CN115975953A - 编码禽流感h5n1 ha的新城疫病毒及其在制备生物佐剂二联疫苗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了编码鸡禽流感HA的鸡新城疫病毒株及其在制备新型生物佐剂二联疫苗中的应用。本发明提供的新城疫重组病毒rClone30‑HA‑chGM‑CSF；新城疫重组病毒rClone30‑HA‑chGM‑CSF中HA如下(a)或(b)：(a)由序列1第1‑567位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质；新城疫重组病毒rClone30‑HA‑chGM‑CSF中chGM‑CSF为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列3自N末端第1‑144位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；本发明提供的不同位点的新城疫重组病毒rClone30‑HA‑chGM‑CSF，具有诱导机体在免疫后7天产生抗体、增强机体的免疫应答和预防效果好等优点，将在鸡新城疫和鸡禽流感的预防史上开辟了一个新的局面。
Description
技术领域
本发明涉及编码禽流感H5N1 HA的鸡新城疫病毒株及其在制备生物佐剂二联疫苗中的应用。
背景技术
新城疫病(Newcastle Disease，ND)，又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒(NewcastleDisease Virus，NDV)引起的一种禽类高度接触性和急性败血性的传染病，是严重危害世界养禽业的重大烈性传染病之一。NDV几乎可以感染所有禽类，病鸡是该病的主要传染源，鸡感染后临床症状出现前24h，其口、鼻分泌物和粪便就有病毒排出。病毒存在于病鸡的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。在流行间歇期的带毒鸡，也是本病的传染源。鸟类也是重要的传播者。病毒可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。该病一年四季均可发生，但以春秋季较多。鸡场内的鸡一旦发生本病，可于4-5d内波及全群。
禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性、接触性呼吸道传染病。禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为A型流感病毒，属于正黏病毒科流感病毒属成员，根据致病力的不同，可分为低致病性禽流感病毒(LPAIV)和高致病性禽流感病毒(HPAIV)。目前，H5和H9亚型是我国养禽场主要禽流感，对养禽业的威胁严重，能够引起严重的传染病，给禽类养殖生产造成极大损失。其中，H5N1亚型为HPAIV，可感染禽类和鸟类，一些毒株也可以跨宿主感染人类及其他的哺乳动物，禽流感不仅严重影响了家禽养殖业的健康发展，还对人类公共卫生安全带来了严重威胁。
血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白是AIV表面的糖蛋白是刺激机体引起免疫应答的主要抗原性蛋白，不仅能诱导中和抗体的产生，而且也能诱导细胞免疫应答反应。HA蛋白作为禽流感病毒的主要靶抗原，是开发禽流感疫苗的首选蛋白。本研究利用新城疫病毒表达系统表达了禽流感病毒的HA蛋白，制备了禽流感基因工程亚单位疫苗，并初步评估了其免疫效果。
目前，预防新城疫和禽流感的主要方法是接种疫苗。新城疫的弱毒疫苗使用方便且能够诱导体液免疫和局部黏膜免疫，在国内外被普遍应用。禽流感主要是用灭活疫苗或者亚单位疫苗。然而，这些疫苗常常需要在首次接种后的14天左右才能产生相应保护抗体，即存在免疫空白期。如果新城疫或者禽流感一旦爆发在疫苗接种的免疫空白期，鸡群将无法得到有效的免疫保护。因此，在新城疫和禽流感的预防工作中，迫切需要可以刺激机体快速产生抗体从而缩短免疫空白期的高效且安全的新型弱毒疫苗。
本发明通过在新城疫疫苗基因组中引入生物佐剂基因(chGM-CSF)和在不同位点中引入禽流感病毒的HA基因，可以有效提高疫苗的免疫效果，极大缩短免疫空白期，提高免疫保护率，同时选择的插入位点并不影响重组病毒的工业生产性能。我们也可以将插入佐剂chGM-CSF基因的新城疫疫苗基因组中，按照插入禽流感病毒HA基因的方式，制备可以预防鸡的其他病毒传染性疾病，比如禽痘、鸡传染性支气管炎等。
发明内容
本发明的目的之一：提供编码禽流感病毒HA的新城疫重组病毒rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)(将禽流感病毒的HA基因和chGM-CSF这种生物佐剂以HA-IRES-chGM-CSF的方式插入到新城疫经典疫苗株Lasota的P和M基因之间)和rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)(将chGM-CSF这种生物佐剂插入到新城疫经典疫苗株Lasota的NP基因和禽流感病毒的HA基因插入到新城疫经典疫苗株Lasota的P和M基因之间)。
本发明的目的之二：提供了不同位点的重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF在预防鸡新城疫和禽流感方面的应用。疫苗免疫鸡群后，可以使鸡快速产生抗体，将免疫空白期从14天缩短为7天，弥补了现有新城疫和禽流感疫苗产生抗体时间过长的缺点。同时亦可增强疫苗的免疫效果。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF及其基因组核苷酸序列、蛋白质序列和HA基因插入新城疫重组病毒rClone30-chGM-CSF的方式，以及其产品在预防新城疫和/或禽流感均为本发明的保护范围。
本发明构建的新城疫重组病毒rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其P基因和M基因之间插入HA-IRES-chGM-CSF基因(如图5A)；构建的新城疫重组病毒rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其NP基因插入chGM-CSF基因和其P基因和M基因之间插入HA基因(如图5B)。所述新城疫重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF中HA为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1自N末端第1-567位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的重组病毒均在本发明的保护范围内；所述新城疫重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF中chGM-CSF为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列3自N末端第1-144位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的重组病毒均在本发明的保护范围内；
编码所述新城疫重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF的HA和chGM-CSF基因也属于本发明的保护范围。
所述基因中，编码所述HA的DNA分子为如下(1)或(2)或(3)：(1)序列表的序列2自5’末端第1-1704位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
编码所述chGM-CSF的DNA分子为如下(4)或(5)或(6)：(4)序列表的序列4自5’末端第1-432位核苷酸所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组病毒均属于本发明的保护范围。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF的相关制剂为本发明保护的范围。
本发明构建的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，其相应制剂，如：冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等，均属本专利保护范围。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF及其基因组核苷酸序列和蛋白质序列为本发明的保护范围。
所述的不同位点的新城疫重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF在预防新城疫和禽流感病方面的应用为本发明保护范围。
所述的新城疫重组病毒rClone30-chGM-CSF在预防鸡其他病毒传染性疾病方面的应用为本发明保护范围。
本发明提供了编码鸡禽流感病毒HA的新城疫重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF，免疫7天后，rClone30-HA-chGM-CSF和rClone30-GM-CSF组产生抗NDV抗体水平高出对照组rClone30组和对照组。表明rClone30-HA-chGM-CSF疫苗免疫可在早期先于rClone30和rClone30-HA疫苗株刺激鸡体内产生抗体并同时增强了体液免疫水平，提高攻毒保护效率。
附图说明
图1为反向遗传操作系统拯救出的不同位点的rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)病毒血凝(HA)和rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)病毒血凝(HA)。
图2为利用RT-PCR方法鉴定不同位点的rClone30-HA-chGM-CSF外源基因HA的表达。图A为rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)的HA基因片段；图B为rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)的HA基因片段。
图3为利用Western Blot检测不同位点的rClone30-HA-chGM-CSF感染DF-1细胞后的细胞上清中的外源蛋白的表达。rClone30为rClone30感染细胞对照组。
图4为实验SPF鸡只免疫rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)、rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)、rClone30-HA、rClone30-GM-CSF和rClone30后不同时间点抗NDV抗体水平和抗HA抗体水平。图A为rClone30-HA-chGM-CSF病毒的抗NDV抗体水平；图B为rClone30-HA-chGM-CSF病毒的抗HA抗体水平。
图5为构建的不同位点的重组病毒rClone30-HA-chGM-CSF结构示意图。图A为rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)结构示意图；图B为rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)结构示意图。
具体实施方案：
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：不同位点的pBrClone30-HA-chGM-CSF的构建和鉴定
1.1pBrClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)的构建和鉴定
利用overlap PCR将HA、IRES与chGM-CSF基因连接在一起，采用凝胶回收试剂盒回收片段，与T载体连接，构建重组质粒HA-IRES-chGM-CSF-T。利用Sac II和Pme I对HA-IRES-chGM-CSF-T和pBrClone30进行双酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将HA-IRES-chGM-CSF片段与pBrClone30载体相连，构建重组质粒pBrClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)。
1.2pBrClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)的构建和鉴定
利用Sac II和Pme I对pUC18-chGM-CSF和pBrClone30进行双酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将chGM-CSF片段与pBrClone30载体相连，构建重组质粒pBrClone30-chGM-CSF。
PCR IRES-HA基因和利用Aat II和Apa I对pBrClone30-chGM-CSF进行酶切。采用凝胶回收试剂盒分别回收片段和载体，将IRES-HA片段与pBrClone30-chGM-CSF载体利用同源重组试剂盒相连，构建重组质粒pBrClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)。
实施例2：不同位点的rClone30-HA-chGM-CSF的拯救、HA检测以及RT-PCR鉴定
2.1rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)的拯救：将重组NDV rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)与三种辅助质粒pTM-NP、pTM-P和pTM-L共转染BHK-21细胞。转染72h后，收获转染细胞上清，反复冻融3次，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。恒温培养72h后，收获鸡胚尿囊液，离心后进行鸡血红细胞凝集(HA)。取结果呈阳性的尿囊液连续用SPF级鸡胚传代3次后混合。
经HA检测，结果显示，图1：HA效价为256。将成功拯救重组病毒rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)。
RT-PCR鉴定：以尿囊液提取RNA反转录的cDNA为模板，使用PCR的方法扩增HA基因片段。结果如图2A所示，扩增片段大小约为1700bp，与预期相符。证明从cDNA克隆成功拯救出具感染性的NDV病毒为rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)。
2.2rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)的拯救：将重组NDV rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)与三种辅助质粒pTM-NP、pTM-P和pTM-L共转染BHK-21细胞。转染72h后，收获转染细胞上清，反复冻融3次，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。恒温培养72h后，收获鸡胚尿囊液，离心后进行鸡血红细胞凝集(HA)。取结果呈阳性的尿囊液连续用SPF级鸡胚传代3次后混合。
经HA检测，结果显示，图1：HA效价为256。将成功拯救重组病毒rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)。
RT-PCR鉴定：以尿囊液提取RNA反转录的cDNA为模板，使用PCR的方法扩增HA基因片段。结果如图2B所示，扩增片段大小约为1700bp，与预期相符。证明从cDNA克隆成功拯救出具感染性的NDV病毒为rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)。
实施例3：Western blot检测外源基因HA的表达量
将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，鸡胚接种尿囊液病毒以DMEM适当倍数稀释，以0.1MOI的重组rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)、rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)和rClone30分别感染细胞，37℃，孵育1h后用DMEM洗涤三遍，然后加入完全DMEM继续培养。48h后反复冻融3次，取细胞上清检测外源基因HA的表达量。制备样品进行15％SDS-PAGE分析，电泳完成后，将目的条带转至硝酸纤维素膜(NC膜)上，快速封闭液封闭NC膜10min，洗涤NC膜；以1：2000的比例稀释鼠抗HA多克隆抗体，37℃孵育1h，洗涤NC膜；以1：7500的比例稀释HRP标记抗鼠二抗，37℃孵育1h，洗涤NC膜；均匀涂抹显色液，曝光显影。设置rClone30为对照组。
结果如图3所示，Western blot结果表明rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)和rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)能够表达HA外源蛋白。
实施例4：不同位点的rClone30-HA-chGM-CSF免疫鸡后HI抗体效价的测定
将14日龄SPF鸡随机分为6组，每组10只。rClone30、rClone30-GM-CSF、rClone30-HA、rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)和rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)分别以105TCID50/0.1ml通过肌肉注射方式免疫，剂量为200μL/只，空白组以相同剂量的PBS代替。各组鸡免疫后5d、7d、10d、14d、21d翅静脉采血分离血清，按常规方法检测NDV HI抗体效价和用ELISA的方法检测抗HA抗体效价。结果如图4。
Claims (5)
1.新城疫重组病毒，为rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)或rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)。新城疫重组病毒rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其P基因和M基因之间插入HA-IRES-chGM-CSF基因，利用Sac II和Pme I双酶切pBrClone30载体后插入HA-IRES-chGM-CSF基因构建重组质粒pBrClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)，利用反向遗传操作将其拯救成新城疫重组病毒rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)；新城疫重组病毒rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)，其活载体基本骨架为Lasota经典疫苗株，在其NP基因插入chGM-CSF基因和其P基因和M基因之间插入HA基因，利用SacII和PmeI双酶切pBrClone30载体后插入HA基因构建重组质粒pBrClone30-HA，利用Aat II和Apa I双酶切pBrClone30-HA后通过同源重组试剂盒插入IRES-chGM-CSF片段构建重组质粒pBrClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)，利用反向遗传操作将其拯救成新城疫重组病毒rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)。
所述新城疫重组病毒rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)或rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)中HA为如下(a)：(a)由序列表中序列1自N末端第1-567位氨基酸残基组成的蛋白质；所述新城疫重组病毒rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)或rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)中chGM-CSF为如下(b)：(b)由序列表中序列3自N末端第1-144位氨基酸残基组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述新城疫重组病毒的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因中，编码所述新城疫重组病毒rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)或rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)中HA的DNA分子为如下(1)：(1)序列表的序列2自5’末端第1-1704位核苷酸所示的DNA分子；
所述基因中，编码所述新城疫重组病毒rClone30-HA-IRES-chGM-CSF(P/M)或rClone30-chGM-CSF(NP)-HA(P/M)中chGM-CSF的DNA分子为如下(2)：(2)序列表的序列4自5’末端第1-432位核苷酸所示的DNA分子。
4.含有权利要求2-3任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组病毒。
5.权利要求1所述新城疫重组病毒或权利要求2所述新城疫重组病毒的基因在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(Ⅰ)：(Ⅰ)预防新城疫和/或禽流感。
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