CN102688488A - 一种粘膜佐剂及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种粘膜佐剂，由壳寡糖与淋巴细胞趋化因子编码质粒共聚交联复合而成。本发明还公开了这种粘膜佐剂的制备方法和应用。本发明的粘膜佐剂，当与经壳聚糖或壳寡糖组装的基因疫苗共滴鼻免疫时，可诱导柯萨奇病毒特异性血清抗体和全身(脾脏和淋巴结)Th1型免疫应答；更重要的是，能诱导肠道粘膜局部增强的特异性分泌型sIgA和IFNγ+Th1应答，效果显著优于裸露的基因疫苗，并可有效预防柯萨奇病毒性心肌炎的发生。因此具有作为新型粘膜疫苗佐剂的潜力。

Description

一种粘膜佐剂及其制备和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种粘膜佐剂及其制备和应用，特别是一种壳寡糖递送系统组装的粘膜佐剂及其制备和应用。

背景技术

当前导致难以攻克的严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、结核分枝杆菌等均通过粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃肠道)入侵和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答，不能在感染第一时间和地点清除粘膜感染病原体，使病原体迅速扩散入血、进而侵犯全身，造成机体损伤；同时发展为慢性感染，导致严重疾病。

对于经粘膜感染病原体，如能诱导粘膜局部(呼吸道、胃肠道、生殖道)的特异性粘膜免疫应答，特别是sIgA的分泌，则可能在感染初期有效中和病毒或细菌，避免病原体入血而后感染全身器官，从而阻止严重疾病如病毒性心肌炎和慢性结核的发生。因此急需可诱导粘膜sIgA分泌的粘膜疫苗的研制。

已知常规疫苗如灭活、减毒疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗等等经常规途径(肌肉注射、皮下)免疫等通常不能诱导特异性粘膜免疫。无论疫苗的形式，通常靶抗原需要经粘膜部位接种，才能被粘膜APC摄取提呈，激活粘膜相关免疫系统(Mucus-associated lympho tissue，MALT)，诱导粘膜免疫。

然而，粘膜部位接种抗原通常很难诱导免疫应答，由于粘膜局部纤毛的频繁摆动、水解酶、DNA酶的大量存在，使得外来抗原迅速降解，不足以被粘膜APC提呈。因此需要通过粘膜递送系统来对疫苗进行组装，而后行粘膜免疫。

针对抗粘膜感染病原体粘膜疫苗研制的重要性，以及粘膜免疫的技术难点，粘膜疫苗首先必需安全和有效的粘膜递送系统，来递送靶抗原疫苗(如基因疫苗)。该系统应当满足：安全无毒性、缓释性、亲粘膜性、通用性；其次必需添加粘膜佐剂，有效增强粘膜免疫的诱导。

柯萨奇病毒性心肌炎主要由B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染所致，青壮年发病较高，可导致约50％的人类急慢性心肌炎和25％扩张性心肌病的发生，是一常见、多发的心血管系统疾病。CVB3属于肠道病毒，通过胃肠道入侵机体后，由于肠道sIgA不能在感染早期及时清除病毒，使病毒迅速扩散入血、进而侵犯心脏和胰腺等器官，导致病毒性心肌炎和胰腺炎；CVB3的持续性感染还可能导致致死性扩张性心肌病的发生，危害严重。目前尚无有效的柯萨奇病毒性心肌炎预防和治疗疫苗问世。

我们前期的研究制备了一种病毒性心肌炎基因疫苗pcDNA3.1-VP1(pVP1)，编码CVB3主要结构抗原VP1(852bp)，该疫苗经肌注免疫，可有效诱导全身性的(脾脏和淋巴结)的特异性T细胞应答和血清IgG分泌，具有中等的免疫保护效果。直接将该基因疫苗进行滴鼻免疫，发现仅能诱导较弱的粘膜免疫(肠道sIgA)，原因与基因在粘膜局部很容易被降解，有效表达的抗原量过低有关。因此我们前期研究以天然生物多糖-脱乙酰壳聚糖(chitosan)为粘膜递送载体介质，以特殊的壳聚糖溶液经与特定浓度的基因疫苗DNA，经共价复合，获得chitosan-pVP1病毒性心肌炎粘膜基因疫苗。该申请已被授予国家发明专利(专利授权号：ZL200710171416.X)。以该粘膜基因疫苗为研究出发点，为了更好地诱导特异性粘膜免疫，延长抗原在粘膜局部的潴留时间、增强粘膜局部对抗原的提呈，必须还要使用良好的粘膜佐剂。

淋巴细胞趋化因子(lymphotactin，LTN)是C族趋化因子，由活化的CD8⁺T细胞、NK细胞和表皮内γδT细胞分泌，在维持粘膜完整性和增强粘膜免疫中发挥重要作用。同时对CD8⁺T和NK细胞具有重要的趋化作用，因此对清除病毒感染至关重要。更为重要的是，LTN可激活粘膜及脾脏内CD4⁺T细胞，促使其分泌大量Th1或Th2细胞因子，有效辅助T细胞或B细胞免疫应答。因此LTN通过激活CD4⁺T细胞，可同时促进固有免疫与获得性免疫的诱导，同时又由于共同粘膜免疫系统性质，促进粘膜免疫和全身免疫的诱导。已有研究显示LTN与蛋白质抗原联合鼻内注射后增加sIgA分泌。因此，本发明选择LTN作为粘膜佐剂，利用其趋引T细胞到达疫苗给予粘膜部位、促进CD4+Th应答等性质，来增强特异性粘膜免疫应答的诱导。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种粘膜佐剂及其制备和应用，所述的这种粘膜佐剂配合其他疫苗进行粘膜部位(滴鼻、口服、经生殖道等)免疫，要解决现有技术中由于常规疫苗无法有效诱导粘膜免疫应答的技术问题。

本发明提供了一种粘膜佐剂，由壳寡糖与编码质粒共聚交联复合而成，所述的编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有小鼠来源的淋巴细胞趋化因子的全长基因，所述的淋巴细胞趋化因子的全长基因序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒或pVAX1质粒中的任意一种。

进一步的，所述的小鼠来源的淋巴细胞趋化因子的氨基酸序列SEQ IDNO：2所示。

进一步的，所述的壳寡糖的分子量在3000～6000之间，脱乙酰度在75％-85％之间。

本发明还提供了上述的一种粘膜佐剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建小鼠来源的淋巴细胞趋化因子编码质粒；

(2)一个制备浓度为0.1～0.4％、PH5.2-5.5的壳寡糖溶液的步骤；

(3)将上述的壳寡糖溶液与浓度为18～25μg/ml、溶解在缓冲液中的编码淋巴细胞趋化因子的质粒DNA溶液在55-60℃下，以15000-17000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用获得粘膜佐剂，所述的粘膜佐剂的形状为球形，直径在250～350nm之间。

进一步的，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的粘膜佐剂以及药学上接受的载体或者赋形剂。

本发明还提供了上述的一种粘膜佐剂在制备预防或治疗病毒性心肌炎、或者结核病的药物或疫苗中的应用。

本发明的疫苗可以以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种。

佐剂是配合疫苗联合使用的非特异性免疫增强剂，通过以适当的方法混合或者联合使用，可有效增强疫苗的免疫效果。

进一步的，所述的粘膜佐剂的粘膜免疫方法如下：

1)将壳寡糖-pLTN粘膜佐剂纳米颗粒先行滴鼻或口服免疫，pLTN质粒量为50～100μg。

2)24小时后，将壳聚糖/壳寡糖-靶抗原纳米颗粒在同一部位，以滴鼻或口服方式免疫。靶抗原质粒量为50～100μg。

3)间隔1～3周，重复1)+2)的组合免疫。

4)经3-4次1)+2)的组合免疫，靶抗原DNA总量约150～200μg，可有效诱导血清IgG和粘膜局部(肠道、呼吸道等)sIgA的分泌。

本发明采用的壳寡糖(oligo-chitosan)，是甲壳类动物来源的天然生物多糖几丁质(chitin)的脱乙酰衍生物。

chitin(几丁质，N-乙酰氨基葡萄糖多聚体)是一种广泛存在于虾、蟹外壳中的天然多糖。chitin与DNA复合可生成不溶于水的微米颗粒(microparticle)，是一种强效的巨噬细胞激活剂，并上调Th1型细胞免疫。

脱乙酰壳多糖(chitosan，化学名为β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖)是几丁质(chitin)的脱乙酰衍生物，分子量从120000～400000，完全无毒，具有生物可容性和生物可降解性。chitosan天然带正电荷，可与带负电荷的粘膜或质粒DNA通过静电天然吸附，因此具有增强粘膜黏附吸收作用；此外还具有促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被广泛用于药物赋形剂与缓释剂。

壳寡糖(oligo-chitosan)又名壳聚糖寡糖(chitosan oligosaccharide)，由壳聚糖(chitosan)经酶解或水解制得，成分为3～10个β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖寡糖。其最大的特点是具有水溶性，使容易被肠道吸收。此外，它具有激活巨噬细胞、T、NK细胞，诱导TNF-α、活性氮、氧中间体(ROI、RNI)产生的特性，因此具有增强Th1型细胞免疫应答和抗胞内病毒或细菌感染潜能。

以合适分子量和脱乙酰度的壳寡糖与质粒DNA在特定的浓度、温度、pH值、振荡速度条件下，可形成大小不一的共聚复合物。本发明以特定性质的壳寡糖制备特定溶液，与特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制备了直径在250-350nm的纳米颗粒复合物。选择0.4％浓度、PH.5.5的壳寡糖(分子量约3000-6000，脱乙酰度75％～85％)溶液，与25μg/ml编码靶抗原的质粒DNA(pcDNA3.1-pLTN)溶液(10mM PBS)，在55℃下，以15000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用，制备了壳寡糖-粘膜佐剂DNA(pLTN)纳米颗粒。经冷冻干燥，置-70℃冻存备用。使用时以无菌PBS溶解，使DNA浓度为1mg/ml。

本发明中，将oligo-chitosan-pLTN粘膜基因疫苗免疫小鼠的方法采用滴鼻方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行：以常规小鼠麻醉方法轻度麻醉小鼠，将小鼠鼻孔向上，以枪头吸取＜20μl液体直接逐滴滴入鼻腔内，待液滴随小鼠呼吸自主进入呼吸道后，再滴下一滴液体。可交替滴入两个鼻孔。液体总体积不宜超过50μl。

本发明中，所述的真核表达质粒的载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于：pcDNA3.1、pVAX以及常见和市售的真核质粒载体。

本发明中，“药学上接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、变态反应)、有合理效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于：水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。

本发明的药物组合物，含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，pH值通常约5-8。

综上所述，本发明的一种壳寡糖递送系统组装的通用粘膜佐剂，具有以下三大特性：

1)其核心是一种佐剂质粒载体，编码小鼠来源的淋巴细胞趋化因子(lymphotactin，LTN)基因。

2)通过具有特定化学性质的有市售的壳寡糖(oligo-chitosan)，与上述pLTN质粒DNA形成共聚复合物后，再通过粘膜途径接种该粘膜佐剂，具有安全无毒性、缓释性、亲粘膜性等多种优势，可促进粘膜局部抗原提呈细胞和T细胞等的激活。

3)该通用粘膜佐剂通过优化免疫途径、免疫程序、免疫剂量、间隔时间，与壳聚糖/壳寡糖系统递送的靶抗原基因疫苗(如病毒性心肌炎基因疫苗chitosan-pVP1或者结核基因疫苗chitosan-pECANS)共同免疫后，能有效增强全身和粘膜部位的sIgA抗体和T细胞应答。

申请人以已获得授权的基于壳聚糖(chitosan)的病毒性心肌炎基因疫苗(一种病毒性心肌炎基因疫苗及其制备方法和应用。专利授权号：ZL200710171416.X)为基础，选择淋巴细胞趋化因子(lymphotactin，LTN)为佐剂，以壳聚糖的衍生物------具有特定性质的天然多糖------壳寡糖(oligo-chitosan)作为新的粘膜佐剂递送载体介质，通过共聚沉淀的方法与LTN编码质粒形成壳寡糖-pLTN纳米颗粒复合物，制备新型粘膜佐剂。实际应用时，将壳寡糖-粘膜佐剂复合物与壳聚糖/壳寡糖-靶抗原质粒复合物疫苗(如chitosan-pVP1病毒性心肌炎基因疫苗)进行共免疫，证实可显著增强粘膜局部粘膜免疫应答(sIgA，T细胞免疫)的诱导，可显著增强了以往发明的壳聚糖-基因疫苗的免疫保护效果。

本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明的oligo-chitosan-pLTN通用粘膜佐剂通过滴鼻免疫，并与chitosan-pVP1病毒性心肌炎基因疫苗共免疫后，可有效诱导针对VP1抗原特异性全身(脾脏和淋巴结)特异性Th1性免疫应答和抗体应答；更重要的是，显著增强了肠道粘膜局部分泌性sIgA和分泌IFNγ的Th1应答，效果显著优于未给予粘膜佐剂的chitosan-pVP1基因疫苗，可使免疫小鼠更加有效抵抗CVB3感染，不发生病毒性心肌炎。

附图说明

图1是pVP1质粒的构建示意图(A)和pVP1质粒的PCR及酶切鉴定电泳图(B)；其中M为DNA marker；1为pcDNA3-VP1经HindIII/BamHI双酶切；2～5分别为PCR鉴定，2：T7u/T7d引物；3：KV1/KV2引物；4：T7-1/KV2引物；5：KV1/T7-2引物。

图2显示了pVP1质粒的体外表达和趋化活性，显示了pVP1质粒体外转染293T细胞后表达产物的western Blot鉴定(33KD)。

图3显示了pLTN质粒的构建示意图(A)和pLTN质粒的PCR及酶切鉴定电泳图(B)；其中1：Marker，2：ConA活化脾细胞RT-PCR扩增LTN，3：pcDNA3.1-LTN PCR扩增LTN，4：pcDNA3.1-LTN经BamH I和Xho I双酶切，5：pcDNA3.1-LTN经BamH I单酶切，6：pcDNA3.1经BamH I和Xho I双酶切鉴定。

图4显示了pLTN质粒体外转染293T细胞后表达产物的western Blot鉴定(14KD)。

图5显示了pLTN质粒表达产物的体外趋化功能。

图6显示了壳寡糖(oligo-chitosan)与pLTN质粒形成的共聚复合物的示意图。

图7是壳寡糖(oligo-chitosan)-pLTN纳米颗粒的扫描电镜照片。

图8是壳聚糖(chitosan)-pVP1纳米颗粒的扫描电镜照片。

图9显示了chitosan-pVP1靶抗原纳米颗粒联合oligo-chitosan-pLTN粘膜佐剂滴鼻免疫诱生的CVB3特异性血清IgG。

图10显示了chitosan-pVP1靶抗原纳米颗粒联合oligo-chitosan-pLTN粘膜佐剂滴鼻免疫诱生的CVB3特异性肠道sIgA。

图11显示了chitosan-pVP1靶抗原纳米颗粒联合oligo-chitosan-pLTN粘膜佐剂滴鼻免疫诱生的脾脏淋巴细胞CVB3特异性IFNγ+Th1细胞应答。

图12显示了chitosan-pVP1靶抗原纳米颗粒联合oligo-chitosan-pLTN粘膜佐剂滴鼻免疫诱生的肠系膜淋巴结CVB3特异性IFNγ+Th1细胞应答。

图13显示了3×LD₅₀剂量CVB3感染小鼠7天后小鼠心肌组织的心肌炎病理情况，其中A代表chi-VP1+oligo-chitosan-LTN i.n；B代表chi-VP1+oligo-chitosan i.n；C代表pcDNA3-VP1 i.n；D代表pcDNA3.1 i.n。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。

实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：

CVB3(Nancy株)由中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室杨英珍教授惠赠。质粒pcDNA3.1(-)、pVAX、宿主细菌DH5α(Invitrogen公司)。基因合成(上海赛百盛公司)。oligo-chitosan(分子量在3000～6000之间，脱乙酰度为75％-85％)购自合肥博美生物有限公司、小鼠IFN-Y ELISA检测试剂盒购自R&D公司；HRP标记羊抗小鼠IgG/IgA多克隆抗体(SouthernBiothech公司)；多肽委托上海吉尔公司合成、Lipofectamin-2000购自invitrogen公司。限制性核酸内切酶HindIII、BamHI、Xho I、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP(TaKaRa公司)；RNase A(Ameresco公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜公司)，大量质粒抽提试剂盒(Qiagen)。6-8周龄雄性BALB/c(H-2^d)小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。

实施例1  pcDNA3.1-pVP1靶抗原基因疫苗的构建及体外表达

1)自新鲜培养的CVB3中经RT-PCR获得CVB3 VP1基因。根据文献报道的CVB3 Nancy毒株VP1 cDNA序列(Klump WM，et al.Completenucleotide sequence of infectious Coxsackievirus B3 cDNA J Virol，1990，64(4)：1573)，设计VP1上下游引物：KV1：5′-CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCCAGTGGAAGACGCG-3′；KV2：5′-CGGGATCCTTACTAAAATGCGCCCGTATTTGTC-3′。并合成pcDNA3.1载体中克隆位点上下游引物T7-1：5′-CGATGAAGATCTCT-3′；T7-2：5′-CGATGAAGATCTCT-3′。按上海华舜生物公司RNAex Reagent&System Kit提取液相病毒RNA。按上海生工生物公司2-N First Strand cDNA SynthesisKit进行逆转录获得cDNA。随后以KV1、KV2引物进行特异PCR，产物即为VP1基因，长度为852bp(图1)。以Golden Beads DNA Gel PurificationKit纯化回收，回收DNA以HindIII、BamHI双酶切，而后与经同样双酶切的pcDNA3.1连接。分别经PCR、酶切和DNA测序鉴定。以T7-1/T7-2为正反向引物获得1067bp片段；以KV-1/KV-2为正反向引物PCR扩增可得到884bp条带。以Hind III和Bam HI对pcDNA3.1-VP1进行双酶切，可切出877bp条带。最终由上海申友DNA测序服务中心进行DNA测序鉴定，证实构建正确。

2)pcDNA3-VP1的体外表达：以Lipofactamine ^TM-2000辅助pcDNA3-VP1质粒转染293T细胞：2ul Lipofectamine^TM与45μl 1640混匀室温5min，1μg质粒DNA与50μl 1640混匀室温5min，二者混匀，室温20min；将100μl DNA-Lipofectamine^TM-2000复合物逐滴加入细胞上。37℃6％CO₂培养。收集72小时细胞培养上清，经SDS-PAGE分离蛋白表达产物，转膜，而后以抗VP1特异性抗体孵育并染色，结果显示：pcDNA3.1-pVP1质粒可在体外有效表达，表达产物为33KD(图2)。

实施例2  pcDNA3.1-LTN粘膜佐剂质粒的构建和体外表达

1)自ConA活化的小鼠脾细胞经RT-PCR获得LTN基因。取正常BALB/c小鼠脾脏5×10⁶个，抽提细胞总RNA。按上海生工生物公司2-N First StrandcDNA Synthesis Kit进行逆转录获得cDNA。根据NCBI GeneBank中LTN的基因序列(NM_008510.1)，设计LTN上下游引物：LTN-1：5′-5’CGGGATCCGCCACCATGAGACTTCTCCTCCT-3’其5’端添加BamH I酶切位点；LTN-2：5′-CCGCTCGAGGGAGGCTGTTACCCAGT-3’其3’端添加Xho I酶切位点。以上述引物行PCR，获得趋化因子Ltn编码基因(376bp)(图3)。RT-PCR产物以Golden Beads DNA Gel Purification Kit纯化回收，以BamHI、Xho I双酶切，与经同样双酶切的pcDNA3.1连接。以Ltn-1/Ltn-2引物可扩增得到376bp条带；以Xho I和Bam HI对pcDNA3.1-LTN进行双酶切，可切出369bp条带；最终由上海申友DNA测序服务中心进行DNA测序鉴定，证实构建正确。

2)pcDNA3-LTN的体外表达：以Lipofactamine^TM-2000辅助转染pcDNA3-LTN质粒转染293T细胞：37℃6％CO₂培养。收集72小时细胞培养上清，经SDS-PAGE分离蛋白表达产物，转膜，而后以抗LTN特异性抗体孵育并染色，结果显示：pcDNA3.1-pLTN质粒可再体外有效表达，表达产物为14KD(图4)。

实施例3  pcDNA3.1-LTN粘膜佐剂质粒表达产物的体外趋化活性

将稳转pcDNA3.1-LTN上清以PEG20000浓缩20-25倍，加入48孔趋化池(美国Neuro probe公司)中；5μm滤膜覆盖在小室上，将45μl正常脾细胞悬液(2*10⁶/ml)加入上室中孵育4小时。取出滤膜，瑞氏姬姆萨染色，计数趋化细胞并计算趋化指数(CI)。结果显示：pcDNA3.1-LTN稳转293T细胞上清可有效趋化脾细胞跨膜移动，CI＝2.875；而对照pcDNA3.1质粒转染上清或正常细胞上清则无趋化活性，CI＜1。当用抗LTN中和性抗体预先与转染上清孵育后，趋化活性显著被抑制，CI＝1.05，提示LTN表达产物具有较好的特异性趋化脾脏免疫细胞活性(图5)

实施例4  壳寡糖(oligo-chitosan)-pLTN粘膜佐剂纳米颗粒的制备

1)质粒DNA的大量制备：依照QIAGEN Plasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。

2)分别制备oligo-chitosan溶液和pcDNA3.1-LTN溶液，方法如下：首先制备0.4％、pH5.5的oligo-chitosan溶液，称取0.4g壳寡糖oligo-chitosan(MW约3000-6000，脱乙酰度75％-85％)，先以100ml 10mM的PBS将其缓慢溶解，37℃放置1hr。0.4μm的滤膜过滤而后保存备用。pcDNA3.1-pLTN质粒以10mM PBS溶解，DNA浓度为25μg/ml，-20℃保存备用。

3)共沉淀法(共凝聚法)制备oligo-chitosan-DNA纳米颗粒，方法如下：在55℃水浴中，将0.4％、pH5.5的oligo-chitosan溶液逐滴滴入25ug/ml质粒DNA溶液中，同时15000rpm高速振荡30秒，即可形成均一略带混浊的oligo-chitosan-DNA纳米颗粒(图6)。扫描电镜证实该复合物颗粒的直径约为250-350nm(图7)。而后将该溶液冷冻干燥，继而用无菌PBS溶解为1mg/ml的浓度，按50μgDNA/50ul的量滴鼻免疫小鼠。

实施例5  壳聚糖(chitosan)-VP1纳米颗粒的制备

1)首先制备0.02％、pH5.7的chitosan溶液，称取0.02g chitosan(Fluka，MW＝400000，脱乙酰度75％-85％)，先以500μl～1ml 1％HAc溶液将其缓慢溶解，37℃放置1hr。而后称取0.042g NaAc，以80ml H₂O溶解，加入上述已彻底溶解的chitosan溶液，混匀后，以1N NaOH调节pH值至5.7等，此即0.02％、pH5.7的chitosan溶液。pcDNA3.1-VP1质粒以5mM Na₂SO₄溶解，DNA浓度为1mg/ml，-20℃保存备用。

2)采用共沉淀法(共凝聚法)制备chitosan-DNA纳米颗粒，方法如下：在55℃水浴中，将0.02％、pH5.7的chitosan溶液逐滴滴入400ug/ml质粒DNA溶液中，同时15000rpm高速振荡20秒，即可形成均一略带混浊的chitosan-DNA纳米颗粒。

3)以扫描电镜观察新鲜制备的chitosan-VP1共凝聚复合物，发现新鲜制备的溶液均匀分布球型、形态均一的颗粒，直径约为150～250nm(图8)。

实施例6  壳寡糖-pLTN粘膜佐剂与壳聚糖-pVP1病毒性心肌炎粘膜基因疫苗共同滴鼻免疫BALB/c小鼠

将6-8周龄BALB/c雄鼠分为4组，分别为：chitosan-pVP1+oligo-chitosan-pLTN、chitosan-pVP1+oligo-chitosan、pcDNA3.1-pVP1(简称pVP1)、pcDNA3.1组，每组8只小鼠。滴鼻免疫程序如下：以0.75％戊巴比妥钠80-120μl经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉。以含有50μg质粒DNA的复合物溶液逐滴滴入小鼠两侧鼻腔。先以oligo-chitosan-pLTN纳米颗粒或oligo-chitosan溶液滴鼻免疫小鼠；24小时后，将含50μg质粒DNA的chitosan-pVP1纳米颗粒或pVP1质粒滴鼻免疫小鼠。以该程序于0周、2周、4周、6周四次滴鼻免疫小鼠。隔周采集血液及粪便样品。经眼眶后眦静脉采血，37℃静置30min，4000rpm×10min，收集血清，分装冻存于-70℃。隔周收集小鼠新鲜粪便，以100mg/ml浓度溶解于含5％脱脂牛奶、1ug/mlaprotinin、1mM PMSF的PBS溶液中，室温放置1～2hr，以15000rpm/min离心10min后分装200μl/管，-70℃冻存。

实施例7壳寡糖-pLTN粘膜佐剂与壳聚糖-pVP1病毒性心肌炎粘膜基因疫苗滴鼻免疫可增强特异性sIgA抗体应答

1)间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异IgG水平。以10μg/ml CVB4VP_1237～249多肽(0.1％BSA，0.1M Na₂CO₃，pH9.6包被液)包被聚苯乙烯微孔板(costar)4℃过夜。以5％milk-PBS封闭板，200μl/孔，37℃2h。依次加1∶100；1∶1000稀释血清及粪便溶液原液、100μl/孔，37℃2h，洗板后加HRP-羊抗小鼠IgG、IgA 37℃1h，洗板后以TMB显色15min，2N H₂SO₄终止反应后测A₄₅₀值。

chitosan-VP1联合oligo-chitosan-LTN组在4周即可诱生了较高水平的特异性IgG，第6周OD值达0.82，且随时间推移IgG水平逐渐升高，抗体水平在第10周时达1.2。而单独chitosan-VP1仅在第6周开始诱生血清IgG，且OD为0.46，第10周IgG水平达0.8，明显低于前者。

2)粪便中sIgA的分泌代表肠道局部粘膜分泌型抗体的诱导。发现：仅有壳聚糖组装的pVP1基因疫苗诱导了sIgA分泌。单独chitosan-pVP1组第8周OD值，最高为0.68；而oligo-chitosan-pLTN粘膜佐剂共免疫诱导的sIgA效价水平显著增高，第10周达到0.96，显著高于其他组(图9，p＜0.05)。总之，壳寡糖-pLTN粘膜佐剂滴鼻免疫有助于粘膜疫苗诱导增强的特异性全身和粘膜抗体应答。提示oligo-chitosan-LTN粘膜佐剂辅助chitosan-pVP1联合免疫，不仅可诱生高水平血清IgG，还增强chitosan-VP1粘膜疫苗诱导的肠道sIgA，可有效发挥粘膜佐剂效果(图10)。

实施例8  壳寡糖-pLTN粘膜佐剂与壳聚糖-pVP1病毒性心肌炎粘膜基因疫苗滴鼻免疫可增强特异性粘膜局部(肠道)Th1免疫应答

取末次免疫后2周小鼠脾脏及肠系膜淋巴结(MLN)细胞制备单细胞悬液，体外以10μg/ml重组VP1蛋白刺激培养48h，行IFN-γ的ELISPOT检测。如图11、12所示：chitosan对照组仅产生极少量的IFN-γ分泌T细胞；chi-pVP1组分别在脾脏和MLN淋巴细胞中产生了260和148个IFN-γ分泌T细胞(P＜0.05)；chi-pVP1+oligo-chi-pLTN共免疫组IFN-γ生成T细胞数量最多，脾脏和肠系膜淋巴结中每10⁶个淋巴细胞可形成354个和224个斑点，与其它组相比具有统计学差异(P＜0.05)。提示滴鼻给予粘膜佐剂oligo-chi-pLTN促进了全身及粘膜部位Th1免疫应答的产生。

实施例9  粘膜佐剂oligo-chitosan-LTN可显著增强病毒性心肌炎粘膜疫苗chitosan-pVP1预防柯萨奇病毒性心肌炎的效果

将上述各疫苗分别免疫20只BALB/c小鼠，末次疫苗免疫后2周，以致病毒性心肌炎感染剂量3xLD50活CVB3病毒100ul经腹腔感染小鼠，7天后取小鼠左心室，制备石蜡切片，HE染色后以普通光镜观察其组织病理学改变。心肌细胞HE染色显示：未免疫小鼠和chitosan-pcDNA3.1对照组小鼠心肌细胞呈严重的灶性坏死，伴弥漫性淋巴细胞浸润，显示显著的柯萨奇病毒性心肌炎。chitosan-VP1滴鼻小鼠的心肌细胞间质偶尔见有水肿，心外膜有少量炎性浸润，病毒性心肌炎发病率约为16％；而chitosan-VP1联合粘膜佐剂oligo-chitosan-LTN纳米颗粒滴鼻免疫组仅5％小鼠发病，发病程度非常轻微，其余小鼠心肌几乎和正常小鼠一样，提示可95％有效预防病毒性心肌炎的发生(图13)。

Claims (8)

1.一种粘膜佐剂，其特征在于：由壳寡糖与编码质粒共聚交联复合而成，所述的编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有小鼠来源的淋巴细胞趋化因子的全长基因，所述的淋巴细胞趋化因子的全长基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种粘膜佐剂，其特征在于：所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒或pVAX1质粒中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的一种粘膜佐剂，其特征在于：所述的小鼠来源的淋巴细胞趋化因子的氨基酸序列SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的一种粘膜佐剂，其特征在于：所述的壳寡糖的分子量在3000～6000之间，脱乙酰度在75％-85％之间。

5.根据权利要求1所述的一种粘膜佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)一个构建小鼠来源的淋巴细胞趋化因子编码质粒的步骤；

(2)一个制备浓度为0.1～0.4％、PH5.2-5.5的壳寡糖溶液的步骤；

(3)将上述的壳寡糖溶液与浓度为18～25μg/ml、溶解在缓冲液中的编码淋巴细胞趋化因子的质粒DNA溶液在55-60℃，以15000-17000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用获得粘膜佐剂，所述的粘膜佐剂的形状为球形，直径在250～350nm之间。

6.根据权利要求5所述的一种粘膜佐剂的制备方法，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

7.一种药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求1所述的粘膜佐剂以及药学上接受的载体或者赋形剂。

8.权利要求1所述的一种粘膜佐剂在制备预防或治疗病毒性心肌炎、或者结核病的药物或疫苗中的应用。

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