CN103341179B - 一种粘膜m细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，所述的疫苗由具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统与B3型柯萨奇病毒抗原编码质粒共聚交联复合组成。本发明还公开了上述的基因疫苗的制备方法，本发明还公开了具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统的制备方法，应用EDC和NHS激活M细胞靶向引导肽段CPE30的羧基，使其与脱乙酰壳聚糖中的氨基形成稳定酰胺酯键获得。通过将本发明的基因疫苗滴鼻免疫小鼠，证实可有效诱导抗原特异性血清和粘膜抗体应答，明显增强全身及胃肠道粘膜局部特异性T细胞杀伤能力，显著提高免疫小鼠抵御柯萨奇病毒B3型感染，是一种优良的病毒性心肌炎预防性疫苗。

Description

一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗及其制备

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，尤其涉及用于预防或治疗病毒性心肌炎的疫苗及其制备方法和应用，特别是一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗及其制备和应用。

背景技术

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是临床常见心血管系统疾病，近年来发病呈上升趋势。在我国VMC发病率约为5％-15％；在暴发流行期发病率高达30％-50%，病死率达24%。不仅如此，VMC反复发作可导致扩张性心肌病和心衰，5年死亡率高达75%，已成为较严重的社会健康问题。肠道病毒，特别是B3型柯萨奇病毒（coxsackievirus B3,CVB3）是引起病毒性心肌炎的主要病原体。目前临床上有效治疗心肌炎的手段缺失，因此其新型预防性疫苗的研制极为必要。

B3型柯萨奇病毒属小RNA病毒，主要来自消化道粘膜感染。粘膜免疫是人体免疫的第一道防线，可在感染的早期和最初感染部位有效控制感染，防止感染扩散。诱导粘膜局部特异性免疫应答，对于有效控制B3型柯萨奇病毒早期感染，预防或减轻病毒性心肌炎具有非常重要的意义，因此新型病毒性心肌炎粘膜疫苗的研制成为近年来的新兴方向和重点。通过粘膜给予DNA疫苗可更好地模拟柯萨奇病毒的天然感染，诱导特异性粘膜免疫，在粘膜局部感染的第一时间清除病原体，可能会产生更为有效的免疫保护作用。

然而，通常粘膜部位接种抗原通常很难诱导免疫应答，这是由于粘膜局部纤毛的频繁摆动、粘膜局部水解酶、DNA酶的大量存在，使得外来抗原迅速降解，不足以被APC提呈。因此需要通过粘膜疫苗递送系统来对DNA疫苗进行组装，而后在粘膜部位免疫。因此，应用申请人过去申请的脱乙酰壳聚糖递送系统（专利名称为：一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳聚糖粘膜递送系统和其应用，专利申请号：200610147575.1）。但由于大多数脱乙酰壳聚糖递送系统组装的DNA疫苗主要经粘膜上皮细胞随机吞噬穿越粘膜层，并非主要通过粘膜上皮细胞-微褶皱细胞（M细胞）介导完成,后者是粘膜摄取和捕获抗原的主要入口。不仅如此，M细胞还可将粘膜抗原以囊泡形式转运给下方富集的巨噬细胞和树突状细胞，有效启动粘膜免疫应答。

考虑到粘膜M细胞在摄取和转运颗粒抗原中的重要地位和强大优势，再以申请人前期申请专利的脱乙酰壳聚糖疫苗组装方法为基础，在该递送系统引入来源于产气荚膜梭菌肠毒素C末端30位氨基酸（CPE30）的M细胞靶向肽段，通过提高抗原跨粘膜转运的能力来增强其粘膜表达，进而诱生高水平的粘膜免疫应答，有效预防病毒性心肌炎。

chitin（几丁质，N－乙酰氨基葡萄糖多聚体）是一种广泛存在于虾、蟹外壳中的天然多糖。chitin与DNA复合可生成不溶于水的微米颗粒（microparticle），是一种强有效的巨噬细胞激活剂，并上调Th1型细胞免疫。chitin经脱乙酰化后可衍生为分子量从120000～400000的chitosan多糖（壳多糖/壳聚糖，β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖)，无毒，具有生物可容性和生物可降解性，天然带正电荷，可与带负电荷的粘膜天然静电吸附，具有增强粘膜黏附吸收作用，还具有促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被广泛用于药物赋形剂与缓释剂。脱乙酰壳聚糖(chitosan,化学名为β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖）是甲壳类动物来源的天然生物多糖，是几丁质（chitin）的脱乙酰衍生物。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗及其制备，所述的这种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗及其制备要解决由于常规基因疫苗的粘膜摄取和转运能力有限、易降解而导致的抗原表达量低、不能诱导强有力的免疫应答、疫苗保护力有限的技术问题。

本发明提供了一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，所述的疫苗由具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统与B3型柯萨奇病毒抗原编码质粒共聚交联复合组成，所述的具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统是由产气荚膜梭菌肠毒素来源的粘膜M细胞靶向肽段CPE30和脱乙酰壳聚糖通过化学方法偶联而成，所述的产气荚膜梭菌肠毒素来源的粘膜M细胞靶向肽段CPE30的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的B3型柯萨奇病毒抗原编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有B3型柯萨奇病毒株来源的衣壳蛋白VP1的全长基因，所述的B3型柯萨奇病毒株来源的衣壳蛋白VP1全长基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，所述的B3型柯萨奇病毒来源的衣壳蛋白VP1氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步的，所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

进一步的，所述的B3型柯萨奇病毒来源的衣壳蛋白VP1编码质粒通过以下步骤构建而成：

1)提取B3型柯萨奇病毒Nancy株DNA作为模板，用SEQ IDNO：4所示的VP1上游引物和SEQ ID NO：5所示的VP1下游引物通过PCR方法扩增B3型柯萨奇病毒来源衣壳蛋白VP1编码基因；

2)将目的基因经Hind III、Bam HI双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得上述的B3型柯萨奇病毒抗原编码质粒。

进一步的，在所述的粘膜M细胞靶向性脱乙酰壳聚糖中，所用的脱乙酰壳聚糖的分子量在380000～420000之间，脱乙酰度为75%-85%。

进一步的，所述的具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）激活M细胞靶向引导肽段CPE30的羧基，使其与脱乙酰壳聚糖中的氨基形成稳定酰胺酯键获得。

进一步的，所述的具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统通过以下步骤构建而成：

(1)一个制备产气荚膜梭菌肠毒素来源的粘膜M细胞靶向肽段CPE30的步骤；

(2)一个制备质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液的步骤；

(3)应用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为偶联试剂，激活M细胞靶向引导肽段CPE30的羧基，使其与脱乙酰壳聚糖中的氨基形成稳定酰胺酯键，经透析、冻干获得具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统。

具体的，在一个制备质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液的步骤中，将所述的脱乙酰壳聚糖溶解在HAc溶液中，常温搅拌，形成1%脱乙酰壳聚糖均一的胶状溶液，然后用5mM乙酸钠溶液调节pH至5.5，制备成质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液。

具体的，在将产气荚膜梭菌肠毒素来源的粘膜M细胞靶向肽段CPE30偶联到脱乙酰壳聚糖上的步骤中，将200μl DMSO溶解的CPE30（1mg），EDC(0.25mg)，NHS(0.15mg)加入800μl MES缓冲液（pH6.0）中，室温反应后加入终浓度为20mMβ-巯基乙醇终止上述偶联反应，将10ml质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液加入上述混合液中，室温搅拌反应24h后，置于截留分子量为12,000Da的透析袋中，于10倍体积5mM乙酸钠溶液（pH5.5）中透析24h（每12h更换透析液）后行冷冻干燥。

本发明还提供了一种具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统，其特征在于：是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺激活M细胞靶向引导肽段CPE30的羧基，使其与脱乙酰壳聚糖中的氨基形成稳定酰胺酯键获得。

本发明还提供了一种制备上述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗的方法，包括以下步骤：

（1）构建B3型柯萨奇病毒来源抗原编码质粒pVP1的步骤，所述的质粒DNA溶解在5mM～25mM的Na₂SO₄中；

（2）一个制备具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统的步骤，在所述的制备具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统的步骤中，先制备产气荚膜梭菌肠毒素来源的粘膜M细胞靶向肽段CPE30，再制备质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液，然后应用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为偶联试剂，激活M细胞靶向引导肽段CPE30的羧基，使其与脱乙酰壳聚糖中的氨基形成稳定酰胺酯键，经透析、冻干获得具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统。

（3）将质量百分比浓度为0.01～0.04%、pH5.5-5.7的粘膜M细胞靶向性粘膜递送系统溶液，与50～400μg/ml pVP1质粒溶液在50-60℃下，以15000-17000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用，获得的粘膜M细胞靶向性脱乙酰壳聚糖-pVP1纳米颗粒为球形，直径在100～400nm之间。

进一步的，在所述的粘膜M细胞靶向性粘膜递送系统溶液中，所述的脱乙酰壳聚糖的分子量在380000～420000之间，脱乙酰度75%～85%。

本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，以及药学上可以接受的载体或者赋形剂。

本发明还提供了上述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗在制备预防或治疗病毒性心肌炎的药物中的应用。

本发明选择来源于产气荚膜梭菌肠毒素C末端30位氨基酸（CPE30），作为M细胞靶向肽段。CPE30位于无毒性的受体结合域，可特异性结合细胞间紧密连接蛋白claudin4，后者高表达于人、鼠呼吸道和消化道粘膜M细胞，因此以CPE30作为引导肽段将抗原靶向递送给M细胞，促进其摄取和转运。

本发明的疫苗可以以滴鼻、口服方式实施粘膜部位接种。

进一步的，所述的病毒性心肌炎基因疫苗的粘膜免疫方法如下：

1）首先对动物进行轻度麻醉；

2）在鼻腔或口腔内逐滴注入粘膜M细胞靶向性的脱乙酰壳聚糖-pVP1纳米颗粒，

3）二周后重复1）＋2）的免疫过程，

4）共免疫3～4次，pVP1DNA总量在150～200μg。

以粘膜M细胞靶向性的脱乙酰壳聚糖与质粒DNA在特定的浓度、温度、pH值、振荡速度条件下，可形成大小不一的共聚复合物。本发明以特定性质的粘膜M细胞靶向性脱乙酰壳聚糖制备特定溶液，与特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制备了直径在100-400nm的纳米颗粒复合物。具体选择质量百分比浓度为0.02%、pH.5.5的粘膜M细胞靶向性脱乙酰壳聚糖溶液，与400μg/ml编码靶抗原的质粒DNA（pcDNA3.1载体构建）溶液（5mM Na₂SO₄）,在55℃下，以15000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用，制备了粘膜M细胞靶向性脱乙酰壳聚糖-B3型柯萨奇病毒靶抗原DNA纳米颗粒。

本发明中，将CPE30-chitosan-病毒性心肌炎基因疫苗免疫小鼠的方法采用滴鼻方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行：以常规小鼠麻醉方法轻度麻醉小鼠，将小鼠鼻部向上，以枪头吸取<20 I液体直接逐滴滴入鼻腔内，待液滴随小鼠吞咽进入呼吸道后，再滴下一滴液体。液体总体积不宜超过50μl。

本发明中，所述的真核表达质粒的载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于：pcDNA3.1、pVAX以及常见和市售的真核质粒载体。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应（如毒性、刺激、变态反应）、有合理效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于：水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。

本发明的药物组合物，含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，pH值通常约6-8。

综上所述，本发明公开的一种粘膜M细胞靶向性脱乙酰壳聚糖递送系统组装的病毒性心肌炎粘膜基因疫苗，具有以下三大特性：

1）其核心B3型柯萨奇病毒衣壳蛋白编码质粒pVP1。CVB3核衣壳结构蛋白质主要由四种多肽VP1、VP2、VP3、VP4组成，其中VP1是参与多种病毒功能的较为重要的核衣壳结构蛋白质。研究表明VP1中含有多个可能的B细胞表位和T细胞表位，具有最强的抗原性，其可诱导有效的特异性抗B3型柯萨奇病毒感染的免疫保护作用。

2）通过已申请专利的脱乙酰壳聚糖粘膜递送系统chitosan（一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳聚糖粘膜递送系统和其应用。专利申请号：200610147575.1），经EDC/NHS化学法将粘膜M细胞靶向性肽段CPE30偶联至脱乙酰壳聚糖系统上。随后将该系统与pVP1质粒形成共聚复合物后，再通过粘膜途径接种DNA疫苗，具有安全无毒性、缓释性、亲粘膜性等多种优势，可促进粘膜局部特异性免疫应答的诱导。

3）该病毒性心肌炎粘膜基因疫苗通过优化免疫途径、免疫程序、免疫剂量、间隔时间，能更有效地诱导全身和粘膜T细胞和抗体应答。

本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明的CPE30-chitosan-pVP1病毒性心肌炎粘膜疫苗通过口服途径免疫小鼠，有效诱导针对B3型柯萨奇病毒的特异性抗体应答；更重要的是，能诱导全身及肠道粘膜局部很强的特异性T细胞应答，同时可诱导分泌高水平IFN-γ的Th1免疫应答，效果显著优于传统chitosan-pVP1心肌炎粘膜疫苗。

附图说明

图1显示了粘膜M细胞靶向肽段CPE30偶联至脱乙酰壳聚糖的示意图。

图2显示了粘膜M细胞靶向肽段CPE30偶联至脱乙酰壳聚糖的化学结构示意图。

图3显示了BCA蛋白定量法绘制的标准曲线。

图4显示了CPE30肽段偶联至脱乙酰壳聚糖的效率。

图5显示了CPE30-chitosan-pVP1疫苗的制备过程中pVP1质粒的构建过程。

图6显示了CPE30-chitosan粘膜递送系统与pVP1通过共聚交联法获得CPE30-chitosan-pVP1疫苗的过程。

图7显示了CPE30-chitosan-pVP1疫苗的大小和表面电位。

图8显示了CPE30-chitosan-pVP1疫苗的电镜图片。

图9显示了CPE30-chitosan-pVP1心肌炎粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱生柯萨奇病毒特异性抗体水平。图A显示血清特异性IgG水平；图B显示粪便特异性IgA水平；图C显示血清特异性IgG亲和力；图D显示粪便特异性IgA亲和力。

图10显示了CPE30-chitosan-pVP1心肌炎粘膜疫苗免疫小鼠诱导的特异性淋巴细胞增殖能力。

图11显示了免疫小鼠脾脏和肠系膜淋巴结细胞特异性杀伤反应。

图12显示了CPE30-chitosan-pVP1心肌炎粘膜疫苗免疫小鼠后产生的免疫保护作用。末次免疫后2周，以3LD₅₀剂量CVB3腹腔感染小鼠。图A显示感染第4天体重下降水平；图B显示第7天血清血清肌酶(CK)水平；图C显示第7天血清肌酶同工酶(CK-MB)水平；图D显示第7天小鼠心脏病理改变。

图13显示了CPE30-chitosan-pVP1心肌炎粘膜疫苗可显著降低感染小鼠心脏病毒滴度。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。

实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：

B3型柯萨奇病毒Nancy株（复旦大学中山医院卫生部病毒性心肌炎重点实验室提供）。质粒pcDNA3.1(+)、pVAX、宿主细菌DH5α、BL21(Invitrogen公司)。基因合成委托上海赛百盛公司。CPE30肽段合成委托上海吉尔生化公司。chitosan(分子量在380000～420000之间，脱乙酰度为75%-85%)购自sigma公司、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体,HRP标记羊抗小鼠IgA多克隆抗体(SouthernBiotech公司)。限制性核酸内切酶Hind III、BamHI(TaKaRa公司）、T4DNA连接酶(MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、EB(上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜公司)，大量质粒抽提试剂盒(Qiagen),乳酸脱氢酶LDH试剂盒购自Roche。6-8周龄雄性BALB/c(H-2^d)小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。

实施例1：pcDNA3.1-VP1B3型柯萨奇病毒基因疫苗的构建

按华舜生物公司RNAex Reagent&System提取液相B3型柯萨奇病毒Nancy株RNA，cDNA合成按上海生工生物公司2-N FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行，随后以该DNA为模板，用VP1上游引物（SEQ ID NO：4）和下游引物（SEQ ID NO：5）通过CR扩增获得VP1基因片段，同时在基因两端分别带上Hind III和BamHI酶切位点。回收并纯化PCR产物（华舜公司小量胶回收试剂盒），并经双酶切后可连接入经相应酶切的载体pcDNA3.1(+)。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选转化菌落。经酶切及测序鉴定成功构建pcDNA3-VP1(pVP1)真核表达质粒。将重组质粒pVP1转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经LB（Amp100μg/ml）液体培养基振荡培养15h，收集菌体，按照QIAGEN Plasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。

实施例2pGEX-VP1原核表达载体的构建及蛋白表达纯化

将扩增得到的pVP1基因用Xho I和Hind III双酶切，与经相应酶切的原核表达载体pGEX连接，构建了pGEX-VP1原核表达质粒。

以pGEX-VP1转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。经LB（Amp100μg/ml）液体培养基振荡培养至A600达到0.75左右，加入异丙基硫代半糖苷（IPTG）至终浓度为0.5mM。继续振荡培养3h，4000r/min离心20min收集菌体，1×PBS重悬后超声破碎，12000r/min于4℃离心20min，分别收获上清和沉淀。上清过亲和层析柱，以不同浓度洗脱液洗脱，收集每1ml洗脱液，保存A280大于1.0的洗脱液，最后经12%SDS-PAGE电泳鉴定表达的蛋白。最后得到纯化蛋白VP1。

实施例3粘膜M细胞靶向递送系统CPE30-chitosan的制备

1）制备质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液。脱乙酰壳聚糖的分子量390kDa，脱乙酰度75%～85%。所述的脱乙酰壳聚糖溶解在1%的HAc中，37℃搅拌，形成1%脱乙酰壳聚糖均一的胶状溶液，然后用5mM乙酸钠溶液调节pH至5.5，制备成质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液。

2）制备偶联CPE30的脱乙酰壳聚糖，以EDC/NHS为偶联试剂，将CPE30偶联到壳聚糖上：首先，化学合成N端乙酰化的CPE30多肽，N端乙酰化可以避免多肽与多肽间偶联。其次，将200μl DMSO溶解的CPE30(1mg)，EDC(0.25mg)，NHS(0.15mg)加入MES缓冲液(pH6.0)中，室温反应2h。后加入β-巯基乙醇（终浓度20mM）中止EDC的作用。将10ml质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液加入上述混合液中，室温搅拌反应24h后，置于截留分子量为12,000Da的透析袋中，于10倍体积5mM乙酸钠溶液（pH5.5）中透析24h（每12h更换透析液）后行冷冻干燥。将冷冻干燥的CPE30偶联后的脱乙酰壳聚糖溶解于5mM乙酸钠溶液，制备成质量百分比浓度为0.1%，pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液。最后，将所得质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的CPE30-chitosan行5倍稀释使其终浓度为百分比浓度0.02%，并以BCA法检测产物中偶联肽段含量。(如图1、图2、图3和图4)

实施例4CPE30-chitosan-pVP1心肌炎基因疫苗的制备

1）质粒DNA的大量制备：依照QIAGEN Plasmid Mega Kit进行。

2）分别制备CPE30-chitosan溶液和pcDNA3.1-pVP1溶液，方法如下：首先制备百分比浓度为0.02%、pH5.5的chitosan溶液，称取0.02g chitosan(Fluka,MW约400000，脱乙酰度75％－85％)，先以500μl-1ml1%HAc溶液将其缓慢溶解，37℃放置1h。而后称取0.042g NaAc，以90ml H₂O溶解，加入上述已彻底溶解的chitosan溶液，混匀后，以1N NaOH调节pH值至5.5，此即0.02%、pH5.5的chitosan溶液。随后，将DMSO溶解的CPE30(1mg)，EDC(0.25mg)，NHS(0.15mg)加入MES缓冲液(pH6.0)中，室温反应2h。后加入β-巯基乙醇（终浓度20mM）中止EDC的作用。将10ml质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液加入上述混合液中，室温搅拌反应24h后，置于截留分子量为12,000Da的透析袋中，于10倍体积5mM乙酸钠溶液（pH5.5）中透析24h（每12h更换透析液）后行冷冻干燥。将冷冻干燥的CPE30偶联后的脱乙酰壳聚糖溶解于5mM乙酸钠溶液，制备成质量百分比浓度为0.1%，pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液。最后，将所得质量百分比浓度为0.1%、pH5.5的CPE30-chitosan行5倍稀释使其终浓度为0.02%。pcDNA3.1-pVP1质粒以5mM Na₂SO₄溶解，DNA浓度为1mg/ml，-20°C保存备用。

3）采用共沉淀法（共凝聚法）制备CPE30-chitosan-DNA纳米颗粒，方法如下：在55℃水浴中，将0.02%、pH5.5的CPE30-chitosan溶液逐滴滴入400μg/ml质粒DNA溶液中，同时15000rpm高速振荡20秒，即可形成均一略带混浊的CPE30-chitosan-DNA纳米颗粒（如图5、图6、图7和图8）。

实施例5CPE30-chitosan-pVP1心肌炎粘膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠

将6-8周BALB/c雄鼠分为9组,其中滴鼻免疫4组，分别为：CPE30-chitosan-pVP1、chitosan-pVP1、CPE30-chitosan-pcDNA3.1,(CPE30-chitosan-vector)chitosan-pcDNA3.1（chitosan-vector）每组6只小鼠。滴鼻免疫程序如下：以0.75%戊巴比妥钠80-120μl经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉。以含有50μg质粒DNA的chitosan-pVP1疫苗溶液逐滴滴入小鼠两侧鼻腔。每两周经眼眶后眦静脉采血，37℃静置30min，6000rpm×10min，收集血清，分装冻存于-70℃。同时，收集小鼠粪便标本，以100mg/ml浓度溶解于PBS溶液中（5%脱脂牛奶、10mM Leupeptin、1μg/ml aprotinin、1mM PMSF），充分混旋后离心收集上清冻存-70℃。

实施例6chitosan-pVP1滴鼻免疫可诱导CVB3特异性抗体应答

间接ELISA法检测免疫小鼠血清中特异的抗CVB3抗原IgG。以5μg/ml VP1蛋白包被聚苯乙烯微孔板（包被液0.1M Na₂CO₃,pH9.6）4℃过夜。以5%milk-PBS封闭板，200μl/孔，37℃1h。依次加1：50稀释血清或粪便原液、100μl/孔，37℃1h，洗板后加HRP-羊抗小鼠IgG或HRP-羊抗小鼠IgA，37℃1h，洗板后以加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色30min，2N H₂SO₄终止反应后测A450值。测定抗体亲和力时，抗原包被、封闭同前，加1：50稀释血清或粪便原液至两块ELISA板，室温反应1h，PBST洗涤后，其中1块ELISA板用100μl/孔6M尿素处理，室温反应10min；另1块板不做尿素处理，随后PBST洗板3次，依次加入HRP-羊抗小鼠IgG/IgA和TMB室温显色，450nm测OD值。用下列公式计算抗体亲和力指数(avidityindex,AI):AI=（尿素处理孔OD值/尿素未处理孔OD值）×100。

如图9A和9B显示：CPE30-chitosan-pVP1心肌炎粘膜基因疫苗免疫四次以后在小鼠体内诱生了高水平的CVB3特异性血清IgG和粪便IgA，OD值分别为0.93和0.88，显著高于chitosan-pVP1组(OD值为0.78和0.72，P<0.05)。此外，CPE30-chitosan-pVP1心肌炎粘膜基因疫苗还显著增加了特异性血清IgG和粪便IgA的亲和力，其亲和指数由chitosan-pVP1组的52和44增加至63和54，上调幅度高达20%左右（图9C和9D）。上述结果提示，CPE30-chitosan-pVP1不仅能够诱导高水平的全身和粘膜局部特异性抗体免疫应答，同时还可显著提高上述抗体的亲和力。

实施例7chitosan-pVP1滴鼻免疫可诱导脾脏和肠系膜淋巴结T细胞的特异性增殖和CTL杀伤

1）小鼠脾脏和肠系膜淋巴结T细胞增殖功能检测

小鼠脾脏和肠系膜淋巴结T细胞增殖功能使用Roche Brdu cellproliferation ELISA试剂盒进行检测，方法如下：取末次免疫后2周，各组小鼠脾脏及肠系膜淋巴结（MLN）细胞，制备无红细胞的淋巴细胞悬液，调整浓度为4×10⁶/ml，加入96孔板，100μl/孔，以终浓度为20μg/ml的VP1蛋白为刺激物，以1640作为空白对照，培养72h后加入Brdu labeling solution，0.1μl/孔，24h后收集细胞，固定后加入anti-Brdu-POD1μl/孔，PBS洗涤后，TMB室温显色10min，测OD370nm值。

结果显示：与chtiosan-pVP1免疫组相比，CPE30-chitosan-pVP1免疫组脾脏细胞对VP1蛋白产生了更强烈的增殖反应（图10A，P<0.05）。不仅如此，其诱导的肠系膜淋巴结局部特异性T细胞也显著强于对照组（图10B，OD值0.53vs0.35），提示该粘膜M细胞靶向性基因疫苗滴鼻免疫可显著增强全身和远端粘膜局部的特异性T细胞增殖反应。

2)小鼠脾脏和肠系膜淋巴结T细胞CTL功能检测

以经灭活的CVB3刺激培养24h的SP2/0细胞作为靶细胞，制备方法如下：首先准备即将传代的SP2/0细胞，然后进行细胞换液，新鲜的培养基包含灭活的CVB3（10^-6/ml）,细胞经37℃培养24h后,靶细胞按100μl/1×10⁴/孔加入96孔U底板。

末次免疫后2周，以3LD₅₀CVB3腹腔感染小鼠，4d后取小鼠脾脏和肠系膜淋巴结细胞，调整浓度为5×10⁶/ml。以该浓度为起始(即效靶比50:1)在板外作倍比稀释，依次为2.5×10⁶/ml(25:1)、1.25×10⁶/ml(12.5:1)，各按100μl/孔加入96孔板中，加样均为三复孔。LDH释放对照组的设计（每组均设3个复孔）：（1）培养液对照组：单纯无血清1640培养液200μl/孔；（2）LDH低释放组：靶细胞100μl/孔+无血清1640培养液100μl/孔；（3）LDH高释放组：靶细胞100μl/孔+细胞裂解液（2%TritonX-100溶液）100μl/孔；（4）效应细胞对照组：分别为效应细胞5×10⁵/孔，2.5×10⁵/孔，1.25×10⁵/孔＋培养液100μl/孔。将已加入细胞的96孔板置37℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养72h。培养结束后将培养板以250g速度离心10min。每孔取100μl细胞培养上清液，加入96孔平底细胞培养板中，于每孔中加入100μlLDH反应液（Roche），室温避光放置30min。将细胞板置于酶标仪中检测492nm的吸光度（A）值。特异性CTL活性的计算方法：CTL细胞毒相对活性＝［（A效靶细胞混合－A效应细胞对照－A低释放对照）/（A高释放对照－A）］×100%。

结果显示，效靶比为50:1时，CPE30-chitosan-pVP1组脾脏和肠系膜淋巴结T细胞特异性杀伤率达46%和19%，高于chitosan-pVP1组（图11A和图11B），提示CPE30-chitosan-pVP1基因疫苗有效诱生了较强的CVB3特异性全身和粘膜局部T细胞CTL应答，有抵抗CVB3感染的潜能。

实施例8CPE30-chitosan-pVP1滴鼻免疫可显著减轻CVB3感染小鼠病毒性心肌炎病情

1）CVB3感染后免疫小鼠体重和心肌损伤血清学指标改变情况

末次免疫后2周，以诱导心肌炎病毒剂量（3LD₅₀）腹腔感染小鼠，称取第0天和第4天体重改变，初步评估心肌炎严重程度。结果显示：感染初期，各组小鼠体重基本相同，但至第4天，对照组小鼠体重下降最为显著，均重仅27g；chitosan-pVP1组其次，均重29.3g，而CPE30-chitosan-pVP1组均重为30.3g，显著高于其他组（图12A）。此外，于感染第7天取血清，于生化分析仪Modular P800上检测肌酸激酶CK和肌酸激酶同工酶CK-MB水平。结果显示：与其他组相比，CPE30-chitosan-pVP1组血清CK和CK-MB水平显著降低，提示其心肌损伤程度最轻。上述结果提示较chitosan-pVP1而言，CPE30-chitosan-pVP1滴鼻免疫可提供更为有效的预防心肌炎的免疫保护效力。（图12B和图12C）

2）CVB3感染后免疫小鼠心肌病理改变

末次免疫后2周，以诱导心肌炎病毒剂量（3LD₅₀）腹腔感染小鼠，于第7天取心脏行石蜡切片和HE染色，具体方法如下：将心脏在PBS中洗净，4%多聚甲醛固定24h、脱水、石蜡包埋后切片，行HE染色，染色步骤：二甲苯Ⅰ（10min）—二甲苯Ⅱ（10min）—100%Ⅰ的乙醇中（2min）—100%Ⅱ的乙醇中（2min）—95%的乙醇中（2min）—90%的乙醇中（2min）—80%的乙醇中（2min）—自来水缸中浸泡5min—苏木精染核7min—水洗（2min）—1%的盐酸酒精分化(5sec)—水洗—弱氨水返蓝—水洗—镜下观察—伊红染胞质（20sec）—水稍洗—80%的乙醇(3sec)—95%的乙醇Ⅰ(3sec)—95%的乙醇Ⅱ(3sec)—100%Ⅰ的乙醇中（5sec）—100%Ⅱ的乙醇中（5sec）—二甲苯Ⅰ（5min）—二甲苯Ⅱ（5min）—中性树胶封片。随后于显微镜下观察拍照。

结果显示：对照组心室内外壁均出现大量严重的灶性坏死，大量心肌细胞被破坏，而代之以成团的炎性淋巴细胞浸润，心肌坏死损伤比较严重；chitosan-pVP1组心肌坏死损伤较轻，心肌实质中仅可见到少量淋巴细胞浸润和坏死灶，炎症灶多集中于心内膜下，范围较小；CPE30-chitosan-pVP1免疫组心肌损伤最轻，部分小鼠心肌除有细胞浊肿现象和少量的淋巴细胞浸润，无明显异常，近似于正常心肌细胞（图12D）。结果提示：CPE30-chitosan-pVP1新型疫苗滴鼻免疫可有效预防病毒性心肌炎的发生。

实施例9CPE30-chitosan-pVP1滴鼻免疫可显著减轻CVB3感染小鼠心脏病毒载量

末次免疫后2周，以诱导心肌炎病毒剂量（3LD₅₀）腹腔感染小鼠，于第7天取心脏，匀浆后取上清，在Hela细胞中测定TCID₅₀（50%细胞培养物感染剂量）来确定感染性CVB3病毒效价，具体方法如下：病毒滴度测定前一天，铺2×10⁴/孔的Hela细胞入96孔板中作为被感染细胞。剪取3LD₅₀CVB3攻击后7天小鼠心脏或胰腺组织，称重后重悬于完全培养基中。组织反复冻融后，匀浆离心取上清并作10倍倍比稀释。取各稀释度上清接种于各孔Hela细胞表面，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μl。逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。按Reed-Muench两氏法计算结果。

结果显示（如图13A和13B）：与对照组和chitosan-pVP1组相比，CPE30-chitosan-pVP1组心脏和胰腺组织病毒载量显著降低，提示该疫苗滴鼻免疫后可有效清除体内病毒，显著减轻病毒性心肌炎病情。

Claims (10)

1.一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，其特征在于：所述的疫苗由具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统与B3型柯萨奇病毒抗原编码质粒共聚交联复合组成，所述的具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统是由产气荚膜梭菌肠毒素来源的粘膜M细胞靶向肽段CPE30和脱乙酰壳聚糖通过化学方法偶联而成，所述的产气荚膜梭菌肠毒素来源的粘膜M细胞靶向肽段CPE30的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述的B3型柯萨奇病毒抗原编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有B3型柯萨奇病毒株来源的衣壳蛋白VP1的全长基因，所述的B3型柯萨奇病毒株来源的衣壳蛋白VP1全长基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，其特征在于：所述的B3型柯萨奇病毒来源的衣壳蛋白VP1氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.如权利要求1所述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，其特征在于：所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

4.如权利要求1所述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，其特征在于：所述的B3型柯萨奇病毒来源的衣壳蛋白VP1编码质粒通过以下步骤构建而成，

(1)提取B3型柯萨奇病毒Nancy株DNA作为模板，用SEQ ID NO：4所示的VP1上游引物和SEQ ID NO：5VP1所示的下游引物通过PCR方法扩增B3型柯萨奇病毒来源衣壳蛋白VP1编码基因；

(2)将目的基因经Hind III、Bam HI双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得上述的B3型柯萨奇病毒抗原编码质粒。

5.如权利要求1所述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，其特征在于：在所述的粘膜M细胞靶向性脱乙酰壳聚糖中，所用的脱乙酰壳聚糖的分子量在380000～420000之间，脱乙酰度为75％-85％。

6.如权利要求1所述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，其特征在于：所述的具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺激活M细胞靶向引导肽段CPE30的羧基，使其与脱乙酰壳聚糖中的氨基形成稳定酰胺酯键获得。

7.如权利要求6所述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，其特征在于：所述的具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统通过以下步骤构建而成，

(1)一个制备产气荚膜梭菌肠毒素来源的粘膜M细胞靶向肽段CPE30的步骤；

(2)一个制备质量百分比浓度为0.01-0.04％、pH5.5-5.7的脱乙酰壳聚糖溶液的步骤；

(3)应用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺为偶联试剂，激活M细胞靶向引导肽段CPE30的羧基，使其与脱乙酰壳聚糖中的氨基形成稳定酰胺酯键，经透析、冻干获得。

8.一种制备权利要求1所述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)构建B3型柯萨奇病毒来源抗原编码质粒pVP1的步骤，所述的质粒DNA溶解在5mM～25mM的Na₂SO₄中；

(2)一个制备具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统的步骤，在所述的制备具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统的步骤中，先制备产气荚膜梭菌肠毒素来源的粘膜M细胞靶向肽段CPE30，再制备质量百分比浓度为0.1％、pH5.5的脱乙酰壳聚糖溶液，然后应用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺为偶联试剂，激活M细胞靶向引导肽段CPE30的羧基，使其与脱乙酰壳聚糖中的氨基形成稳定酰胺酯键，经透析、冻干获得具有粘膜M细胞靶向性的粘膜递送系统。

(3)将质量百分比浓度为0.01～0.04％、pH5.5-5.7的粘膜M细胞靶向性粘膜递送系统溶液，与50～400μg/ml pVP1质粒溶液在50-60℃下，以15000-17000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用，获得的粘膜M细胞靶向性脱乙酰壳聚糖-pVP1纳米颗粒为球形，直径在100～400nm之间。

9.一种药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求1所述的一种粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗，以及药学上可以接受的载体或者赋形剂。

10.权利要求1所述的粘膜M细胞靶向性病毒性心肌炎基因疫苗在制备预防或治疗病毒性心肌炎的药物中的应用。