA载体上提供编码本文的组合物的核酸(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、衔接子、向导核酸等)。许多载体，例如质粒，粘粒，微环，噬菌体，病毒等可用于将核酸递送到靶细胞中。包含核酸的载体可以保持游离态，例如，作为质粒、微环DNA、病毒如巨细胞病毒、腺病毒等，或者可以通过同源重组或随机整合整合到靶细胞基因组中，例如，逆转录病毒衍生的载体如MMLV、HIV-1和ALV。
诸如Cas蛋白或嵌合体、嵌合受体和/或衔接子的致动部分可作为多肽提供给细胞。这样的蛋白可以任选地与增加产物溶解度的多肽结构域融合。所述结构域可以通过确定的蛋白酶切割位点(例如可被TEV蛋白酶切割的TEV序列)与多肽连接。衔接子还可以包括一个或多个柔性序列，例如，1至10个甘氨酸残基。在一些实施方式中，在维持产物溶解度的缓冲液中进行融合蛋白的切割，例如，在0.5至2M尿素存在下，在增加溶解度的多肽和/或多核苷酸存在下等。感兴趣的结构域包括内吞体裂解(endosomolytic)结构域，例如流感HA结构域；和其他有助于生产的多肽，例如IF2结构域、GST结构域、GRPE结构域等。可以构造多肽以提高稳定性。例如，肽可以聚乙二醇化，其中聚乙烯氧基延长其在血流中的寿命。
本文的组合物(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、嵌合衔接子、向导核酸等)可融合至多肽渗透结构域(permeant domain)以促进细胞摄取。许多渗透结构域可用于本文的非整合多肽中，包括肽、肽模拟物和非肽载体。例如，渗透肽可以是来自黑腹果蝇转录因子触角足蛋白(Antennapaedia)的第三α螺旋，称为穿膜肽(penetratin)，其包含氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK。另一个实例中，渗透肽包含HIV-1tat基本区氨基酸序列，其可以包括例如天然产生的tat蛋白的氨基酸49-57。其他渗透域包括多精氨酸基序，例如HIV-1rev蛋白的氨基酸34-56的区域，九-精氨酸，八-精氨酸等。(例如参见Futaki等(2003)Curr Protein Pept Sci.2003年4月；4(2)：87-9和446；和Wender等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2000Nov.21；97(24):13003-8；公开的美国专利申请20030220334；20030083256；20030032593；和20030022831，通过引用具体纳入本文用于教导肽和拟肽的移位)。可以使用九精氨酸(R9)序列。(Wender等人2000；Uemura等人2002)。可以选择进行融合的位点以优化多肽的生物学活性、分泌或结合特性。
本文的组合物(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、衔接子、向导核酸等)可以在体外或通过真核细胞或通过原核细胞产生，并且可以进一步通过解折叠处理(例如热变性、DTT减少等)和进一步重折叠。
本文的组合物(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、衔接子、向导核酸等)可以通过体外合成制备。可以使用各种商业合成设备，例如Applied Biosystems股份有限公司，Beckman等的自动合成仪。通过使用合成仪，非天然氨基酸可以取代天然存在的氨基酸。可以通过方便性、经济性、所需纯度等来确定制备的具体序列和方式。
本文的组合物(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、衔接子、向导核酸等)也可根据常规重组合成方法分离和纯化。可以制备表达宿主的裂解物，并使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术纯化裂解物。所述组合物可以包含例如至少20重量％，至少约75重量％，至少约95重量％的所需产物，和为了治疗目的，例如至少约99.5重量％，涉及与产物的制备方法及其纯化有关的污染物。所述百分比基于总蛋白质。
本文的组合物(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、衔接子、向导核酸等)，无论是作为核酸还是多肽导入，都可以提供给细胞约30分钟至约24小时，例如1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时，或从约30分钟至约24小时的任何其他时间段，其可以以约每天至约每4天的频率重复，例如每1.5天、每2天、每3天或从约每天至约四天中的任何其他频率。可以一次或多次给受试细胞提供所述组合物，例如，一次、两次、三次或超过三次，并且在每次接触后使细胞与试剂一起温育一段时间，如16-24小时，之后可以用新鲜培养基替代培养基，所述细胞可以进一步培养。
在向细胞提供两种或更多种不同靶向复合物(例如，与相同或不同靶DNA中的不同序列互补的两种不同的向导核酸)的情况下，可以同时提供所述复合物(例如作为两种多肽和/或核酸)，或同时递送。或者，可以相继提供它们，例如，首先提供靶向复合物，接着提供第二靶向复合物等，反之亦然。
可向靶DNA或细胞提供有效量的本文组合物(例如，致动部分诸如Cas蛋白或Cas嵌合体、嵌合受体、衔接子、向导核酸等)。有效量可以是诱发的量，例如，相对于阴性对照(例如与空载体或不相关多肽接触的细胞)，两个同源序列之间观察到的目标调控量例如至少约2倍变化(增加或减少)或更多。有效量或剂量可以诱发靶基因调控的例如约2倍变化、约3倍变化、约4倍变化、约7倍、约8倍增加、约10倍、约50倍、约100倍、约200倍、约500倍、约700倍、约1000倍、约5000倍或约10,000倍变化。靶基因调控的量可以通过任何合适的方法测定。
在促进细胞存活的任何培养基中和任何培养条件下，可以使所述细胞与组合物接触。例如，细胞可以悬浮在方便的任何合适的营养培养基中，如添加有胎牛血清或热灭活山羊血清(约5-10％)、L-谷氨酰胺、巯基(特别是2-巯基乙醇)和抗生素(例如青霉素和链霉素)的Iscove的改良的DMEM或RPMI 1640。培养基可能含有细胞对其响应的生长因子。如本文所定义，生长因子是无论在培养基中还是在完整组织中，通过对跨膜受体的特异性作用能够促进细胞存活、生长和/或分化的分子。生长因子可以包括多肽和非多肽因子。
在许多实施方式中，所选的递送系统针对特定组织或细胞类型。在一些情况下，递送系统的组织或细胞靶向通过将递送系统与组织或细胞特异性标记物(如细胞表面蛋白)结合来实现。病毒和非病毒传递系统可设定为靶向感兴趣的组织或细胞类型。
可以施用含有本文所述的分子(例如，多肽和/或编码多肽的核酸)或免疫细胞的药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，所述组合物以足以治疗或至少部分阻止疾病或病症的症状，或者治疗、治愈、改善或减轻病症的量给予已患有疾病或病症的受试者。用于此用途的有效量可基于疾病或病症的严重程度和病程、先前的治疗、受试者的健康状况、体重和对药物的反应以及治疗医师的判断而变化。
多种治疗剂可以以任何顺序或同时施用。如果同时施用，多种治疗剂可以以单一、统一形式或以多种形式提供，例如作为多个分开的药丸。所述分子可以一起包装或分开包装，包装在一个包装中或多个包装中。一种或全部治疗剂可以多剂量给药。如果不是同时施用，多次剂量之间的时间可以变化多达约一个月。
本文所述的分子可以在疾病或病症发生之前、之间或之后施用，并且施用含有化合物的组合物的时机可以变化。例如，药物组合物可以用作预防药，并且可以连续地施用于患有疾病或疾病倾向的受试者，以防止疾病或病症的发生。所述分子和药物组合物可以在症状发作过程中或发作后尽可能快地施用于受试者。可以在症状发作的前48小时内、在症状发作的前24小时内、在症状发作的前6小时内、或在症状发作后3小时内初始施用所述分子。初始施用可以通过任何实际途径，例如使用本文所述任何制剂，通过本文所述的任何途径。可以在检测到或怀疑疾病或病症发作后，在可行的情况下尽可能快地施用分子，并且持续治疗疾病所需的时间长度，例如约1个月至约3个月。每个受试者的治疗时间可能会有所不同。
一个分子可以被包装进生物胶囊(biological compartment)。包含所述分子的生物胶囊可以施用于受试者。生物胶囊可以包括但不限于病毒(慢病毒、腺病毒)、纳米球、脂质体、量子点，纳米颗粒，微粒，纳米胶囊，囊泡，聚乙二醇颗粒，水凝胶和微胶粒。
例如，生物胶囊可以包含脂质体。脂质体可以是包含一个或多个脂双层的自组装结构，每个脂双层可以包含含有反向的两亲性脂质分子的两个单层。两亲性脂质包含一个极性(亲水)头基，所述头基与一个或两个或更多个非极性(疏水)酰基或烷基链共价连接。疏水性酰基链与周围水性介质之间的能量上不利的接触诱导两亲性脂质分子自身排列，使得极性头基朝向双层表面并且酰基链朝向双层内部，有效地保护酰基链免于接触与含水环境。
用于脂质体中的优选的两亲性化合物的实例包括磷酸甘油酯和鞘脂，其代表性的实例包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二亚油酰磷脂酰胆碱和卵鞘磷脂或其任意组合。
生物胶囊可以包含纳米颗粒。纳米颗粒包含直径约40纳米至约1.5微米、约50纳米至约1.2微米、约60纳米至约1微米、约70纳米至约800纳米、约80纳米至约600纳米、约90纳米至约400纳米、约100纳米至约200纳米。
在一些情况下，随着纳米颗粒的尺寸增加，释放速率减慢或延长，并且随着纳米颗粒的尺寸减小，释放速率增加。
纳米颗粒中白蛋白的量可以为约5％至约85％白蛋白(v/v)，约10％至约80％，约15％至约80％，约20％至约70％白蛋白(v/v)，约25％至约60％，约30％至约50％或约35％至约40％。所述药物组合物可以包含多达30、40、50、60、70或80％或更多的纳米颗粒。在一些情况下，本文的核酸分子可以结合到所述纳米颗粒的表面。
生物将囊可以包含病毒。所述病毒可以是用于本文的药物组合物的递送系统。示例性的病毒可以包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒I或II、细小病毒、网状内皮组织增生病毒和腺相关病毒(AAV)。可以使用病毒将本文的药物组合物递送至细胞。病毒可以在体内、离体或体外感染和转导细胞。在离体和体外递送中，转导的细胞可以施用于需要治疗的受试者。
药物组合物可被包装入病毒递送系统。例如，所述组合物可以通过HSV-1无辅助病毒包装系统包装入病毒体。
可通过直接注射，立体定位注射，脑室内，通过微型泵输注系统，通过对流，导管，静脉内，肠胃外，腹膜内和/或皮下注射将病毒递送系统(例如，包含本文的药物组合物的病毒)施用于有需要的受试者的细胞、组织或器官。在一些情况下，可以在体外或离体用病毒递送系统转导细胞。转导的细胞可以施用于患有疾病的受试者。例如，可以用包含药物组合物的病毒递送系统转导干细胞，并且将干细胞植入患者中以治疗疾病。在一些情况下，给予受试者的转导细胞的剂量可以是约1×105细胞/kg,约5×105细胞/kg,约1×106细胞/kg,约2×106细胞/kg,约3×106细胞/kg,约4×106细胞/kg,约5×106细胞/kg,约6×106细胞/kg,约7×106细胞/kg,约8×106细胞/kg,约9×106细胞/kg,约1×107细胞/kg,约5×107细胞/kg,约1×108细胞/kg,或更多。
通过病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等将生物胶囊导入到细胞中。
在一些实施方式中，施用表达所述系统的免疫细胞。表达所述系统的免疫细胞可以在疾病或病症发生之前、之间或之后施用，并且施用免疫细胞的时机可以变化。例如，表达所述系统的免疫细胞可以用作预防药，并且可以连续地施用于具有病症或疾病倾向的受试者，以防止疾病或病症的发生。所述免疫细胞可以在症状发作过程中或发作后尽可能快地施用于受试者。可以在症状发作的前48小时内、在症状发作的前24小时内、在症状发作的前6小时内、或在症状发作后3小时内初始施用。初始施用可以通过任何实际途径，例如使用本文所述任何制剂，通过本文所述的任何途径。可以在检测到或怀疑疾病或病症发作后，一旦可行随即施用免疫细胞，并且治疗疾病所需的时间长度为，例如约1个月至约3个月。每个受试者的治疗时间可能会有所不同。
存在于组合物中的本文所述的分子(例如多肽和/或核酸)的范围可为约1mg至约2000mg；约5mg至约1000mg、约10mg至约25mg至500mg、约50mg至约250mg、约100mg至约200mg、约1mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约150mg、约150mg至约200mg、约200mg至约250mg、约250mg至约300mg、约300mg至约350mg、约350mg至约400mg、约400mg至约450mg、约450mg至约500mg、约500mg至约550mg、约550mg至约600mg、约600mg至约650mg、约650mg至约700mg、约700mg至约750mg、约750mg至约800mg、约800mg至约850mg、约850mg至约900mg、约900mg至约950mg或约950mg至约1000mg。
存在于组合物中的本文所述的分子(例如多肽和/或核酸)的量可为约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1150mg、约1200mg、约1250mg、约1300mg、约1350mg、约1400mg、约1450mg、约1500mg、约1550mg、约1600mg、约1650mg、约1700mg、约1750mg、约1800mg、约1850mg、约1900mg、约1950mg、或约2000mg。
存在于组合物中的本文所述的分子(例如，多肽和/或核酸)可以提供至少0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、10个或更多单位的活性/mg分子。活性可以是基因表达的调控。在一些实施方式中，递送至受试者的分子的活性单位的总数为至少25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、210,000、220,000、230,000、或250,000或更多个单位。在一些实施方式中，递送至受试者的分子的活性单位的总数为至多25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、210,000、220,000、230,000、或250,000或更多个单位。
在一些实施方式中，将至少约10,000个活性单位递送至受试者，每50kg体重标准化。在一些实施方式中，至少将约10,000、15,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、210,000、220,000、230,000或250,000单位或更多的活性分子递送给受试者，每50kg体重标准化。在一些实施方式中，治疗有效剂量包含至少5×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、1.1×107、1.2×107、1.5×107、1.6×107、1.7×107、1.8×107、1.9×107、2×107、2.1×107或3×107或更多单位的活性的分子。在一些实施方式中，治疗有效剂量包含至多5×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、1.1×107、1.2×107、1.5×107、1.6×107、1.7×107、1.8×107、1.9×107、2×107、2.1×107或3×107或更多单位的活性的分子。
在一些实施方式中，治疗有效剂量为至少约10,000、15,000、20,000、22,000、24,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、125,000、150,000、200,000，或500,000单位/kg体重。在一些实施方式中，治疗有效剂量为至多约10,000、15,000、20,000、22,000、24,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、125,000、150,000、200,000、或500,000单位/kg体重。
在一些实施方式中，递送至受试者的分子的活性至少为10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、30,000、32,000、34,000、35,000、36,000、37,000、40,000、45,000,或50,000,或更多U/mg分子。在一些实施方式中，递送至受试者的分子的活性至多为10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、30,000、32,000、34,000、35,000、36,000、37,000、40,000、45,000、或50,000、或更多U/mg分子。
在本文各方面的各种实施方式中，可以获得药代动力学和药效学数据。获得这些数据的各种实验技术都是可用的。描述特定组合物的合适的药代动力学和药效学曲线组分可以因人类受试者中药物代谢的变化而变化。药代动力学和药效学曲线可以根据一组受试者的平均参数确定。受试者组包括适合于确定代表性平均值的任何合理数目的受试者，例如5个受试者、10个受试者、15个受试者、20个受试者、25个受试者、30个受试者、35个受试者或更多。平均值可以通过计算所测量的每个参数的所有受试者测量值的平均值来确定。如本文所述，可以调节剂量以实现所需的药代动力学或药效学曲线，诸如本文所述的所需的或有效的血液曲线。
药代动力学参数可以是适用于描述分子的任何参数。例如，Cmax可以是例如不小于约25ng/mL；不小于约50ng/mL；不小于约75ng/mL；不小于约100ng/mL；不小于约200ng/mL；不小于约300ng/mL；不小于约400ng/mL；不小于约500ng/mL；不小于约600ng/mL；不小于约700ng/mL；不低于约800ng/mL；不小于约900ng/mL；不小于约1000ng/mL；不小于约1250ng/mL；不小于约1500ng/mL；不小于约1750ng/mL；不小于约2000ng/mL；或适用于描述本文所述分子的药代动力学曲线的任何其它Cmax。
本文所述分子的Tmax可以是例如不大于约0.5小时、不大于约1小时、不大于约1.5小时、不大于约2小时、不大于约2.5小时、不大于约3小时、不超过约3.5小时、不超过约4小时、不超过约4.5小时、不超过约5小时，或适用于描述本文所述分子的药代动力学曲线的任何其他Tmax。
本文所述分子的AUC(0-inf)可以是例如不小于约50ng·hr/mL、不小于约100ng/hr/mL、不小于约150ng/hr/mL、不小于约200ng·hr/mL、不小于约250ng/hr/mL、不小于约300ng/hr/mL、不小于约350ng/hr/mL、不小于约400ng/hr/mL、不小于约450ng/hr/mL、不小于约500ng/hr/mL、不小于约600ng/hr/mL、不小于约700ng/hr/mL、不小于约800ng/hr/mL、不小于约900ng/hr/mL、不小于约1000ng·hr/mL、不小于约1250ng/hr/mL、不小于约1500ng/hr/mL、不小于约1750ng/hr/mL、不小于约2000ng/hr/mL、不小于约2500ng/hr/mL、不小于约3000ng/hr/mL、而不是小于约3500ng/hr/mL、不小于约4000ng/hr/mL、不小于约5000ng/hr/mL、不小于约6000ng/hr/mL、不小于约7000ng/hr/mL、不小于约8000ng/hr/mL、不小于约9000ng/hr/mL、不小于约10,000ng/hr/mL或适合描述本文所述分子的药代动力学曲线的任何其它AUC(0-inf)。
本文所述的分子在施用后约1小时的血浆浓度可以是例如不小于约25ng/mL、不小于约50ng/mL、不小于约75ng/mL、不小于约100ng/mL、不小于约150ng/mL、不小于约200ng/mL、不小于约300ng/mL、不小于约400ng/mL、不小于约500ng/mL、不小于约600ng/mL、不小于约700ng/mL、不小于约800ng/mL、不小于约900ng/mL、不小于约1000ng/mL、不小于约1200ng/mL或本文所述分子的任何其他血浆浓度。
药效学参数可以是适用于描述本文的药物组合物的任何参数。例如，在例如约2小时、约4小时、约8小时、约12小时或约24小时后，药效学曲线可表现出与炎症相关的因子减少。
在本文各方面的各种实施方式中，在受试者中进行本文的方法。受试者可以是人。受试者可以是哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、牛、狗、猪、绵羊、马)。受试者可以是脊椎动物或无脊椎动物。受试者可以是实验动物。受试者可以是患者。受试者可以患有疾病。受试者可以显示出疾病的症状。受试者可以不显示出疾病症状，但仍患有疾病。受试者可以在看护者的医疗护理下(例如，受试者住院并由医生治疗)。受试者可以是植物或作物。
实施例
以下非限制性实施例进一步说明了本文的各个方面。
实施例1：通过嵌合跨膜受体改变细胞因子的表达
如图14所示，包含嵌合跨膜受体多肽1401和嵌合衔接子多肽1402的系统用于改变免疫细胞的细胞因子表达。系统的组分在淋巴细胞中表达，如T细胞。产生的嵌合跨膜受体多肽包括一个胞外区，所述胞外区包含结合HER2的单链Fv(scFv，例如抗原相互作用结构域)。嵌合跨膜受体多肽的胞内区包含与基因调节多肽(GMP)连接的免疫细胞信号传导结构域1403。所述免疫细胞信号传导结构域包含作为主要信号传导结构域的CD3ζ信号结构域和来自CD28的共刺激结构域。GMP包含连接至限制性识别位点(例如，蛋白酶序列)的致动部分1404(例如，dCas9)。嵌合衔接子多肽包含切割部分1405。受体结合部分可以与修饰的嵌合跨膜受体多肽结合或聚集。当通过受体和衔接子相互作用使切割部分靠近切割识别位点时，切割识别位点可被切割部分切割，从而从膜系受体释放致动部分。致动部分易位至细胞核并调控来自基因组DNA(例如靶多核苷酸)的白细胞介素-1(IL-1)的表达。致动部分可以通过经由物理障碍或编辑编码IL-1的核酸序列使得基因产物产生缺陷或完全去除基因序列来调控转录，从而调控IL-1的表达。降低来自淋巴细胞的IL-1表达可以减少免疫治疗中与CRS相关的毒性。在GMP释放之前或之后，dCas9致动部分可以与单向导RNA(sgRNA)复合。在另一种构型中，嵌合跨膜受体包含切割部分，并且嵌合衔接子多肽包含GMP。
实施例2：通过抗体偶联的嵌合跨膜受体改变细胞因子的表达
如图14所示，包含嵌合跨膜受体多肽1401和嵌合衔接子多肽1402的系统用于改变免疫细胞的细胞因子表达。系统的组分在淋巴细胞中表达，如T细胞。产生的嵌合跨膜受体多肽包括一个胞外区，所述胞外区包含Fc受体的Fc结合结构域(例如抗原相互作用结构域)，可以结合抗HER2抗体(例如抗原)。嵌合跨膜受体多肽的胞内区包含与基因调节多肽(GMP)连接的免疫细胞信号传导结构域1403。所述免疫细胞信号传导结构域包含作为主要信号传导结构域的CD3ζ信号结构域和来自CD28的共刺激结构域。GMP包含连接至限制性识别位点(例如，蛋白酶序列)的致动部分1404(例如，dCas9)。嵌合衔接子多肽包含切割部分1405。受体结合部分可以与修饰的嵌合跨膜受体多肽结合或聚集。当通过受体和衔接子相互作用使切割部分靠近切割识别位点时，切割识别位点可被切割部分切割，从而从膜系受体释放致动部分。致动部分转移至细胞核并调控来自基因组DNA(例如靶多核苷酸)的白细胞介素-1(IL-1)的表达。致动部分可以通过经由物理障碍或编辑编码IL-1的核酸序列使得基因产物产生缺陷或完全去除基因序列来调控转录，从而调控IL-1的表达。降低来自淋巴细胞的IL-1表达可以减少免疫治疗中与CRS相关的毒性。在GMP释放之前或之后，dCas9致动部分可以与单向导RNA(sgRNA)复合。在另一种构型中，嵌合跨膜受体包含切割部分，并且嵌合衔接子多肽包含GMP。
实施例3：通过嵌合跨膜受体改变PD-1的表达
如图15所示，包含嵌合跨膜受体多肽1501和嵌合衔接子多肽1502的系统用于改变免疫细胞中PD-1的表达。系统的组分在淋巴细胞中表达，如T细胞。产生的嵌合跨膜受体多肽包括一个胞外区，所述胞外区包含结合HER2的单链Fv(scFv，例如抗原相互作用结构域)。嵌合跨膜受体多肽的胞内区包含与基因调节多肽(GMP)连接的免疫细胞信号传导结构域1503。所述免疫细胞信号传导结构域包含作为主要信号传导结构域的CD3ζ信号结构域和来自CD28的共刺激结构域。GMP包含连接至限制性识别位点(例如，蛋白酶序列)的致动部分1504(例如，dCas9)。嵌合衔接子多肽包含切割部分1505。受体结合部分可以与修饰的嵌合跨膜受体多肽结合或聚集。当通过受体和衔接子相互作用使切割部分靠近切割识别位点时，切割识别位点可被切割部分切割，从而从膜系受体释放致动部分。致动部分转移至细胞核并调控来自基因组DNA(例如靶多核苷酸)的PD-1的表达。致动部分可通过经由物理障碍或编辑编码PD-1的核酸序列使得基因产物产生缺陷或完全去除基因序列来调控转录，从而调控PD-1的表达。降低来自淋巴细胞的PD-1表达可以增加免疫疗法的效果。在GMP释放之前或之后，dCas9致动部分可以与单向导RNA(sgRNA)复合。在另一种构型中，嵌合跨膜受体包含切割部分，并且嵌合衔接子多肽包含GMP。
实施例4：通过抗体偶联的嵌合跨膜受体改变PD-1的表达
如图15所示，包含嵌合跨膜受体多肽1501和嵌合衔接子多肽1502的系统用于改变免疫细胞中PD-1的表达。系统的组分在淋巴细胞中表达，如T细胞。产生的嵌合跨膜受体多肽包括一个胞外区，所述胞外区包含Fc受体的Fc结合结构域(例如抗原相互作用结构域)，可以结合抗HER2抗体(例如抗原)。嵌合跨膜受体多肽的胞内区包含与基因调节多肽(GMP)连接的免疫细胞信号传导结构域1503。所述免疫细胞信号传导结构域包含作为主要信号传导结构域的CD3ζ信号结构域和来自CD28的共刺激结构域。GMP包含连接至限制性识别位点(例如，蛋白酶序列)的致动部分1504(例如，dCas9)。嵌合衔接子多肽包含切割部分1505。受体结合部分可以与修饰的嵌合跨膜受体多肽结合或聚集。当通过受体和衔接子相互作用使切割部分靠近切割识别位点时，切割识别位点可被切割部分切割，从而从膜系受体释放致动部分。致动部分转移至细胞核并调控来自基因组DNA(例如靶多核苷酸)的PD-1的表达。致动部分可通过经由物理障碍或编辑编码PD-1的核酸序列使得基因产物产生缺陷或完全去除基因序列来调控转录，从而调控PD-1的表达。降低来自淋巴细胞的PD-1表达可以增加免疫疗法的效果。在GMP释放之前或之后，dCas9致动部分可以与单向导RNA(sgRNA)复合。在另一种构型中，嵌合跨膜受体包含切割部分，并且嵌合衔接子多肽包含GMP。
实施例5：通过嵌合跨膜受体多肽表达另外的嵌合跨膜受体多肽
如图16所示，包含嵌合跨膜受体多肽1601和嵌合衔接子多肽1602的系统用于从质粒表达第二受体多肽。系统的组分在淋巴细胞中表达，如T细胞。产生的嵌合跨膜受体多肽包括一个胞外区，所述胞外区包含结合HER2的单链Fv(scFv，例如抗原相互作用结构域)。嵌合跨膜受体多肽的胞内区包含与基因调节多肽(GMP)连接的免疫细胞信号传导结构域1603。所述免疫细胞信号传导结构域包含作为主要信号传导结构域的CD3ζ信号结构域和来自CD28的共刺激结构域。GMP包含连接至限制性识别位点(例如，蛋白酶序列)的致动部分1604(例如，dCas9)。嵌合衔接子多肽包含切割部分1605。受体结合部分可以与修饰的嵌合跨膜受体多肽结合或聚集。当通过受体和衔接子相互作用使切割部分靠近切割识别位点时，切割识别位点可被切割部分切割，从而从膜系受体释放致动部分。致动部分转移至被递送至细胞中的外源质粒(例如，靶多核苷酸)并调控第二受体多肽的表达。致动部分可包含增强外源质粒转录的转录激活因子。在GMP释放之前或之后，dCas9致动部分可以与单向导RNA(sgRNA)复合。在另一种构型中，嵌合跨膜受体包含切割部分，并且嵌合衔接子多肽包含GMP。
实施例6：通过抗体偶联的嵌合跨膜受体多肽表达另外的嵌合跨膜受体多肽
如图16所示，包含嵌合跨膜受体多肽1601和嵌合衔接子多肽1602的系统用于从质粒表达第二受体多肽。系统的组分在淋巴细胞中表达，如T细胞。产生的嵌合跨膜受体多肽包括一个胞外区，所述胞外区包含Fc受体的Fc结合结构域(例如抗原相互作用结构域)，其结合抗HER2抗体(例如抗原)。嵌合跨膜受体多肽的胞内区包含与基因调节多肽(GMP)连接的免疫细胞信号传导结构域1603。所述免疫细胞信号传导结构域包含作为主要信号传导结构域的CD3ζ信号结构域和来自CD28的共刺激结构域。GMP包含连接至限制性识别位点(例如，蛋白酶序列)的致动部分1604(例如，dCas9)。嵌合衔接子多肽包含切割部分1605。受体结合部分可以与修饰的嵌合跨膜受体多肽结合或聚集。当通过受体和衔接子相互作用使切割部分靠近切割识别位点时，切割识别位点可被切割部分切割，从而从膜系受体释放致动部分。致动部分转移至被递送至细胞中的外源质粒(例如，靶多核苷酸)并调控第二受体多肽的表达。致动部分包含增强外源质粒转录的转录激活因子。在GMP释放之前或之后，dCas9致动部分可以与单向导RNA(sgRNA)复合。在另一种构型中，嵌合跨膜受体包含切割部分，并且嵌合衔接子多肽包含GMP。
实施例7：在TEV蛋白酶存在下从嵌合受体切割dCas9-KRAB结构域
在TEV蛋白酶存在下，包含在哺乳动物细胞中表达的dCas9-KRAB的嵌合受体多肽在TEV可切割序列(tcs)处被切割。在本实施例中，TEV蛋白酶与连接于dCas9-KRAB的前T细胞抗原受体α(PTCRA)(PTCRA-dCas9-KRAB)、连接于dCas9-KRAB的GPCR受体CXCR2(CXCR2-dCas9-KRAB)、连接于dCas9-KRAB的白介素6受体(IL6R)(IL6R-dCas9-KRAB)、或连接于dCas9-KRAB的CD19-靶向嵌合抗原受体(CAR)(CAR-dCas9-KRAB)在HEK293T细胞中共表达，通过Western印迹分析细胞裂解物中切割产物的存在。
通过分子克隆产生各嵌合受体的哺乳动物细胞表达载体。PTCRA-dCas9-KRAB构建体包括连接于TEV可切割序列(tcs)的PTCRA、dCas9、KRAB和C-Myc-DDK(PTCRA-dCas9-KRAB)。CXCR2构建体包括连接于TEV可切割序列(tcs)的CXCR2、dCas9、KRAB和C-Myc-DDK(CXCR2-dCas9-KRAB)。IL6R构建体包括连接于TEV可切割序列(tcs)的IL6R、dCas9、KRAB和C-Myc-DDK(IL6R-dCas9-KRAB)。CAR构建体包括连接于TEV可切割序列(tcs)的CAR、dCas9、KRAB和C-Myc-DDK(CAR-dCas9-KRAB)。TEV蛋白酶以诱导型表达系统(tet-on)提供以允许通过多西环素(doxycycline，DOX)调控TEV表达；这包括tet-on-TEV质粒和rtTA表达质粒。
对于各嵌合受体，将哺乳动物细胞表达载体与tet-on-TEV和rtTA质粒在HEK293T细胞中共转染。使用“游离”dCas9-KRAB或无DNA转染的细胞作为对照。简而言之，使用Mirus转染试剂以50-70％融合率转染HEK293T细胞。转染后24小时，将多西环素(DOX)加入到细胞培养基中以启动TEV蛋白酶的高表达。使用诱导型表达系统，添加多西环素(DOX)导致高表达TEV蛋白酶，而DOX不存在导致TEV蛋白酶的低表达。转染后48小时，将细胞样品收集在添加有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中，并通过Western印迹分析。
对于Western印迹分析，使用NuPAGE LDS样品缓冲液(4X)NuPAGE还原剂(10X)制备细胞裂解物，在预制蛋白质凝胶上跑胶，然后转移到硝酸纤维素膜上。用抗Cas9和抗ACTB(对照)抗体检测膜。
Western印迹分析表明，在存在或不存在DOX的情况下tcs处嵌合受体的切割情况。图20中对应于切割的dCas9-KRAB存在较小蛋白条带表明，在TEV蛋白酶(“低”和“高”TEV)存在下从嵌合受体切割dCas9-KRAB。
实施例8：在衔接子-TEV蛋白酶存在下从CAR-dCas9-KRAB切割dCas9-KRAB
在各种衔接子-TEV蛋白酶融合体(fusions)存在下，CAR-dCas9-KRAB多肽在TEV可切割序列(tcs)处被切割。在本实施例中，TEV蛋白酶融合到各种跨膜和细胞质衔接子蛋白上，这些蛋白可以被募集到活化的CAR上。检测的细胞质衔接子蛋白包括ZAP70、LCP-2、GADS和GRB2。检测的跨膜衔接子包括LCK和LAT。各种衔接子-TEV蛋白酶构建体以诱导型表达系统(tet-on)提供以允许通过多西环素(doxycycline，DOX)调控TEV表达；这包括tet-on衔接子-TEV质粒和rtTA表达质粒。
对于各衔接子蛋白，如实施例7中所述的CAR-dCas9-KRAB的表达载体与tet-on衔接子-TEV和rtTA质粒在HEK293T细胞中共表达。使用“游离的”dCas9-KBAB或CAR-dCas9-KRAB转染而未共转染衔接子-TEV的细胞作为对照。简而言之，使用Mirus转染试剂以50-70％融合率转染HEK293T细胞。转染24小时后，将多西环素(DOX)加入到细胞培养基中以启动衔接子-TEV的高表达。使用诱导型表达系统，添加多西环素(DOX)导致高表达衔接子-TEV蛋白酶，而DOX不存在导致衔接子-TEV蛋白酶的低表达。转染后48小时，将细胞样品收集在添加有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中，并通过Western印迹分析。
对于Western印迹分析，使用NuPAGE LDS样品缓冲液(4X)NuPAGE还原剂(10X)制备细胞裂解物，在预制蛋白质凝胶上跑胶，然后转移到硝酸纤维素膜上。用抗Cas9和抗ACTB(对照)抗体检测膜。
在低DOX和高DOX的存在下，对于跨膜和细胞质衔接子-TEV融合体都观察到tcs处的嵌合受体切割。图21中在对应于切割的dCas9-KRAB处存在较小蛋白条带表明，在衔接子-TEV蛋白酶(低TEV和高TEV)存在下从嵌合受体切割dCas9-KRAB。对于细胞质衔接子，低表达的衔接子-TEV足以用于切割。对于跨膜衔接子，衔接子-TEV(+DOX)的高表达导致更高水平的切割。
实施例9：配体结合诱导的嵌合受体切割
在Jurkat细胞和原代人T细胞中测定嵌合受体多肽的配体诱导的受体切割。在Jurkat细胞或原代人T细胞中表达结合CD19抗原的嵌合受体多肽和嵌合衔接子多肽以产生工程化Jurkat细胞和工程化T细胞。当将CD19抗原呈递给细胞时，在工程Jurkat细胞和工程化T细胞中观察到受体切割。
将CD19结合的CAR-dCas9-KRAB(CD19-CAR-dCas9-KRAB)慢病毒和衔接子-TEV慢病毒包装在293T细胞中。慢病毒转导用于产生共表达CD19-CAR-dCas9-KRAB和衔接子-TEV多肽(例如ZAP70-TEV、LCP2-TEV、GADS-TEV、GRB2-TEV、PIK3R-TEV、LCK-TEV、LAT-TEV和NCK-TEV)的工程化Jurkat细胞和工程化T细胞。通过流式细胞术(CD19-CAR-dCas9-KRAB)和Western印迹(衔接子-TEV)验证慢病毒转导。在转导和验证多肽表达后，工程化Jurkat细胞和工程化T细胞(分别)与CD19+白血病细胞系NALM-6细胞、CD19+Burkitt淋巴瘤Daudi细胞、或CD19+Burkitt淋巴瘤Raji细胞共培养。作为对照，工程化Jurkat细胞和T细胞(分别)与CD19-细胞(不表达CD19)共培养。CD19与CD19-CAR-dCas9-KRAB胞外结构域的结合激活CAR信号传导，并将衔接子-TEV多肽(例如ZAP70-TEV、LCP2-TEV、GADS-TEV、GRB2-TEV、PIK3R-TEV、LCK-TEV、LAT-TEV和NCK-TEV)募集至发生切割的嵌合受体多肽的胞内结构域。在共培养后，将工程化Jurkat细胞和工程化T细胞裂解用于Western印迹分析，以检测在如实施例7中所述CD19+细胞或CD19-细胞存在下游离dCas9-KRAB(从受体裂解)的存在。将CD19激活的切割水平，与与CD19-细胞共培养的工程化Jurkat细胞和工程化T细胞的受体切割的基础水平进行比较。
预计在与CD19+细胞共培养的工程化Jurkat细胞或工程化T细胞中，嵌合受体多肽的切割会更高。
实施例10：由嵌合受体切割产生的转录调控(下调)
在工程化Jurkat细胞和工程化T细胞中测定由嵌合受体多肽的配体依赖性切割引起的基因表达水平的变化以及由此导致的用于转录调控的dCas9-KRAB的释放。如实施例9中所述，工程化Jurkat细胞和工程化T细胞共表达CD19-CAR-dCas9-KRAB和衔接子-TEV，并且另外表达靶向RNA(sgRNA)。靶向RNA对PD-1(sgPD-1)或IL-6(sgIL-6)具有特异性。将CD19结合的CAR-dCas9-KRAB(CD19-CAR-dCas9-KRAB)慢病毒、衔接子-TEV慢病毒和靶向PD-1的sgRNA或IL-6慢病毒包装在293T细胞中。慢病毒转导用于产生共表达CD19-CAR-dCas9-KRAB、衔接子-TEV多肽(例如ZAP70-TEV、LCP2-TEV、GADS-TEV、GRB2-TEV、PIK3R-TEV、LCK-TEV、LAT-TEV和NCK-TEV)和sgRNA(例如，sgPD-1，sgIL-6或sgNT“非靶向”)的工程化Jurkat细胞和工程化T细胞。通过流式细胞术(CD19-CAR-dCas9-KRAB)和Western印迹(衔接子-TEV)验证慢病毒转导。在转导后，工程化Jurkat细胞和工程化T细胞(分别)与CD19+白血病细胞系NALM-6细胞、CD19+Burkitt淋巴瘤Daudi细胞、或CD19+Burkitt淋巴瘤Raji细胞共培养。作为对照，将工程化的Jurkat细胞和工程化的T细胞与CD19-细胞共培养。CD19与嵌合受体胞外结构域的结合激活CAR信号传导，并将衔接子-TEV多肽(例如ZAP70-TEV，LCP2-TEV，GADS-TEV，GRB2-TEV，PIK3R-TEV，LCK-TEV，LAT-TEV和NCK-TEV)募集至可发生切割的CAR-dCas9-KRAB融合蛋白的胞内结构域处。在共培养后，将工程化Jurkat细胞和工程化T细胞裂解用于Western印迹分析，以检测在如实施例7中所述CD19+细胞或CD19-细胞存在下游离dCas9-KRAB(从受体裂解)的存在。
如实施例8所述，通过Western印迹分析验证配体依赖性的受体切割。通过qPCR分析由释放dCas9-KRAB和随后靶向与sgRNA复合的dCas9-KRAB引起的PD-1和IL-6基因表达水平的变化。通过流式细胞术分析PD-1(蛋白)表面的表达。通过ELISA分析IL-6(蛋白)的分泌。
预计响应于CD19和CD19CAR-dCas9-KRAB结合的PD-1和IL-6表达的转录调控的变化。预计在表达CD19CAR-dCas9-KRAB、衔接子-TEV和sgRNA的工程化Jurkat细胞和原代人类T细胞中，PD-1和IL-6下调。预计与CD19+白血病和淋巴瘤细胞共培养的表达非靶向RNA(例如sgNT)的工程化Jurkat和T细胞显示转录调控超过基线的最小变化，因为sgNT预计不会靶向用于转录调控的dCas9-KRAB。
实施例11：由嵌合受体切割产生的转录调控(上调)
在工程化Jurkat细胞和工程化T细胞中测定由嵌合受体多肽的配体依赖性切割引起的基因表达水平的变化以及由此导致的用于转录调控的dCas9-KRAB的释放。如实施例9中所述，工程化Jurkat细胞和工程化T细胞共表达CD19-CAR-dCas9-VPR和衔接子-TEV，并且另外表达靶向RNA(sgRNA)。靶向RNA对PD-1(sgPD-1)或IL-6(sgIL-6)具有特异性。将CD19结合的CAR-dCas9-VPR(CD19-CAR-dCas9-VPR)慢病毒、衔接子-TEV慢病毒和靶向PD-1的sgRNA或IL-6慢病毒包装在293T细胞中。慢病毒转导用于产生共表达CD19-CAR-dCas9-VPR、衔接子-TEV多肽(例如ZAP70-TEV、LCP2-TEV、GADS-TEV、GRB2-TEV、PIK3R-TEV、LCK-TEV、LAT-TEV和NCK-TEV)和sgRNA(例如，sgPD-1，sgIL-6或sgNT“非靶向”)的工程化Jurkat细胞和工程化T细胞。通过流式细胞术(CD19-CAR-dCas9-VPR)和Western印迹(衔接子-TEV)验证慢病毒转导。在转导后，工程化Jurkat细胞和工程化T细胞(分别)与CD19+白血病细胞系NALM-6细胞、CD19+Burkitt淋巴瘤Daudi细胞、或CD19+Burkitt淋巴瘤Raji细胞共培养。作为对照，将工程化的Jurkat细胞和工程化的T细胞与CD19-细胞共培养。CD19与嵌合受体胞外结构域的结合激活CAR信号传导，并将衔接子-TEV多肽(例如ZAP70-TEV，LCP2-TEV，GADS-TEV，GRB2-TEV，PIK3R-TEV，LCK-TEV，LAT-TEV和NCK-TEV)募集至可发生切割的CAR-dCas9-VPR融合蛋白的胞内结构域处。在共培养后，将工程化Jurkat细胞和工程化T细胞裂解用于Western印迹分析，以检测在如实施例7中所述CD19+细胞或CD19-细胞存在下游离dCas9-VPR(从受体裂解)的存在。
如实施例8所述，通过Western印迹分析验证配体依赖性的受体切割。通过qPCR分析由释放dCas9-VPR和随后靶向与sgRNA复合的dCas9-VPR引起的PD-1和IL-6基因表达水平的变化。通过流式细胞术分析PD-1(蛋白)表面的表达。通过ELISA分析IL-6(蛋白)的分泌。
预计响应于CD19和CD19CAR-dCas9-VPR结合的PD-1和IL-6表达的转录调控的变化。预计在表达CD19CAR-dCas9-VPR、衔接子-TEV和sgRNA的工程化Jurkat细胞和原代人类T细胞中，PD-1和IL-6上调。预计与CD19+白血病和淋巴瘤细胞共培养的表达非靶向RNA(例如sgNT)的工程化Jurkat和T细胞显示转录调控超过基线的最小变化，因为sgNT预计不会靶向用于转录调控的dCas9-VPR。
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这样的实施例仅作为示例提供。本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换而不偏离本发明。应该理解的是，可以在实施本发明时采用本发明所述的实施例的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且藉此应涵盖这些权利要求及其等变化的范围内的方法和结构。

Claims (147)

1.一种用于免疫细胞的条件性调控的系统，其特征在于，所述系统包括：
(a)嵌合跨膜受体多肽，其包含(i)包含结合抗原的抗原相互作用结构域的胞外区和(ii)包含免疫细胞信号传导结构域的胞内区；
(b)包含受体结合部分的嵌合适配体多肽，所述受体结合部分在受体多肽与抗原结合后经受体修饰的情况下结合所述受体多肽；
(c)包含连接至切割识别位点的致动部分的基因调节多肽(GMP)；和
(d)当接近切割识别位点时切割识别位点以从GMP释放致动部分的切割部分；
其中：(i)切割部分形成受体多肽的胞内区域的一部分，并且所述GMP形成嵌合衔接子多肽的一部分；(ii)所述切割部分与第二衔接子多肽形成复合物，所述第二衔接子多肽与抗原结合后经受体修饰并与受体多肽结合，并且所述GMP形成所述嵌合衔接子多肽的一部分；或(iii)所述切割部分形成嵌合衔接子多肽的一部分，并且GMP形成受体多肽的胞内区域的一部分。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述切割部分形成所述受体多肽的胞内区域的一部分，并且GMP形成嵌合衔接子多肽的一部分。
3.如权利要求1所述的系统，所述切割部分与第二衔接子多肽形成复合物，所述第二衔接子多肽与抗原结合后经受体修饰并与受体多肽结合，并且所述GMP形成所述嵌合衔接子多肽的一部分。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述切割部分形成所述嵌合衔接子多肽的一部分，并且GMP形成所述受体多肽的胞内区域的一部分。
5.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述免疫细胞是淋巴细胞。
6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述淋巴细胞是T细胞。
7.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
8.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合抗体。
9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合抗体的Fc结构域、Fv结构域、重链和轻链中的至少一种。
10.如权利要求9所述的系统，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合抗体的Fc结构域。
11.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述抗原相互作用结构域包含Fab、单链Fv(scFv)、胞外受体结构域和Fc结合结构域中的至少一种。
12.如权利要求11所述的系统，其特征在于，所述抗原相互作用结构域包含Fc结合结构域，所述Fc结合结构域包含Fc受体或其片段。
13.如权利要求12所述的系统，其特征在于，所述抗原相互作用结构域包含Fc结合结构域，所述Fc结合结构域包含FcγRI(CD64)、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIA(CD32,H131)、FcγRIIA(CD32,R131)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIB-1、FcγRIIB-2、FcγRIIIA(CD16a,V158)、FcγRIIIA(CD16a,F158)、FcγRIIIB(CD16b,FcγRIIIb-NAl)、FcγRIIIB(CD16b,FcγRIIIb-NA2)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR、FcRn，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。
14.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合于包含抗体的抗原，所述抗体反过来结合选自以下的抗原：1-40-β-淀粉状蛋白、4-1BB、5AC、5T4、激活素受体样激酶1、ACVR2B、腺癌抗原、AGS-22M6、α-胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽杆菌、BAFF、β-淀粉样蛋白、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、C5、CA-125、家犬狼疮IL31、碳酸酐酶9(CA-IX)、心肌肌球蛋白、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147(基础免疫球蛋白)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3ε、CD30、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配体、CD41、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CEA相关抗原、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艰难梭菌、凝聚因子A、CSF1R、CSF2、CTLA-4、C-X-C趋化因子受体4型、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、达比加群酯、DLL4、DPP4、DR5、大肠杆菌志贺毒素1型、大肠杆菌志贺毒素2型、EGFL7、EGFR、内毒素、EpCAM、上皮唾蛋白、ERBB3、大肠杆菌、呼吸道合胞病毒F蛋白、FAP、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白胞外结构域B、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、卷曲受体、神经节苷脂GD2、GD2、神经节苷脂GD3、磷脂酰肌醇聚糖3、GMCSF受体α链、GPNMB、生长分化因子8、GUCY2C、血球凝集素、乙肝表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、组蛋白复合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、人分散因子受体激酶、人TNF、人β-淀粉样蛋白、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE的Fc区、IGF-1受体、IGF-1、IGHE、IL-17A、IL-17F、IL-20、IL-12、IL-13、IL-17、IL-1β、IL-22、IL-23、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、ILGF2、甲型流感血凝素、甲型流感病毒血凝素、胰岛素样生长因子I受体、整联蛋白α4β7、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整联蛋白αIIbβ3、整联蛋白αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素γ诱导蛋白、ITGA2、ITGB2(CD18)、KIR2D、路易斯-Y抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-选择素(CD62L)、LTA、MCP-1、间皮素、MIF、MS4A1、MSLN、MUC1、粘蛋白CanAg、髓磷脂相关糖蛋白、肌生成抑制蛋白、NCA-90(粒细胞抗原)、神经凋亡调节蛋白酶1、NGF、N-羟乙酰神经氨酸、NOGO-A、Notch受体、NRP1、穴兔、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-Rα、磷酸钠共转运蛋白、磷脂酰丝氨酸、血小板衍生生长因子受体β、前列腺癌细胞、绿脓杆菌、狂犬病病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞病毒、RHD、恒河猴因子、RON、RTN4、硬化蛋白、SDC1、选择素P、SLAMF7、SOST、鞘氨醇-1-磷酸盐、金黄色葡萄球菌、STEAP1、TAG-72、T细胞受体、TEM1、腱生蛋白C、TFPI、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、MUC1的肿瘤特异性糖基化形式、肿瘤相关钙信号转导器2、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白和VWF。
15.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合于选自下组的抗体的Fc结构域：20-(74)-(74)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿比珠单抗、ABP 494(西妥昔单抗生物仿制药)、阿布里单抗、ABT-700、ABT-806、阿克提单抗-A(锕Ac-225林妥珠单抗)、阿卡单抗、阿达木单抗、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿达卡莫单抗、阿杜单抗、阿非莫单抗、AFM13、阿芙土珠单抗、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、PEG化的阿拉西马单抗、ALD518、阿仑单抗、阿妥莫单抗、戊妥莫单抗、阿马昔单抗、AMG228、AMG820、麻安莫单抗、安替单抗瑞伐坦、阿尼弗洛姆单抗、安鲁单抗、APN301、APN311、阿泊珠单抗、APX003/SIM-BD0801(贝伐单抗)、APX005M、阿西莫单抗、ARX788、阿斯库昔单抗、阿塞珠单抗、ASG-15ME、阿特珠单抗、安妥明单抗、ATL101、阿特利单抗(也称为托珠单抗)、阿托木单抗、阿维拉姆单抗、B-701、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、巴维昔单抗、BAY1129980、BAY1187982、贝妥莫单抗、贝格洛姆单抗、贝利木单抗、贝拉珠单抗、柏替木单抗、贝索单抗、倍他卢汀单抗(177Lu-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸特托单抗)、贝伐单抗、BEVZ92(贝伐单抗生物仿制药)、贝佐洛单抗、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、比西单抗、双马单抗、贝美珠单抗、莫比瓦妥单抗、BIW-8962、博纳吐单抗、布洛唑单抗、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、博科齐单抗、维本妥昔单抗、布雷瓦雷克斯单抗、布里亚明单抗、溴达拉单抗、溴化丙单抗、支舒巴单抗、C2-2b-2b、康纳单抗、莫坎妥珠单抗、坎妥单抗瑞伐坦、卡普利单抗、卡罗单抗喷地肽偶联物、卡伦单抗、卡妥索单抗、CBR96-阿霉素免疫偶联物、CBT124(贝伐单抗)、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠单抗、PEG化的塞妥珠单抗、西妥昔单抗、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、伯格西他土珠单抗、西妥木单抗、克拉扎珠单抗、克立昔单抗、克伐他单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物、CM-24、钴妥珠单抗、考土昔单抗-DM4偶联物、康妥单抗、康昔单抗、科塔拉(碘I-131地洛妥单抗生物素)、cR6261、克伦单抗、DA-3111(曲妥珠单抗生物仿制药)、达塞珠单抗、达利珠单抗、达妥珠单抗、PEG化的达匹罗单抗、达雷木单抗、达雷木单抗(商品名为Enhanze)、达介素、癸曲单抗、地昔单抗、丹因珠单抗-MMAF偶联物、地诺单抗、达妥昔单抗、达妥昔单抗-MMAF偶联物、地洛昔单抗-生物素、地莫单抗、DI-B4、丁妥昔单抗、地利达莫单抗、DKN-01、DMOT4039A、阿托度单抗、屈西他单抗、DS-1123、DS-8895、杜利他单抗、杜普单抗、杜伐单抗、杜昔单抗、依美昔单抗、依库珠单抗、埃巴单抗、依屈洛单抗、依法珠单抗、依芬古单抗、埃尔德单抗、埃格曼图姆单抗、伊洛珠单抗、艾西莫单抗、艾马珠单抗、依米妥珠单抗、恩伐珠单抗、伊凡珠单抗-维多汀偶联物、PEG化恩莫单抗、恩比利珠单抗、依诺珠单抗、依诺替单抗、恩师妥昔单抗、西依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、厄马索单抗、依他珠单抗、依曲利珠单抗、依伐单抗、依福单抗、艾韦单抗、法索单抗、法拉莫单抗、法鲁珠单抗、法辛单抗、FBTA05、泛维珠单抗、费扎尼单抗、FF-21101、FGFR2抗体-药物偶联物、菲伯免疫蛋白、非卡妥珠单抗、菲妥木单抗、福利木单抗、法兰妥单抗、福利替单抗、芬特妥珠单抗、福拉木单抗、福韦单抗、FPA144、去甲美马单抗、FS102、富拉单抗、伏妥昔单抗、加利昔单抗、甘露单抗、冈特莫单抗、加维莫单抗、格图单抗-奥佐米星偶联物、吉利单抗、格伐克单抗、吉妥昔单抗、维格列巴单抗、GNR-006、GNR-011、哥利木单抗、高密昔单抗、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、古塞尔库姆单抗、Hu14.18K322A单抗、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、伊巴珠单抗、伊立莫单抗替西坦偶联物、伊鲁库单抗、依达鲁单抗、IGN002、IGN523、伊戈伏单抗、IMAB362、IMAB362(克洛昔单抗)、伊马单抗、IMC-CS4、IMC-D11、英西单抗、伊马曲单抗、IMGN529、IMMU-102(钇-90-依普鲁单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物)、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗抗体、INCAGN1876、依克拉单抗、INCSHR1210、吲妥昔单抗瑞伐坦、维因度单抗、英夫利昔单抗、伊诺莫单抗、奥妥珠格图单抗-奥佐米星偶联物偶联物、英特单抗、依帕非赛、IPH4102、伊匹木单抗、伊拉单抗、伊沙昔单抗、异妥拉明单抗、伊托珠单抗、衣克珠单抗、JNJ-56022473、JNJ-61610588、克利昔单抗、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉托唑单抗、拉托唑单抗-格维他偶联物、LAG525、兰布利单抗、拉帕单抗、L-DOS47、利勃珠单抗、利马索单抗、仑齐鲁单抗、勒德利木单抗、白妥昔单抗、莱卡单抗、利比维单抗、维利伐妥单抗、利格珠单抗、利洛单抗-赛塔坦偶联物、林妥珠单抗、利鲁单抗、LKZ145、洛德昔单抗、洛克韦单抗、莫洛伐妥单抗、卢卡珠单抗、PEG化的卢利珠单抗、鲁米昔单抗、鲁曲单抗、LY3164530、马塔单抗、马妥昔单抗、马司莫单抗、马妥单抗、马维里单抗、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551(吲哚单抗)、MEDI-565、MEDI6469、美泊利单抗、迈他珠单抗、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉珠单抗、米拉珠单抗-SN-38、明妥莫单抗、米维妥昔单抗-索拉素偶联物、米托单抗、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、莫加利单抗、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫洛莫单抗、莫他珠单抗、莫昔单抗-帕多毒素偶联物、穆罗莫纳-CD3(muromonab-CD3)、塔非那托克-塔芬毒素偶联物、纳霉单抗、萘妥莫单抗-衣塔芬毒素偶联物、纳妥单抗、那他珠单抗、奈巴库单抗、奈米单抗、奈莫珠单抗、奈利莫单抗、奈西伐单抗、尼妥珠单抗、尼沃单抗、巯诺莫单抗-美培坦偶联物、10-Nov、奥比妥昔单抗、奥匹妥珠单抗、奥卡鲁单抗、奥克里昔单抗、奥杜莫单抗、阿法单抗、奥拉他单抗、奥昔单抗、奥马珠单抗、OMP-131R10、OMP-305B83、阿那妥单抗、恩妥昔单抗、阿昔单抗、阿曲单抗-莫那毒素偶联物、奥戈伏单抗、奥替单抗、奥立昔单抗、奥特鲁单抗、OX002/MEN1309、奥索单抗、奥扎尼单抗、奥索利单抗、帕吉巴昔单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、潘科曼单抗、潘科曼单抗-GEX、泛巴单抗、帕撒单抗、帕昔单抗、帕索妥昔单抗、帕替利单抗、帕特利单抗、PAT-SC1、PAT-SM6、彭布利单抗、培马单抗、哌拉单抗、帕妥珠单抗、培昔单抗、PF-05082566(乌托单抗)、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、匹利珠单抗、维匹那妥单抗、品妥莫单抗、普鲁单抗、维波达单抗、庞尼泽单抗、普利昔单抗、普罗昔单抗、普鲁米单抗、PRO 140、普罗信单抗、PSMA ADC、奎珠单抗、拉托单抗、拉德鲁单抗、拉维夫单抗、拉潘昔单抗、拉莫鲁单抗、雷尼珠单抗、拉克昔单抗、瑞伐珠单抗、瑞伐单抗、REGN1400、REGN2810/SAR439684、利昔单抗、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利妥珠单抗、利努单抗、利妥昔单抗、RM-1929、RO7009789、罗巴单抗、罗乐单抗、罗莫索单抗、罗他珠单抗、罗维珠单抗、鲁普单抗、妥珠单抗-格维他偶联物、沙马利单抗、SAR408701、SAR566658、沙利鲁单抗、SAT012、沙妥单抗-喷地肽偶联物、SCT200、SCT400、SEA-CD40、塞库单抗、塞巴坦单抗、塞妥昔单抗、赛韦单抗、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西布曲单抗、西伐单抗、西妥昔单抗、西妥珠单抗、西普利单抗、西鲁库单抗、维索菲妥单抗、索冷珠单抗、索利单抗、索普昔单抗、索妥单抗、丝塔单抗、舒乐单抗、苏维珠单抗、SYD985、SYM004(伏妥昔单抗和莫妥昔单抗)、Sym015、TAB08、他巴单抗、塔卡珠单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物、塔多珠单抗、塔利单抗、坦纳单抗、塔尼单抗、普利妥单抗-帕普毒素偶联物、塔雷克斯顿单抗、TB-403、替非珠单抗、特勒金单抗、阿替莫单抗-阿利毒素偶联物、替纳单抗、替尼昔单抗、替普珠单抗、四丙珠单抗、司他洛单抗、替妥洛明单抗、TG-1303、TGN1412、钍-227-依普鲁单抗偶联物、替昔单抗、替加妥单抗、替拉珠单抗、维蒂索单抗、TNX-650、塔西单抗、托拉珠单抗、托沙单抗、托西单抗、托维单抗、曲洛单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-厄塔毒素偶联物、TRBS07、TRC105、曲利单抗、曲美单抗、特伐单抗、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、图卡珠单抗-西莫白介素偶联物、妥韦单抗、U3-1565、U3-1784、乌布妥昔单抗、优隆单抗、乌洛单抗、乌索单抗、乌司他单抗、伐他昔单抗-塔利素偶联物、维凡多鲁单抗、范蒂姆单抗、维库珠单抗、伐昔单抗、伐利单抗、伐他珠单抗、VB6-845、维多珠单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维森单抗、维西珠单抗、伏罗昔单抗、沃塞妥单抗-马伏毒素偶联物、伏妥单抗、YYB-101、扎鲁单抗、扎诺米单抗、扎妥昔单抗、齐拉明单抗、和阿佐莫单抗-阿利毒素偶联物。
16.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述胞外区域包含多个抗原相互作用结构域，其各自表现出与相同或不同抗原的结合。
17.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合于选自下组的抗原：707-AP、生物素化的分子、α-肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、亲脂素、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、细胞凋亡蛋白酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、路易斯Y(Lewis Y)、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/黑素-A(Melan-A)、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活素、存活素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。
18.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述受体多肽的免疫细胞信号传导结构域包含主要信号传导结构域，所述主要信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
19.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述受体多肽的免疫细胞信号传导结构域包含主要信号传导结构域，所述主要信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
20.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述免疫细胞信号传导结构域包含选自下组的蛋白质的主要信号传导结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(又名ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。
21.如权利要求20所述的系统，其特征在于，所述主要信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。
22.如权利要求21所述的系统，其特征在于，所述主要信号传导结构域包含CD3ζ的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
23.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述免疫细胞信号传导结构域包含共刺激结构域。
24.如权利要求23所述的系统，其特征在于，所述免疫细胞信号传导结构域包含多个共刺激结构域。
25.如权利要求23所述的系统，其特征在于，所述共刺激结构域包含以下物质的信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体或Toll配体受体。
26.如权利要求23所述的系统，其特征在于，所述共刺激结构域包含选自下组的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、树突状细胞植物血凝素-1(Dectin-1)/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、伊卡洛斯(Ikaros)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
27.如权利要求23所述的系统，其特征在于，所述共刺激结构域可操作地调节免疫细胞中的增殖信号和/或存活信号。
28.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述受体包含至少一种靶向肽，其指导受体多肽转运至细胞的特定区域。
29.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述靶向肽指导受体多肽转运至细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、过氧化物酶体或质膜。
30.如权利要求28所述的系统，其特征在于，所述靶向肽包含核输出信号(NES)。
31.如权利要求28所述的系统，其特征在于，所述靶向肽包括质膜靶向肽。
32.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述受体修饰包括化学修饰。
33.如权利要求32所述的系统，其特征在于，所述化学修饰包括磷酸化。
34.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述嵌合适配体多肽的受体结合部分包含选自下组的分子的结合结构域：ABL1、ABL2、APBA1、APBA2、APBA3、BCAR3、BLK、BLNK、BMX、BTK、CHN2、CISH、CRK、CRKL、CSK、DAPP1、DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6、DOK7、EAT-2、EPS8、EPS8L1、EPS8L2、EPS8L3、FER、FES、FGR、FRK、FRS2、FRS3、FYN、GADS、GRAP、GRAP2、GRB10、GRB14、GRB2、GRB7、HCK、HSH2D、INPP5D、INPPL1、IRS1、IRS2、IRS3、IRS4、ITK、JAK2、LAT、LCK、LCP2、LYN、MATK、NCK1、NCK2、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PLCG1、PLCG2、PTK6、PTPN11、PTPN6、RASA1、SAP、SH2B1、SH2B2、SH2B3、SH2D1A、SH2D1B、SH2D2A、SH2D3A、SH2D3C、SH2D4A、SH2D4B、SH2D5、SH2D6、SH3BP2、SHB、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、SHD、SHE、SHP1、SHP2、SLA、SLA2、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、SRC、SRMS、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUPT6H、SYK、TEC、TENC1、TLN1、TLN2、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、TXK、VAV1、VAV2、VAV3、YES1、ZAP70、X11a、其任何衍生的结合结构域、其任何变体和其片段。
35.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述致动部分包含CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调控多肽、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、转录激活物样效应物相关基因调控多肽、大范围核酸酶、天然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、阿尔古(Argonaute)蛋白，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。
36.如权利要求35所述的系统，其特征在于，所述致动部分包含Cas蛋白，并且所述系统还包含与Cas蛋白形成复合物的向导RNA(gRNA)。
37.如权利要求36所述的系统，其特征在于，所述gRNA包含显示与靶多核苷酸有至少80％序列一致性的靶向区段。
38.如权利要求36所述的系统，其特征在于，所述Cas蛋白基本上不具有DNA切割活性。
39.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述致动部分包含至少一个将致动部分引导至细胞特定区域的靶向肽。
40.如权利要求39所述的系统，其特征在于，所述靶向肽包含核定位信号(NLS)。
41.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述受体修饰包括在多个修饰位点处的修饰，并且每个修饰位点可有效地结合于嵌合衔接子多肽和/或第二衔接子多肽。
42.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述切割识别位点包含多肽序列，并且切割部分包含蛋白酶活性。
43.如权利要求1所述的系统，其特征在于，一旦从GMP释放，所述致动部分结合于靶多核苷酸，从而通过对靶多核苷酸的物理阻碍或对有效抑制或增强靶多核苷酸的基因表达的额外因子的募集，来调节靶多核苷酸的基因表达。
44.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述致动部分包含有效增加靶多核苷酸的基因表达的转录激活因子。
45.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述致动部分包含有效降低靶多核苷酸的基因表达的转录抑制因子。
46.如权利要求43-45中任一项所述的系统，其特征在于，所述靶多核苷酸包括基因组DNA。
47.如权利要求43-45中任一项所述的系统，其特征在于，所述靶多核苷酸包括基因组RNA。
48.如权利要求43-45中任一项所述的系统，其特征在于，所述靶多核苷酸包括内源性基因或内源性基因产物。
49.如权利要求48所述的系统，其特征在于，所述内源基因或内源基因产物编码细胞因子。
50.如权利要求49所述的组合物，其特征在于，所述细胞因子选自下组：4-1BBL、激活素βA、激活素βB、激活素βC、激活素βE、artemin蛋白(ARTN)、BAFF/BLyS/TNFSF138、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、骨形态发生蛋白1(BMP1)、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CD153/CD30L/TNFSF8、CD40L/CD154/TNFSF5、CD40LG、CD70、CD70/CD27L/TNFSF7、CLCF1、c-MPL/CD110/TPOR、CNTF、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7/Ppbp、CXCL9、EDA-A1、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Fas配体/FASLG/CD95L/CD178、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF4、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、生长分化因子1(GDF1)、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFNω/IFNW1、IL11、IL18、IL18BP、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F3/IL1RA、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1RL2、IL31、IL33、IL6、IL8/CXCL8、抑制素-A、抑制素-B、瘦素、LIF、LTA/TNFB/TNFSF1、LTB/TNFC、神经秩蛋白(neuturin)(NRTN)、OSM、OX-40L/TNFSF4/CD252、珀色芬蛋白(PSPN)、RANKL/OPGL/TNFSF11(CD254)、TL1A/TNFSF15、TNFA、TNF-α/TNFA、TNFSF10/TRAIL/APO-2L(CD253)、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14/LIGHT/CD258、XCL1和XCL2。
51.如权利要求48所述的系统，其特征在于，所述内源基因或内源基因产物编码免疫调节蛋白。
52.如权利要求51所述的组合物，其特征在于，所述免疫调节蛋白选自下组：A2AR、B7.1、B7-H3/CD276、B7-H4/B7S1/B7x/Vtcn1、B7-H6、BTLA/CD272、CCR4、CD122、4-1BB/CD137、CD27、CD28、CD40、CD47、CD70、CISH、CTLA-4/CD152、DR3、GITR、ICOS/CD278、IDO、KIR、LAG-3、OX40/CD134、PD-1/CD279、PD2、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA/Dies1/Gi24/PD-1H(C10orf54)。
53.如权利要求43-45中任一项所述的系统，其特征在于，所述靶多核苷酸包括异源性基因或异源性基因产物。
54.如权利要求53所述的系统，其特征在于，所述异源基因或异源基因产物编码额外的嵌合跨膜受体多肽。
55.如权利要求54所述的系统，其特征在于，所述所述额外的嵌合跨膜受体多肽包含：
(a)胞外区，所述胞外区包含一个可以结合于额外抗原的额外抗原相互作用结构域；和
(b)共刺激结构域。
56.一种表达权利要求1中所述的系统的淋巴细胞。
57.如权利要求56所述的淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞的特征在于：当受体多肽与抗原结合时，通过在切割识别位点切割而从GMP释放出所述的致动部分。
58.如权利要求56所述的淋巴细胞，其特征在于，所述释放的致动部分与淋巴细胞中的靶多核苷酸形成复合物。
59.如权利要求58所述的淋巴细胞，其特征在于，所述致动部分与靶多核苷酸之间复合物的形成导致淋巴细胞中基因表达的上调。
60.如权利要求59所述的淋巴细胞，其特征在于，所述基因是异源基因。
61.如权利要求60所述的淋巴细胞，其特征在于，所述异源基因编码额外的嵌合跨膜受体多肽。
62.如权利要求61所述的淋巴细胞，其特征在于，所述所述额外的嵌合跨膜受体多肽包含：
(a)胞外区，所述胞外区包含一个可以结合额外抗原的额外抗原相互作用结构域；和
(b)共刺激结构域。
63.如权利要求59所述的淋巴细胞，其特征在于，所述基因是内源基因。
64.如权利要求63所述的淋巴细胞，其特征在于，所述内源基因编码细胞因子。
65.如权利要求64所述的淋巴细胞，其特征在于，所述细胞因子选自下组：4-1BBL、激活素βA、激活素βB、激活素βC、激活素βE、artemin蛋白(ARTN)、BAFF/BLyS/TNFSF138、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、骨形态发生蛋白1(BMP1)、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CD153/CD30L/TNFSF8、CD40L/CD154/TNFSF5、CD40LG、CD70、CD70/CD27L/TNFSF7、CLCF1、c-MPL/CD110/TPOR、CNTF、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7/Ppbp、CXCL9、EDA-A1、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Fas配体/FASLG/CD95L/CD178、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF4、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、生长分化因子1(GDF1)、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFNω/IFNW1、IL11、IL18、IL18BP、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F3/IL1RA、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1RL2、IL31、IL33、IL6、IL8/CXCL8、抑制素-A、抑制素-B、瘦素、LIF、LTA/TNFB/TNFSF1、LTB/TNFC、神经秩蛋白(NRTN)、OSM、OX-40L/TNFSF4/CD252、珀色芬蛋白(PSPN)、RANKL/OPGL/TNFSF11(CD254)、TL1A/TNFSF15、TNFA、TNF-α/TNFA、TNFSF10/TRAIL/APO-2L(CD253)、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14/LIGHT/CD258、XCL1和XCL2。
66.如权利要求58所述的淋巴细胞，其特征在于，所述致动部分与靶多核苷酸之间复合物的形成下调淋巴细胞中基因的表达。
67.如权利要求66所述的淋巴细胞，其特征在于，所述基因是内源基因。
68.如权利要求67所述的淋巴细胞，其特征在于，所述内源基因编码免疫调节蛋白。
69.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，所述免疫调节蛋白选自下组：A2AR、B7.1、B7-H3/CD276、B7-H4/B7S1/B7x/Vtcn1、B7-H6、BTLA/CD272、CCR4、CD122、4-1BB/CD137、CD27、CD28、CD40、CD47、CD70、CISH、CTLA-4/CD152、DR3、GITR、ICOS/CD278、IDO、KIR、LAG-3、OX40/CD134、PD-1/CD279、PD2、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA/Dies1/Gi24/PD-1H(C10orf54)。
70.一种表达权利要求1所述的系统的淋巴细胞群，其特征在于，所述淋巴细胞群的特征在于：当受体多肽与抗原结合时，通过在切割识别位点切割而从GMP释放所述致动部分。
71.一种诱导靶细胞死亡的方法，其特征在于，所述方法包括将靶细胞暴露于权利要求56所述的淋巴细胞，在将靶细胞暴露于淋巴细胞后，由淋巴细胞表达的受体多肽结合于抗原，所述抗原包括靶细胞的细胞表面抗原或由靶细胞分泌的抗原，其中受体多肽与抗原的结合激活了淋巴细胞的细胞毒性，从而诱导靶细胞的死亡。
72.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是癌细胞。
73.如权利要求71所述的方法，其特征在于，当致动部分从GMP释放时，受体多肽与抗原的结合激活了淋巴细胞的细胞毒性。
74.如权利要求73所述的方法，其特征在于，所述致动部分通过靶多核苷酸的物理阻碍或对有效抑制或增强靶多核苷酸的基因表达的额外因子的募集，来调节靶多核苷酸的基因表达。
75.如权利要求73所述的方法，其特征在于，所述致动部分包含有效增加靶多核苷酸的基因表达的转录激活因子。
76.如权利要求73所述的方法，其特征在于，所述致动部分包含有效降低靶多核苷酸的基因表达的转录抑制因子。
77.如权利要求74-76中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶多核苷酸包括基因组DNA。
78.如权利要求74-76中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶多核苷酸包括基因组RNA。
79.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述受体修饰包括磷酸化。
80.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述受体修饰包括在多个修饰位点处的修饰，并且每个修饰有效地结合于嵌合衔接子多肽。
81.如权利要求71-80中任一项所述的方法，其特征在于，所述致动部分包含CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调控多肽、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、转录激活物样效应物相关基因调控多肽、大范围核酸酶、天然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、阿尔古蛋白，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。
82.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述致动部分包含与向导RNA(gRNA)形成复合物的Cas蛋白。
83.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述Cas蛋白基本上不具有DNA切割活性。
84.如权利要求71-83中任一项所述的方法，其特征在于，所述切割识别位点包含多肽序列，并且切割部分包含蛋白酶活性。
85.一种用于条件性调节淋巴细胞的方法,其特征在于,所述方法包括使权利要求56所述的淋巴细胞与结合于嵌合跨膜受体多肽的抗原相互作用结构域的抗原接触，所述接触导致免疫细胞活性的激活或失活，从而条件性地调节淋巴细胞。
86.如权利要求85所述的方法,其特征在于,免疫细胞活性选自下组：淋巴细胞的克隆扩增；淋巴细胞的细胞因子的释放；淋巴细胞的细胞毒性；淋巴细胞的增殖；淋巴细胞的分化、去分化或分化转化；淋巴细胞的运动和/或运输；淋巴细胞的衰竭和/或重新激活；以及通过淋巴细胞释放其他细胞间的分子、代谢物、化合物或其组合。
87.如权利要求85所述的方法,其特征在于,在抗原与受体多肽的抗原相互作用结构域结合后，致动部分从GMP释放，从而实现激活或失活。
88.一种嵌合衔接子多肽,其特征在于,包括:
(a)受体结合部分，其结合于经与抗原结合后的发生修饰的受体，所述受体包含具有免疫细胞信号传导结构域的胞内区；和
(b)与所述受体结合部分连接的基因调节多肽(GMP)，其中所述GMP包含与切割识别位点连接的致动部分；
其中一旦所述受体结合部分与发生了修饰的所述受体结合后，通过在所述切割识别位点切割从所述GMP释放出所述致动部分。
89.如权利要求88所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述受体结合部分包含选自下组的分子的结合结构域：ABL1、ABL2、APBA1、APBA2、APBA3、BCAR3、BLK、BLNK、BMX、BTK、CHN2、CISH、CRK、CRKL、CSK、DAPP1、DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6、DOK7、EAT-2、EPS8、EPS8L1、EPS8L2、EPS8L3、FER、FES、FGR、FRK、FRS2、FRS3、FYN、GADS、GRAP、GRAP2、GRB10、GRB14、GRB2、GRB7、HCK、HSH2D、INPP5D、INPPL1、IRS1、IRS2、IRS3、IRS4、ITK、JAK2、LAT、LCK、LCP2、LYN、MATK、NCK1、NCK2、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PLCG1、PLCG2、PTK6、PTPN11、PTPN6、RASA1、SAP、SH2B1、SH2B2、SH2B3、SH2D1A、SH2D1B、SH2D2A、SH2D3A、SH2D3C、SH2D4A、SH2D4B、SH2D5、SH2D6、SH3BP2、SHB、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、SHD、SHE、SHP1、SHP2、SLA、SLA2、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、SRC、SRMS、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUPT6H、SYK、TEC、TENC1、TLN1、TLN2、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、TXK、VAV1、VAV2、VAV3、YES1、ZAP70、X11a、其任何的结合结构域、其任何变体和其任何片段。
90.如权利要求88所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述嵌合衔接子多肽包含至少一种靶向肽，其指导受体多肽转运至细胞的特定区域。
91.如权利要求90所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述靶向肽指导嵌合衔接子多肽转运至细胞核、细胞质、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体或质膜。
92.如权利要求90所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述靶向肽包含核输出信号(NES)。
93.如权利要求92所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述NES连接至嵌合衔接子多肽的N端。
94.如权利要求90所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述靶向肽包含质膜靶向肽。
95.如权利要求90所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述靶向肽连接于致动部分。
96.如权利要求95所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述靶向肽包含核定位信号(NLS)。
97.如权利要求96所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述包含与致动部分连接的NLS的靶向肽，在致动部分通过在切割识别位点处切割并从GMP中释放后，指导致动部分转运至细胞的核。
98.如权利要求88所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述致动部分包含CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调控多肽、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、转录激活物样效应物相关基因调控多肽、大范围核酸酶、天然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、阿尔古蛋白，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。
99.如权利要求98所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述致动部分包含可与向导RNA(gRNA)形成复合物的Cas蛋白。
100.如权利要求99所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述Cas蛋白基本上不具有DNA切割活性。
101.如权利要求88所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述致动部分通过对靶多核苷酸的物理阻碍或对有效抑制或增强靶多核苷酸的基因表达的额外因子的募集，来调节基因的表达。
102.如权利要求88所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述致动部分包含有效增加靶多核苷酸的基因表达的转录激活因子。
103.如权利要求88所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述致动部分包含有效降低靶多核苷酸的基因表达的转录抑制因子。
104.如权利要求88所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述切割识别位点两侧是受体结合部分和致动部分。
105.如权利要求88所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述切割识别位点包含被蛋白酶识别的切割识别序列。
106.如权利要求105所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述切割识别位点包含多个切割识别序列，每个切割识别序列被相同或不同的蛋白酶识别。
107.如权利要求105所述的嵌合衔接子多肽，其特征在于，所述切割识别序列被选自下组的蛋白酶识别：消化肽酶、氨基肽酶、安克洛酶、血管紧张素转换酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、钙蛋白酶I、钙蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、细胞凋亡蛋白酶1、细胞凋亡蛋白酶2、细胞凋亡蛋白酶3、细胞凋亡蛋白酶4、细胞凋亡蛋白酶5、细胞凋亡蛋白酶6、细胞凋亡蛋白酶7、细胞凋亡蛋白酶8、细胞凋亡蛋白酶9、细胞凋亡蛋白酶10、细胞凋亡蛋白酶11、细胞凋亡蛋白酶12、细胞凋亡蛋白酶13、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、糜酶、糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体C1r、补体C1s、补体因子D、补体因子I、黄瓜素、二肽基肽酶IV、弹性蛋白酶(白细胞)、弹性蛋白酶(胰腺的)、蛋白内切酶Arg-C、蛋白内切酶Asp-N、蛋白内切酶Glu-C、蛋白内切酶Lys-C、肠激酶、因子Xa、无花果蛋白酶、弗林蛋白酶、颗粒酶A、颗粒酶B、HIV蛋白酶、IG酶(Igase)、激肽释放酶组织、亮氨酸氨肽酶(通用)、亮氨酸氨肽酶(胞质)、亮氨酸氨肽酶(微粒体)、基质金属蛋白酶、甲硫氨酸氨肽酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶、脯氨酸酶、链霉蛋白酶E、前列腺特异性抗原、来自灰色链霉菌的碱性蛋白酶、来自曲霉菌的蛋白酶、来自斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、来自酱油曲霉(Aspergillus sojae)的蛋白酶、蛋白酶(地衣芽孢杆菌)(碱性的或碱性蛋白酶)、来自多粘芽孢杆菌的蛋白酶、来自芽孢杆菌属的蛋白酶、来自根霉属的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶体、来自米曲霉的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨基肽酶、肾素、肾素、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、热粘蛋白、凝血酶、组织纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、类胰蛋白酶(tryptase)和尿激酶。
108.一种嵌合跨膜受体多肽,其特征在于,包括:
(a)胞外区，所述胞外区包含结合于抗原的抗原相互作用结构域；和
(b)胞内区，其包含：
免疫细胞信号传导结构域；和
与所述免疫细胞信号传导结构域连接的基因调节多肽(GMP)，其中所述GMP包含与切割识别位点连接的致动部分；
其中一旦所述抗原与胞外区结合后，通过在切割识别位点处切割从GMP释放出致动部分。
109.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合于膜结合的抗原。
110.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合于非膜结合的抗原。
111.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合于抗体。
112.如权利要求111所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合于抗体的Fc结构域、Fv结构域、重链和轻链中的至少一个。
113.如权利要求112所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合于抗体的Fc结构域。
114.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域包含Fab、单链Fv(scFv)、胞外受体结构域和Fc结合结构域中的至少一个。
115.如权利要求114所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域包含Fc结合结构域，所述Fc结合结构域包含Fc受体或其任意片段。
116.如权利要求115所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域包含Fc结合结构域，所述Fc结合结构域包括：FcγRI(CD64)、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIA(CD32,H131)、FcγRIIA(CD32,R131)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIB-1、FcγRIIB-2、FcγRIIIA(CD16a,V158)、FcγRIIIA(CD16a,F158)、FcγRIIIB(CD16b,FcγRIIIb-NAl)、FcγRIIIB(CD16b,FcγRIIIb-NA2)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR、FcRn，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。
117.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，抗原相互作用结构域结合于一抗原，所述抗原包括抗体，所述抗体反过来结合选自以下的抗原：1-40-β-淀粉状蛋白、4-1BB、5AC、5T4、激活素受体样激酶1、ACVR2B、腺癌抗原、AGS-22M6、α-胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽杆菌(Bacillus anthracisanthrax)、BAFF、β-淀粉样蛋白、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、C5、CA-125、家犬狼疮IL31、碳酸酐酶9(CA-IX)、心肌肌球蛋白、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147(基础免疫球蛋白)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3ε、CD30、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配体、CD41、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CEA相关抗原、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艰难梭菌、凝聚因子A、CSF1R、CSF2、CTLA-4、C-X-C趋化因子受体4型、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、达比加群酯、DLL4、DPP4、DR5、大肠杆菌志贺毒素1型、大肠杆菌志贺毒素2型、EGFL7、EGFR、内毒素、EpCAM、上皮唾蛋白、ERBB3、大肠杆菌、呼吸道合胞病毒F蛋白、FAP、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白胞外结构域B、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、卷曲受体、神经节苷脂GD2、GD2、神经节苷脂GD3、磷脂酰肌醇聚糖3、GMCSF受体α链、GPNMB、生长分化因子8、GUCY2C、血球凝集素、乙肝表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、组蛋白复合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、人分散因子受体激酶、人TNF、人β-淀粉样蛋白、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE的Fc区、IGF-1受体、IGF-1、IGHE、IL-17A、IL-17F、IL-20、IL-12、IL-13、IL-17、IL-1β、IL-22、IL-23、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、ILGF2、甲型流感血凝素、甲型流感病毒血凝素、胰岛素样生长因子I受体、整联蛋白α4β7、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整联蛋白αIIbβ3、整联蛋白αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素γ诱导蛋白、ITGA2、ITGB2(CD18)、KIR2D、路易斯-Y抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-选择素(CD62L)、LTA、MCP-1、间皮素、MIF、MS4A1、MSLN、MUC1、粘蛋白CanAg、髓磷脂相关糖蛋白、肌生成抑制蛋白、NCA-90(粒细胞抗原)、神经凋亡调节蛋白酶1、NGF、N-羟乙酰神经氨酸、NOGO-A、Notch受体、NRP1、穴兔、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-Rα、磷酸钠共转运蛋白、磷脂酰丝氨酸、血小板衍生生长因子受体β、前列腺癌细胞、绿脓杆菌、狂犬病病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞病毒、RHD、恒河猴因子、RON、RTN4、硬化蛋白、SDC1、选择素P、SLAMF7、SOST、鞘氨醇-1-磷酸盐、金黄色葡萄球菌、STEAP1、TAG-72、T细胞受体、TEM1、腱生蛋白C、TFPI、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、MUC1的肿瘤特异性糖基化形式、肿瘤相关钙信号转导器2、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白和VWF。
118.如权利要求115所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合选自下组的抗体的Fc结构域：20-(74)-(74)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(米拉珠单抗；维妥珠单抗)、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿比珠单抗、ABP 494(西妥昔单抗生物仿制药)、阿布里单抗、ABT-700、ABT-806、阿克提单抗-A(锕Ac-225林妥珠单抗)、阿卡单抗、阿达木单抗、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿达卡莫单抗、阿杜单抗、阿非莫单抗、AFM13、阿芙土珠单抗、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、PEG化的阿拉西马单抗、ALD518、阿仑单抗、阿妥莫单抗、戊妥莫单抗、阿马昔单抗、AMG228、AMG820、麻安莫单抗、安替单抗瑞伐坦、阿尼弗洛姆单抗、安鲁单抗、APN301、APN311、阿泊珠单抗、APX003/SIM-BD0801(贝伐单抗)、APX005M、阿西莫单抗、ARX788、阿斯库昔单抗、阿塞珠单抗、ASG-15ME、阿特珠单抗、安妥明单抗、ATL101、阿特利单抗(也称为托珠单抗)、阿托木单抗、阿维拉姆单抗、B-701、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、巴维昔单抗、BAY1129980、BAY1187982、贝妥莫单抗、贝格洛姆单抗、贝利木单抗、贝拉珠单抗、柏替木单抗、贝索单抗、倍他卢汀单抗(177Lu-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸特托单抗)、贝伐单抗、BEVZ92(贝伐单抗生物仿制药)、贝佐洛单抗、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、比西单抗、双马单抗、贝美珠单抗、莫比瓦妥单抗、BIW-8962、博纳吐单抗、布洛唑单抗、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、博科齐单抗、维本妥昔单抗、布雷瓦雷克斯单抗、布里亚明单抗、溴达拉单抗、溴化丙单抗、支舒巴单抗、C2-2b-2b、康纳单抗、莫坎妥珠单抗、坎妥单抗瑞伐坦、卡普利单抗、卡罗单抗喷地肽偶联物、卡伦单抗、卡妥索单抗、CBR96-阿霉素免疫偶联物、CBT124(贝伐单抗)、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠单抗、PEG化的塞妥珠单抗、西妥昔单抗、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、伯格西他土珠单抗、西妥木单抗、克拉扎珠单抗、克立昔单抗、克伐他单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物、CM-24、钴妥珠单抗、考土昔单抗-DM4偶联物、康妥单抗、康昔单抗、科塔拉(碘I-131地洛妥单抗生物素)、cR6261、克伦单抗、DA-3111(曲妥珠单抗生物仿制药)、达塞珠单抗、达利珠单抗、达妥珠单抗、PEG化的达匹罗单抗、达雷木单抗、达雷木单抗(商品名为Enhanze)、达介素、癸曲单抗、地昔单抗、丹因珠单抗-MMAF偶联物、地诺单抗、达妥昔单抗、达妥昔单抗-MMAF偶联物、地洛昔单抗-生物素、地莫单抗、DI-B4、丁妥昔单抗、地利达莫单抗、DKN-01、DMOT4039A、阿托度单抗、屈西他单抗、DS-1123、DS-8895、杜利他单抗、杜普单抗、杜伐单抗、杜昔单抗、依美昔单抗、依库珠单抗、埃巴单抗、依屈洛单抗、依法珠单抗、依芬古单抗、埃尔德单抗、埃格曼图姆单抗、伊洛珠单抗、艾西莫单抗、艾马珠单抗、依米妥珠单抗、恩伐珠单抗、伊凡珠单抗-维多汀偶联物、PEG化恩莫单抗、恩比利珠单抗、依诺珠单抗、依诺替单抗、恩师妥昔单抗、西依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、厄马索单抗、依他珠单抗、依曲利珠单抗、依伐单抗、依福单抗、艾韦单抗、法索单抗、法拉莫单抗、法鲁珠单抗、法辛单抗、FBTA05、泛维珠单抗、费扎尼单抗、FF-21101、FGFR2抗体-药物偶联物、菲伯免疫蛋白、非卡妥珠单抗、菲妥木单抗、福利木单抗、法兰妥单抗、福利替单抗、芬特妥珠单抗、福拉木单抗、福韦单抗、FPA144、去甲美马单抗、FS102、富拉单抗、伏妥昔单抗、加利昔单抗、甘露单抗、冈特莫单抗、加维莫单抗、格图单抗-奥佐米星偶联物、吉利单抗、格伐克单抗、吉妥昔单抗、维格列巴单抗、GNR-006、GNR-011、哥利木单抗、高密昔单抗、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、古塞尔库姆单抗、Hu14.18K322A单抗、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、伊巴珠单抗、伊立莫单抗替西坦偶联物、伊鲁库单抗、依达鲁单抗、IGN002、IGN523、伊戈伏单抗、IMAB362、IMAB362(克洛昔单抗)、伊马单抗、IMC-CS4、IMC-D11、英西单抗、伊马曲单抗、IMGN529、IMMU-102(钇-90-依普鲁单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物)、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗抗体、INCAGN1876、依克拉单抗、INCSHR1210、吲妥昔单抗瑞伐坦、维因度单抗、英夫利昔单抗、伊诺莫单抗、奥妥珠格图单抗-奥佐米星偶联物偶联物、英特单抗、依帕非赛、IPH4102、伊匹木单抗、伊拉单抗、伊沙昔单抗、异妥拉明单抗、伊托珠单抗、衣克珠单抗、JNJ-56022473、JNJ-61610588、克利昔单抗、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉托唑单抗、拉托唑单抗-格维他偶联物、LAG525、兰布利单抗、拉帕单抗、L-DOS47、利勃珠单抗、利马索单抗、仑齐鲁单抗、勒德利木单抗、白妥昔单抗、莱卡单抗、利比维单抗、维利伐妥单抗、利格珠单抗、利洛单抗-赛塔坦偶联物、林妥珠单抗、利鲁单抗、LKZ145、洛德昔单抗、洛克韦单抗、莫洛伐妥单抗、卢卡珠单抗、PEG化的卢利珠单抗、鲁米昔单抗、鲁曲单抗、LY3164530、马塔单抗、马妥昔单抗、马司莫单抗、马妥单抗、马维里单抗、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551(吲哚单抗)、MEDI-565、MEDI6469、美泊利单抗、迈他珠单抗、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉珠单抗、米拉珠单抗-SN-38、明妥莫单抗、米维妥昔单抗-索拉素偶联物、米托单抗、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、莫加利单抗、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫洛莫单抗、莫他珠单抗、莫昔单抗-帕多毒素偶联物、穆罗莫纳-CD3(muromonab-CD3)、塔非那托克-塔芬毒素偶联物、纳霉单抗、萘妥莫单抗-衣塔芬毒素偶联物、纳妥单抗、那他珠单抗、奈巴库单抗、奈米单抗、奈莫珠单抗、奈利莫单抗、奈西伐单抗、尼妥珠单抗、尼沃单抗、巯诺莫单抗-美培坦偶联物、10-Nov、奥比妥昔单抗、奥匹妥珠单抗、奥卡鲁单抗、奥克里昔单抗、奥杜莫单抗、阿法单抗、奥拉他单抗、奥昔单抗、奥马珠单抗、OMP-131R10、OMP-305B83、阿那妥单抗、恩妥昔单抗、阿昔单抗、阿曲单抗-莫那毒素偶联物、奥戈伏单抗、奥替单抗、奥立昔单抗、奥特鲁单抗、OX002/MEN1309、奥索单抗、奥扎尼单抗、奥索利单抗、帕吉巴昔单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、潘科曼单抗、潘科曼单抗-GEX、泛巴单抗、帕撒单抗、帕昔单抗、帕索妥昔单抗、帕替利单抗、帕特利单抗、PAT-SC1、PAT-SM6、彭布利单抗、培马单抗、哌拉单抗、帕妥珠单抗、培昔单抗、PF-05082566(乌托单抗)、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、匹利珠单抗、维匹那妥单抗、品妥莫单抗、普鲁单抗、维波达单抗、庞尼泽单抗、普利昔单抗、普罗昔单抗、普鲁米单抗、PRO 140、普罗信单抗、PSMA ADC、奎珠单抗、拉托单抗、拉德鲁单抗、拉维夫单抗、拉潘昔单抗、拉莫鲁单抗、雷尼珠单抗、拉克昔单抗、瑞伐珠单抗、瑞伐单抗、REGN1400、REGN2810/SAR439684、利昔单抗、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利妥珠单抗、利努单抗、利妥昔单抗、RM-1929、RO7009789、罗巴单抗、罗乐单抗、罗莫索单抗、罗他珠单抗、罗维珠单抗、鲁普单抗、妥珠单抗-格维他偶联物、沙马利单抗、SAR408701、SAR566658、沙利鲁单抗、SAT012、沙妥单抗-喷地肽偶联物、SCT200、SCT400、SEA-CD40、塞库单抗、塞巴坦单抗、塞妥昔单抗、赛韦单抗、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西布曲单抗、西伐单抗、西妥昔单抗、西妥珠单抗、西普利单抗、西鲁库单抗、维索菲妥单抗、索冷珠单抗、索利单抗、索普昔单抗、索妥单抗、丝塔单抗、舒乐单抗、苏维珠单抗、SYD985、SYM004(伏妥昔单抗和莫妥昔单抗)、Sym015、TAB08、他巴单抗、塔卡珠单抗-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸偶联物、塔多珠单抗、塔利单抗、坦纳单抗、塔尼单抗、普利妥单抗-帕普毒素偶联物、塔雷克斯顿单抗、TB-403、替非珠单抗、特勒金单抗、阿替莫单抗-阿利毒素偶联物、替纳单抗、替尼昔单抗、替普珠单抗、四丙珠单抗、司他洛单抗、替妥洛明单抗、TG-1303、TGN1412、钍-227-依普鲁单抗偶联物、替昔单抗、替加妥单抗、替拉珠单抗、维蒂索单抗、TNX-650、塔西单抗、托拉珠单抗、托沙单抗、托西单抗、托维单抗、曲洛单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-厄塔毒素偶联物、TRBS07、TRC105、曲利单抗、曲美单抗、特伐单抗、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、图卡珠单抗-西莫白介素偶联物、妥韦单抗、U3-1565、U3-1784、乌布妥昔单抗、优隆单抗、乌洛单抗、乌索单抗、乌司他单抗、伐他昔单抗-塔利素偶联物、维凡多鲁单抗、范蒂姆单抗、维库珠单抗、伐昔单抗、伐利单抗、伐他珠单抗、VB6-845、维多珠单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维森单抗、维西珠单抗、伏罗昔单抗、沃塞妥单抗-马伏毒素偶联物、伏妥单抗、YYB-101、扎鲁单抗、扎诺米单抗、扎妥昔单抗、齐拉明单抗、和阿佐莫单抗-阿利毒素偶联物。
119.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述胞外区域包含多个抗原相互作用结构域，其各自表现出与相同或不同抗原的结合。
120.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述抗原相互作用结构域结合于选自下组的抗原：707-AP、生物素化的分子、α-肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、亲脂素、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、细胞凋亡蛋白酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、路易斯Y(Lewis Y)、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/黑素-A(Melan-A)、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活素、存活素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。
121.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述免疫细胞信号传导结构域包含主要信号传导结构域，所述主要信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
122.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述免疫细胞信号传导结构域包含主要信号传导结构域，所述主要信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
123.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述免疫细胞信号传导结构域包含选自下组的蛋白质的主要信号传导结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(又名ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。
124.如权利要求123所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述主要信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。
125.如权利要求124所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述主要信号传导结构域包含CD3ζ的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
126.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述免疫细胞信号传导结构域包含共刺激结构域。
127.如权利要求126所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述免疫细胞信号传导结构域包含多个共刺激结构域。
128.如权利要求126所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述共刺激结构域包含以下物质的信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体或Toll配体受体。
129.如权利要求126所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述共刺激结构域包含选自下组的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFFR/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、树突状细胞植物血凝素-1(Dectin-1)/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、伊卡洛斯(Ikaros)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
130.如权利要求126所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述共刺激结构域可调控免疫细胞的增殖信号和/或存活信号。
131.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述致动部分包含CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调控多肽、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、转录激活物样效应物相关基因调控多肽、大范围核酸酶、天然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、阿尔古蛋白，其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。
132.如权利要求131所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述致动部分包含与向导RNA(gRNA)形成复合物的Cas蛋白。
133.如权利要求132所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述Cas蛋白基本上不具有DNA切割活性。
134.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述致动部分通过对靶多核苷酸的物理阻碍或对有效抑制或增强靶多核苷酸的基因表达的额外因子的募集，来调节基因的表达。
135.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述致动部分包含有效增加靶多核苷酸的基因表达的转录激活因子。
136.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述致动部分包含有效降低靶多核苷酸的基因表达的转录抑制因子。
137.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述切割识别位点两侧是免疫细胞信号传导结构域和致动部分。
138.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述切割识别位点包含被蛋白酶识别的切割识别序列。
139.如权利要求138所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述切割识别位点包含多个切割识别序列，每个切割识别序列被相同或不同的蛋白酶识别。
140.如权利要求138所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述切割识别序列被选自下组的蛋白酶识别：消化肽酶、氨基肽酶、安克洛酶、血管紧张素转换酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、钙蛋白酶I、钙蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、细胞凋亡蛋白酶1、细胞凋亡蛋白酶2、细胞凋亡蛋白酶3、细胞凋亡蛋白酶4、细胞凋亡蛋白酶5、细胞凋亡蛋白酶6、细胞凋亡蛋白酶7、细胞凋亡蛋白酶8、细胞凋亡蛋白酶9、细胞凋亡蛋白酶10、细胞凋亡蛋白酶11、细胞凋亡蛋白酶12、细胞凋亡蛋白酶13、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、糜酶、糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体C1r、补体C1s、补体因子D、补体因子I、黄瓜素、二肽基肽酶IV、弹性蛋白酶(白细胞)、弹性蛋白酶(胰腺的)、蛋白内切酶Arg-C、蛋白内切酶Asp-N、蛋白内切酶Glu-C、蛋白内切酶Lys-C、肠激酶、因子Xa、无花果蛋白酶、弗林蛋白酶、颗粒酶A、颗粒酶B、HIV蛋白酶、IG酶(Igase)、激肽释放酶组织、亮氨酸氨肽酶(通用)、亮氨酸氨肽酶(胞质)、亮氨酸氨肽酶(微粒体)、基质金属蛋白酶、甲硫氨酸氨肽酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶、脯氨酸酶、链霉蛋白酶E、前列腺特异性抗原、来自灰色链霉菌的碱性蛋白酶、来自曲霉菌的蛋白酶、来自斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、来自酱油曲霉(Aspergillus sojae)的蛋白酶、蛋白酶(地衣芽孢杆菌)(碱性的或碱性蛋白酶)、来自多粘芽孢杆菌的蛋白酶、来自芽孢杆菌属的蛋白酶、来自根霉属的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶体、来自米曲霉的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨基肽酶、肾素、肾素、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、热粘蛋白、凝血酶、组织纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、类胰蛋白酶(tryptase)和尿激酶。
141.如权利要求108所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述嵌合跨膜受体多肽还包含至少一种靶向肽，其指导受体转运至细胞的特定区域。
142.如权利要求141所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述靶向肽指导受体转运至细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、过氧化物酶体或质膜。
143.如权利要求141所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述靶向肽包含核输出信号(NES)。
144.如权利要求141所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述靶向肽包含质膜靶向肽。
145.如权利要求141所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述靶向肽连接于致动部分。
146.如权利要求145所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述靶向肽包含核定位信号(NLS)。
147.如权利要求146所述的嵌合跨膜受体多肽，其特征在于，所述包含与致动部分连接的NLS的靶向肽，在致动部分通过在切割识别位点处切割并从GMP中释放后，指导致动部分转运至细胞的核。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110115759A (zh) * 2019-05-29 2019-08-13 中国海洋大学 一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法
CN110201158A (zh) * 2019-06-11 2019-09-06 南京融捷康生物科技有限公司 药物组合物
CN110327458A (zh) * 2019-07-09 2019-10-15 上海交通大学医学院 自分泌vegfb在t细胞代谢与功能以及肿瘤免疫治疗中的应用
CN110330567A (zh) * 2019-07-02 2019-10-15 南京凯地生物科技有限公司 双特异性嵌合抗原受体t细胞，其制备方法和应用
CN111676195A (zh) * 2019-03-11 2020-09-18 北京卡替医疗技术有限公司 一种治疗t细胞肿瘤的ucar免疫细胞
CN112480237A (zh) * 2019-09-12 2021-03-12 上海津曼特生物科技有限公司 一种融合蛋白及其制备方法和应用
CN113056288A (zh) * 2018-11-20 2021-06-29 康奈尔大学 放射性核素的大环配合物及其在癌症的放射治疗中的应用
CN113186268A (zh) * 2021-05-08 2021-07-30 苏州海苗生物科技有限公司 Dna-rna杂合双链特异性缀合物在促进核酸复制及在新型冠状病毒检测中应用
US11175293B1 (en) 2021-01-04 2021-11-16 University Of Utah Research Foundation Rapid assay for detection of SARS-CoV-2 antibodies
CN113817621A (zh) * 2021-09-07 2021-12-21 天津大学 同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株及制备方法和应用
CN114539415A (zh) * 2020-11-24 2022-05-27 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗PD-L1/VEGF/TGF-β多特异性抗体及其用途
CN114945586A (zh) * 2020-01-21 2022-08-26 张晋宇 一种药物组合物及其用途

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112018013663A2 (pt) 2016-01-11 2019-01-22 Univ Leland Stanford Junior proteínas quiméricas e métodos de imunoterapia
MY196175A (en) 2016-01-11 2023-03-20 Univ Leland Stanford Junior Chimeric Proteins And Methods Of Regulating Gene Expression
US10858422B2 (en) 2016-05-31 2020-12-08 Abcentra, Llc Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody
WO2017210360A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Cardiovax, Llc Methods for diagnosing and treating systemic lupus erythematosus
WO2018148649A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 The Institute For Cancer Research D/B/A Chimera of bone morphogenic protein 2 and the müllerian-inhibiting substance type ii receptor binding region of mullerian-inhibiting substance
KR20190142775A (ko) 2017-04-19 2019-12-27 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 조작된 항원 수용체를 발현하는 면역 세포
US20200362038A1 (en) * 2017-09-11 2020-11-19 The Regents Of The University Of California Antibody-mediated delivery of cas9 to mammalian cells
EP3723787A4 (en) 2017-12-14 2021-09-01 Bluebird Bio, Inc. DARIC INTERLEUKIN RECEPTORS
BR112020011898A2 (pt) * 2017-12-14 2020-12-01 Bluebird Bio, Inc. receptores daric nkg2d
WO2019152781A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified monocytes/macrophages/dendritic cells expressing chimeric antigen receptors and uses in diseases and disorders associated with protein aggregates
AU2019235782A1 (en) * 2018-03-14 2020-10-08 Celledit Llc Modification of immune cells for reducing toxicity and uses thereof in adoptive cell therapy
US20210230548A1 (en) * 2018-05-03 2021-07-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Natural killer cells engineered to express chimeric antigen receptors with immune checkpoint blockade
CA3110282A1 (en) * 2018-08-24 2020-02-27 Locanabio, Inc. Fasl immunomodulatory gene therapy compositions and methods for use
TW202034958A (zh) * 2018-10-30 2020-10-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗血管內皮生長因子（ｖｅｇｆ）抗體與抗組織因子（ｔｆ）抗體－藥物共軛體之組合以治療癌症之方法
CA3119917A1 (en) 2018-12-03 2020-06-11 Eric Steven BURAK Radioimmunoconjugates and checkpoint inhibitor combination therapy
KR20240000655A (ko) * 2018-12-27 2024-01-02 주식회사 뉴라클사이언스 죽상경화증을 치료하기 위한 항-fam19a5 항체의 사용
EP3927830A4 (en) * 2019-02-22 2022-11-30 Refuge Biotechnologies, Inc. CHIMERA POLYPEPTIDES AND METHODS OF USING THE SAME
US20220177862A1 (en) * 2019-03-12 2022-06-09 University Of Washington Precise Gene Activation Via Novel Designed Proteins Mediating Epigenetic Remodeling
KR102323342B1 (ko) * 2019-04-26 2021-11-08 주식회사 와이바이오로직스 IL-17A 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 이중표적 항체
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
EP3998282A4 (en) * 2019-07-08 2023-08-09 Progen Co., Ltd. NEW FUSION PROTEIN AND ITS USE
CN114729025A (zh) * 2019-09-24 2022-07-08 加利福尼亚大学董事会 用于配体依赖性转录调控的新型受体
CN110964750A (zh) * 2019-11-13 2020-04-07 沣潮医药科技（上海）有限公司 携带基因元件组合的嵌合抗原受体细胞文库、制备和筛选方法及用途
CN115397854A (zh) * 2020-01-17 2022-11-25 百济神州有限公司 抗NKp30抗体及使用方法
WO2021231436A1 (en) * 2020-05-11 2021-11-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Therapeutic methods for treating covid-19 infections
AU2021285992A1 (en) 2020-06-04 2023-01-05 Carisma Therapeutics Inc. Novel constructs for chimeric antigen receptors
TW202237640A (zh) * 2020-11-04 2022-10-01 美商聖堤生物科技股份有限公司 蛋白酬載釋放
KR20230104264A (ko) * 2020-11-08 2023-07-07 레퓨즈 바이오테크놀로지스, 인크. 유전자 발현 또는 활성을 조절하는 시스템 및 방법
WO2022170093A2 (en) * 2021-02-05 2022-08-11 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for treating with car cells
WO2022204151A1 (en) * 2021-03-23 2022-09-29 The Regents Of The University Of California Synthetic intermembrane proteolysis receptors for custom antigen-induced transcriptional regulation
US20230032871A1 (en) * 2021-07-14 2023-02-02 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Recombinant Viral Particle for Gene and/or Cellular Therapy
CN114621929B (zh) * 2021-12-21 2023-05-30 河南省肿瘤医院 一种抗肿瘤树突状细胞及其制备方法、表达载体及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150044772A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
WO2015092024A2 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Cellectis Method of engineering multi-input signal sensitive t cell for immunotherapy
WO2015142661A1 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
US20150291966A1 (en) * 2012-07-25 2015-10-15 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
CN105101803A (zh) * 2013-02-06 2015-11-25 人类起源公司 具有改进特异性的修饰的t淋巴细胞

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US812436A (en) 1905-06-17 1906-02-13 Douglas P Morrison System of calibrating recording watt-hour meters.
DE4129849A1 (de) * 1991-02-14 1992-08-27 Boehringer Mannheim Gmbh Monoklonale antikoerper gegen humane pankreas-inselzellen
US6017735A (en) 1997-01-23 2000-01-25 Marie Curie Cancer Care Materials and methods for intracellular transport and their uses
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
AU746454B2 (en) 1998-03-02 2002-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
JP2004503463A (ja) 1998-08-24 2004-02-05 ザ　ボード　オブ　トラスティーズ　オブ　ザ　リーランド　スタンフォード　ジュニア　ユニバーシティ 免疫系媒介損傷から器官、組織および細胞を保護するための組成物および方法
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6593292B1 (en) 1999-08-24 2003-07-15 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
US7229961B2 (en) 1999-08-24 2007-06-12 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
US7256286B2 (en) 1999-11-30 2007-08-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bryostatin analogues, synthetic methods and uses
AU2002306500C1 (en) 2001-02-16 2006-09-28 Cellgate, Inc. Transporters comprising spaced arginine moieties
DE10211063A1 (de) 2002-03-13 2003-10-09 Axaron Bioscience Ag Neue Verfahren zur Detektion und Analyse von Protein-Interaktionen in vivo
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US20060206949A1 (en) 2003-01-28 2006-09-14 Sylvain Arnould Custom-made meganuclease and use thereof
US20070224615A1 (en) 2003-07-09 2007-09-27 Invitrogen Corporation Methods for assaying protein-protein interactions
CA2531698A1 (en) 2003-07-09 2005-01-27 Sentigen Biosciences, Inc. Method for assaying protein-protein interaction
FR2858235B1 (fr) * 2003-07-31 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation d'anticorps optimises en adcc pour traiter les patients faibles repondeurs
US20110158974A1 (en) 2005-03-15 2011-06-30 Cellectis Heterodimeric Meganucleases and Use Thereof
EP1893627A4 (en) 2005-05-27 2009-11-11 Sentigen Biosciences Inc MULTIPLEXARRAY SUITABLE FOR THE INVESTIGATION OF PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
DK2336362T3 (en) 2005-08-26 2019-01-21 Dupont Nutrition Biosci Aps USE OF CRISPR-ASSOCIATED GENES (CAS)
US8021867B2 (en) 2005-10-18 2011-09-20 Duke University Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity
EP1991267B1 (en) * 2006-03-03 2017-12-20 Biogen MA Inc. Methods of treating inflammatory and autoimmune diseases with natalizumab
ATE528647T1 (de) 2006-03-16 2011-10-15 Life Technologies Corp Verfahren zur untersuchung von protein-protein- interaktionen
ATE530669T1 (de) 2006-05-19 2011-11-15 Danisco Markierte mikroorganismen und entsprechende markierungsverfahren
WO2007149807A1 (en) 2006-06-20 2007-12-27 Invitrogen Corporation Methods for identifying modifiers of gpr1 activity
EP2205729A2 (en) 2007-09-27 2010-07-14 Sangamo BioSciences, Inc. Genomic editing in zebrafish using zinc finger nucleases
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
WO2010075441A1 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Trustees Of Boston University Modular nucleic acid-based circuits for counters, binary operations, memory, and logic
SG181601A1 (en) 2009-12-10 2012-07-30 Univ Minnesota Tal effector-mediated dna modification
WO2012166906A1 (en) 2011-05-31 2012-12-06 Massachusetts Institute Of Technology Cell-directed synthesis of multifunctional nanopatterns and nanomaterials
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
US9732392B2 (en) 2011-08-05 2017-08-15 Northwestern University Modular sensor architecture for cell based biosensors
WO2013049330A1 (en) 2011-09-28 2013-04-04 The Regents Of The University Of California Synthetic transcriptional control elements and methods of generating and using such elements
IN2014MN00974A (zh) 2011-12-16 2015-04-24 Targetgene Biotechnologies Ltd
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
LT3401400T (lt) 2012-05-25 2019-06-10 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui
DE202013012597U1 (de) 2012-10-23 2017-11-21 Toolgen, Inc. Zusammensetzung zum Spalten einer Ziel-DNA, umfassend eine für die Ziel-DNA spezifische guide-RNA und eine Cas-Protein-codierende Nukleinsäure oder ein Cas-Protein, sowie deren Verwendung
US20150315576A1 (en) 2012-11-01 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Genetic device for the controlled destruction of dna
EP3138911B1 (en) 2012-12-06 2018-12-05 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
PT2921557T (pt) 2012-12-12 2016-10-19 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
DK2898075T3 (en) 2012-12-12 2016-06-27 Broad Inst Inc CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF IMPROVED SYSTEMS, PROCEDURES AND ENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
ES2576128T3 (es) 2012-12-12 2016-07-05 The Broad Institute, Inc. Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
ES2658401T3 (es) 2012-12-12 2018-03-09 The Broad Institute, Inc. Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
CA3081054A1 (en) 2012-12-17 2014-06-26 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided human genome engineering
SI3613439T1 (sl) 2013-02-15 2021-11-30 The Regents Of The University Of California Himerni antigenski receptor in postopki njegove uporabe
US20160138027A1 (en) 2013-03-14 2016-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of diseases and conditions associated with dysregulation of mammalian target of rapamycin complex 1 (mtorc1)
KR101780885B1 (ko) 2013-03-14 2017-10-11 카리부 바이오사이언시스 인코포레이티드 핵산-표적화 핵산의 조성물 및 방법
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US9745368B2 (en) * 2013-03-15 2017-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
CA2906553C (en) 2013-03-15 2022-08-02 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
CA2910489A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
EP3417880A1 (en) 2013-06-05 2018-12-26 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
SG11201509866TA (en) 2013-06-06 2015-12-30 Agency Science Tech & Res Protease-responsive peptide biosensors and methods for analyte detection
DK3011032T3 (da) 2013-06-17 2020-01-20 Broad Inst Inc Fremføring, modificering og optimering af systemer, fremgangsmåder og sammensætninger til målretning mod og modellering af sygdomme og forstyrrelser i postmitotiske celler
EP3011034B1 (en) 2013-06-17 2019-08-07 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
CN105517579B (zh) 2013-07-10 2019-11-15 哈佛大学校长及研究员协会 用于RNA向导的基因调节和编辑的正交Cas9蛋白
CA3109801C (en) 2013-08-22 2024-01-09 Andrew Cigan Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
US9772328B2 (en) 2013-09-12 2017-09-26 The University Of Queensland Bimolecular protease-based biosensor
US10822606B2 (en) * 2013-09-27 2020-11-03 The Regents Of The University Of California Optimized small guide RNAs and methods of use
US20160237455A1 (en) 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
LT3066201T (lt) 2013-11-07 2018-08-10 Editas Medicine, Inc. Su crispr susiję būdai ir kompozicijos su valdančiomis grnr
EP3071695A2 (en) 2013-11-18 2016-09-28 Crispr Therapeutics AG Crispr-cas system materials and methods
EP3074419B1 (en) * 2013-11-25 2018-08-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors to control hiv infection
EP3126498A4 (en) 2014-03-20 2017-08-23 Université Laval Crispr-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof
AU2015236128A1 (en) 2014-03-25 2016-11-10 Editas Medicine Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating HIV infection and AIDS
EP3122880B1 (en) 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
GB201405845D0 (en) 2014-04-01 2014-05-14 Ucl Business Plc Signalling system
WO2015155686A2 (en) 2014-04-08 2015-10-15 North Carolina State University Methods and compositions for rna-directed repression of transcription using crispr-associated genes
WO2016011210A2 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells for adoptive cell therapy
DK3212789T3 (da) 2014-10-31 2020-07-27 Massachusetts Inst Technology Massiv parallel kombinatorisk genetik til crispr
WO2016115033A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Microrna combinations for anti-cancer therapeutics
JP6784687B2 (ja) 2015-02-24 2020-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 結合誘発型転写スイッチ及びその使用方法
US10619155B2 (en) 2015-03-17 2020-04-14 Brown University Methods for labeling and manipulating a cellular circuit
GB201509413D0 (en) 2015-06-01 2015-07-15 Ucl Business Plc Fusion protein
US20170058282A1 (en) 2015-07-09 2017-03-02 Massachusetts Institute Of Technology Genetically engineered sensors for in vivo detection of bleeding
JP6878408B2 (ja) 2015-09-01 2021-05-26 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ モジュールポリペプチドライブラリならびにその作製方法及びその使用
WO2017044476A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for recombinase-based genetic diversification
CN108884456A (zh) 2015-10-01 2018-11-23 麻省理工学院 生物状态机
BR112018013663A2 (pt) 2016-01-11 2019-01-22 Univ Leland Stanford Junior proteínas quiméricas e métodos de imunoterapia
MY196175A (en) 2016-01-11 2023-03-20 Univ Leland Stanford Junior Chimeric Proteins And Methods Of Regulating Gene Expression

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150291966A1 (en) * 2012-07-25 2015-10-15 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
CN105101803A (zh) * 2013-02-06 2015-11-25 人类起源公司 具有改进特异性的修饰的t淋巴细胞
US20150044772A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
WO2015092024A2 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Cellectis Method of engineering multi-input signal sensitive t cell for immunotherapy
WO2015142661A1 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOLE T.ROYBAL等: ""Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatoria Antigen-sensing Circuits"", 《CELL》 *
张瑞萍等: ""嵌合T细胞受体的构建及其在T淋巴细胞表面的表达和体外抗肿瘤功能的检测"", 《中华实验外科杂志》 *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113056288A (zh) * 2018-11-20 2021-06-29 康奈尔大学 放射性核素的大环配合物及其在癌症的放射治疗中的应用
CN111676195A (zh) * 2019-03-11 2020-09-18 北京卡替医疗技术有限公司 一种治疗t细胞肿瘤的ucar免疫细胞
CN110115759B (zh) * 2019-05-29 2022-02-18 中国海洋大学 一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法
CN110115759A (zh) * 2019-05-29 2019-08-13 中国海洋大学 一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法
CN110201158A (zh) * 2019-06-11 2019-09-06 南京融捷康生物科技有限公司 药物组合物
CN110201158B (zh) * 2019-06-11 2020-06-09 南京融捷康生物科技有限公司 药物组合物
CN110330567A (zh) * 2019-07-02 2019-10-15 南京凯地生物科技有限公司 双特异性嵌合抗原受体t细胞，其制备方法和应用
CN110330567B (zh) * 2019-07-02 2020-11-06 南京凯地生物科技有限公司 双特异性嵌合抗原受体t细胞，其制备方法和应用
CN110327458A (zh) * 2019-07-09 2019-10-15 上海交通大学医学院 自分泌vegfb在t细胞代谢与功能以及肿瘤免疫治疗中的应用
CN110327458B (zh) * 2019-07-09 2022-02-25 上海交通大学医学院 自分泌vegfb在t细胞代谢与功能以及肿瘤免疫治疗中的应用
CN112480237A (zh) * 2019-09-12 2021-03-12 上海津曼特生物科技有限公司 一种融合蛋白及其制备方法和应用
CN112480237B (zh) * 2019-09-12 2023-10-17 上海津曼特生物科技有限公司 一种融合蛋白及其制备方法和应用
CN114945586A (zh) * 2020-01-21 2022-08-26 张晋宇 一种药物组合物及其用途
CN114539415A (zh) * 2020-11-24 2022-05-27 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗PD-L1/VEGF/TGF-β多特异性抗体及其用途
CN114539415B (zh) * 2020-11-24 2024-02-02 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗PD-L1/VEGF/TGF-β多特异性抗体及其用途
US11175293B1 (en) 2021-01-04 2021-11-16 University Of Utah Research Foundation Rapid assay for detection of SARS-CoV-2 antibodies
US11467165B2 (en) 2021-01-04 2022-10-11 University Of Utah Research Foundation Rapid assay for detection of SARS-CoV-2 antibodies
CN113186268A (zh) * 2021-05-08 2021-07-30 苏州海苗生物科技有限公司 Dna-rna杂合双链特异性缀合物在促进核酸复制及在新型冠状病毒检测中应用
CN113817621A (zh) * 2021-09-07 2021-12-21 天津大学 同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株及制备方法和应用
CN113817621B (zh) * 2021-09-07 2023-02-17 天津大学 同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株及制备方法和应用

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