CN110151985A - 一种ihnv基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种IHNV基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：表达载体pET‑22b‑m的构建，表达载体pET‑22b‑m中M蛋白的表达，口服微球疫苗的制备。本发明的有益效果在于：本发明所用的海藻酸钠及壳聚糖皆为天然多糖，安全无毒、无污染，能够稳定增加目的蛋白的稳定性和均一性，壳聚糖本身能够抑制细菌活性，为微球疫苗的长久稳定保存提供了保障；本发明提供的制备方法，过程简单，耗费时间少，制备成功率高；本发明提供的一种IHNV基因工程口服微球疫苗，释放性、耐酸性良好，通过免疫实验发现该疫苗对虹鳟鱼有一定的免疫保护作用。

Description

一种IHNV基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及对动物病毒性传染病基因疫苗的研究，具体涉及一种IHNV基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)是鱼类病毒性病原体的一种，能引起鳟鱼(Oncorhunchus mykiss)、鲑鱼(Salmo salar)等冷水鱼的造血器官坏死病(Infectious hematopoietic necrosis，IHN)。IHNV是20世纪50年代在华盛顿及俄勒冈州红大马哈鱼(Oncorhynchus nerka)孵卵期的鱼苗身上首次被发现的，它随着带病毒鱼的粪便、尿、性腺产物等的排泄排入水中，再通过鱼鳃和消化道侵入健康鱼体，进而实现病毒的传染。IHNV的传播方式一般是水平传播，但是也存在垂直传播或鱼卵传播的方式。
IHNV呈典型弹状，弧形的一端直径约20nm，平坦的一端直径约80nm，长度约170nm，为反义单链RNA病毒，有囊膜；脂蛋白包膜表面有纤细的刺突，厚约15nm。IHNV基因组大小约为11100bp，从3’端依次编码核衣壳蛋白(NucLeocapsid protein,N)、聚合酶相关磷酸蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、糖蛋白、非结构蛋白及RNA聚合酶蛋白。目前，根据IHNV的G基因的变异系数分为五个基因型：U(upper)、M(middle)、L(lower)、E(Europe)和JRt(Japanese rainbow trout)，基因分型与地理的相关性高于宿主因素和时间因素。
IHNV不耐酸、不耐热，对游离碘、乙醚、甘油、氯仿等较为敏感，于50％甘油中保存1～2周可失去活性。IHNV能在虹鳟性腺细胞系(Rainbow trout gonad,RTG-2)、鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma papulossum of crap,EPC)、大鳞大麻哈鱼胚细胞系(Chinooksalmon embryo,CHSE-214)、肥头鲦鱼细胞(Fathead minnow,FHM)等细胞系上生长，其中FHM和EPC对其最为敏感。IHNV在细胞中培养的最佳温度为15℃左右，高于23℃时IHNV会停止复制。
研究表明，虹鳟鱼对于IHNV的抵抗，主要包括3种方式，一是非特异性免疫，当虹鳟鱼被IHNV感染或者G蛋白的刺激，会诱导IFN(包括I型干扰素和II型干扰素)产生，IFN中的I型干扰素会进一步诱导具有GTP酶活性的Mx蛋白产生，Mx蛋白具有广谱的抗病毒活性，对多种DNA病毒和RNA病毒有抑制作用；同时当虹鳟鱼被被IHNV感染后，促炎症反应、替代补体途径、凋亡、吞噬作用、自然杀伤细胞活力、分泌及内吞作用中的免疫相关基因的表达均有上调，这些基因的表达的上调能够提高对IHNV的抵抗力；二是先天性免疫屏障，在鱼类的表皮组织先天存在病毒防御系统，可抵抗病毒入侵，限制病毒在鱼体内扩散，并可以启动鱼体警报系统；三是特异性的细胞免疫，当虹鳟鱼被IHNV感染或者疫苗诱导，可以产生中和抗体和特异性细胞免疫反应，产生一定的抵抗作用。但是这3中抵抗方式都不是非常有效的，尤其是在IHNV暴发的急性阶段。原因主要包括以下几个方面：IHNV的复制速度比先天性免疫反应的速度快；抗体产生的速度较慢，在感染几周后才能检测到，且病毒滴度达到一定阈值才能激发虹鳟鱼产生保护抗体。
使用有效的疫苗对虹鳟鱼进行免疫是虹鳟鱼养殖业可持续发展的关键，使用疫苗不仅会减少疾病造成的经济损失，还会降低抗生素对环境的影响，保证食品安全。目前针对IHNV的疫苗种类主要包括灭活疫苗、减毒疫苗及重组疫苗三种。第一种灭活疫苗，此类疫苗是使用丙内酯、二乙烯亚胺及甲醛对IHNV进行50℃、48h或100℃、30min的灭活处理得到的，经IHNV攻毒实验发现，可对虹鳟鱼产生良好的保护作用。第二种减毒疫苗，此类疫苗是使用多次传代培养的减毒IHNV制成，免疫虹鳟鱼、黄鲑发现也起到了明显的保护作用。第三种重组疫苗，此类疫苗包括G、N、M蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗及合成肽疫苗。G、N、M蛋白亚单位疫苗是指将保护性抗原基因与表达载体连接，然后在真核细胞或原核细胞中表达，把重组蛋白质或多肽制成疫苗，制备方法简单，安全性较好。目前用于IHNV的亚单位疫苗主要是IHNVG蛋白，具体是指将IHNV的糖蛋白G与大肠杆菌的表达载体TrpE连接，构建重组质粒，原核表达G蛋白，通过注射和口服的方式免疫虹鳟鱼，保护率可达到81～100％；另有研究证明，原核表达的IHNV N和M蛋白对虹鳟鱼也有一定的保护作用。DNA疫苗，是目前对于IHNV最为有效的一种疫苗产品，DNA疫苗中含有巨细胞病毒极早期基因启动子(CMVIEP)，可启动IHNV G基因的G蛋白表达，刺激鱼体产生对IHNV的保护性免疫反应。之后有人用CMV启动子代替了CMVIEP启动子，并且于2005年在加拿大已被商品化。但也有科研人员认为，在渔用疫苗中插入一段人类病毒CMV启动子是不安全的，故又构建了包含虹鳟干扰素调节因子1A基因(IRF1A)启动子的质粒DNA(pIRF1A-G)，该启动子能够操纵G基因表达，进而刺激鱼体产生特异性中和抗体；此外该质粒DNA还包含一个受ZnCl2诱导的金属硫蛋白启动子pMT，该启动子能够诱导含DNA疫苗的细胞凋亡，进而提高了DNA疫苗的安全性。随着对免疫途径的不断探究，开发出了用PLGA纳米粒作为载体，通过投喂对虹鳟鱼进行免疫的途径；将DNA疫苗包裹在藻酸盐微球中，通过口服给药对虹鳟鱼进行免疫的途径。
随着生物技术的快速发展，对IHNV的研究愈加全面和深入，但是仍未探索出一条有效途径来控制该病的暴发。针对此问题，一方面，研制出一种高效、经济、可操作性强的疫苗迫在眉睫；另一方面，通过抗病育种，优化虹鳟鱼的种质资源，降低对IHNV的敏感性也是防止IHN暴发的有效出路；此外，随着人们对虹鳟鱼免疫相关基因的不断研究，有望探寻出IHNV与虹鳟鱼免疫系统互作的机制，从而为防治IHNV提供新的思路和策略。
发明内容
为了弥补现有技术中没有有效控制IHNV暴发途径，克服现在IHNV疫苗市场没有一种高效、经济、可操作性强的疫苗产品，本发明提供了一种IHNV基因工程疫苗及其制备方法和应用。通过设计针对IHNV-m基因的表达载体，并将其包裹于海藻酸钠-壳聚糖中制成微球疫苗，从而获得免疫原性良好的基因工程疫苗。
一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1.1表达载体pET-22b-m的构建
1.1.1PCR扩增获得目的片段：取IHN患病虹鳟组织，分离IHNV，之后采用所述IHNV感染EPC细胞，之后提取EPC细胞的RNA，并以所述RNA作为模板，上游引物M-F和下游引物M-R为引物进行RT-PCR扩增反应，获得cDNA；再以所述cDNA为模板，以所述上游引物M-F和下游引物M-R为引物，使用TransTaq-T DNA聚合酶进行PCR扩增反应，获得目的片段；
1.1.2目的片段和表达载体pET-22b的双酶切：将所述目的片段和表达载体pET-22b分别使用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切获得两段双酶切产物，之后将所述两段双酶切产物分别进行回收，获得载体双酶切产物和目的片段双酶切产物；
1.1.3双酶切产物连接：将所述载体双酶切产物和目的片段双酶切产物通过T4DNA连接酶进行连接反应，获得表达载体pET-22b-m；
1.2重组菌中M蛋白的表达及纯化
1.2.1重组菌BL21(pET-22b-m)的制备：将所述表达载体pET-22b-m转化到E.coliBL21感受态细胞中，并将所述感受态细胞涂布到含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，获得重组菌BL21(pET-22b-m)；
1.2.2M蛋白的诱导表达：将所述重组菌BL21(pET-22b-m)接种于含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养液中，37℃过夜活化；次日将所述过夜活化的菌液按体积比1％接种于含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养液中，37℃培养至OD600为0.4-0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度0.8mM，之后在26℃、180rpm条件下诱导表达6h；
1.2.3重组菌株的超声破碎：用离心管收集诱导表达后的菌液，之后8000rpm，离心10min，弃上清，用滤纸将上清吸干，加生理盐水重悬沉淀获得重悬液；之后在冰浴中对所述重悬液进行超声破碎，所述超声破碎条件为功率400W，破5s，歇10s，至所述重悬液呈蛋清状，结束超声破碎过程；之后在4℃、14000rpm条件下离心10min，收集上清，即为待纯化菌液。
1.2.4M蛋白的纯化：将所述待纯化菌液用Ni-NTA层析柱进行纯化，获得纯化后的M蛋白；
1.3口服微球疫苗的制备：取10mL所述纯化后的M蛋白作为抗原，加入10mL 2％的海藻酸钠搅拌混匀，再加入100mL大豆油，冰浴中8×103r/min搅拌10min充分乳化；再加10mL 3％CaCl2溶液，冰浴中500r/min搅拌15～30min充分复乳化，之后4℃、4000g离心15min，弃上清，用75％酒精洗涤三次后收集沉淀，称为沉淀1；加30mL PBS重悬所述沉淀1，加30mL 1％壳聚糖，冰浴中500r/min搅拌2h，之后4℃、4000g离心15min，弃上清，用75％酒精洗涤三次后收集沉淀，称为沉淀2，并将所述沉淀2放到-80℃冰箱中预冷30min；将预冷后的所述沉淀2放入已预热30min的冷冻干燥机中，4℃真空冻干24h，即获得IHNV基因工程口服微球疫苗。
作为一种优选的方案，步骤1.1.1中所述目的片段的大小为509bp。
更为优选的是，步骤1.1.1中所述RT-PCR扩增反应的条件为94℃预变性5min；94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
所述上游引物M-F的序列为5′-ACAGTTCTGATCCCTCCTCC-3′，所述下游引物M-R的序列为5′-GTCTCCTGGGCATAGTAGTC-3′。
更为优选的是，步骤1.1.3中所述连接反应的体系为载体双酶切产物13μL、目的片段双酶切产物2μL、5×T4Buffer 4μL、T4DNA连接酶1μL。
一种IHNV基因工程口服微球疫苗，采用前述任意一项所述的制备方法制备获得。
作为一种优选的方案，所述IHNV基因工程口服微球疫苗平均粒径为17.6μm，包封率为43.8％，载抗原量为6.02％，在PBS、0.75％NaC、蒸馏水中的膨胀率分别为556.24％、602.16％、666.10％。
一种IHNV基因工程口服微球疫苗在IHNV在造血器官坏死病IHN防治领域的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供的一种IHNV基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用具有以下优势：
①本发明所用的海藻酸钠及壳聚糖皆为天然多糖，安全无毒、无污染，能够稳定增加目的蛋白的稳定性和均一性，壳聚糖本身能够抑制细菌活性，为微球疫苗的长久稳定保存提供了保障；
②本发明提供的一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，过程简单，耗费时间少，制备成功率高；
③本发明提供的一种IHNV基因工程口服微球疫苗通过光学显微镜观察呈球形或类球形，平均粒径为17.6μm，包封率为43.8％，载抗原量为6.02％，在PBS、0.75％NaCl、蒸馏水中的膨胀率分别为556.24％、602.16％、666.10％。
④本发明提供的一种IHNV基因工程口服微球疫苗，释放性、耐酸性良好，通过免疫效果评估实验表明，免疫剂量为0.1g/尾时虹鳟鱼血清中抗体效价为1:6400，RPS为71.4％，说明该疫苗对虹鳟鱼有一定的免疫保护作用。
附图说明
图1是本发明的具体实施方式中步骤1.1.4中RT-PCR的结果图；
图2是本发明的具体实施方式中步骤1.1.9中pET-22b-m重组质粒双酶切产物电泳验证示意图；
图3是本发明的具体实施制备的方式中步骤1.2.4获得的纯化后的M蛋白液和步骤1.2.5中获得的M蛋白浓缩液的SDS-PAGE电泳验证示意图；
图4是本发明的具体实施制备的IHNV基因工程口服微球疫苗的显微结构照片；
图5是本发明的具体实施制备的IHNV基因工程口服微球疫苗在不同条件下的释放曲线。
附图标记的含义：图1中1为目的片段，M为DNAmaker2000；图2中1为pET-22b-m重组质粒双酶切产物，M为DNAmaker150000；图3中1为纯化后的M蛋白液，2为M蛋白浓缩液，M为Protein Marker。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1.1表达载体pET-22b-m的构建
1.1.1IHNVm基因引物设计：根据GenBank公布的IHNVm基因全序列，以及载体pET-22b的序列，设计并合成上游引物M-F和下游引物M-R，其中上游引物M-F的序列为5′-ACAGTTCTGATCCCTCCTCC-3′，下游引物为M-R序列为5′-GTCTCCTGGGCATAGTAGTC-3′。
1.1.2IHNVm模板的获得：取IHN患病虹鳟组织，分离IHNV，之后采用IHNV感染EPC细胞，之后提取EPC细胞的RNA。
1.1.3RT-PCR扩增：以步骤1.1.1获得的上游引物M-F和下游引物M-R为引物，步骤1.1.2获得的RNA为模板，反转录获得cDNA。
1.1.4PCR扩增：以获得的cDNA模板使用TransTaq-T DNA聚合酶进行PCR扩增，获得目的片段，大小为509bp，具体结果见图1。其中PCR的反应体系为100μL，具体组成比例见表1。RT-PCR的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
表1PCR反应体系
1.1.5表达载体pET-22b的双酶切：将表达载体pET-22b使用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切。其中双酶切反应体系为20μL，具体组成比例见表2。双酶切反应条件为37℃金属浴3h，之后70℃金属浴热激10min使限制性内切酶失活。
表2双酶切反应体系
1.1.6目的片段的双酶切：将步骤1.1.3获得的目的片段使用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切。其中双酶切反应体系为20μL，具体组成比例见表3。双酶切反应条件为37℃金属浴3h，之后70℃金属浴热激10min使限制性内切酶失活。
表3双酶切反应体系
1.1.7双酶切目的片段回收：将经过步骤1.1.5双酶切获得的载体双酶切产物和经过步骤1.1.6双酶切获得的目的片段双酶切产物分别采用1％琼脂糖进行凝胶电泳鉴定，并分别回收目的片段双酶切产物和载体双酶切产物。
1.1.8载体双酶切产物与目的片段双酶切产物的连接：将步骤1.1.7回收目的片段双酶切产物和载体双酶切产物通过T4DNA连接酶进行连接，获得表达载体pET-22b-m。其中连接反应体系为20μL，具体组成比例见表4。连接反应条件为16℃金属浴连接过夜。
表4连接体系
1.1.9表达载体pET-22b-m的转化与鉴定：将表达载体pET-22b-m转化到E.coliBL21感受态细胞中，并将感受态细胞涂布到含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，获得重组菌BL21(pET-22b-m)；之后提取重组菌中的重组质粒，使用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳验证，结果显示表达载体pET-22b-m构建成功，具体结果见图2。
1.2重组菌中M蛋白的表达及纯化
1.2.1重组菌BL21(pET-22b-m)的制备：将所述表达载体pET-22b-m转化到E.coliBL21感受态细胞中，涂布含有Amp的LB平板，37℃培养过夜，获得重组菌BL21(pET-22b-m)；
1.2.2M蛋白的诱导表达：诱导表达采用的方法为将重组菌BL21(pET-22b-m)接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养液中，37℃过夜活化；次日将过夜活化的菌液按体积比1％接种于含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养液中，37℃培养至OD600为0.4-0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度0.8mM，之后在26℃、180rpm条件下诱导表达6h；
为了达到更好的诱导表达效果，本实验对诱导剂IPTG的浓度和诱导温度进行了筛选，采用的诱导温度分别为22℃、24℃、26℃、28℃，加入IPTG后诱导体系的终浓度分别为0.6mM、0.8mM、1mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2mM；采用的筛选方法为将不同表达条件下表达的M蛋白进行SDS-PAGE分析，经SDS-PAGE分析确定最佳的诱导条件为26℃、加入IPTG后诱导体系的终浓度0.8mM。
1.2.3重组菌株的超声破碎：用离心管收集诱导表达后的菌液，之后8000rpm，离心10min，弃上清，用滤纸将上清吸干，加生理盐水重悬沉淀获得重悬液；之后在冰浴中对所述重悬液进行超声破碎，超声破碎条件为功率400W，破5s，歇10s，至重悬液呈蛋清状结束超声破碎过程；之后在4℃、14000rpm条件下离心10min，收集上清，即为待纯化菌液。
1.2.4M蛋白的纯化：取待纯化菌液5mL，加入到已经平衡好的Ni-NTA层析柱内，4℃条件下，上柱2小时；打开层析柱下盖，将层析柱内的液体全部放出，之后用2-5倍体积的Lysis buffer冲洗层析柱壁，之后加入Wash buffer洗涤，4mL/次，4℃摇床摇10min/次，共洗涤三次；之后用Elution solution洗脱M蛋白，1mL/次，4℃摇床摇10min/次，共洗脱四次，收集洗脱流出液，即为纯化后的M蛋白液；取纯化后的M蛋白液进行SDS-PAGE检测，观察到单一条带，大小为21.6kD，具体结果见图3。
1.2.5M蛋白的浓缩：将步骤1.2.4获得的全部纯化后的M蛋白液装入浓缩柱中，4℃，8000rmp，离心30min，留取柱间液体，即为M蛋白浓缩液；取少量M蛋白浓缩液进行SDS-PAGE，在21.6kD处可见到清晰的目的条带，具体结果见图3。
1.3IHNV基因工程口服微球疫苗的制备
1.3.1取10mL纯化后的M蛋白作为抗原，加入10mL 2％的海藻酸钠，用玻璃棒搅拌混匀；再加100mL大豆油，冰浴中8×103r/min搅拌10min，充分乳化；加10mL 3％CaCl2溶液，冰浴中500r/min搅拌15～30min，充分复乳化，之后4℃，4000g离心15min，弃上清；加75％酒精洗涤沉淀，之后4℃，4000g离心15min，弃上清，重复清洗两次后收集沉淀。
1.3.2加30mL PBS重悬收集的沉淀，加30mL 1％壳聚糖，冰浴中500r/min搅拌2h，之后4℃、4000g离心15min，弃上清，收集沉淀；加75％酒精洗涤沉淀，之后4℃、4000g离心15min，弃上清，重复清洗两次后收集沉淀，并将沉淀放到-80℃冰箱中预冷30min。
1.3.3将预冷后的沉淀样品放入已经预热30min的冷冻干燥机中，4℃真空冻干24h，获得IHNV基因工程口服微球疫苗，-20℃保存备检。
2.IHNV基因工程口服微球疫苗的性能检测和效果评估
对步骤1制备的一种IHNV基因工程口服微球疫苗进行性能检测和效果评估，具体包括对显微结构、疫苗粒径、膨胀率、包封率、载抗原量等性能的检测，以及对疫苗体外释放曲线，疫苗免疫效果的评估。
2.1疫苗性能的检测
2.1.1显微结构检测：采用Nikon Elipse TS100倒置显微镜观察微球形态，结果显示在光学显微镜下，IHNV基因工程口服微球疫苗呈球形或类球形，具体见图4。
2.1.2显微结构及粒径的测定：取少量微球疫苗，用PBS重悬，涂于载玻片后置于光学显微镜下观察，并用显微镜上的标尺随机测量50个微球的粒径，结果显示IHNV基因工程口服微球疫苗的平均粒径为17.6μm。
2.1.3膨胀率的测定：称取100mg微球疫苗，加入10mL溶胀溶液中，37℃溶胀2～2.5h，真空抽滤后，用滤纸吸干水分，称重，之后根据公式，膨胀率＝(Wt-Wo)/Wo，计算微球的膨胀率，公式中Wt为微球疫苗溶胀后的质量，Wo为微球疫苗溶胀前的质量；本实验中使用的溶胀溶液分别为pH7.4PBS、蒸馏水和0.75％NaCl溶液三种。结果显示IHNV基因工程口服微球疫苗在pH7.4PBS、蒸馏水、0.75％NaCl三种溶胀溶液的膨胀率分别为556.24％、666.10％、602.16％。
2.1.4包封率、载抗原量的测定：称取100mg微球疫苗，加入10mL 0.06M的柠檬酸三钠溶液，静置5～10min；之后在冰浴中，功率400W条件下超声破碎10min；4℃、4000g离心10min，收集上清，上清中的蛋白浓度采用BCA法进行测定；之后根据下面的公式分别计算微球疫苗的包封率和载抗原量：
包封率(％)＝M实测/M总×100％；M实测为实际测定的微球疫苗中蛋白量，M总为制备微球时加入的总蛋白量；
载抗原量(％)＝M实测/M×100％；M实测为实际测定的微球疫苗中蛋白量，M为所用的微球疫苗总质量。
结果显示IHNV基因工程口服微球疫苗包封率为43.8％，载抗原量为6.02％。
2.2疫苗体外释放实验
称取三份各100mg微球疫苗，分别加入pH7.4PBS、0.75％NaCl溶液、pH2.3的HCl溶液各10mL，置于37℃，100rpm恒温摇床上培养；并于第1h、3h、7h、1d、3d、7d、14d、21d取样，检测三种溶液中各时间点的蛋白含量，统计结果，制成释放曲线，具体结果见图5。实验结果显示，IHNV基因工程口服微球疫苗在PBS和生理盐水中7h累积释放率在35％左右，在21d基本完全释放，释放性良好；但在pH2.3HCl溶液中释放7h时，累积释放率仅为21％，表明该疫苗耐酸性良好。
2.3疫苗免疫效果评估
2.3.1分组及免疫
在河北省张家口市涿鹿县河东镇张各庄渔场进行室内养殖实验，渔场水温12～13℃，水质良好，流动；选用体内无抗体，10cm左右大小的虹鳟鱼进行实验。虹鳟鱼先在驯养一周，免疫前禁食12h，之后用MS-222对鱼体进行麻醉以减少免疫时的应激反应，之后将健康虹鳟鱼分为3组进行免疫，免疫完成后放入渔场正常饲养；初次免疫14天后同剂量加强免疫一次。其中分组免疫的方式为：第1组是微球疫苗组，采用0.1g/尾微球疫苗溶于400μL的PBS，灌喂方式口服免疫；第2组是M蛋白疫苗组，采用400μL M蛋白溶液灌喂方式口服免疫；第3组是对照组，采用400μL PBS灌喂方式口服免疫。
2.3.2虹鳟鱼血清中抗体效价的测定
2.3.2.1虹鳟鱼血清样品制备：正常饲养三周后，每组随机选取5尾虹鳟鱼，MS222对鱼体进行麻醉，剪开肌肉，从围心腔找到心脏，右手1mL无菌注射器拿针头从中间向左下扎针，拉注射器的时候避免太快，否则容易把静脉窦的膜吸在针头上；将收集到的血液转移至1.5mL无菌离心管中，4℃，12000rpm离心15min，收集上层血清，-20℃保存，制备得到虹鳟鱼血清样品。
2.3.2.2虹鳟鱼血清样品抗体效价的测定：按100、200、400、800、1600、3200、6400、12800倍比稀释虹鳟鱼血清样品，免疫血清为一抗BL21(pET-22b-m)表达产物为抗原，HRP标记的IgG为酶标二抗进行ELISA检测，具体结果见表5。实验结果显示，免疫三周后第1组和第2组的虹鳟鱼血清样品中抗体效价分别为1:6400，1:400。
表5 0.1g微球疫苗免疫组血清ELISA结果
注：P/N大于2.1判定为阳性
2.3.3保护率测定：将免疫后的3组虹鳟鱼放到发病的鱼池中进行感染试验，记录各组累计死亡数，按下式计算各组相对保护率RPS，具体结果见表6。
RPS(％)＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％
表6攻毒实验结果
实验结果显示，IHNV基因工程口服微球疫苗组的RPS为71.4％，M蛋白疫苗组的RPS为26.2％。
应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 河北师范大学
<120> 一种IHNV基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
acagttctga tccctcctcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gtctcctggg catagtagtc 20
<210> 3
<211> 509
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
acagttctga tccctcctcc ccacctcctc agcggagacg aggagagggt gacaatactc 60
agtgcagagg gggagatcaa ggtgactgga agaagaccaa ccacacttga ggagaagatc 120
tattactcta tgaatctggc ggctgccatc gtagggggag atctacaccc ctcattcaaa 180
tccatgacct atctgttcca gaaagagatg gagttcggaa gcacccaaga aaaagtcaac 240
ttcggatctc gaaaaccaga acctcagacc acctaccagg taatgaaggc gagggaagtc 300
taccttcaga cccagcctct cgagaagaag atcccaatgc agacctactc cgtcagcaca 360
gagggggcta ccatcacctt cacaggacgg ttcctgtttt catccagcca tgtaggttgc 420
gacgacaaca ggaccaaact ggcggggctt gatgggttca caacctccaa cagctaccag 480
agggtcaaag actactatgc ccaggagac 509

Claims (8)

1.一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1.1 表达载体pET-22b-m的构建
1.1.1 PCR扩增获得目的片段：取IHN患病虹鳟组织，分离IHNV，之后采用所述IHNV感染EPC细胞，之后提取EPC细胞的RNA，并以所述RNA作为模板，上游引物M-F和下游引物M-R为引物进行RT-PCR扩增反应，获得cDNA；再以所述cDNA为模板，以所述上游引物M-F和下游引物M-R为引物，使用TransTaq-T DNA聚合酶进行PCR扩增反应，获得目的片段；
1.1.2 目的片段和表达载体pET-22b的双酶切：将所述目的片段和表达载体pET-22b分别使用限制性内切酶Nde Ⅰ和HindⅢ进行双酶切获得两段双酶切产物，之后将所述两段双酶切产物分别进行回收，获得载体双酶切产物和目的片段双酶切产物；
1.1.3 双酶切产物连接：将所述载体双酶切产物和目的片段双酶切产物通过T4 DNA连接酶进行连接反应，获得表达载体pET-22b-m；
1.2 重组菌中M蛋白的表达及纯化
1.2.1 重组菌BL21(pET-22b-m)的制备：将所述表达载体pET-22b-m转化到E.coliBL21感受态细胞中，并将所述感受态细胞涂布到含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，获得重组菌BL21(pET-22b-m)；
1.2.2 M蛋白的诱导表达：将所述重组菌BL21(pET-22b-m)接种于含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养液中，37℃过夜活化；次日将所述过夜活化的菌液按体积比1％接种于含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养液中，37℃培养至OD600为0.4-0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度0.8mM，之后在26℃、180rpm条件下诱导表达6h；
1.2.3 重组菌株的超声破碎：用离心管收集诱导表达后的菌液，之后8000rpm，离心10min，弃上清，用滤纸将上清吸干，加生理盐水重悬沉淀获得重悬液；之后在冰浴中对所述重悬液进行超声破碎，所述超声破碎条件为功率400W，破5s，歇10s，至所述重悬液呈蛋清状，结束超声破碎过程；之后在4℃、14000rpm条件下离心10min，收集上清，即为待纯化菌液。
1.2.4 M蛋白的纯化：将所述待纯化菌液用Ni-NTA层析柱进行纯化，获得纯化后的M蛋白；
1.3 口服微球疫苗的制备：取10mL所述纯化后的M蛋白作为抗原，加入10mL2％的海藻酸钠搅拌混匀，再加入100mL大豆油，冰浴中8×103r/min搅拌10min充分乳化；再加10mL3％CaCl2溶液，冰浴中500r/min搅拌15～30min充分复乳化，之后4℃、4000g离心15min，弃上清，用75％酒精洗涤三次后收集沉淀，称为沉淀1；加30mL PBS重悬所述沉淀1，加30mL 1％壳聚糖，冰浴中500r/min搅拌2h，之后4℃、4000g离心15min，弃上清，用75％酒精洗涤三次后收集沉淀，称为沉淀2，并将所述沉淀2放到-80℃冰箱中预冷30min；将预冷后的所述沉淀2放入已预热30min的冷冻干燥机中，4℃真空冻干24h，即获得IHNV基因工程口服微球疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1.1中所述目的片段的大小为509bp。
3.根据权利要求1所述的一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1.1中所述PCR扩增反应的条件为94℃预变性5min；94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述的一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1.1中所述上游引物M-F的序列为5′-ACAGTTCTGATCCCTCCTCC-3′；所述下游引物M-R的序列为5′-GTCTCCTGGGCATAGTAGTC-3′。
5.根据权利要求1所述的一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1.3中所述连接反应的体系为载体双酶切产物13μL、目的片段双酶切产物2μL、5×T4Buffer 4μL、T4 DNA连接酶1μL。
6.一种IHNV基因工程口服微球疫苗，其特征在于，根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法制备获得。
7.一种IHNV基因工程口服微球疫苗，其特征在于，所述IHNV基因工程口服微球疫苗平均粒径为17.6μm，包封率为43.8％，载抗原量为6.02％，在PBS、0.75％NaCl、蒸馏水中的膨胀率分别为556.24％、602.16％、666.10％。
8.一种IHNV基因工程口服微球疫苗在IHNV在造血器官坏死病IHN防治领域的应用。
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