CN106164258A

CN106164258A - 基于作为异源多肽载体的包含非节段负链rna病毒的核蛋白的多聚核糖核蛋白的亚单位疫苗平台

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Publication number: CN106164258A
Application number: CN201480062811.2A
Authority: CN
Inventors: M·萨拉; D·雅各布; F·坦吉
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Universite Paris Diderot Paris 7
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Universite Paris Diderot Paris 7
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2034-09-17
Also published as: AU2014350565A1; US10300128B2; AU2014350565B2; CN106164258B; CA2928053C; EP2873728A1; WO2015071009A1; EP3071690A1; US20160271242A1; EP3071690B1; CA2928053A1

Abstract

本发明涉及基于作为异源多肽载体的包含非节段负链核糖核酸(RNA)病毒的核蛋白的多聚核糖核蛋白(RNP)的亚单位疫苗平台。本发明还涉及得自至少200个融合蛋白与细胞RNA的组合体的多聚RNP，或者涉及表达这些多聚RNP的重组酵母或酵母裂解物。本发明还涉及制备这些多聚RNP或重组酵母或酵母裂解物的方法。本发明特别涉及它们用作活性成分在体外产生免疫原性组合物或者在需要其的宿主体内引起针对异源多肽的保护性预防或治疗性免疫应答的用途。本发明的重组酵母或酵母裂解物也可以用作表达和载体系统以递送至宿主。

Description

基于作为异源多肽载体的包含非节段负链RNA病毒的核蛋白的多聚核糖核蛋白的亚单位疫苗平台

本发明涉及基于作为异源多肽载体的包含非节段负链核糖核酸(RNA)病毒的核蛋白的多聚核糖核蛋白(RNP)的亚单位疫苗平台。本发明还涉及多聚RNP，它们得自至少200个融合蛋白与细胞RNA的组合体(assembly)，或者涉及表达这些多聚RNP的重组酵母或酵母裂解物。本发明还涉及制备这些多聚RNP或者重组酵母或酵母裂解物的方法。本发明特别涉及它们作为在体外产生免疫原性组合物的活性成分或者在需要的宿主内引起抗所述异源多肽的保护性预防或治疗性免疫应答的用途。本发明的重组酵母或酵母裂解物也可以用作向宿主递送的表达和载体系统。

免疫原或表位递送是疫苗成功的主要问题。尽管仅几种佐剂得到许可(http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/VaccineSafety/ucm187810.htm,Vaccines,Blood&Biologics,2011)，但是目前揭示了针对疫苗多肽的大批基于化学的新佐剂或免疫刺激剂(Ribeiro,CM,Schijns VE,2010,Methods Mol Biol 626:1-14)。然而，已产生了一些关于与疫苗联合使用的化合物的安全性问题(Bagnoli F etal.,2011,OMICS 15:545-566；Tomljenovic L,2011,J Alzheimers Dis 23:567-598；Francois G et al.,2005,Pediatr Infect Dis J 24:953-961；Piyasirisilp S,Hemachudha T,2002,Curr Opin Neurol 15:333-338；Miller E et al.,2013,BMJ 346:f794)。因此，需要开发另外的递送策略。其中出现了使用减毒的(Lacerda CM et al.,2011,Mycopathologia 171:395-401)或灭活的(Stubbs AC et al.,2001,Nat Med 7:625-629；Roohvand F,Kossari N,2012,Expert Opin Ther Pat 22:391-415；Bian G et al.,2009,Vaccine 28:187-194)酵母。基于酵母的疫苗在无佐剂条件下能引起体液和细胞介导的免疫应答(Stubbs AC et al.,2001,Nat Med 7:625-629；Roohvand F,Kossari N,2012,Expert Opin Ther Pat 22:391-415；Bian G et al.,2009,Vaccine 28:187-194)。热灭活酵母已经示出保护小鼠抗全身性曲霉菌病和球孢子菌病(Liu M et al.,2011,Vaccine29:1745-1753)，或者为鸡提供传染性囊病的无菌保护作用(Arnold M et al.,2012,PLoSOne 7:e42870)。重组酵母目前开发作为针对人体内HBV和HCV(Haller AA et al.,2007,Vaccine 25:1452-1463)或白血病(Bui MR et al.,2010,Vaccine 28:6028-6035)的疫苗候选物。完整酵母形式的酵母激活树突细胞(DC)并通过DC上的fungipods或吞噬突触(phagocytic synapses)而被有效摄入(Neumann AK,Jacobson K,2010,PLoS Pathog 6:e1000760；Goodridge HS et al.,2011,Nature 472:471-475)。甘露糖和Dectin-1受体均介导人DC与最生物技术相关酵母即酿酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)之间的相互作用(Bazan SB et al.,2011,Vaccine 29:8165-8173)。DC通过Dectin-1模式识别受体可以区分直接真菌接触(fungal contact)与可溶的真菌衍生成分(Goodridge HS et al.,2011,Nature 472:471-475)。因此，激活的DC成为在重组酵母中表达的抗原的强呈递细胞，有效递送抗原至MHC I类和II类途径。因此，酵母-DC相互作用提供了对于抗原免疫原性的强佐剂效应(Stubbs AC et al.,2001,Nat Med 7:625-629；Roohvand F,Kossari N,2012,Expert Opin Ther Pat 22:391-415；Bian G et al.,2009,Vaccine 28:187-194；Saiki M et al.,2005,J Autoimmun 24,203-208)。

单体抗原的多聚化也被大量证实通过DC摄入增加而增加其免疫原性(Arias MAet al.,2011,Vaccine 29:1258-1269；Singh M et al,2007,Expert Rev Vaccines 6:797-808；Xiang SD et al.,2006,Methods 40:1-9；Storni T et al.,2005,Adv DrugDeliv Rev 57:333-355)。通常源自病毒的一些多聚蛋白质已经用作递送系统(Casares Set al.,2010,Vaccine 28:4880-4894；Gonzalez MC et al.,2009,Virus Res 146:107-114；Vietheer PT et al.,2007,Antivir Ther 12:477-487；Jariyapong P et al.,2013,Vaccine 31:417-424)。

麻疹病毒(MV)的核蛋白(N)包含病毒螺旋状核壳(Griffin DE et al.,2012,FEMSMicrobiol Rev 36:649-662；Griffin DE,2001,Fields Virology.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins Publications.pp.1401–1441)，具有在表达该蛋白质的细胞的细胞质中在任何RNA分子周围以1个N分子比6个核糖核苷酸的比率自组合的能力，所述细胞包括哺乳动物(Bourhis JM,Canard B,Longhi S,2006,Virology 344:94-110)、细菌(Warnes A et al.,1995,Gene 160:173-178)或者酵母细胞(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124))。这样产生了螺旋状、高度稳定和多聚的RNP，与在MV病毒颗粒中存在的RNP在形状和直径方面均是类似的(Jensen MR et al.,2011,Proc Natl AcadSci U S A 108:9839-9844)。MV-N蛋白在巴斯德毕赤酵母GS115酵母株中的表达诱导形成在细胞质中通过电子显微镜可见的大量这些RNP，而无需其它麻疹病毒蛋白的辅助(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。

疫苗生产者大量使用酵母作为生物反应器以生产大量的低成本疫苗，最佳的实例是抗乙型肝炎病毒(HBV)疫苗这种疫苗基于HBV小表面抗原(HBsAg)，在酿酒酵母中生产。与目前市场上的所有基于酵母的疫苗相同，HbsAg是从酵母中产生和纯化的。验证酿酒酵母作为抗原生物反应器和递送系统的尝试目前处于临床前和临床试验阶段。一种HCV治疗性疫苗(GI-5005)在IIb期测试，一种HBV治疗性疫苗(GI-13000)正经历临床前研究(http://www.globeimmune.com/)。这些疫苗候选物基于酿酒酵母，与大多数基于完整酵母的疫苗候选物相同(Liu M et al.,2011,Vaccine 29:1745-1753；Bui MR et al.,2010,Vaccine 28:6028-6035)。在2009年，巴斯德毕赤酵母(GS115株)的完整基因组被测序(De Schutter K et al.,2009,Nat Biotechnol 27:561-566)。这促进了巴斯德毕赤酵母在疫苗学中作为生物反应器的开发。事实上，巴斯德毕赤酵母与酿酒酵母相比可赋予更多的优势，如通过强可诱导启动子严格控制蛋白质产生及降低翻译后最终加入转基因蛋白质中的寡糖链的长度。此外，与在酿酒酵母中产生的抗原的超抗原性作用相关的糖基化蛋白质上末端α-1,3多糖链(Cregg JM et al.,1993,Biotechnology(NY)11:905-910)在巴斯德毕赤酵母中不形成。因此，巴斯德毕赤酵母是在完整酵母疫苗开发中感兴趣的替代方案，因为这个物种与酿酒酵母相比在异源抗原上导入较少的翻译后修饰(Cregg JM et al.,1993,Biotechnology(N Y)11:905-910)。此外，与酿酒酵母不同，巴斯德毕赤酵母特别适于发酵生长并且具有在发酵期间达到极高细胞密度的能力，这可以改良整体蛋白质产量(Liu R et al.,2009,Appl Biochem Biotechnol 158:432-444)。

国际专利申请WO2007/119011揭示了融合蛋白，其中感兴趣的蛋白质如来自病原性微生物如疟原虫的抗原融合在副黏液病毒科病毒如麻疹病毒的N蛋白的C末端。这些融合蛋白在大肠杆菌中表达，并以可溶环(soluble rings)形式纯化，含有N蛋白的10个分子及细菌来源的RNA，被提议用于疫苗接种和细胞内载体化。

多肽(特别是携带表位的多肽或抗原)与另一多肽(作为载体蛋白的N蛋白)的融合可影响载体蛋白的折叠和/或一般性质。具体地，如果载体蛋白自组合成四级结构(即MVRNP)，则这种蛋白质与异源蛋白质的融合可削弱其结合。在HBV VLP的情况中，证实与HBsAg蛋白在N末端融合的蛋白质/肽(自组合成HBV VLP)的长度和氨基酸组成、三个读框中半胱氨酸残基和/或ATG密码子的存在以及疏水性显著影响VLP组合体的效力及其免疫原性(Gonzales MC et al.2009,Virus research 146:107-114；Berkower et al.2004,Virology 321:75–86；Cheong et al.2009,J.Virol.Methods 158:35–40；Mancini etal.1994,Int.Rev.Immunol.11:143–151；Michel et al.2007Vaccine 25:1901–1911)。值得注意的是，GSK的包含佐剂的抗恶性疟原虫疫苗基于这些VLP(高剂量)(WO93/10152；Vanloubbeeck Y et al.2013.Vaccine)。

国际专利申请WO2009/095791揭示了一种通过反向遗传学产生感染性核糖核蛋白颗粒(RNP)、RNP样麻疹病毒或者与异源序列融合的这种RNP的方法，所述方法在重组酵母中进行，例如在酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母中进行。该专利申请揭示了MV-RNP在酵母中的生产与纯化。

国际专利申请WO2010/033841揭示了热灭活的完整酵母如巴斯德毕赤酵母在制备免疫治疗性组合物以治疗慢性丙型肝炎病毒中的用途。

专利申请US5830463、US8221763和EP0789593涉及基于酵母的递送运载体，例如基于巴斯德毕赤酵母的递送运载体，及其用于递送各种化合物至不同细胞类型的用途。酵母运载体不需要与佐剂一起施用，且能保护动物免于感染，例如免于疟原虫感染。

疫苗学中的主要挑战是开发新抗原生产和递送策略及由于安全性考虑而避免使用化学佐剂。本发明解决这些问题。

为了评估基于作为多聚化多肽的表位递送载体的重组酵母的新的疫苗平台，本发明人使用了疟疾动物模型。尽管已进行了大量研究，但是事实上有效的疟疾疫苗仍未被获得(Daily JP,2012,N Engl J Med 367:2349-2351)。因此，研究新的方法是值得的。

疟疾是一种由雌性疟蚊刺入皮肤之后血液中疟原虫增殖导致的危及生命的疾病。已知感染人体的疟原虫是间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、诺斯疟原虫(Plasmodium knowlesi)和恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，后者是导致大多数人死亡的最主要的寄生物。该寄生物在皮肤中形成，称作子孢子，进入血流并侵入肝细胞，在此其增殖为裂殖子。然后，在肝细胞破裂后，这些裂殖子感染红细胞并经历多倍核分裂产生能侵入另外的红细胞的进一步的裂殖(Miller LH et al.,2013,Nat Med 19:156-167)。

疟原虫子孢子由环子孢子蛋白(CS)覆盖，这是针对疟原虫的前红细胞阶段的主流疫苗候选物。当将其接种于宿主皮肤内时，CS蛋白存在于疟原虫子孢子表面(10pg/子孢子；Kumar S et al.,2013,J Immunol Methods 390:99-105)(Miller LH et al.,2013,NatMed 19:156-167；Nussenzweig V,Nussenzweig RS,1985,Cell 42:401-403；Gueirard Pet al.,2010,Proc Natl Acad Sci U S A 107:18640-18645)。已知CS的抗体(Kester KEet al.,2009,J Infect Dis 200:337-346；John CC et al.,2005,Am J Trop Med Hyg73:222-228；Schofield L et al.,1987,Nature 330:664-666)以及特异性CD8+T细胞(Schofield L et al.,1987,Nature 330:664-666；Weiss WR et al.,1988,Proc NatlAcad Sci U S A 85:573-576；Radosevic K et al.,2010,Clin Vaccine Immunol 17:1687-1694)在动物模型、主要是啮齿动物中针对子孢子攻击起保护作用。在人体中，最先进的疟疾疫苗候选物(RTS,S)基于这种CS抗原(Regules JA et al.,2011,Expert RevVaccines 10:589-599)。在RTS,S中，CS多聚体化是通过其与乙型肝炎病毒样颗粒结合而实现的。RTS,S的III期实验的全部结果预期在2015年完成。目前根据年龄组和终点估计在三次剂量后12个月内疫苗的效力为30-56％(Agnandji ST et al.,2012,N Engl J Med367:2284-2295)。然而，最近的IIb期分析示出RTS,S的效力与传播强度负相关，在三年远景下降至零(Bejon P et al.,2013,Lancet Infect Dis)。这大力支持了开发第二代疟疾疫苗策略。

本发明人建立了一个基于麻疹病毒核蛋白(MV-N)在巴斯德毕赤酵母中的异源表达的递送系统。本发明人示出这种蛋白质在巴斯德毕赤酵母中与细胞RNA的自发自组合提供了一种用于多聚化异源多肽的方式或载体。作为概念验证，本发明人将MV-N与伯氏疟原虫(Plasmodium berghei，Pb)的环子孢子蛋白(CS)融合，伯氏疟原虫是啮齿动物疟疾病原体(Scheller LF et al.,1994,Infect Immun 62:4844-4847)。

本发明因此涉及得自至少200个融合蛋白与细胞核糖核酸(RNA)的组合体的多聚核糖核蛋白(RNP)，其中所述融合蛋白包含与携带一或多个表位的异源多肽直接或间接融合的副粘液病毒科的非节段负链RNA病毒的核蛋白(N)。

在一个特定的实施方案中，本发明涉及得自至少200个融合蛋白与细胞核糖核酸(RNA)的组合体的多聚核糖核蛋白(RNP)，其中所述融合蛋白由与携带一或多个表位的异源多肽直接或间接融合的副粘液病毒科的非节段负链RNA病毒的核蛋白(N)组成。

本发明的核蛋白涵盖来自MV病毒的天然核蛋白，特别是来自MV Schwarz或MVMoraten的N蛋白。其还涉及来自MV病毒的天然核蛋白的变体或突变形式。其也涵盖已经经历翻译后修饰的核蛋白，例如糖基化核蛋白。

在本发明的一个优选实施方案中，核蛋白及任选地异源多肽是糖基化的，尤其是酵母糖基化的结果，例如通过巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母糖基化。

在本发明中，术语“核糖核蛋白”缩写为RNP。

如本文定义，术语“核糖核蛋白(RNP)”是指含有细胞核糖核酸(RNA)和本发明的融合蛋白的四级结构，后者以使得其沿着RNA链组合的方式多聚体化以形成棒形结构。所述细胞RNA特别是在细胞的细胞质中的RNA，在此形成RNP。因此，这个四级结构的构象与副粘液病毒科的非节段负链RNA病毒的构象不同，在该构象中RNP得自作为核壳的N和P蛋白与复制MV-RNA的自组合。

本发明的RNP采用棒形结构，如先前Spehner et al.(J.Virol.1991,65(11):6296-6300)或Bakker et al.(J.Gen.Virol.,2013,94:1734-1738)所述。优选地，本发明的多聚RNP、特别是采用棒形结构的那些RNP，具有人字形形状，直径为至少20nm，棒长度为至少100nm。一旦荷载异源多肽，本发明的RNP是稳定的且保持其结构，在其表面上暴露所述异源多肽。在多聚RNP中，异源多肽均是同一性质，特别是在其氨基酸含量及序列长度方面均是相同的。在本发明的构架内，考虑到融合蛋白的数目和/或被包壳的RNA的长度和/或核苷酸组成，RNP在多聚体中可具有不同的组成。

令人惊奇地，在本发明中，首次证实MV病毒的N蛋白形成的RNP能递送其表面上的异源多肽。

已经揭示了甚至在不存在病毒RNA的条件下，MV N蛋白通过与其在之中表达的各种细胞中存在的细胞RNA相互作用可以自组合成RNP(Spehner D et al.1991J.Virol 65(11),6296-6300；Bourhis JM,Canard B,Longhi S,2006,Virology 344:94-110；Warnes Aet al.,1995,Gene 160:173-178；Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。一个N分子包裹精确6个RNA核苷酸或者与精确6个RNA核苷酸相互作用，其已经被建议解释所谓的“六位原则(rule of six)”，已知六位原则是允许保持MV有效复制必需的。N蛋白与RNA分子的核苷酸之间的相互作用涉及所述蛋白质的核心部分，所述核心部分由该蛋白质的N末端400个氨基酸残基组成(总共525个氨基酸残基中的400个)。在麻疹病毒中，需要调节机制以阻止在不存在进行中的病毒基因组RNA合成的条件下N蛋白的非法自组合。这个作用是由病毒磷蛋白(P)实现的，其与N蛋白的结合阻止后者的非法自组合，且还保持细胞质中N蛋白的可溶形式。因此，在不存在病毒磷蛋白表达的条件下，即在本发明的表达系统的情况中，N蛋白与不同长度的细胞RNA分子随意结合。

因此，倘若多聚RNP具有如本文揭示的是全部或基本上全部由N蛋白与如本文定义的异源蛋白形成的融合蛋白，则多聚RNP在其融合蛋白的数目及RNA分子的大小和/或成分方面可彼此不同。

如本文定义，术语“融合蛋白”是指如本文定义的核蛋白(N)、特别是副粘病毒科的非节段负链RNA病毒、优选麻疹病毒的核蛋白与如本文定义的异源多肽的融合。这种融合蛋白不削弱本发明多聚RNP的稳定性。本发明的融合蛋白是通过重组多核苷酸在宿主细胞、特别是在酵母中表达而获得的，所述重组多核苷酸编码所述N蛋白和异源多肽，当翻译时这些编码序列任选在多核苷酸内融合依靠第三个序列作为在N蛋白与异源序列之间的接头。根据本发明，术语“融合蛋白”因此涵盖了通过表达其的酵母进行的糖基化获得的糖基化蛋白质。

如本文定义，术语“细胞核糖核酸”是指在酵母细胞中存在的RNA，特别是在细胞的细胞质中存在的酵母。具体地，这种RNA从细胞的基因组中转录，即是细胞RNA。在特定的实施方案中，RNA可以是编码融合蛋白及任选包含如后文定义的前导序列和/尾随(trailer)序列的特定RNA。

如本文定义，术语“异源多肽”是指该多肽不是由副粘病毒科病毒天然表达的蛋白质或抗原，而是具有另一病原性生物如寄生物或另一病毒的特征。这种多肽携带表位B和/或T表位，当在本发明的RNP上表达时诱导在宿主、特别是在人体中免疫应答，且能针对所述病原体感染、特别是针对所述寄生物或病毒感染起保护作用。携带表位的多肽可特别是抗原，即由宿主免疫系统识别的多肽。

如本文定义，术语“副粘病毒科”涵盖副粘病毒亚科，特别是麻疹病毒属。

根据本发明的制备本发明RNP的一个特定实施方案，副粘病毒科的非节段负链RNA病毒选自：麻疹病毒，牛瘟病毒(RPV)，小反刍兽疫病毒(PPRV)，犬瘟热病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)和猫麻疹病毒。优选地，副粘病毒科的非节段负链RNA病毒是麻疹病毒。更优选地，所述麻疹病毒来自减毒活麻疹病毒毒株。优选的减毒活麻疹病毒毒株是Schwarz、Moraten、Rubeovax、AIK-C、Zagreb和Edmonston毒株。最优选的减毒活麻疹病毒毒株是Schwarz毒株和Moraten毒株。

在本发明中，术语“麻疹病毒”缩写为“MV”。

如本文定义，短语“来自减毒活麻疹病毒毒株的麻疹病毒”是指源自在同一宿主、特别是人中与确定的亲代毒株相比无毒性或低毒性毒株的麻疹病毒，同时在宿主、特别是在人体内施用时保持感染性质和免疫原性及可能的辅助作用。

适于制备本发明的融合蛋白和RNP的特定核蛋白是麻疹病毒核蛋白。例如，所述核蛋白可以是Schwarz/Moraten MV的核蛋白或其变体，特别是具有如在不同MV毒株中发现的那些氨基酸取代，如在Parks et al.(Journal of Virology,2001,75(2),910-920)中描述。

编码Schwarz/Moraten MV的核蛋白的多核苷酸的天然及优化的核苷酸序列以及本发明的Schwarz/Moraten MV的核蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示那些序列。

编码Rubeovax MV的核蛋白的多核苷酸的天然和优化的核苷酸序列以及本发明的Rubeovax MV的核蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:4、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示那些序列。

编码AIK-C MV的核蛋白的多核苷酸的天然和优化的核苷酸序列以及本发明的AIK-C MV的核蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:7、SEQ ID No:8和SEQ ID No:9所示那些序列。

编码Zagreb MV的核蛋白的多核苷酸的天然和优化的核苷酸序列以及本发明的Zagreb MV的核蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:10、SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示那些序列。

编码Edmonston MV的核蛋白的多核苷酸的天然和优化的核苷酸序列以及本发明的Edmonston MV的核蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:13、SEQ ID No:11和SEQ IDNo:12所示那些序列。

本发明的天然蛋白质的突变体形式是具有点突变的蛋白质，特别是具有1-10％氨基酸残基取代或者具有如本文例证及在各种MV毒株中发现的在MV的核蛋白之间发生的突变或者通过氨基酸残基缺失所致突变。突变形式还包括缺失多肽片段如在MV的核蛋白的C末端部分中1-125个氨基酸残基的片段，即这个核蛋白的后125个氨基酸残基链片段(氨基酸401-525)。毕竟真正观测到MV的天然核蛋白与RNA分子之间的相互作用涉及该天然蛋白质的N末端400氨基酸残基。

根据本发明的一个特定实施方案，异源多肽来自寄生物，优选来自疟原虫属的原生动物寄生物，更优选来自伯氏疟原虫或者恶性疟原虫，或者来自病毒，优选来自小RNA病毒科，更优选来自肠道病毒属，例如肠道病毒71(EV71)。

短语“疟原虫属原生动物寄生物”是指与哺乳动物尤其是人宿主的生命周期的各个阶段相关的每一及全部形式的寄生物，包括子孢子，特别是在接种后机体内存在的子孢子，或者在肝细胞中发育的子孢子，裂殖子，尤其包括在肝细胞中产生的裂殖子(红细胞前阶段形式，及包括生命周期的红细胞阶段形式，如在生命周期的红细胞中包含的裂殖子)。这些形式的寄生物特征在于本领域熟知且鉴别的各种特异性抗原，及可以参考感染的阶段命名。

在本发明的一个特定实施方案中，异源多肽是CS(环子孢子)多肽，特别是伯氏疟原虫或恶性疟原虫的CS多肽。

编码伯氏疟原虫的CS多肽的多核苷酸的天然及优化的核苷酸序列以及本发明的伯氏疟原虫的CS多肽的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:14、SEQ ID No:15和SEQ ID No:1所示的序列。

根据本发明的一个特定实施方案，编码恶性疟原虫的CS多肽的多核苷酸的天然及优化的核苷酸序列以及本发明的恶性疟原虫的CS多肽的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:17、SEQ ID No:18和SEQ ID No:19所示的序列。

肠道病毒是副粘病毒科肠道病毒属的小正义单链RNA病毒，其导致广泛的感染。具体地，肠道病毒71(EV71)在1969年首次分离，其导致手足口病(HFMD)，主要是在幼儿发病，且可以与神经学并发症相关。亚洲国家已经见到疾病的大爆发，尤其是在2013年夏季。

在本发明的一个特定实施方案中，异源多肽来自肠道病毒属，优选来自肠道病毒71(EV71)。

在一个特定的实施方案中，来自肠道病毒的异源多肽是肠道病毒71的VP1(病毒衣壳蛋白1)。

编码肠道病毒71的VP1蛋白质的多核苷酸的天然及优化的核苷酸序列以及本发明的肠道病毒71的VP1蛋白质的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ IDNo:22所示的序列。

抗生物素蛋白，一种高度糖基化的卵清蛋白，已知其具有生物素高亲和性，使得可以形成稳定的抗生物素蛋白-生物素复合物。已经发现其广泛用于蛋白质和核酸检测以及纯化方法中。

根据本发明的一个特定实施方案，异源多肽是抗生物素蛋白或者包含抗生物素蛋白。

编码抗生物素蛋白的多核苷酸的天然及优化的核苷酸序列以及本发明的抗生物素蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:23、SEQ ID No:24和SEQ ID No:25所示的序列。

根据本发明的一个特定实施方案，异源多肽与如本文定义的核蛋白(N)(包括其变体)的C末端融合，特别是通过肽接头与如本文定义的核蛋白(N)(包括其变体)的C末端融合，接头序列大小在5-10个氨基酸残基之间。接头被认为是既不属于天然核蛋白也不属于异源多肽的序列。本发明的优选的肽接头由6或7个氨基酸残基组成。优选地，肽接头是小肽接头，其由具有小的及无电荷侧链的氨基酸残基如丙氨酸和甘氨酸组成。

根据本发明的另一特定的实施方案，本发明的融合蛋白不包含肽接头。

根据本发明的一个特定实施方案，编码肽接头的核苷酸序列及本发明的肽接头的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:26和SEQ ID No:27所示序列。其特别用于设计制备RNP的N-PbCS、N-VP1和N-抗生物素蛋白融合蛋白中。

根据本发明的另一个特定的实施方案，编码肽接头的核苷酸序列及本发明的肽接头的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:28和SEQ ID No:29所示的序列。其特别用于设计制备RNP的N-PfCS融合蛋白中。

根据本发明的一个特定实施方案，编码N-PbCS融合蛋白的多核苷酸的天然及优化的核苷酸序列以及本发明的N-PbCS融合蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:30、SEQ IDNo:31和SEQ ID No:32所示序列，其中核蛋白N得自Schwarz毒株，所述融合蛋白包含如SEQID No:26或SEQ ID No:27所示序列的肽接头。

根据本发明的一个特定实施方案，编码N-PfCS融合蛋白的多核苷酸的天然及优化的核苷酸序列以及本发明的N-PfCS融合蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:33、SEQ IDNo:34和SEQ ID No:35所示序列，其中核蛋白N得自Schwarz毒株，所述融合蛋白包含如SEQID No:28或SEQ ID No:29所示序列的肽接头。

根据本发明的一个特定的实施方案，编码N-VP1融合蛋白的多核苷酸的天然及优化的核苷酸序列以及本发明的N-VP1融合蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:36、SEQID No:37和SEQ ID No:38所示序列，其中核蛋白N得自Schwarz毒株，所述融合蛋白包含如SEQ ID No:26或SEQ ID No:27所示序列的肽接头。

根据本发明的一个特定的实施方案，编码N-抗生物素蛋白融合蛋白的多核苷酸的天然及优化的核苷酸序列以及本发明的N-抗生物素蛋白融合蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:39、SEQ ID No:40和SEQ ID No:41所示序列，其中核蛋白N得自Schwarz毒株，所述融合蛋白包含如SEQ ID No:26或SEQ ID No:27所示序列的肽接头。

本发明的多聚RNP是高分子量RNP，由核蛋白(N)与异源多肽获得的200-1000个融合蛋白组合而成，优选由300-700个所述融合蛋白、特别优选由500-700个所述融合蛋白组合而成。这些RNP的分子量在10,000-100,000kDa之间。在这个结构中，N蛋白与异源多肽融合，且也与其在之中表达的细胞的RNA分子相互作用，以此方式所述异源多肽激发被施用该多肽的宿主的免疫系统。

本发明还涉及编码本发明融合蛋白的多核苷酸，特别是包含如下序列的多核苷酸：(i)编码选自SEQ ID No:2、SEQ ID No:5、SEQ ID No:8和SEQ ID No:11的核蛋白(N)的核苷酸序列，任选与(ii)编码选自SEQ ID No:26和SEQ ID No:28的肽接头的核苷酸序列融合，以及(iii)编码与(i)的核苷酸序列或者如果有的话与(ii)的核苷酸序列融合的编码异源多肽的核苷酸序列。

本说明书中使用的术语“编码”定义为当将核酸分子置于表达控制序列包括转录启动子之下时该分子被转录的能力及在适当情况下在选择的细胞或细胞系中适当翻译以进行产物表达的能力。

根据本发明，编码N蛋白的多核苷酸及编码异源多肽的多核苷酸有利地优化以在酵母中表达，及N蛋白的起始ATG密码子置于修饰的Kozak共有序列中以在酵母中正确翻译起始多基因(aaaaaaATGGCC)(Kozak M1987,NAR 15:8125-8148；Kozak M 1990,PNAS 87:8301-8305，其揭示了aAaAaAATGca)。

在本发明的一个特定实施方案中，包含编码核蛋白(N)核苷酸序列的多核苷酸具有优化的序列以在酵母中表达。这个多核苷酸的特定的实施方案是在SEQ ID No:2、SEQ IDNo:5、SEQ ID No:8和SEQ ID No:11中选择的。

在本发明的一个特定实施方案中，密码子优化是对编码核蛋白(N)的多核苷酸及对编码融合蛋白的异源多肽的多核苷酸进行的。

在特定的实施方案中，进行密码子优化以缺失可用于选择用于表达本发明核糖核蛋白的酵母的蛋白酶的裂解位点。结果，融合蛋白及含有其的RNP从密码子优化的序列中的表达可以使得全长融合蛋白在所述选择的酵母中较高量表达，及因此可以有利地影响因此获得的RNP的免疫原性性质。在确定的编码融合蛋白的多核苷酸中酵母蛋白酶的特异性位点可以通过评定从酵母细胞中表达的融合蛋白的消化模式而实验性确定。对表达本发明的融合蛋白的多核苷酸中裂解位点作图的实验方案在实施例4中特别揭示。

在本发明的一个特定实施方案中，编码核蛋白(N)的多核苷酸及编码异源多肽的多核苷酸被插入在来自副粘病毒科非节段负链RNA病毒的前导序列和/或尾随序列之间。这些病毒序列含有衣壳化信号，使得RNA与核蛋白(N)组合(Longhi S.Current topics inmicrobiology and immunology 2009；329:103-28)。克隆的在编码核蛋白(N)和异源多肽的多核苷酸的上游和下游的前导序列和尾随序列可以使得这些RNA分子衣壳化在RNP中。副粘液病毒科的非节段负链RNA病毒的前导序列和尾随序列已经在国际专利申请WO2009/095791中描述。前导序列可包含副粘液病毒科非节段负链RNA病毒的一个病毒启动子，尾随序列可包含转录终止子序列。例如，克隆在核蛋白编码序列上游的MV Schwarz前导序列(包含N起始密码子)及克隆在异源多肽编码序列下游的MV Schwarz尾随序列分别如SEQ IDNo:42和SEQ ID No:43所示。

在本发明的一个特定实施方案中，编码本发明的融合蛋白的多核苷酸进一步包含前导序列和/或尾随序列，例如克隆在核蛋白(N)的编码序列上游的前导序列，序列如SEQID No:42所示，和/或克隆在异源多肽编码序列的下游的尾随序列，序列如SEQ ID No:43所示。

在本发明的一个方面，多核苷酸具有这样的核酸序列，其由编码MV病毒、特别是Schwarz/Moraten毒株N蛋白的核苷酸序列在其相应于N蛋白C末端或如本文定义的变体的C末端的末端与编码肽接头的序列融合而成。

在本发明的一个特定实施方案中，包含编码异源多肽的核苷酸序列的多核苷酸被优化以在酵母中表达。这个多核苷酸的一个特定实施方案选自SEQ ID No:15、SEQ ID No:18、SEQ ID No:21和SEQ ID No:24。

在本发明的一个特定实施方案中，包含编码融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸被优化以在酵母中表达。这个多核苷酸的一个特定实施方案选自SEQ ID No:31、SEQ ID No:34和SEQ ID No:37。

本发明还涉及分离的或纯化的如本文定义的编码融合蛋白的多核苷酸。具体地，本发明涉及分离的或纯化的编码如本文定义的融合蛋白及包含选自SEQ ID No:31、SEQ IDNo:34和SEQ ID No:37的核苷酸序列的多核苷酸。

本发明还涉及分离的或纯化的由本文揭示的多核苷酸编码的融合蛋白。具体地，本发明涉及分离的或纯化的由本文揭示的多核苷酸编码的及包含选自SEQ ID No:32、SEQID No:35和SEQ ID No:38的氨基酸序列的融合蛋白。

根据本发明的一个特定的实施方案，编码RNP的融合蛋白的多核苷酸，特别是具有本文例证的序列之一的多核苷酸，是在适于酵母表达的可诱导启动子控制下。甲醇诱导的AOX1启动子是这种控制序列的一个实例。

本发明还涉及一种表达载体，特别是携带本发明多核苷酸的质粒，其在实施例中例证。

本发明还涉及重组酵母，其与本发明的多核苷酸在使得本发明的多聚RNP组成型或瞬时或可诱导表达的条件下重组。本发明还涉及重组酵母，其用本发明的多核苷酸重组，特别是通过用包含所述多核苷酸的质粒转染而重组。所述转染是有利地稳定的。

本发明还涉及重组酵母，其表达本发明的多聚RNP。

本发明还涉及重组酵母，其是重组的，尤其是用本发明的多核苷酸转染的，并且表达本发明的多聚RNP。

所述重组酵母的细胞适合以活细胞或者以灭活形式、特别是热灭活的酵母细胞任一形式用于本发明的实施方案中。在这种情况中，酵母细胞可以设计为是完整重组酵母。

根据本发明的一个特定的实施方案，本发明的重组酵母是从巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母株中制备的。具体地，巴斯德毕赤酵母株是SMD1168酵母株或GS115酵母株或者KM71酵母株，或者本领域技术人员已知的任何其它酵母株(Lin-Cereghino J.et al.,MethodsMol.Biol.,2007,389,11-25)。巴斯德毕赤酵母株是可商购的(Invitrogen,GeneScriptTM)。

本发明还涉及一种灭活的重组酵母，其得自对如本文定义的重组酵母进行在58-60℃热灭活45-60分钟、优选在60℃热灭活45分钟。

本发明还涉及酵母裂解物，其是本发明的重组酵母的裂解物。

如本文定义，术语“酵母裂解物”涵盖了全部或部分酵母裂解物，如将经机械破坏的酵母细胞进行轻度离心以消除细胞核及大多数细胞膜。

本发明还涉及免疫原性组合物，其包含本发明的多聚RNP或者重组酵母或酵母裂解物。

在特定的实施方案中，所述免疫原性组合物不包含辅助佐剂。

如本文定义，术语“辅助佐剂”涵盖了增强疫苗的免疫应答的任何分子，如油、铝盐和病毒颗粒。辅助佐剂的实例为本领域技术人员熟知。

本发明还涉及包含本发明的多聚RNP或者重组酵母或酵母裂解物的亚单位疫苗平台。在本发明中，组合两种递送系统(酵母和MV RNP)。

本发明还涉及含本发明的重组酵母的混合物或者酵母裂解物的混合物的多价疫苗，其中在混合物中存在至少两个克隆的重组酵母或酵母裂解物，一个克隆表达与另一克隆表达的异源多肽不同的如本文定义的异源多肽。

本发明还涉及包含本发明的重组酵母的混合物或者酵母裂解物的混合物的多价免疫原性组合物，其中在混合物中存在至少两个克隆的重组酵母或酵母裂解物，一个克隆表达与另一克隆表达的异源多肽不同的如本文定义的异源多肽。具体地，所述混合物包含表达不同RNP的酵母，即通过其RNP表达的异源多肽区分酵母彼此，或者这种酵母的裂解物。在这种情况中，将各自表达感兴趣的多肽的不同的重组酵母或酵母裂解物混合在一个疫苗中。

本发明还涉及一种制备本发明的多聚RNP的方法，特征在于其包括如下步骤：

(i)获得本发明的重组酵母或酵母裂解物，及

(ii)从所述酵母或酵母裂解物中回收所述多聚RNP。

本发明还涉及一种制备本发明的重组酵母或酵母裂解物的方法，包括：

(i)将酵母用本发明的多核苷酸重组，

(ii)在培养基中培养所述酵母，

(iii)在所述酵母中表达融合蛋白，特别是在诱导控制所述多核苷酸表达的启动子，例如通过甲醇诱导时，

(iv)任选地，将所述酵母在58-60℃热灭活45-60分钟、优选在60℃热灭活45分钟，及

(v)任选地，制备酵母裂解物。

本发明还涉及本发明的重组酵母或酵母裂解物在体外生产疫苗的用途。

本发明还涉及本发明的重组酵母或酵母裂解物在体外生产免疫原性组合物的用途。

本发明还涉及本发明的重组酵母或酵母裂解物用于表达及将载体系统递送至宿主的用途。

本发明还涉及本发明的多聚RNP作为活性成分以在体外生产疫苗的用途。

本发明还涉及本发明的多聚RNP作为活性成分在体外生产免疫原性组合物的用途。

本发明还涉及本发明的多聚RNP或者重组酵母或酵母裂解物用于在需要其的宿主体内引起针对异源多肽的保护性预防或治疗性免疫应答。具体地，所述免疫应答根据在RNP上表达的异源多肽而用以对抗疟疾起保护作用或者用以对抗肠道病毒感染起保护作用。

根据另一个特定的实施方案，包含本发明的重组酵母或酵母裂解物的疫苗诱导抗体的产生，尤其是针对RNP的异源多肽的抗体。

根据另一个特定的实施方案，包含本发明的重组酵母或酵母裂解物的疫苗诱导Th1和Th2免疫应答。

在本发明的一个特定实施方案中，重组酵母、重组酵母裂解物或多聚RNP的施用以初免-加强(prime-boost)方案实施。

据认为本发明的组合物(特别是如本文定义的RNP、重组酵母或酵母裂解物)当免疫的宿主在用其它感染因素的寄生物免疫攻击后具有保护作用，其使得通常在感染所述寄生物或感染因素之后引起的症状延迟发生和/或减弱，这种保护作用是通过施用本发明的组合物所寻求的作用，或者特别是寄生物血症被延迟时。

本发明的其它特征和优势通过下文实施将显而易见，且也在附图中例证。

附图简述

图1：来自4个独立实验的首次接受试验的小鼠在攻击5天后的寄生物血症。血液寄生物血症以感染的红细胞(iRBC)占总红细胞RBC的百分比的log₁₀标度表示。通过Mann-Whitney非参数检验(p>0.05)确定，寄生物血症的中位值在所有组小鼠中均是相当的。四个独立实验在x轴上标为1、2、3和4。

图2：免疫方案的示意图。免疫和攻击时间表以天数(d)给出，出血时间点以周数给出。

图3：用30YU N-PbCS无佐剂的酵母裂解物免疫后在小鼠体内引起的体液应答。(A)抗-PbCS IgG应答的动力学。(B)抗-N IgG应答的动力学。OD_450nm以log₁₀标度表示。黑色箭头表示免疫时间表。小鼠血清以稀释度10³使用。

图4：免疫接种和攻击后寄生物血症延迟及体液应答。(A)在用野生型酵母或表达N或N-PbCS的酵母免疫后第42天收集的小鼠血清中的抗N IgG效价。效价在算术标度中以0-10¹表示，对数标度(log₁₀)中以10²-10⁵表示。对于N-PbCS小鼠的特定符号表示在A、B和F图中相同的动物。中位数值通过Wicoxon双样本检验(p＝0.4558)对比。(B)在用N-PbCS酵母免疫的小鼠中抗-PbCS IgG应答的动力学。OD_450nm以log₁₀标度表示。黑色箭头表示免疫时间表。井号(#)表示在10A组中抗-N抗体阴性小鼠。(C)用N-PbCS、N或野生型酵母免疫的小鼠和未接受处理(未免疫的)小鼠在用6,000GFP⁺Pb子孢子感染后的寄生物血症的平均和标准偏差log₁₀值。血液寄生物血症以追踪前7天的感染的红细胞(iRBC)与总RBC的百分比的log₁₀标度表示。星号(*)表示Mann-Whitney非参数检验的显著性水平：一个星相应于p<0.05，两个星相应于p<0.005。(D)死亡时间(天数，x轴)与iRBC/总RBC(y轴；算术标度)/小鼠之间的逆相关性。死亡原因在该表的上部示出。(E)在用6,000GFP⁺Pb子孢子攻击后免疫的小鼠的存活曲线。(F)用N-PbCS免疫的小鼠在第42天体液IgG应答分型。杆(bar)相应于每组的中位数值以log₁₀标度表示。星号(*)表示显著中位数差异(p<0.05；Mann-Whitney非参数检验)。井号(#)表示在10A组中抗-N抗体阴性小鼠。

图5：在免疫的小鼠中第42天的体液IgG应答分型(Isotyping)。用30YU N-PbCS酵母裂解物免疫的小鼠用(○)表示，用30YU N-PbCS热灭活的完整酵母免疫的小鼠用(●)表示，或者用酵母裂解物免疫的小鼠用(▲)表示。杆相应于每组的中间数值。星号(*)表示显著中位数差异(一个星号表示p<0.05，两个星号表示p<0.005，三个星号表示p<0.0005，Mann-Whitney非参数检验)。

图6：免疫的小鼠的实验攻击。(A)用N-PbCS、PbCS、N或野生型无佐剂的酵母裂解物免疫接种的小鼠中及在未免疫的小鼠中在用8,000GFP⁺伯氏疟原虫子孢子感染之后的寄生物血症的平均和标准偏差log₁₀值(实验2)。星号(*)表示显著中位数差异(两个星号表示p<0.005，三个星号表示p<0.0005；Mann-Whitney非参数检验)。(B)在攻击后第5天的寄生物血症。杆相应于中位数。星号表示显著中位数差异(p<0.005，Mann-Whitney非参数检验)。与未接受处理组相比在N-PbCS免疫接种的小鼠组中寄生物血症降低以倍数表示。

图7：30YU、150YU和300YU的N-PbCS在酵母裂解物中免疫原性。在第42天对体液IgG应答分型(Isotyping)：(A)IgG、(B)IgG1、(C)IgG2a和(D)IgG2b。杆相应于每组中位数值。无寄生物感染的小鼠的抗体效价以环形表示。(E)用N-PbCS在不同剂量和方案免疫的小鼠中及在未免疫的小鼠中用10,000GFP⁺伯氏疟原虫子孢子感染后的寄生物血症的平均和标准偏差log₁₀值(实验3)。(F)在攻击后第5天的寄生物血症。杆相应于中位数。与未接受处理组相比免疫组中寄生物血症降低以倍数表示。

图8：在攻击后第5天的寄生物血症。小鼠组用如下配方免疫及来自同一实验的未免疫的小鼠。

(A)-30YU N-PbCS、N或者野生型酵母裂解物，每两周一次共三次

(B)-30YU N-PbCS、N或者野生型酵母裂解物，每周一次共五次

(C)-150YU N-PbCS、N或者野生型酵母裂解物，每周一次共五次

(D)-300YU N-PbCS、N或者野生型酵母裂解物，每周一次共五次

杆相应于中位数。星号(*)表示显著中位数差异(一个星号表示p<0.05，两个星号表示p<0.005；Mann-Whitney非参数检验)。

图9：在用30YU N-PbCS酵母免疫接种后第42天小鼠的体液IgG应答分型。L，无佐剂的裂解物配方，每周施用一次共五次；AL，铝佐剂的裂解物配方，每两周施用一次共三次。杆相应于每组的中位数值。

图10：N-PbCS的有佐剂的和无佐剂的酵母裂解物的免疫原性。在第42天体液IgG应答的分型(Isotyping)：(A)IgG，(B)IgG1，(C)IgG2a及(D)IgG2b。杆相应于每个组的中位数值。无寄生物感染的小鼠的抗体效价以环形表示。星号(*)表示显著中位数差异(一个星号表示p<0.05，两个星号表示p<0.005；Mann-Whitney非参数检验)。

图11：在攻击后第5天寄生物血症对比。L，无佐剂的酵母裂解物(实验3)；AL，铝佐剂的酵母裂解物(实验4)。Alum，仅用铝免疫的小鼠组。杆相应于组中寄生物感染的小鼠的平均数。杆相应于中位数。星号(*)表示显著中位数差(p<0.05，Mann-Whitney非参数检验)。无寄生物感染的小鼠从计算中排除。与同一实验中的代表性未接受处理组相比在免疫组中寄生物血症降低以倍数表示。

图12：在PbCS的C末端(A)或N末端(B)截短的N-PbCS蛋白的示意图。MV-N，深灰色；PbCS，浅灰色。氨基酸编号根据来自MV Schwarz疫苗株的N蛋白和来自Pb ANKA株的PbCS蛋白给出。

图13：N-VP1融合蛋白(A)和NQD-VP1融合蛋白(B)的示意图。NQD突变体在Karlinet al,Virology 302,420-432(2002)中描述。给出了突变及其氨基酸位置。

图14：表达N-VP1的巴斯德毕赤酵母GS115的鉴定。在表达N-VP1(A)或NQD-VP1(B)的GS115裂解物的超离心级分和沉淀物中N和VP1蛋白的ELISA定量(标准化平均值来自一式两份的超离心管)。灰色带表示进行电子显微镜分析的集合的混合样品(每个离心管的级分18-26)。数值相应于在OD_450nm/620nm的光密度。SB：悬浮缓冲液。表达N(C)或N-VP1(D)的GS115的酵母的裂解物的电子显微镜分析。N-VP1样品相应于来自A图的集合的混合物(S1和S2一式两份)。箭头指向RNP棒状结构。

图15：巴斯德毕赤酵母GS115N-VP1酵母裂解物混合(MIX)样品的鉴定。(A)：在GS115N-VP1酵母裂解物超离心之后获得的集合的混合样品的Western印迹分析(S1和S2表示来自两个独立超离心管的级分18-26)。N，纯化的重组N蛋白。SNAP-VP1，纯化的重组SNAP-标签的P1蛋白。(B)：N-VP1条带(MixS1和MixS2)的平均强度的数字示意图(上图)，通过A图的抗-N抗体检测。柱状图示出相对于代表整体条带强度的总面积图(百分比)的每个峰的面积。

图16：免疫方案示意图。免疫时间表以天数(d)给出，放血时间点用周数给出。免疫方案A相应于每周一次免疫接种(d0、d7、d14、d21和d28)，而方案B是两周一次免疫接种(d0、d14和d28)。加强剂量在d58施用。

图17：在C57Bl/6小鼠中抗-VP1抗体应答的ELISA分析。将小鼠在皮下免疫接种30YU的表达N-VP1的巴斯德毕赤酵母及随后实施方案B。S5、S6、S7和S8是单独的小鼠。数据相应于1/100稀释的小鼠血清，在(A)图中给出。(B)图详述了跟踪前80天的在(A)图中给出的数据。OD：在450nm的光密度(参考波长：600nm)。

图18：在C57Bl/6小鼠中抗-N抗体应答的ELISA分析。将小鼠在皮下免疫接种30YU的表达N-VP1的巴斯德毕赤酵母及随后实施方案B。S5、S6、S7和S8是单独的小鼠。数据相应于1/100稀释的小鼠血清，在(A)图中给出。(B)图详述了跟踪前80天的在(A)图中给出的数据。OD：在450nm的光密度(参考波长：600nm)。

图19：N蛋白在GS115、KM71和SMD1168巴斯德毕赤酵母株中的表达。图中标示出在选择平板中针对特定克隆的Geneticin浓度以及克隆编号。酵母裂解物在western印迹加样之前以1/600稀释。

图20：N-PbCS在巴斯德毕赤酵母中的表达。(A)N-PbCS融合蛋白示意图。MV-N(灰色)由在N末端的核心结构域和在C末端的非结构化尾部结构域组成(Longhi S,2012,AdvExp Med Biol 725:126-141)。GAAGAGA接头以黑色表示。PbCS(白色)相应于中心重复区，两侧是蛋白质的N末端和C末端结构域的主要部分(Plassmeyer ML et al.,2009,J BiolChem 284:26951-26963)。氨基酸编号根据来自MV Schwarz疫苗株的N蛋白及来自Pb ANKA株的PbCS蛋白给定(序列详细内容在图21示出)。(B)表达N-PbCS或者(C)N的SMD1168的定量western印迹分析。在(B)和(C)中，将酵母裂解物如所标示地稀释，增加浓度的MV-N蛋白用作标准，western印迹用抗-N抗体探查。

图21：在GS115、KM71和SMD1168巴斯德毕赤酵母株中表达的N(SEQ ID No:2)(A)和PbCS(SEQ ID No:15)(B)蛋白的优化的核苷酸序列。N与PbCS之间的接头的核苷酸序列(SEQID No:26)在方框中以粗体表示(B)；(C)N-PbCS的Kyte-Doolitle亲水性分布图(DNAStrider1.4f18)：负值相应于亲水性氨基酸基序。

图22：表达单独N(871ng/YU(A))或者表达N-PbCS(12ng/YU(B))的SMD1168裂解物的超离心级分(U)和沉淀物中N或PbCS蛋白质的ELISA定量分析。酵母培养物、裂解物和超离心均一式两份进行(3U和4U表达N的酵母，及5U和6U表达N-PbCS的酵母)。数值相应于在OD_450nm(在OD_620nm数值作为参考)的光密度乘以样品稀释度。SB：悬浮缓冲液。

图23：一式两份的来自超离心样品(U)的级分(Fr)和沉淀物中总RNA(A、B和C)和总可溶蛋白质(TSP；D、E和F)。(A和D)用无插入体的pPIC3.5K转化的SMD1168巴斯德毕赤酵母；(B和E)表达N的SMD1168巴斯德毕赤酵母；(C和F)表达N-PbCS的SMD1168巴斯德毕赤酵母。SB：悬浮缓冲液。靶向基因插入的PCR分析证实通过NanoDrop^TM对总RNA含量分析在样品中不存在(源于细胞核的)基因组DNA。

图24：来自表达N(A)或N-PbCS(B)的SMD1168巴斯德毕赤酵母的酵母裂解物的电子显微镜分析。标示出比例尺。黑色箭头指示RNP棒及环形结构。

图25：在酵母中N或N-PbCS表达的免疫荧光分析(N染色，第三个柱；PbCS染色，第四个柱；及核，第二个柱)。每个图像均是间隔0.5μm的三个连续聚焦平面的最大强度投影。

图26：巴斯德毕赤酵母在YPD平板上在热灭活后的繁殖活性检测。每个斑点相应于250YU样品中的1YU(5×10⁷个细胞)，加样于YPD/琼脂平板上并在30℃培养7天。GS115加热处理的样品在水平线上从1至8编号，KM71处理组编号为9-16，SMD1168处理组编号为17-24。(A)GS115、(B)KM71和(C)SMD1168样品不进行加热处理，而所有其它斑点在58℃加热45分钟(1、2、9、10、17、18)或者60分钟(3、4、11、12、19、20)，及在60℃加热45分钟(5、6、13、14、21、22)或60分钟(7、8、15、16、23、24)。未处理组样品生长活跃(A、B和C)，而所有加热处理的样品(1-24)其繁殖活性均完整被阻滞(可见斑点相应于在平板上加样的1YU)。

图27：在免疫的小鼠中抗-巴斯德毕赤酵母IgG应答。将热灭活的野生型巴斯德毕赤酵母(25YU)直接包被(黑色柱)或者在连接后包被(白色柱)。结果(OD_450nm)来自WT、N、PbCS和N-PbCS免疫的小鼠组的1/1,000稀释度的血清样品。天然组未示出识别巴斯德毕赤酵母的交叉反应抗体(数据未示出)。井号(#)表示示出阴性抗-N应答的免疫的小鼠(图4A)。

实施例

实施例1：重组酵母产生和鉴定

合成并根据在巴斯德毕赤酵母(GeneScript^TM)中表达而优化N、PbCS及PbCS核苷酸序列，在EcoRI和NotI限制位点内克隆进pPIC3.5K质粒(Invitrogen)中以用于在甲醇诱导的AOX1启动子控制下进行酵母表达。在N-PbCS融合蛋白中，将具有7个氨基酸(GAAGAGA)的接头插入在N与PbCS基因之间。GS115、KM71和SMD1168酵母株通过电穿孔转化并铺板于RDB平板(组氨酸缺陷的培养基)以进行第一轮克隆选择(HIS+8克隆)。在YPD-Geneticin平板上进行具有多个插入序列的克隆的筛选，抗生素终浓度为0.25-4.0mg/ml(G8168-100，Sigma-Aldrich)。关于酵母培养基和平板的详细描述见针对巴斯德毕赤酵母的Invitrogen用户手册所述。

基于甲醇诱导监测N、PbCS和N-PbCS蛋白质表达的动力学和水平。将酵母克隆在BMG培养基中培养过周末，然后转移至BMM培养基中，通过每24小时在培养物中加入0.5％甲醇诱导并维持蛋白质产生。在裂解之前，通过分光光度法在OD_600nm分析以确定酵母细胞的数量。收集的培养样品每24小时使用酸洗涤的玻璃珠(425-600μm；G8772Sigma-Aldrich)和裂解缓冲液(Breaking Buffer)(Invitrogen)进行裂解。在机械裂解之后，酵母提取物在134g离心10分钟，然后通过在371g离心15分钟澄清上清。在变性条件下在具有XT MOPS缓冲液(Criterion 345-0123，Bio-Rad)的4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上进行Western印迹(WB)，使用Color PlusTM Prestained Protein Ladder(7-200kDa；P7711BioLabs)、硝化纤维膜(HybondTM-C Extra RPN303E；Amersham Biosciences)及作为一级抗体的抗-N克隆25或120(Buckland R et al.,1989,J Gen Virol 70(Pt 2):435-441)或者抗-PbCS抗体，抗-PbCS抗体由作为BEI Resources Repository,NIAID,NIH的一部分的Malaria Researchand Reference Reagent Resource Center(MR4)获得：小家鼠(B细胞)；小家鼠(骨髓瘤)3D11，MRA-100，由V Nussenzweig保藏。一级抗体以1/1,000稀释度在4℃过夜，二级HRP-缀合的绵羊抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare UK Limited,NA931V)以1/5,000稀释度在室温1小时30分钟。在定量WB中，将选择的克隆在BMM中诱导，在54小时时终止培养。通过分光光度法分析(OD_600nm)量化酵母(酵母单位，YU)并裂解。裂解的样品如所示稀释，并以预定数量(10-20ng)与N标准蛋白质(GenScript)平行加样于凝胶上。抗-N克隆25用作一级抗体。N和N-PbCS条带强度通过发光图像分析仪(Luminescent Image Analyzer)LAS-1000plus(FUJIFILM)量化，并报道在N标准曲线上。裂解物中总可溶蛋白质(TSP)通过Bio-RadBradford测定测量。

在巴斯德毕赤酵母中表达的MV RNP的大小

在甲醇诱导54小时后，在冰上终止酵母培养，并将样品(4,325YU)裂解及重悬浮于2ml悬浮缓冲液(SB：TrisHCl 25mM pH 7.5，NaCl 50mM，EDTA 2mM于UltraPure^TM无DNase/RNase蒸馏水中)，其中补加了抗蛋白酶混合物(Roche)及rRNasin RNase抑制剂(Promega)。将2ml样品加样于9ml在SB中的20％蔗糖垫中，在SW41Ti转子中以36,000rpm在4℃离心1小时。使用连身泵取样机(Cole-Parmer)收集1ml级分。将沉淀物重悬浮于1ml SB中。通过Bio-Rad Bradford测定、NanoDropTM1000分光光度计和抗-N或抗-PbCS夹心ELISA，分析包含沉淀物的每个等份的总可溶蛋白质(TSP)、总RNA及N或N-PbCS蛋白浓度。对在134g离心之前和之后的裂解的酵母培养物及对澄清的裂解物进行的PCR分析是通过传统方案进行，使用得自Invitrogen的Taq DNA聚合酶，5’AOX1(Invitrogen)和3’NOPT-INTER(5’-TTGTTCAGTCTGACCAGTCTC)引物在重组酵母基因组上产生一个437个核苷酸条带。抗-N和抗-PbCS夹心ELISA是在碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中包被0.5μg/ml小鼠抗-N(MAB8906Millipore)或者1/2,000稀释度的MR4-100抗-PbCS单克隆抗体，并且使用在1×PBS中的稀释度1/10,000的抗-N兔多克隆IgG抗体(ABIN346975Antibodies-Online GMBH)作为一级抗体，在1×PBS中的稀释度1/7,000的抗-兔IgG-HRP(NA934V AmershamBiosciences)作为二级抗体。抗-N ELISA阳性对照是表达N蛋白的SMD1168，裂解并在1×PBS中以1/200、1/400和1/800稀释。加样于超离心管之前，抗-PbCS ELISA阳性对照是N-PbCS SMD1168裂解物(1/200)。ELISA平板使用EnSpire 2300Multilabel分析仪(PerkinElmer)在OD_450nm读取，使用OD_620nm作为参考波长。从无酵母(仅在20％蔗糖上加样SB)的超离心管中收集的级分和沉淀物在所有进行的检测(ELISA、NanoDrop^TM和Bradford)中均示出反应物阴性背景。

根据传统Svedberg方程的沉降计算程序已经用于预测感兴趣的蛋白质从超离心管中的溶液上表面移动的距离(cm)。这个计算程序考虑到：(i)蛋白质质量和结构以估计vbar和Sw20沉降参数；(ii)重组离心管特性和转子直径；(iii)每个溶液相的蔗糖百分比和体积；(iv)超离心时间；及(vi)旋转速度(rpm)。

电子显微镜检查

将表达N或N-PbCS的SMD1168酵母如上述裂解和澄清。对N澄清的裂解物直接进行EM，而N-PbCS澄清的裂解物通过超离心浓缩，通过在20-60％蔗糖梯度在32,000rpm(SW32Ti)离心1.5小时。收集中间相的级分，在30％蔗糖垫上在32,000rpm(SW32Ti)进一步超离心4小时以收集沉淀物。将样品点印在辉光放电碳包被的网格上(EMS，美国)，并用NanoW^TM(Nanoprobes,USA)负染色(Desfosses A et al.,2011,J Virol 85:1391-1395)。然后用Philips/FEI CM 12透射电子显微镜在120kV观测样品。使用KeenViewTM相机(OSIS，德国)和ITEM软件(OSIS，德国)记录图像。RNP长度和直径以手工计数的50个颗粒的平均测量值估算。测量标准偏差为5％。

免疫荧光分析

在诱导蛋白质表达之后，将50YU/样品用3.7％甲醛固定。细胞壁用溶细胞酶(Sigma-Aldrich:L2524-50KU)消化，并将细胞通过甲醇/丙酮再次固定，并附着于显微镜载玻片上，如Keeling et al.(Keeling JW,Miller RK,2011,Methods Mol Biol 782:231-244)所述。将细胞用兔多克隆抗-MV-N(Covalab pab0035；1/500稀释度)或者MRA-100小鼠抗-PbCS单克隆抗体(1/1,000稀释度)标记，然后Alexa 488山羊抗-兔IgG(H+L)(Invitrogen A-11008；1/500稀释度)或CY3-AffinityPure F(ab’)2Frag山羊抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoReasearch 115-166-072；1/1,000稀释度)作为二级抗体。在机动的(motorized)倒置宽场荧光显微镜上获得明视野和荧光图像。该系统由AxioVision软件(Release 4.8.2.0,Zeiss)控制，由机动的倒置显微镜(AxioObserver Z.1,Zeiss)组成，装备了卤素照明器(HAL100,Zeiss)、金属卤化物照明器(HXP120,Zeiss)及CCD相机(AxioCamMR,Zeiss)。DAPI、Alexa Fluor和Cy3使用特定滤器检测。间隔0.5μm的6个焦平面堆叠使用100×油镜(EC Plan-Neofluar 100x/1,30Oil Iris,Zeiss)获得。然后将图像用ImageJ软件(Schneider CA et al.,2012,Nat Methods 9:671-675)处理。

巴斯德毕赤酵母的热灭活

将GS115、KM71或SMD1168酵母株在YPD培养基中在30℃培养，将250YU在134g离心沉淀10分钟，小心除去培养基，将酵母沉淀物在指定温度和时间点在水浴中处理。热灭活通过将样品转移至冰上而终止。然后将每个样品的1YU铺板于YPD/琼脂上，在30℃培养7天。通过将20μl亚甲蓝溶液(Sigma-Aldrich；0.05mmol-1 3于PBS pH 7.2中)加入同体积酵母细胞悬浮液中进行存活性检测，死亡细胞计数在光学显微镜下进行。对于免疫，将完整的SMD1168野生型酵母或者表达N、PbCS或N-PbCS的酵母(54修饰培养物)在60℃热灭活45分钟，以30YU/50μl重悬浮于1×PBS中。

小鼠免疫、流式细胞计量术、存活率和ELISA分析

6周龄的C56Bl/6雌性小鼠根据European Directive 2010/63/EU要求圈养及列入在实验方案组中。将实验方案递交Ethic Comity Ile-de-France-Paris1(advise n^er2012-0009)并由其许可。从到来至死亡(研究终点)每天监测小鼠。在对应的腹股沟淋巴结为小鼠进行皮下注射(50μl)，在第一次免疫接种之前3天(天数减3)或者在下一次免疫接种之前6小时进行放血(100μl)。在最后一次放血后(d42)，将小鼠在d43用6,000个子孢子/小鼠攻击(1μl，在后足垫进行皮内注射)。子孢子是从用在hsp70启动子控制下表达GFP(GFP⁺)的Pb ANKA株感染的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的唾液腺解剖中新鲜收集的[63]。在攻击后(c+)，从c⁺3至c⁺7每天从尾部收集血样(2μl)，在600μl1×PBS中稀释并在平板中通过荧光激活的细胞淘选法(FACS；Miltenyi Biotec)分析。红细胞(RBC)的双联(Doublets)和集簇从计数中除去。估算总RBC中单一GFP⁺RBC(感染的RBC，iRBC)，数据通过MACSQuantify^TM软件分析。每天登记攻击后的死亡数直至全部小鼠死亡(c⁺29)。在研究终点之前不有意处死小鼠，因为死亡评分是确定接种对于最终增强的脑型疟抗性及延长的存活时间的效力所必需的。在这个临床前研究中没有评估疫苗效力可接受的减轻处理。对于血液中IgG定量，通过T-MG毛细管血液收集系统(Terumo Medical Corporation)从血样中分离放血血清并在-20℃贮存直至进行ELISA测定。抗-N IgG ELISA通过在孔中包被50μg的>70％纯的重组N蛋白(Genscript)进行及使用在1×PBS、Tween 0.05％和BSA0.5％中1/5,000和1/20,000稀释度的单克隆小鼠抗-N一级抗体(MAB8906,Millipore)作为阳性对照。抗-PbCS IgG ELISA通过在孔中包被50μg重组PbCS蛋白而进行，所述蛋白质是在巴斯德研究院(Institut Pasteur)的重组蛋白质和抗体生产核心实验室产生的，使用BioPod F800微型发酵罐电池(Fogale Nanotech)(Frachon E et al.,2006,Appl EnvironMicrobiol 72:5225-5231)。来自MR4-100反应物的抗-PbCS单克隆抗体以1/4,000和1/10,000稀释度用于阳性对照。通过在碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中包被25YU的完整或裂解的野生型巴斯德毕赤酵母/孔进行抗-巴斯德毕赤酵母IgG ELISA。酵母如所述预先培养、灭活及裂解。完整的或裂解的酵母的孔中饱和度通过ELISA定义，使用1/200稀释度的抗巴斯德毕赤酵母兔多克隆抗体(BP2240，Acris Antibodies)及1/10,000稀释度的抗-兔IgG-HRP(NA934V Amersham Biosciences)。在对所有血清样品进行的ELISA中，使用系列稀释液(对于抗-N和抗-PbCS ELISA使用1/100、1/1,000、1/10,000和1/100,000稀释度；对于抗-巴斯德毕赤酵母ELISA使用1/300和1/1,000)、在1×PBS中1/5,000稀释的HRP-缀合的绵羊抗-小鼠IgG二级抗体(NA931V，GE Healthcare UK Limited)及3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(TMB；Sigma-Aldrich)。在5分钟后用2N H₂SO₄终止ELISA进展，并在OD_450nm读取平板，使用OD_620nm作为参考波长。在IgG同种型的ELISA确定中，来自Southern Biotech的多克隆山羊抗-小鼠ads-HRP IgG(1030-05:稀释度1/8,000)、IgG1(1070-05；稀释度1/4,000)、IgG2a(1080-05；稀释度1/4,000)和IgG2b(1090-05；稀释度1/4,000)用作二级抗体。将血清经两倍稀释从1/50稀释至最大1/614,400。效价以OD_450nm信号高于截止值(平均光密度加上研究小鼠预先免疫的对照血清的3倍标准偏差)的最高样品稀释度的倒数确定。进行Mann-Whitney非参数检验和Spearman检验，使用美国加州圣地亚哥GraphPad软件的针对Mac OSX的GraphPad Prism version 5.0b(www.graphpad.com)进行。

实施例2：RNP-酵母疫苗平台的固有性质

重组RNP酵母；裂解物与完整的热灭活酵母配制物的对比

在完整的热灭活酵母内的抗原递送已经证实高度有效。酵母细胞壁成分代表PAMP(病原体相关的分子模式)，这被免疫系统、尤其是树突细胞认为是危险信号，使得酵母是一种有效的递送载体(Neumann A.K.et al.,2010,PLoS Pathog 6,e1000760；Stubbs,A.C.etal.,2001,Nat.Med.7,625-629)。为了研究由酵母内部成分提供的佐剂作用，本发明人评估了在酵母裂解物内的N-PbCS RNP递送，并将其与完整酵母疫苗配制物进行对比。产生酵母裂解物(通过用玻璃珠的传统机械裂解获得并部分除去细胞膜和细胞核级分)，重组蛋白质含量通过定量western印迹测量。确立的酵母裂解物生产的实验条件提供了高度可再现性。

为了能对比不同攻击实验中的保护性效力，本发明人评估了在未接受实验的小鼠中攻击的可再现性，在不同时间点进行的四个实验中使用单独批次的伯氏疟原虫子孢子。在所有四组中在攻击后第5天的寄生物血症根据Mann-Whitney非参数检验是统计学相当的(图1)。因此，子孢子批次的感染性是可再生的，使得本发明人可以对比在单独的攻击实验中获得的结果。

使用与针对完整重组酵母相同的免疫时间表和小鼠组检测在无佐剂的酵母裂解物内N-PbCS RNP递送(图2)。在1-2次免疫接种后出现抗-PbCS抗体应答(图3A)，而使用完整的热灭活酵母在第2-4次接种后出现(图4B)。使用30YU的N-PbCS酵母裂解物进行5次免疫接种诱导与如在攻击前时间点确定的在完整的热灭活酵母(3×10⁴)内N-PbCS免疫接种(图5)相比更同质的抗-PbCS抗体效价及更高的效价水平(10⁵)。此外，在这两个配制物之间不同的抗体同种型模式(尤其是IgG2a)表示由裂解的或完整酵母配制物提供的佐剂对于抗PbCS免疫应答的Th1和Th2极化具有不同的作用。在N-PbCS裂解物免疫组中检测到的抗-N应答在1-2次免疫接种后出现，在第3次免疫后达到高台水平，在随后的免疫中保持这个水平直至攻击前时间点，而在用完整的热灭活的N-PbCS酵母免疫的小鼠中，抗-N抗体在2-4次免疫接种后出现，在一些小鼠中持续增长直至攻击前时间点(数据未示出)。

令人惊奇地，抗-PbCS应答甚至在用具有非多聚的PbCS的酵母裂解物免疫接种的小鼠中存在(这不是等同于完整的热灭活配制物的情况)，然而比在裂解物中具有多聚PbCS的水平低2-log(图5)及比在完整酵母配制物中具有多聚PbCS的水平低1-log。

然而，当攻击免疫的小鼠时，无多聚的PbCS的小鼠示出寄生物血症无延迟，表明引起的抗-PbCS体液应答对于对抗鼠伯氏疟原虫感染无保护作用，并且对于完整酵母配制物，需要在酵母裂解物中PbCS的多聚化递送以诱导抗原特异性保护性免疫应答(图6A)。事实上，在用8,000个伯氏疟原虫子孢子攻击时，用N-PbCS酵母裂解物免疫组与未接受处理组相比寄生物血症明显延迟(3.3-倍)(图6B)。相当的寄生物血症延迟是通过热灭活的完整酵母递送N-PbCS而获得(4-倍)。

这些结果表明失去酵母细胞壁的酵母裂解物提供佐剂，但是因为其仅呈现完整酵母递送胚胎的一部分，似乎其以不同方式刺激免疫系统。然而，尽管事实是N-PbCS酵母裂解物在诱导抗-PbCS体液应答中比完整的热灭活的N-PbCS酵母更有效，但是这两个配制物之间抗-PbCS抗体效价和IgG同种型模式的不同未能预测接种对于寄生物血症的不同影响，这两个配制物获得对抗伯氏疟原虫攻击的相同益处。

PbCS抗原剂量递增

N-PbCS RNP在完整酵母细胞中的递送受限于酵母的量(30YU)，其不能安全地施用小鼠而不导致在注射部位的严重局部炎症(数据未示出)。由本发明人进行的初步研究表明每两周施用一次共三次(three bi-weekly)30YU的完整的热灭活酵母证实不足以诱导强力抗-PbCS抗体，且对于攻击无有益作用，而每周一次共五次施用相同剂量则显著降低寄生物血症和临床结果，如上文所述。由于酵母裂解物可以浓缩，因此在酵母裂解物内RNP的递送允许增加N-PbCS RNP的剂量及可以评估更高剂量的N-PbCS对于寄生物血症的效力。

每周一次共施用五次剂量的30YU、150YU和300YU的N-PbCS酵母裂解物之间的对比未证实在N-PbCS体液应答IgG效价中剂量依赖性作用是相当的且达到3×10⁵，这似乎是高台值(图7A、B、C、D)。此外，对比使用相同抗原/裂解物剂量在每两周一次共三次(30YU×3)与每周一次共五次(30YU×5)的免疫方案，示出每周一次注射是触发较早的(从第7天开始)抗-N和抗N-PbCS抗体应答所必需的，这与使用完整酵母配制物的情况一样(数据未示出)。事实上，在攻击前时间点(第43天)，在每周一次共五次的免疫方案中抗-PbCS效价与在每两周施用一次共三次的免疫方案相比增加1-log(中位数分别为2×10⁵和1.9×10⁴)(图7A)。

寄生物血症延迟是剂量依赖性的，使用三次免疫接种30YU N-PbCS酵母裂解物与未接受处理组小鼠相比对于寄生物血症无影响，五次免疫接种30YU、150YU和300YU在第5天导致寄生物血症分别降低2.3-倍、4.2-倍和8.4-倍(无寄生物感染的小鼠从计算中排除)(图7E、F)。此外，在300YU组中的一只小鼠在整个跟踪的研究期间(攻击后30天)保持阴性寄生物血症，并发展为无疟疾临床迹象，表明对抗伯氏疟原虫感染的无菌性保护作用。注意接受三次或五次免疫接种30YU的N-PbCS酵母裂解物的小鼠与接受150YU和300YU的小鼠相比呈现出较少的脑型疟(数据未示出)。然而，每组小鼠的数目不足以确定这种作用是否具有统计学意义。

较高剂量的酵母裂解物(150YU和300YU)通过集合一些酵母裂解物而制备，纯RNP浓度在技术上是不可能的。结果，“酵母背景”在这些配制物中成比例地增加。然而，用可比较剂量的N和野生型酵母免疫的小鼠对照组在整个研究中始终存在，检测到N和野生型酵母无显著影响(图8)。

这个数据表明在基于N的RNP上递送较高剂量的PbCS增强疫苗候选物对抗伯氏疟原虫感染的保护性效力。

解释参与的免疫机制的初步尝试

如上文所述，在酵母裂解物中获得的增加剂量的N-PbCS提供了对抗攻击的更好的保护作用。平行地，使用铝(氢氧化铝)佐剂的30YU N-PbCS裂解物免疫的三只小鼠的初步实验示出总的抗-PbCS IgG应答与通过等价物佐剂的裂解物配制物诱导的那些应答相当(图9)。然而，通过两个对比的配制物诱导的IgG模式不同(图9)。较高效价的IgG1及较低效价的IgG2a和IgG2b表明铝对Th2应答的增强作用，根据其固有的抗体刺激性质实现(Gupta,R.K.et al.,2000,Vaccine Adjuvants)。在本发明的模型中，未能提供涉及抗-PbCS T细胞应答的直接证据，因为在C57Bl/6小鼠中未鉴别出来自PbCS的T细胞表位，因此T细胞应答的参与通过抗-PbCS IgG分型间接评估。

为了评估是否可以发现这样的实验条件以诱导通过用N-PbCS RNP免疫提供的无菌性保护作用，将高剂量(50YU、100YU和150YU)的N-PbCS酵母裂解物(分别为215ng、430ng和645ng的PbCS)通过每两周一次共三次注射方案在存在50μg/剂铝佐剂条件下施用小鼠。选择每两周施用一次的方案，因为我们的初步结果表明小鼠不良好耐受用具有铝佐剂的每周一次共五次的免疫方案，导致对攻击的易感性增加(数据未示出)。用铝-佐剂的N-PbCS酵母裂解物进行免疫接种与用150YU和300YU N-PbCS在不存在铝佐剂的条件下获得的最高应答相比引起抗-PbCS抗体效价增加1-log(图10)。显然，由所有含铝配制的剂量(50YU、100YU和150YU)诱导的抗-PbCS抗体应答在第42天均达到相同的中位数效价(106)，这似乎是抗-PbCS抗体应答的高台值。在这些组的每一组中，六只小鼠中的两只小鼠对于10,000个伯氏疟原虫子孢子攻击是被无菌性保护的，而其它四只小鼠表明寄生物血症显著降低(在用50YU、100YU和150YU免疫组中在攻击后第5天分别是9.7-倍、8.7-倍和6.7-倍，无寄生物感染的小鼠从计算中除去)(图11)。在三个检测的剂量中，铝佐剂的最小剂量(50YU)的N-PbCS酵母裂解物足以诱导PbCS介导的保护作用。显然，先前用表达N蛋白的完整重组酵母观测的对于寄生物血症的非特异性益处对照在用铝佐剂的N裂解物免疫组中未鉴别。

如先前所观测，在抗-PbCS抗体效价与无菌性保护作用之间无相关性，因为小鼠组呈现出在抗体效价中相对一致的结果，无菌性保护的小鼠未示出最高的抗-PbCS效价。在用佐剂和非佐剂的N-PbCS裂解物免疫的无菌保护的小鼠中观测到寄生物血症降低未证实一种配制物相对于另一种配制物的优势，假设高剂量的N-PbCS在所有疫苗候选物中对于保护性效力具有最显著的影响。

总之，本发明人评估了递送N-PbCS RNP疫苗的三种不同的配制物：完整的重组酵母、无铝佐剂的酵母裂解物及有铝佐剂的酵母裂解物。两种裂解物配制物均允许PbCS抗原的施用量成比例增加，这可以仅在完整的重组酵母配制物中初步优化。通过用30YU(130ngPbCS)的完整的重组酵母免疫获得寄生物血症显著降低(4-倍)，使用没有铝佐剂的300YU(1300ng PbCS)酵母裂解物，这种降低可以达到8.4-倍。N-PbCS RNP(50-150YU，相应于215-645ng PbCS)组合铝佐剂在一些小鼠中产生无菌性保护作用(六只小鼠中的两只)及在同一免疫组中的其它小鼠中显著降低寄生物血症，程度与无佐剂的300YU组相同。

增加基于RNP的疫苗候选物效力的多种方法

用在热灭活的完整酵母内递送的N-PbCS RNP进行免疫提供了针对伯氏疟原虫攻击的无可非议的有益作用。利用在所有进行的实验中获得的结果，本发明人确定在热灭活的配制物中N-PbCS的剂量是次佳的。通过增加裂解物单价配制物中N-PbCS的剂量，增强保护性效力，但是不能绕开(bypass)一定的阈值。这个结果与多个临床前研究和临床研究的结果一致，表明基于CS蛋白的单价疫苗候选物不能提供针对疟疾的完全的无菌保护作用(Schwartz et al.,2012,Malaria Journal,11,11)。因此，本发明人评估了使用重组RNP平台在热灭活的完整酵母中多聚其它抗原并产生多价疫苗配制物的可能性。

为此目的，将在感染人的疟原虫物种中具有功能和结构同系物的五种伯氏疟原虫蛋白PbTRAP、PbSPECT、PbSPECT2、PbSUB1和PbSUB2与N蛋白融合在SMD1168巴斯德毕赤酵母中表达，使用与PbCS基因相同的实验方案进行。虽然来自恶性疟原虫的的TRAP已经在一些亚单位疫苗候选物中评估(在人体实验中在ChAd-MVA初免-加强配制物中针对感染具有20％效力)(Ewer et al.,2013,Nat.Commun.,4,2836)，本发明人了解到其它四种蛋白质仍未在临床前实验或临床实验中检测其免疫原性。选择这些伯氏疟原虫蛋白进行研究是基于其在疟原虫感染的红细胞前和红细胞阶段的功能相关性。

在不同的诱导时间点，与N和N-PbCS选择相似地进行表达最高量N-PbTRAP、N-PbSPECT、N-PbSPECT2、N-PbSUB1和N-PbSUB2融合蛋白的重组酵母克隆的选择。这些蛋白质的最佳诱导时间和最高表达水平是可变的，但是与PbCS抗原一样，所述融合蛋白产量低于单独的N蛋白及最终的单独的抗原的表达水平(表1)。

表1：在单独的SMD1168巴斯德毕赤酵母中或者在与MV N融合蛋白中伯氏疟原虫蛋白质的表达。

五种获得的融合蛋白的免疫原性和保护性效力首先在单价配制物中评估。检测不同的参数以鉴别针对每个抗原的最佳免疫方案，如配制物(热灭活的完整酵母或者铝佐剂的酵母裂解物)、剂量(在这两种配制物中均为3YU、30YU，及在铝佐剂的裂解物中150YU)以及施用时间表(三次或五次免疫，每周一次或每两周一次)(表2)。由于参数的高可变性，每组仅三只小鼠用于筛选，在三种情况中当结果有歧义时，使用六只小鼠再次进行实验以证实数据(3+6只小鼠，表2)。根据免疫方案，抗-TRAP和抗-SPECT2抗体可以在攻击前时间点在不同水平检测。通过“自制”ELISA(如Jacob et al.,2014,PLoS ONE 9,e86658所述进行，使用在大肠杆菌中重组产生的伯氏疟原虫蛋白)，在评估的免疫方案中检测到无抗-SPECT、抗-SUB1和抗-SUB2抗体。引起的抗-N抗体的水平根据所述配制物及融合抗原是高度可变的。

独立于体液免疫应答和使用的免疫参数，无一抗原-配制物设置是对抗伯氏疟原虫攻击具有保护性的，通过在攻击后3-7天在免疫组中与未免疫的未接受处理的小鼠组相比不存在寄生物血症延迟而判断(表2)。尽管检测的单价配制物不提供保护作用，但是仍评估表达不同N-抗原的热灭活的酵母的两个组合。第一个组合由15YU N-PbSPECT2、3YU N-PbSUB1和15YU N-PbSUB2的表达酵母混合物组成，第二个组合由15YU N-PbCS、15YU N-PbSPECT2和3YU N-PbSUB1表达酵母组成。这两个组合均在完整的热灭活的配制物中施用(33YU/免疫接种)，每周施用一次共五次。其无一对伯氏疟原虫攻击具有保护性。因此评估的五种伯氏疟原虫蛋白质使用不同酵母配制物(完整酵母或酵母裂解物)与N蛋白融合在单价或多价配制物中均未提供关于寄生物血症的任何益处。具有较强抗原性性质的疟原虫蛋白质的鉴别是为基于在热灭活的完整酵母中递送的重组RNP产生多价疫苗候选物所必需的。然而，这项研究证实酵母-RNP平台潜在地适于设计多价疫苗，通过各种抗原在酵母中与MV N融合的表达及混合这些重组酵母而实现。

表2：N-PbTRAP、N-PbSPECT、N-PbSPECT2、N-PbSUB1和N-PbSUB2单价配制物在小鼠中的免疫原性和保护性效力。HI，热灭活的酵母；AL，铝佐剂的酵母裂解物。抗体应答如果在所有小鼠中均检测到用“+”表示，如果在一些小鼠中检测到用“+/-”表示，如果在任何小鼠中均未检测到用“-”表示。

针对热灭活的完整酵母递送的表达优化：N-PbCS和N-PfCS.

用N-PbCS酵母裂解物免疫小鼠已经明确证实N-PbCS剂量与有益结果之间的相关性。通过ELISA而不是通过western印迹筛选N-PbCS克隆尝试相对高产量地选择表达N-PbCS的巴斯德毕赤酵母SMD1168克隆。通过这种方法，检测多达80个克隆，但是这种尝试获得与这项研究中使用的克隆均相似N-PbCS表达水平的克隆。这提示应该进行较高通量的选择或者PbCS蛋白或酵母的固有性质与N-PbCS表达的高台水平相关(初级氨基酸结构或者对于酵母细胞的毒性)。为了检测第二个假说，本发明人评估了与N融合的截短形式的PbCS的产生。由于蛋白质的中心重复部分是高度免疫原性的，因此PbCS的N-或C-末端结构域或者可以从N-PbCS融合基因中缺失(图12)。SMD1168酵母用如先前所述与N融合的两种截短形式的PbCS之一转化(PbCS-ΔNterm或者PbCS-ΔCterm)。N截短的N-PbCS克隆(N-PbCS-ΔNterm)在SMD1168中不能获得，而C截短的形式(N-PbCS-ΔCterm)最佳选择的克隆中以237ng/YU表达，这比全长N-PbCS(12ng/YU)高20倍(表3)。这个结果表明独特的蛋白质结构域的氨基酸成分影响融合蛋白的表达水平。

本发明人然后评估了与N融合的PfCS在巴斯德毕赤酵母中的表达水平，PfCS是来自感染人的恶性疟原虫的CS抗原。N-PfCS成功在GS115和KM71中表达，表达水平为97ng/YU(表3)，这比在上述临床前研究中使用的N-PbCS高接近1-log(Jacob et al.,2014,PLoSONE 9,e86658)。这提示与N融合的蛋白质在巴斯德毕赤酵母中的表达是序列和酵母株特异性的，及进一步的PbCS和PfCS序列优化为产生作为疟疾疫苗候选物在优化完整的重组酵母评估中具有较高表达水平酵母克隆所必需。

表3：在巴斯德毕赤酵母中与MV N融合的PbCS和PfCS表达的优化。“-”表示未尝试在指定条件下蛋白质表达，“N/A”表示由于快速降解不能获得蛋白质表达。

实施例3：针对其它感染性疾病的完整的重组酵母：肠道病毒71(EV-71)实例

由于其免疫原性和自主佐剂性质，本发明人建议所述酵母-RNP平台可以用于影响人体的各种病理学中。为了证实这点，本发明人研究了这种新的疫苗平台针对肠道病毒71(EV71)感染的效力。EV71是导致手足口病(HFMD)的因素，这种疾病严重影响5岁以下的儿童，引起神经系统并发症并导致死亡(Solomon et al.,2010,The Lancet InfectiousDiseases,100,778-790)。如先前针对PbCS所述，将EV-71病毒的主要的抗原性VP1衣壳蛋白(Chen et al.,2008,Vaccine,26,2882-2889；Wu et al.,2001,Vaccine,20,895-904)在C末端与N融合(图13)。转化巴斯德毕赤酵母，并且与N-PbCS相反，N-VP1在GS115株中表达，表达水平为94ng/YU，但是在SMD1168株中降解(表4)，再次提示对于每个指定抗原均需要进行实验性评估序列特异性和最佳酵母株。EV71VP1与N融合及维持RNP形成的可能性通过电子显微镜分析Mix样品中包含的级分，随后酵母裂解和超离心而验证(图14A、C和D)。重组RNP上VP1的存在通过对混合(Mix)样品进行western印迹分析证实，通过电子显微镜观测(图15)。

表4：EV-71蛋白VP1在单独的巴斯德毕赤酵母或者在与MV N融合中的表达

中和抗-VP1抗体与免于EV-71的保护作用相关(Lee et al.,2010,Expert RevVaccines 9,149-156；Wu et al.,2001,Vaccine,20,895-904)。进行使用完整N-VP1RNP重组酵母的免疫方案并收集血清以评估抗-VP1体液应答。由于EV-71感染通过口服途径发生，因此这种病毒提供了检测用携带N-VP1RNP的完整酵母口服免疫的相关性的完美模型，以在病毒感染部位直接引起粘膜免疫性。

用重组巴斯德毕赤酵母免疫以产生在VP1蛋白质表面上暴露的RNP

免疫方案的示意图在图16中示出。概括而言，根据图中所示方案A或B，经皮下或口服用表达本发明的在RNP中作为融合蛋白的VP1蛋白热灭活的巴斯德毕赤酵母免疫小鼠(C57BL/6)。根据进行的实验，酵母的施用剂量为0、0.3、3和30YU。在根据方案A或B施用多次剂量后，在第58天施用加强剂量。

进行ELISA以确定得自各个实验的抗-VP1效价，最佳结果在图17中报道；在相同免疫背景下也测量抗-N抗体效价(图18)。

当在皮下施用时，热灭活的酵母在30YU剂量即在最高的检测剂量以最低注射次数提供更高的免疫作用(根据方案B)。对于N和VP1抗原获得相同的结论。相反，口服免疫不提高针对VP1蛋白的清晰应答(观测到背景信号，及在第58天的加强免疫未示出明确作用)。针对N蛋白，当以最低施用次数施用时，施用的最低剂量(0.3YU)提供最佳结果(方案B)。

实施例4：酵母中蛋白酶的裂解位点

在酵母细胞中，蛋白酶识别表达的异源蛋白质中的特异性裂解位点。这些蛋白酶及其裂解位点仍未阐述。不同的巴斯德毕赤酵母株(即GS115vs SMD118)具有特异性蛋白酶。因此，一旦重组蛋白质在特异性酵母株中表达，则其可经历巴斯德毕赤酵母株相关蛋白酶的降解。对许多N-X融合蛋白(其中X是感兴趣的抗原)进行的实验示出取决于X，N-X消化模式(在N-X诱导、酵母裂解及抗-N和抗-X WB之后后显示)是X-特异性的，在相同酵母株中在相同蛋白质诱导时间点高度可再生，显示一些蛋白质条带。还未明确这种模式是否相应于完整酵母细胞内部的实际情况，因为为了分析这种模式，酵母必须被裂解。蛋白酶在裂解及裂解物处理后可起作用(即使在裂解期间使用抗-蛋白酶混合物)。但是在任何情况中，蛋白质消化模式均相应于在高度特异性位点蛋白酶裂解。

在完整的和裂解物酵母配制物两种形式中，在疫苗批次中存在N-X蛋白的所有长度变体(如果证实存在)，因此一旦疫苗平台根据用于产生疫苗批次的参数校准，则蛋白酶活性是不相关的。

但是，时刻记住可以增加酵母内部的N-X全长产生和/或疫苗免疫原性，通过改变巴斯德毕赤酵母生产株或者通过根据经验修饰相应于蛋白酶裂解位点的蛋白质序列以改变N-X蛋白的消化模式。可以通过对N-X蛋白质条带进行质谱分析和蛋白质测序分析对裂解位点作图。裂解位点的中和化将增加N-X全长相关的产品。

结果

麻疹病毒核蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

优化编码麻疹病毒疫苗(MV)Schwarz株(Combredet C et al.,2003,J Virol 77:11546-11554)的核蛋白(N)的核苷酸序列以在巴斯德毕赤酵母中表达，并克隆进在甲醇可诱导的AOX1启动子控制下的pPIC3.5K质粒中。将三个巴斯德毕赤酵母株(常用的GS115和KM71，以及SMD1168，后者是蛋白酶A活性缺陷的)用所述重组质粒转化，并扩增10个阳性克隆/株。N表达的第一个动力学研究通过酵母裂解物的western印迹分析进行。发现N表达的最佳时间点是在甲醇诱导这三个巴斯德毕赤酵母株之后54小时(h)。然后通过对在诱导后54h收集的酵母裂解物进行western印迹分析以选择每个酵母株的最佳N表达克隆。这些克隆示出相当重量的全长未降解的N的最高水平表达(图19)。N表达通过Bradford分析和定量western印迹在GS115、KM71和SMD1168最佳克隆中进一步鉴定。N蛋白在预测的表观分子量表达，无可见降解或加工。表达的N蛋白的量为大约1μg/酵母单位(YU)。在GS115和KM71酵母株中，N产量占总可溶蛋白质(TSP)的24％，而在SMD1168酵母株中仅为14％(表5)。在GS115和KM71中的表达水平与先前针对这些酵母株示出的范围相同(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。

表5：在巴斯德毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168株中表达的N蛋白的量。1个YU相应于10⁷个酵母细胞。

N-PbCS在SMD1168巴斯德毕赤酵母中的表达

为检测使用基于MV N的RNP作为载体以在疟疾疫苗原型中多聚化异源抗原的可能性，本发明人将来自Pb(ANKA株)的环子孢子(CS)抗原(Nussenzweig V,Nussenzweig RS,1985,Cell 42:401-403)通过具有7个氨基酸的接头与MV-N的C末端融合(图20A；图21；KyteJ,Doolittle RF,1982,J Mol Biol 157:105-132)。选择使用Pb使得可以使用小鼠动物模型以通过接种和寄生物攻击评估疫苗原型的免疫原性和效力(Scheller LF et al.,1994,Infect Immun 62:4844-4847；Craig AG et al.,2012,PLoS Pathog 8:e1002401)。将GS115、KM71和SMD1168巴斯德毕赤酵母株通过AOX1甲醇可诱导启动子控制下携带N-PbCS编码基因的pPIC3.5K转化。在GS115和KM71酵母株中N-PbCS的诱导导致融合蛋白快速降解(数据未示出)，而全长融合蛋白在SMD1168酵母株中正确产生(图20B)。在诱导后54h获得N-PbCS最大表达。在通过定性和定量western印迹选择的最佳N-PbCS表达克隆中，在相同酵母株中融合蛋白的表达水平(12ng/YU)比单独的N(871ng/YU)低73倍(表5；图20C)。因此，全长N-PbCS融合蛋白可以仅在SMD1168巴斯德毕赤酵母中表达，与单独的N蛋白的水平相比低接近2-log。为了获得具有单体形式疟原虫抗原的对照酵母，如先前所述产生并选择只PbCS表达的SMD1168克隆。PbCS酵母示出单独的抗原(16ng/YU)与N-PbCS融合蛋白(12ng/YU)的相当的表达水平。表达N、PbCS或N-PbCS的重组SMD1168酵母的复制动力学在所有检测的培养基(YPD、BMG和BMM)中均是严格相当的。在重组与野生型SMD1168酵母之间观测到无宏观(macroscopic)表型差异。

在巴斯德毕赤酵母中高分子量基于N的核糖核蛋白的产生

MV-N核蛋白具有在哺乳动物、细菌或酵母细胞的细胞质中围绕RNA自组合的能力(Bourhis JM et al.,2006,Virology 344:94-110；Warnes A et al.,1995,Gene 160:173-178；Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。为了评定在SMD1168巴斯德毕赤酵母中N和N-PbCS是否被组合为高分子量RNP，将酵母裂解物在20％蔗糖上超离心，确定级分和沉淀物中存在的N和PbCS蛋白的数量(图22)。尽管N多聚化可以影响不同大小的RNP对于用于量化的抗-N抗体的亲和性，按时仍可以在N和N-PbCS样品中在相似水平级分中进行N数量的对比。对于这两种重组酵母，在蔗糖上N和N-PbCS的分布模式示出在上方级分中存在单体或寡聚的N，在中间级分中存在多聚形式，在沉淀物中存在高度多聚RNP。显然，本发明人通过计算程序估计沉淀物中存在的RNP重于36,502kDa，组合超过628个N分子。在两种重组酵母之间读取的2-log差异与在N和N-PbCS酵母之间N表达水平(871ng/YU vs12ng/YU)的2-log差异相关。

显然，在N-PbCS重组酵母中，N主要在沉淀物中发现。对N-PbCS沉淀物进行的定量western印迹分析表明RNP主要由N组成(70-80％)，全长N-PbCS蛋白代表全部N的10-20％。此外，重组RNP含有10％的降解的N-PbCS蛋白(数据未示出)。N-PbCS酵母的失衡情况可能是由于PbCS抗原与亚细胞元件相互作用拉下RNP所致，或者由于N-PbCS融合使RNP稳定化产生高度多聚的RNP所致。与野生型酵母相比，异源抗原表达不修饰酵母RNA和TSP模式(图23)。这些模式不依赖于加样于蔗糖上的酵母的量而维持(数据未示出)。

为了寻找RNP的结构，通过电子显微镜(EM)观测酵母裂解物。在N重组SMD1168酵母中，本发明人发现具有人字形的直径为20-22nm及30-200nm的可变棒长度的许多RNP(图24A)。这个发现与先前在重组巴斯德毕赤酵母GS115株(Slibinskas R et al.,2004,JBiotechnol 107:115-124)及在MV感染的哺乳动物细胞(Griffin DE,2001,FieldsVirology.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins Publications.pp.1401–1441)中的描述相似。在N-PbCS样品中，RNP呈现出与长度为30-70nm的仅具有N的RNP相比具有较低刚性。大多数N-PbCS RNP在微环境中检测到，其中可见在棒结构旁边的独立的环(图24B)。由于与N相比N-PbCS较低的表达水平，因此对N-PbCS澄清的裂解物进行两次超离心，以浓缩N-PbCS结构，而N样品则否。这解释了如先前所述在两种样品中观测到的平均棒长度的差异(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。此外，在第一次超离心之后，本发明人选择含有大约333个N分子的RNP的级分，其代表与其它超离心级分或沉淀物中存在的较短或较长RNP结构相比的主要群体。考虑到1个N分子关联6个RNA核糖核苷酸(Griffin DE,2001,Fields Virology.Philadelphia:Lippincott Williams&WilkinsPublications.pp.1401–1441)，及真核mRNA的平均大小为2kb(Jackson DA,Pombo A,Iborra F,2000,FASEB J 14:242-254)而产生这个假说。然后基于沉降计算程序进行RNP选择(见“方法”章节)。裂解物中较轻或较重N-PbCS RNP的存在以及选择的RNP中N-PbCS融合蛋白的存在通过对取自两次超离心的从离心管顶部至底部的所有1ml级分进行抗-PbCS/抗-N夹心ELISA证实(数据未示出)。

对N或N-PbCS重组SMD1168酵母进行免疫荧光分析示出RNP位于较大且紧密的细胞质包涵体中，如先前在GS115巴斯德毕赤酵母中针对单独的N所观测结果(Slibinskas R etal.,2004,J Biotechnol 107:115-124)，并且N包涵体与PbCS共同位于N-PbCS酵母中(图25)。

巴斯德毕赤酵母的热灭活

巴斯德毕赤酵母替代酿酒酵母作为完整的重组酵母疫苗的开发利用，需要一套热灭活方案以保证在其使用之前处于生长状态的酵母细胞死亡。将先前在IIb期实验中检测的重组酿酒酵母在56℃热灭活1小时(Haller AA et al.,2007,Vaccine 25:1452-1463)。由于这个方案只是部分灭活巴斯德毕赤酵母GS115，本发明人评估了一系列灭活温度和处理时间以实现酵母生长的完全损害。本发明人检测了巴斯德毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168。在加热处理后酵母的存活力通过将其在平板上及在液态培养基中在30℃培养7天进行分析。繁殖能力的总体损失与缺乏代谢活性相关，通过亚甲蓝存活性检测评定。在58-60℃热灭活45-60分钟后获得这三种酵母株的完全生长损害(表6)。对于接下来的实验，本发明人使用在60℃热灭活45分钟。

表6：巴斯德毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168的热灭活。连字符(-)相应于不完全灭活，“n.v.”相应于无存活的酵母。这些实验结果在图26中示出。

在伯氏疟原虫-C57Bl/6小鼠模型中评估完整的重组N-PbCS SMD1168酵母疫苗的免疫原性和效力

为了评估表达作为PbCS抗原的载体的基于MV-N-的RNP的完整的重组SMD1168酵母的免疫原性和效力，本发明人使用Pb感染的C56Bl/6小鼠模型，这是重度啮齿动物疟疾的高度严格动物模型(Scheller LF et al.,1994,Infect Immun 62:4844-4847)。通过五次(每周一次)皮下注射30YU热灭活的不存在辅助佐剂条件下表达N-PbCS的SMD1168巴斯德毕赤酵母进行免疫接种(图2)。这个剂量含有360ng的N-PbCS，相应于大约230ng的N和130ng的PbCS抗原。第二组小鼠用30YU仅表达N的重组SMD1168相似免疫(用野生型SMD1168酵母稀释以相对于N-PbCS组调节N与酵母材料的量)。第三组接受30YU野生型(WT)SMD1168，第四组保持不接种但是平行圈养(未接受处理组)。在免疫期间每周及就在攻击之前(第42天)进行引流放血，以确定抗体应答。所有组小鼠均在第43天用6,000个GFP⁺Pb子孢子攻击，监测寄生物血症及小鼠存活率。GFP⁺Pb子孢子提供了在整个Pb生命周期与野生型寄生物相同的生长速度和感染性(Ishino T et al.,2006,59:1175-1184)，用于促进通过流式细胞计量术确定寄生物血症。为了扩大小鼠取样及验证第一个实验的结果，根据上述方案进行另外的免疫研究。在这个第二次免疫中，加入一个8只小鼠的新组：用单体形式表达疟原虫抗原的PbCS重组酵母免疫的PbCS组。与免疫次数无关，数据是相当的，示出输出的鲁棒性，尽管是两个独立的子孢子和重组酵母制备物。因此，集合这两次的免疫组(图4和图27)。

抗-N IgG抗体在用N或N-PbCS酵母免疫的小鼠体内在第三次注射后变得可检测，并在第42天达到最高效价。在第42天的抗-应答(图4A)在N与N-PbCS免疫组中均是统计学相当的，除去在抗-N体液应答中N与PbCS之间的免疫干扰。所有免疫的小鼠均示出抗巴斯德毕赤酵母抗体应答(图27)，而未接受处理的小鼠未呈现抗-巴斯德毕赤酵母交叉反应抗体应答(数据未示出)。有趣的是，抗-N抗体阴性的两只N-PbCS小鼠(图4A)具有抗-PbCS应答，抗体效价为4×10⁴和1.5×10⁵(图4B和4F)。在PbCS组中，抗-PbCS抗体应答在整个跟踪期间均在检测限度(数据未示出)，而在N-PbCS组中，在2-4次免疫之后检测到且在最后一次注射之后在半数动物中仍增加(图4B)。当免疫完成时，中位数效价在第42天达到3×10⁴(图4F)。PbCS与N-PbCS组之间的对比明确示出MV N RNP上疟原虫抗原的多聚化拯救了抗原特异性抗体应答。

在最后一次免疫之后2周，免疫的小鼠用6,000GFP⁺Pb子孢子攻击，在寄生物指数生长期间在较早时间点确定寄生物血症(含有寄生物的RBS的比例)(图4C)。从攻击后第3天至第6天，在N、PbCS及野生型对照组中的寄生物血症是相当的，其中iRBC降低与未接受治疗组的值无统计学差异，而寄生物血症在N-PbCS组中显著降低(显然，在攻击后第5天降低大约4倍；在第4天和第5天p<0.05，及在第6天p<0.005；Mann-Whitney非参数检验)。N-PbCS与PbCS组之间寄生物血症对比再次示出在RNP上PbCS多聚化产生这种差异。本发明人观测到早期死亡的小鼠(第7-14天)呈现出实验性脑型疟疾的临床迹象，而在20天后小鼠由于高寄生物血症的结果导致死亡(在第20天高至35-55％的iRBC/RBC，及在第25天为60-70％)。在第5天的寄生物血症和死亡天数示出显著的负相关性(Spearman检验；p<0.005)：低寄生物血症(0-0.2％)优先导致推迟死亡，而较高寄生物血症(>0.2％)导致与实验性脑型疟疾相关的更快速死亡(图4D)。用N-PbCS酵母免疫增加存活率，因为14只小鼠中有10只在攻击后第22天仍存活，而PbCS、野生型和未接受处理组的大多数小鼠在第11天左右死亡(图4E)。令人惊奇地，尽管在N与PbCS之间抗体交叉反应完全不存在，并且N和N-PbCS免疫对寄生物血症有不同影响，但是N组示出与N-PbCS组相当的存活率。在N-PbCS组中，具有最高抗-PbCSIgG水平的小鼠具有最延长的存活时间，尽管抗体效价不能预测或早或晚的动物死亡结果(Mann-Whitney非参数检验)。

由于IgG亚类根据其结构而介导不同的免疫效应功能(Nimmerjahn F,RavetchJV,2008,Nat Rev Immunol 8:34-47)，本发明人确定了在N-PbCS免疫的小鼠中在攻击之前应答PbCS的IgG亚类(图4F)。没有体液免疫应答的Th1和Th2极化，因为IgG1应答与IgG2b是统计学相当的，而且IgG1与IgG2a(p<0.05)之间的相关差异通过IgG2b应答在Th2/Th1偏倚中补偿(Mann-Whitney非参数检验)。显然，检测到显著的IgG1和IgG2a/b体液应答提示在用完整的N-PbCS重组酵母在不存在佐剂的条件下免疫接种之后引起Th1和Th2细胞因子环境。

在本发明中，PbCS与MV-N的融合导致抗原在RNP结构中多聚化，其位于重组酵母的细胞质中。在不存在辅助佐剂及在低抗原剂量条件下皮下注射(每次注射130ng PbCS)，在严厉攻击之后N-PbCS巴斯德毕赤酵母诱导明显的寄生物血症延迟出现以及受体C57Bl/6小鼠的延长的存活期，所述严厉攻击由皮内注射高数目(6,000)感染性Pb子孢子组成。在N、PbCS和N-PbCS组之中进行对比表明RNP上PbCS多聚化是在小鼠中显著降低寄生物血症及增加存活率所必需的。但是就存活率而言，N蛋白似乎与疟原虫抗原多聚化一起导致这样的结果。抗-PbCS IgG应答反映出Th1和Th2免疫应答的无偏贡献，表明在不存在辅助佐剂条件下免疫系统的广泛引起。

本发明人假设来自Pb(感染小鼠)和恶性疟原虫(感染人)的CS蛋白共有构象和功能性质，尽管其存在大约60％不同的氨基酸序列(Plassmeyer ML et al.,2009,J BiolChem 284:26951-26963)。为了确定在巴斯德毕赤酵母中CS表达是否依赖于特异性蛋白质序列，本发明人产生了MV-N融合蛋白，具有来自恶性疟原虫(株系3D7；PfCS)和来自PbCS的等价CS结构域。全长N-PfCS(92.73kDa)在巴斯德毕赤酵母GS115和KM71中产生，产量为97ng/YU(数据未示出)，而N-PbCS(91.32kDa)不在GS115或KM71酵母株中产生，只在SMD1168酵母株中以较低产量产生(12ng/YU)。这些数据表明初级氨基酸序列决定在巴斯德毕赤酵母中N-CS融合蛋白表达的效力。酵母蛋白酶在外源蛋白质降解中是主要作用物。由于对于蛋白酶靶位的仅可获得一般知识基本来自酿酒酵母，因此本发明的生产系统的结果从可利用的现有知识中不可预测。在巴斯德毕赤酵母中观测到与PbCS相比PfCS更好的生产产量由本发明人认为是有利于这个策略开发人疫苗。对于完整的灭活的酵母，施用方案是重要问题。在这项研究中，本发明人示出以一周间隔注射三次是在大多数小鼠中引起可检测的抗-CS抗体应答所必需的。在初步实验中，本发明人观察到以两周的间隔注射三次(d0、d14、d28)不诱导抗-CS抗体或寄生物血症延迟(数据未示出)。这也许是由于N-PbCS在SMD1168株中的低表达水平(12ng/YU)或者完整的重组巴斯德毕赤酵母的固有特点所致。显然需要通过进一步选择表达克隆而增加抗原生产产量。然而，也许需要频繁的加强免疫以引起强力的长期免疫应答。检测多剂量的完整重组酵母与肌生成抑制蛋白(Zhang T et al.,2011,Vaccine 29:8412-8416)、K-Ras肿瘤蛋白(Lu Y et al.,2004,Cancer Res 64:5084-5088)或者HCV NS3与Core(GI-5005；Haller AA et al.,2007,Vaccine 25:1452-1463)的治疗性接种的免疫方案。特别是在这个最后的研究中，多至13次每周一次的剂量的完整的重组酵母示出在小鼠中无酵母中和化及在兔中无毒性，以及细胞免疫应答随着注射频率而增加(Haller AA et al.,2007,Vaccine 25:1452-1463)。然而，由于物流(logistic)和经济原因，仅可以计划不超过三种疫苗对生活在疟疾流行地区的婴儿进行预防性免疫。

总之，本发明人提供了巴斯德毕赤酵母作为疫苗生产和递送系统的替代方案以多聚化疟原虫抗原。鉴于Pb子孢子感染严格C57Bl/6小鼠模型的可利用性，选择PbCS，使得可以评估疫苗在体内的效力。CS抗原通过与已知在酵母中在大型RNP中自组合的MV-N融合而多聚化。通过在巴斯德毕赤酵母SMD1168中表达，N-PbCS蛋白产生在表面携带PbCS的高度聚合的及异源的RNP。电子显微镜和免疫荧光分析表明这些RNP的形状及其在周围细胞包涵体中的位置。用热灭活的表达N-PbCS RNP的完整的巴斯德毕赤酵母对C57Bl/6小鼠进行皮下免疫接种提供了对抗高剂量寄生物的皮内注射攻击的显著保护作用。因此，在不存在辅助佐剂的条件下，在完整的未纯化酵母中表达的极低量PbCS抗原显著降低与在高度严厉攻击模型中Pb感染相关的临床损害，证实了这种疫苗策略的固有佐剂性。

完整酵母-RNP疫苗平台的固有佐剂性和效力

本研究的关键步骤是检验N蛋白在与另一蛋白质例如PbCS融合时是否保留其形成RNP的能力。本发明人在巴斯德毕赤酵母中表达N-PbCS融合蛋白并证实在PbCS的C末端与N蛋白N末端融合时N蛋白确实能形成RNP。重组N-PbCS RNP具有与只由N产生的RNP相似的“人字形”结构，位于酵母细胞质的紧密包涵体中。PbCS与N融合与单独的N相比导致表达水平降低70倍，使得N-PbCS产量为12ng/YU。尽管存在这种降低，但是本发明人证实在不存在辅助佐剂的条件下，在免疫和攻击之后表达这些RNP的完整重组酵母导致寄生物血症显著延迟及对于临床结果的益处。

重组RNP代表设计的疫苗平台的主要抗原性成分，可以认为是纳米颗粒亚单位疫苗。根据示出多聚化抗原递送的优势的其它研究(Bachmann et al.,2010,Nature,10,787-796)，证实RNP是一种强力的载体，其增加PbCS的免疫原性。非多聚化PbCS诱导较低的(通过酵母裂解物递送)或无(通过热灭活的完整酵母递送)体液应答，在这两种情况中用非多聚化PbCS免疫对于伯氏疟原虫攻击均无保护作用。相反，根据剂量和配制物，多聚化PbCS诱导强体液应答，并提供寄生物血症延迟或者无菌保护作用。重点提及的是在加热处理后，酵母细胞壁变得难以通过机械裂解而降解，阻止在热灭活的酵母中分析RNP。然而，用携带N-PbCS RNP而不是单体状态PbCS的酵母免疫接种的益处提供了PbCS在酵母中确实多聚体化的证据。

表达N-PbCS RNP的完整的热灭活的巴斯德毕赤酵母的免疫原性通过在免疫后的强抗体应答而更显著，并且在攻击时感染延迟。尽管评估的配制物/免疫方案(用30YU表达N-PbCS的热灭活的巴斯德毕赤酵母免疫，每周一次共五次)对于抗伯氏疟原虫感染不是无菌性保护作用，但是其显著延迟寄生物血症发生，证实在肝脏感染节段已经发生PbCS-依赖性寄生物抑制作用。这种作用通过等于在30YU的N-PbCS表达酵母的少如130ng的PbCS的实现，这是极低剂量的抗原(例如在GSK临床前实验中，在小鼠中每次注射使用5μg的RTS,S与ASO1佐剂组合，其含有1μg的CS抗原)。此外，用表达N-PbCS的酵母免疫显著降低脑型疟疾的发病率。这种作用对于随后开发人疫苗候选物具有重要价值，因为脑型疟疾是在人体中造成疟疾感染的永久后果或死亡的主要因素。对脑型疟疾的易感性示出与在感染期间的变应性炎症应答相关(Mécheri,2012,BBA,1822,49-56)。根据这种见解，需要寻求与通过接种表达N-PbCS RNP的完整的热灭活酵母诱导的脑型疟疾逃逸(escape)相关的机制。由于用表达N的酵母免疫的小鼠也示出寄生物血症降低，尽管程度较N-PbCS免疫的小鼠低，以及同样的脑型疟疾逃逸，因此N自身似乎对于寄生物血症和脑型疟疾逃逸具有非特异性益处，这需要进行研究。

由于在完整酵母内递送的RNP的剂量受限于在感染部位不引起不可逆的炎症的可以给小鼠施用的酵母的最大量(30YU)，因此利用酵母裂解物配制物进行较高剂量RNP的递送。事实上，随着无佐剂酵母裂解物的剂量增加(30、150和300YU)，在寄生物血症延迟中检测到明显的剂量依赖性作用。在用最高剂量的300YU N-PbCS酵母裂解物免疫的组中，六只动物中的一只动物在整个跟踪期间无寄生物感染及发展为无临床感染迹象，表明无菌性保护作用。用3或5次注射携带N-PbCS的30YU酵母裂解物免疫的小鼠与用150YU和300YU免疫的小鼠相比示出对抗脑型疟疾的更高比率的保护作用。然而，需要较大组的小鼠进行统计学分析。

除去酵母细胞壁及在酵母裂解物内递送RNP也使得本发明人去评估酵母内部成分的潜在佐剂作用。热灭活的酵母含有细胞壁PAMP(病原体相关的分子模式)，虽然其在热灭活时在一定程度被修饰，但仍被免疫系统细胞识别为危险信号。相反，酵母裂解物基本上没有酵母表面PAMP，而是代表酵母蛋白质和外源性质核酸的配制物，其可以由哺乳动物细胞识别为危险信号。将30YU的携带N-PbCS的酵母在完整的热灭活的配制物和无佐剂的裂解配制物中评估。示出酵母裂解物诱导略高的针对N和PbCS的抗体应答。抗体在用免疫裂解物免疫2-3次后出现，而用热灭活的酵母需要3-4次免疫才引起体液应答。然而，N-PbCS RNP在这两种递送配制物中降低寄生物感染的保护性效力是相当的，因为在攻击后第5天，用热灭活的配制物免疫的小鼠中寄生物血症降低4倍，用酵母裂解物免疫的小鼠中降低3.3倍。

体液应答和细胞应答均被认为在对抗人体中恶性疟原虫感染的CS介导保护作用中起作用(Kai et al.,2011,PLoS ONE；Kumar et al.,2006,Nature,444,937-940；Moorthy et al.,2008,Malaria Journal,8,312)。由于在C57Bl/6小鼠中未鉴别出针对PbCS的T细胞表位，这使得要进行简便的T细胞测定，在本研究中细胞应答的诱导是通过对IgG抗体应答分型而间接探索的。已知IgG同种型模式已知与Th1和Th2细胞因子环境的建立相关(分别为IgG2b和IgG2a)(Nimmerjahn et al.,2008,Nature,8,34-47)。此外，为了评估实验条件是否可以改良以诱导通过N-PbCS RNP免疫的无菌性保护作用，在酵母裂解物配制物中加入氢氧化铝凝胶(明矾)佐剂。由于明矾具有抗体刺激性质(Gupta et al.,2000,Vaccine Adjuvants)，因此评估在保护作用中抗-PbCS体液应答的参与情况。

对三只小鼠的小组的初步研究示出在热灭活的完整酵母中及在铝佐剂的酵母裂解物中递送的30YU的N-PbCS提供的保护作用无显著差异(数据未示出)。由于先前示出抗-PbCS体液应答以及寄生物血症降低是剂量依赖性的，因此在具有铝的配制物中评估一系列更高的剂量(50YU、100YU和150YU)。有趣的是，以每两周施用一次共三次的所有这三个剂量产生相当的结果：与先前获得的最大值(2×10⁵，300YU N-PbCS酵母裂解物)相比抗-PbCS抗体效价增加接近10-倍(10⁶)，在每组中六只小鼠有两只处于无菌性保护作用。关于整体高水平的抗体效价，小鼠中抗-PbCS抗体的个体水平不预测无菌性保护作用。与其它研究结果一致，本发明人示出抗-PbCS抗体在对抗疟原虫感染的保护作用中起有限的作用，因为≥50YU的携带N-PbCS的具有铝的酵母裂解物配制物诱导抗-PbCS抗体的高台效价，这不能预测保护作用。

虽然N-PbCS在30YU热灭活的完整酵母内递送，但是无佐剂的或者铝佐剂的酵母裂解物提供了与抗-PbCS抗体效价无关的相似水平的寄生物血症降低，本发明人认为应优先进一步开发热灭活的完整酵母配制物。热灭活的完整酵母配制物在生产和经济观点方面是有利的，因为制备酵母裂解物可显著增加疫苗成本及限制其在发展中国家的潜在用途。此外，热灭活的完整酵母提供了在不存在冷链条件下冻干转运以及口服途径施用的可能性，这样对于促进疫苗分配和施用具有重大影响。水凝胶作为佐剂刺激体液应答的用途在这个疫苗平台是无优势的，因为无佐剂配制物在刺激抗体应答中是有效的，其与保护作用无关。随着公众由于对疫苗及其佐剂成分的副作用的社会不耐受性所致对接种的不接受性的增加，通常与这些副作用问题相关，完整酵母RNP配制物代表一种优化的疫苗策略，因为其可以在不存在辅助佐剂条件下诱导抗原特异性免疫应答。

这项研究提供了在热灭活的完整酵母中产生的重组RNP作为预防性疫苗的有效抗原递送平台的证据。然而，关于疟疾疫苗的开发，需要进一步优化。由于N-PbCS RNP的保护性效力是剂量依赖性的，因此优化酵母中N-PbCS表达对于更有效的完整的热灭活的疫苗配制物是关键因素。其次，为了改良疫苗配制物，需要继续研究重组RNP的完整酵母递送的免疫原性的根本机制。在多个研究中证实，完整酵母细胞被树突细胞有效摄取，这导致重组表达的抗原在MHC I类和II类分子中的有效呈递及CD4+和CD8+T细胞的诱导。在疟疾的情况中，T细胞介导的免疫性的诱导似乎在保护作用中起主要作用。由于在免疫应答诱导中作为第一步，需要研究完整重组酵母与DC之间的相互作用。通过对比在存在纯化的N-PbCS RNP条件下DC激活和运动性，或者在酵母-裂解物或者热灭活的完整酵母中的递送，可以确定抗原与全部酵母成分的最佳比率。此外，为了更直接证实细胞应答的诱导作用，需要将这个平台在具有指定T细胞表位的另一抗原背景中评估。

Claims

1.得自至少200个融合蛋白和细胞核糖核酸(RNA)的组合体的多聚核糖核蛋白(RNP)，其中所述融合蛋白包含副粘病毒(Paramyxoviridae)科非节段负链RNA病毒的核蛋白(N)，所述核蛋白与携带一或多个表位的异源多肽直接或间接融合。

2.权利要求1的多聚RNP，其中副粘病毒科非节段负链RNA病毒是麻疹病毒，优选衍生自减毒活麻疹病毒毒株的麻疹病毒，更优选衍生自Schwarz、Moraten、Rubeovax、AIK-C、Zagreb和Edmonston毒株的麻疹病毒，甚至更优选衍生自Schwarz毒株或Moraten毒株的麻疹病毒。

3.权利要求1或2的多聚RNP，其中所述异源多肽来自寄生物，优选来自疟原虫(Plasmodium)属的原生动物寄生物，更优选来自伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)或恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，或者来自病毒，优选来自小RNA病毒(Picornaviridiae)科，更优选来自肠道病毒(Enterovirus)属，例如来自肠道病毒71(EV71)。

4.权利要求1-3任一项的多聚RNP，其中所述异源多肽与核蛋白(N)的C末端融合，特别是通过肽接头与核蛋白(N)的C末端融合，所述肽接头的序列大小为5-10个氨基酸残基，优选6或7个氨基酸残基的肽接头。

5.权利要求1-4任一项的多聚RNP，其是高分子量RNP，由核蛋白(N)与异源多肽获得的200-1000个融合蛋白组合而成，优选由300-700个所述融合蛋白、特别是由500-700个所述融合蛋白组合而成。

6.权利要求1-4任一项定义的融合蛋白的多核苷酸，特别是包含如下序列的多核苷酸：(i)编码选自SEQ ID No:2、SEQ ID No:5、SEQ ID No:8和SEQ ID No:11的核蛋白(N)的核苷酸序列，任选地与(ii)编码选自SEQ ID No:26和SEQ ID No:28的肽接头的核苷酸序列融合，及(iii)与(i)的核苷酸序列或者，如果有的话，与(ii)的核苷酸序列融合的编码异源多肽的核苷酸序列。

7.权利要求6的多核苷酸，其进一步包含前导序列和/或尾随序列，例如SEQ ID No:42所示的克隆在核蛋白(N)的编码序列上游的前导序列，和/或SEQ ID No:43所示的克隆在异源多肽编码序列下游的尾随序列。

8.权利要求6的分离的或纯化的多核苷酸，其编码权利要求1-4任一项定义的融合蛋白，并且包含选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37的核苷酸序列。

9.表达载体，特别是携带权利要求6-8任一项的多核苷酸的质粒。

10.重组酵母，其是用权利要求6-8任一项的多核苷酸在使得权利要求1-5任一项的多聚RNP组成型表达或瞬时表达或可诱导表达的条件下重组的。

11.权利要求10的重组酵母，其是从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)株或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株中制备的。

12.灭活的重组酵母，其得自权利要求10或11的重组酵母在58-60℃热灭活45-60分钟，优选在60℃热灭活45分钟。

13.酵母裂解物，其是权利要求10或11的重组酵母的裂解物。

14.免疫原性组合物，其包含权利要求1-5任一项的多聚RNP或者权利要求10-12任一项的重组酵母或者权利要求13的酵母裂解物，其任选地不包含辅助佐剂。

15.亚单位疫苗平台，其包含权利要求1-5任一项的多聚RNP或者权利要求10-12任一项的重组酵母或者权利要求13的酵母裂解物。

16.多价免疫原性组合物，其包含权利要求10-12任一项的重组酵母的混合物或者权利要求13的酵母裂解物的混合物，其中在所述混合物中存在重组酵母或酵母裂解物的至少两个克隆，一个克隆表达权利要求1、3和4任一项定义的异源多肽，所述异源多肽与其他克隆的异源多肽不同。

17.一种制备权利要求1-5任一项的多聚RNP的方法，特征在于其包括如下步骤：

(i)获得权利要求10-12任一项的重组酵母或者权利要求13的酵母裂解物，及

(ii)从所述酵母或酵母裂解物中回收多聚RNP。

18.一种制备权利要求10-12任一项的重组酵母或者权利要求13的酵母裂解物的方法，包括：

(i)将酵母用权利要求6-8任一项的多核苷酸重组，

(ii)在培养基中培养所述酵母，

(iii)在所述酵母中表达融合蛋白，

(iv)任选地，将所述酵母在58-60℃热灭活45-60分钟，优选在60℃热灭活45分钟，及

(v)任选地，制备酵母裂解物。

19.权利要求10-12任一项的重组酵母或者权利要求13的酵母裂解物作为在体外产生免疫原性组合物的活性成分或者作为向宿主递送的表达和载体系统的用途。

20.权利要求1-5任一项的多聚RNP作为在体外产生免疫原性组合物的活性成分的用途。

21.权利要求1-5任一项的多聚RNP或者权利要求10-12任一项的重组酵母或者权利要求13的酵母裂解物，用于在需要其的宿主内引起针对异源多肽的保护性预防或治疗性免疫应答。