CN110115759A - 一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法，通过上调Bmp8a蛋白的表达量来增强鱼类的抗病毒免疫力。本发明首先提供Bmp8a蛋白的一种用途，是在制备提高鱼类抗病毒免疫力的制品中的应用。本发明证明bmp8a基因敲除后的斑马鱼的抗病毒能力显著下降，而过表达Bmp8a可显著上调干扰素等抗病毒相关基因的表达，显示Bmp8a在抗病毒免疫中具有重要作用。通过在鱼类中注射Bmp8a成熟肽，增强鱼类的抗病毒免疫力，从而达到防治鱼类病毒性疾病的目的。

Description

一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法

技术领域

本发明属于鱼类免疫技术领域，具体涉及一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法。

背景技术

鱼类病毒性疾病传染性强、传播速度快、死亡率高，严重危害水产养殖业，能够造成重大经济损失。国内外已经研发和生产了少数鱼类病毒性疾病的疫苗，但仍存在免疫效果差、血清型差异等问题，难以在生产实践中应用。因此，目前鱼类病毒性疾病的治疗还存在相当大难度，主要以预防为主。

骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)家族是一类疏水性糖蛋白家族，属于Transforming Growth Factor Beta(TGF-β)超家族。BMP8是BMP家族的众多成员之一，在斑马鱼中，Bmp8只有Bmp8a一种形式。斑马鱼Bmp8a首先形成一个含有433个氨基酸的前肽，活性的Bmp8a成熟肽由羧基端的137个氨基酸组成。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法，通过上调Bmp8a蛋白的表达量来增强鱼类的抗病毒免疫力，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供Bmp8a蛋白的一种用途，是在制备提高鱼类抗病毒免疫力的制品中的应用；所述的制品，为注射用液体蛋白制剂；

本发明还提供Bmp8a蛋白的另一种用途，是通过检测Bmp8a蛋白的表达量来筛选抗病毒能力强的亲鱼；

所述的Bmp8a蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其成熟肽的氨基酸序列为SEQID NO:2；

编码上述的Bmp8a蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明另一个方面还提供一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法，通过上调bmp8a蛋白的表达量来增强鱼类的抗病毒免疫力。

本发明将bmp8a基因敲除后的斑马鱼抗病毒能力显著下降，显示Bmp8a在抗病毒免疫中具有重要作用。通过在饲料中添加Bmp8a成熟肽或在鱼类中注射Bmp8a成熟肽，增强鱼类的抗病毒免疫力，从而达到防治鱼类病毒性疾病的目的。

附图说明

图1：斑马鱼bmp8a基因的组织表达图；

图2：斑马鱼bmp8a基因TALEN靶位点设计图；

图3：斑马鱼bmp8a基因TALEN靶位点上下游嵌套PCR电泳图。M：DL 2000Maker；1：外侧PCR产物；2：内侧PCR产物。

图4：斑马鱼bmp8a基因TALEN靶位点突变检测结果。(A)：Hph Ⅰ酶切PCR产物电泳图。M：DL 2000Maker；1-9：注射TALEN mRNA胚胎；WT：未注射TALEN mRNA的野生型胚胎。(B)：图(A)中1、2、8号胚胎bmp8a基因突变测序结果。

图5：利用TALEN技术对斑马鱼bmp8a基因进行敲除示意图。

图6：斑马鱼bmp8a基因敲除后，MHC1基因表达显著下降图。

图7：GCRV病毒刺激可显著上调斑马鱼组织中bmp8a基因表达图。

图8：GCRV病毒刺激可显著上调斑马鱼ZFL细胞中bmp8a基因的表达图。

图9：过表达斑马鱼Bmp8a可显著上调抗病毒相关基因的表达图。

图10：过表达斑马鱼Bmp8a可显著抑制病毒基因VP5的表达图。

图11：bmp8a突变体斑马鱼更易受到病毒感染图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：bmp8a基因敲除实验

斑马鱼Bmp8a蛋白DE氨基酸序列为SEQ ID NO:1,其对应的成熟肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码上述Bmp8a蛋白的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。斑马鱼bmp8a基因主要表达在斑马鱼的精巢、肠和皮肤组织中，脑组织中表达次之，心脏、肌肉组织中表达量相对较低(图1)。

运用TALEN技术对斑马鱼bmp8a基因进行敲除。具体方法如下：

1)靶位点设计：

利用Submit TALEN Targeter(https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen)网站，根据TALEN技术靶位点设计原则，对斑马鱼BMP8a基因每个外显子进行分析，结合zBMP8a基因结构域特点，设计靶位点，并通过NEB公司网站找到高效率酶切位点。选择在第4个外显子上设计靶位点，Spacer为斑马鱼BMP8a cDNA的833-849bp，左臂为816-832bp，右臂为850-866bp，Spacer上含有Hph Ⅰ酶切位点，用于后续突变体检验，且Hph Ⅰ酶效率很高，可直接切割PCR产物(图2)。

2)靶位点确认

在靶位点上下游设计嵌套PCR扩增外侧引物P5和内侧引物P6。以外侧引物P5、基因组粗提液进行第一轮PCR扩增，外侧PCR扩增产物大小为957bp；以内侧引物P6、第一轮PCR产物进行二轮PCR扩增，内侧PCR扩增产物大小为556bp(图3)。Hph Ⅰ酶切内侧PCR产物分别产生227bp、339bp两条带。

引物序列如下：

P5-F：5'-GGAACTCTGAATCTGCGTCT-3'

P5-R：5'-TCACAGGAGGGCGAATAG-3'

P6-F：5'-GACAGACATTCAGGCACGTA-3'

P6-R：5'-GCCGTCCACTGCTATGAT-3'

3)构建TALEN表达载体及体外转录、纯化mRNA

利用Golden Gate方法构建TALEN表达载体，并测序。提取含有TALEN表达载体菌液质粒，通过NotⅠ酶将质粒线性化。体外转录合成编码TALEN的mRNA。体外转录结束后，加入1μl DNase Ⅰ，37℃水浴孵育15min，以出去mRNA中的DNA模板，并电泳检测。-80℃保存备用。

4)显微注射

(1)性成熟的野生型斑马鱼雌雄交配产卵，体外受精后收集胚胎。

(2)将左臂、右臂TALEN mRNA混合，显微注射到单细胞期或2细胞期斑马鱼受精卵中，得到F0胚胎。

5)突变检测

取2dpf注射后斑马鱼胚胎，粗提基因组。进行嵌套PCR。HPh Ⅰ酶酶切PCR产物，37℃反应2h。酶切结束后，将10μl酶切产物进行电泳检测。如果有完整的、没有被切开的条带，则靶位点可能发生突变，将未切开的条带回收纯化，回收纯化的PCR产物连接到pGEM-T载体，转化到trans5α克隆菌种，涂布到蓝白斑筛选平板上，挑选出重组子，并测序。将测序结果与野生型BMP8a基因组比对分析，确认基因敲除成功(图4)，获得F0代突变体斑马鱼。

6)经过几代的筛选和养殖，获得了在靶位点内缺失7bp的F3代纯合子突变体(图5)。

进一步利用Real-time PCR技术检测发现，斑马鱼bmp8a基因敲除后，MHC1基因表达显著下降(图6)。MHCⅠ在提呈病毒抗原给细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，Tc或CTL)的细胞免疫中发挥着关键作用。由此推断Bmp8a蛋白与抗病毒免疫有关。

实施例2：GCRV病毒刺激可显著上调斑马鱼bmp8a基因的表达

用草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)腹腔注射斑马鱼，分别用Real-time PCR技术检测对脾、肠、肝脏和肾脏组织中bmp8a基因表达的影响，发现GCRV病毒刺激可显著上调斑马鱼bmp8a基因的表达(图7)。同样，用GCRV病毒处理斑马鱼肝脏细胞系(ZFL)，也发现bmp8a基因的表达显著上调(图8)。结果表明斑马鱼bmp8a对病毒刺激有明显的应答反应，Bmp8a在鱼类抗病毒免疫中具有重要作用。

实施例3：过表达斑马鱼Bmp8a可显著上调抗病毒相关基因的表达

在斑马鱼ZFL细胞系中，过表达斑马鱼Bmp8a，用Real-time PCR技术检测抗病毒相关基因IFNφ1、IFNφ3和Mx的表达，发现过表达斑马鱼Bmp8a可显著上调抗病毒相关基因IFNφ1、IFNφ3和Mx的表达(图9)，进一步证明Bmp8a在鱼类抗病毒免疫中具有重要作用。

在EPC细胞系中，过表达斑马鱼Bmp8a。用GCRV病毒感染细胞，用Real-time PCR技术检测病毒基因VP5的表达，发现过表达斑马鱼Bmp8a可显著下调病毒基因VP5的表达(图10)，证明Bmp8a具有抑制病毒在EPC细胞中的复制的功能。

实施例4：bmp8a突变体斑马鱼更易受到病毒感染

采取腹腔注射的方法用大菱鲆皮疣病毒感染斑马鱼，成年野生型和bmp8a突变体各10条，注射剂量是20μl,10⁸TCID 50/ml。结果发现，大菱鲆皮疣病病毒感染后相同时间，突变体的病害症状程度更为严重(图11A)；另外，野生型比突变体的生存率要高，在感染后5d，突变体开始死亡，直到6d多后全部死亡，在此期间，野生型斑马鱼一直没有出现死亡(图11B)。这说明Bmp8a参与了斑马鱼的抗病毒免疫，可提高斑马鱼对病毒感染的抵抗力。

本发明提供的Bmp8a蛋白可用于制备提高鱼类抗病毒免疫力的制品。例如饲料添加剂，但优选制备成能注射使用的液体制剂；通过注射方式来提供鱼体内Bmp8a蛋白的含量提升，从而提高鱼类抗病毒的能力。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 433

<212> PRT

<213> 斑马鱼( zebrafish)

<400> 1

Met Asp Arg His Glu Val Glu Ile Val Ser Ser Lys His Gln Ser Arg

1 5 10 15

Gly Arg Lys Arg Thr Arg Leu Phe Pro Pro Ser Ile Phe Leu Pro Leu

20 25 30

Cys Val Leu Leu Cys Val Trp Gly Gln Val Glu Gly Val Val His Ser

35 40 45

Ser Phe Arg Arg Leu Ser Gly Arg Glu Lys Lys Glu Met Gln Lys Glu

50 55 60

Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu Pro Gly Arg Pro Arg Pro His Pro Pro

65 70 75 80

Leu Arg Pro Pro Ser Ser Ala Pro Leu Phe Met Leu Asp Leu Tyr His

85 90 95

Ala Val Ser Ser Glu Ala Asp Asp Arg Pro Gly Leu Gly Phe Thr Pro

100 105 110

Glu Val Val Ser His Ala Ala Leu Pro Thr Leu Ser Thr His Met Pro

115 120 125

Pro Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Ala Asp Thr Val Met Ser Phe Val

130 135 140

Asn Leu Val Glu Gln Glu Lys Asp Leu Leu Gln Pro Arg Pro Tyr Trp

145 150 155 160

Lys Glu Phe Arg Phe Asp Leu Thr Pro Leu Pro Gln Gly Glu Thr Val

165 170 175

Thr Ala Ala Glu Phe Arg Ile Tyr Lys Thr Leu Thr Met Gly Trp Arg

180 185 190

Phe Asn His Thr Leu His Ile Ser Val Tyr Glu Ile Leu Arg Glu Lys

195 200 205

Arg His Arg Glu Pro Glu Leu Val Leu Leu Asp Met Gln Ser Val Pro

210 215 220

Ala Gly Gln Glu Gly Trp Leu Ala Phe Asp Val Thr Ser Ala Ser Asn

225 230 235 240

Arg Trp Leu Leu His Pro Arg Ser Asn Leu Gly Ile Arg Leu Tyr Val

245 250 255

Glu Thr Glu Glu Asp His Arg Ser Trp Val Gly Leu Val Gly Arg Arg

260 265 270

Gly Pro Arg Ser Lys Gln Pro Phe Met Val Thr Phe Phe Arg Ala Ser

275 280 285

Gln Ala Pro Cys Arg Pro Pro Arg Ala Leu Lys His Thr Asn Gln Arg

290 295 300

Lys Lys Lys Thr Lys Tyr Asp Leu Pro His Pro Asn Arg Pro Gly Ile

305 310 315 320

Phe Asp Gln Asn His Ser Ser Gly Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu

325 330 335

Leu Tyr Val Ser Phe Ser Asp Leu Gly Trp Lys Asp Trp Val Leu Ala

340 345 350

Pro Thr Gly Tyr Ser Ala Tyr Tyr Cys Asp Gly Glu Cys Asp Tyr Pro

355 360 365

Leu Gly Ser Cys Met Asn Ala Thr Asn His Ala Met Ile Gln Leu Leu

370 375 380

Val His Leu Leu Arg Pro Asp Glu Val Pro Lys Ala Cys Cys Ala Pro

385 390 395 400

Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ala Val Leu Phe Tyr Asp Asp Asn Asn Asn

405 410 415

Val Ile Leu Lys Lys Gln Arg Asn Met Val Val Lys Asn Cys Gly Cys

420 425 430

Leu

<210> 2

<211> 137

<212> PRT

<213> 斑马鱼( zebrafish)

<400> 2

Ala Leu Lys His Thr Asn Gln Arg Lys Lys Lys Thr Lys Tyr Asp Leu

1 5 10 15

Pro His Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Asp Gln Asn His Ser Ser Gly

20 25 30

Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Ser Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Lys Asp Trp Val Leu Ala Pro Thr Gly Tyr Ser Ala Tyr Tyr

50 55 60

Cys Asp Gly Glu Cys Asp Tyr Pro Leu Gly Ser Cys Met Asn Ala Thr

65 70 75 80

Asn His Ala Met Ile Gln Leu Leu Val His Leu Leu Arg Pro Asp Glu

85 90 95

Val Pro Lys Ala Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ala Val

100 105 110

Leu Phe Tyr Asp Asp Asn Asn Asn Val Ile Leu Lys Lys Gln Arg Asn

115 120 125

Met Val Val Lys Asn Cys Gly Cys Leu

130 135

<210> 3

<211> 1302

<212> DNA

<213> 斑马鱼( zebrafish)

<400> 3

atggacagac acgaggttga gattgtgtcc tcaaaacacc agagcagagg gaggaaacga 60

acccgacttt tccctccgtc catcttcctc cctctgtgtg tattgctgtg tgtttggggt 120

caggtggaag gagtggttca ttccagcttt cgtcggctca gcggtcggga aaagaaggag 180

atgcagaagg agattttatc cattttgggt ctccccgggc ggcctaggcc tcacccgccg 240

ctgcggccgc cttcctccgc cccgctcttc atgctggacc tttatcatgc ggtgtcgtct 300

gaggctgatg acaggccggg tttgggtttc actccggaag tggtcagtca tgccgcactg 360

cccactttaa gcacacacat gccgccgctt ggtactgtgg tcagtgaggc cgacacggtt 420

atgagcttcg tgaacctggt tgaacaggag aaggatctgc tccagcctcg gccatactgg 480

aaggagtttc gcttcgatct cactccgctt cctcagggag agacggtcac cgctgctgag 540

tttcgcatct ataaaactct taccatgggt tggcgtttca accacaccct ccatatctct 600

gtctatgaaa tcctgaggga gaaaagacac agggagcctg agctggtgct gctggacatg 660

cagtctgtac ctgcgggtca ggagggttgg ctggcatttg atgtgacttc tgcaagcaat 720

cgctggcttc tccatcctcg gagcaacctg ggcatccgcc tttatgtgga aactgaggag 780

gatcacaggt catgggtggg tctggtgggt cggcgtgggc ctcgctctaa gcagccgttc 840

atggtgacgt tcttcagagc tagtcaagcc ccttgccgcc caccgcgtgc tctgaaacac 900

accaatcaac gcaagaaaaa aactaagtat gacctgccac acccaaacag acccggcata 960

tttgaccaaa atcatagcag tggacggcag gcctgtaaga agcatgaact ctacgtcagc 1020

ttcagcgacc ttggctggaa ggactgggtt ttggccccta caggttattc tgcgtattat 1080

tgtgacgggg aatgtgatta tcctctgggc tcttgtatga atgccacaaa ccatgccatg 1140

atccagctgc tggttcatct tctgagacca gatgaagtgc ctaaagcctg ctgcgctcca 1200

accaaactca gtcccatcgc tgtgctcttc tatgatgaca acaacaacgt tattctaaag 1260

aaacaacgaa atatggtggt caagaattgt ggctgtttat ag 1302

Claims (6)

1.一种Bmp8a蛋白的用途，其特征在于，是在制备提高鱼类抗病毒免疫力的制品中的应用。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制品为饲料添加剂或注射用液体蛋白制剂。

3.本发明还提供bmp8a蛋白的另一种用途，是通过检测bmp8a蛋白的表达量来筛选抗病毒能力强的亲鱼。

4.如权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述的Bmp8a蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其成熟肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

5.如权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述的Bmp8a蛋白的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

6.一种提高鱼类抗病毒免疫力的方法，其特征在于，所述的方法是通过上调Bmp8a蛋白的表达量来增强鱼类的抗病毒免疫力。