CN110384798B - 靶向引流淋巴结的cvb3心肌炎重组蛋白疫苗及其制备方法 - Google Patents

靶向引流淋巴结的cvb3心肌炎重组蛋白疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗及其制备方法。本发明通过引入旨在延长抗原体内滞留，同时高效靶向引流淋巴结的双功能佐剂分子，以期有效提高该蛋白疫苗的免疫保护效果。本发明将链球菌G蛋白的血清白蛋白结合结构域与VP1重组制备了ABD‑VP1重组蛋白疫苗，构建一种长效心肌炎重组蛋白疫苗，有效激活机体CVB3特异性免疫应答，预防病毒性心肌炎。本发明的病毒性心肌炎重组蛋白疫苗ABD‑VP1通过皮下方式免疫小鼠，抗原可有效在引流淋巴结富集，有效诱导针对CVB3的特异性抗体及T细胞免疫应答，有效预防病毒性心肌炎，因此是一种优良的预防性病毒性心肌炎的备选蛋白疫苗。

Description

靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗及其制备方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
病毒性心肌炎(Viral Myocarditis,VMC)是心肌局限性或弥漫性炎性病变，发病率约为5％-15％，是临床常见的心血管系统疾病，好发于40岁以下青壮年人群，同时也是青少年猝死的主要原因。近年来，病毒性心肌炎发病率逐年上升，已成为影响人民健康和引发社会劳动力大幅下降的重要社会公共卫生问题。肠道病毒，特别是柯萨奇病毒B3型(Coxsackievirus B3,CVB3)，是引发病毒性心肌炎的最主要病原体。目前，尽管在CVB3的致病机理及病毒性心肌炎的诊治方面取得了一些进展，但心肌炎高效防治疫苗及特异性药物尚且缺失。目前疫苗接种被公认为是预防感染性疾病最有效和经济的手段，因此CVB3心肌炎疫苗的研制受到了免疫学和心肌炎领域专家的高度关注。
目前在研的CVB3疫苗主要包括DNA疫苗、重组蛋白疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗等。其中通过基因工程技术制备的重组蛋白疫苗因其良好的免疫原性、生物安全性以及制备、接种、储存和运输的便捷性等优势受到大家的高度关注和青睐。CVB3核衣壳结构蛋白质主要由四种多肽VP1、VP2、VP3、 VP4组成，其中VP1是参与多种病毒功能的较为重要的核衣壳结构蛋白质。研究表明VP1中含有多个可能的B细胞表位和T细胞表位，具有最强的抗原性，其可诱导有效的特异性抗柯萨奇病毒B3型感染的免疫保护作用。然而其在较大型以及灵长类动物差强人意的免疫效果极大限制了其进一步临床应用的可能性，而增加蛋白疫苗的免疫原性也成为疫苗领域的重点和难点问题。制约重组疫苗效果的主要原因一方面是其在体内稳定性差，滞留时间短暂，尚未被抗原提呈细胞捕获即被降解；另一方面，即使被少量抗原提呈细胞(APC)捕获后，也不能有效在引流淋巴结富集，诱导强力高水平免疫应答。
白蛋白作为医药学领域理想的载药体系的特质而定：第一，白蛋白 (albumin)是机体血浆中含量最丰富的蛋白质，约占血浆含量的50％-60％，且无免疫原性和调理作用、安全无毒、可生物降解、生物相容性好等。这些优点使得白蛋白成为当今医药学领域中极具吸引力和竞争力的载药体系之一。第二，更重要的是白蛋白在体内非常稳定(在人体半衰期约为19天)，多种获准应用于临床的小分子化学或者肽段药物，如地特胰岛素、胰岛素和利拉鲁肽等均通过与白蛋白结合实现了体内循环半衰期的显著延长，维持了高水平的血药浓度，显著增加了药效，故通过结合白蛋白延长蛋白疫苗的半衰期具有极高的可行性和安全性。第三，白蛋白具有可在淋巴结大量积累富集的特性，可有效靶向淋巴结，目前白蛋白结合分子已被广泛用于医学影像和淋巴结靶向治疗领域，具有巨大的发展潜力及应用前景。然而，目前利用白蛋白增加重组蛋白疫苗的体内滞留和促进引流淋巴结富集的研究还极为有限。
发明内容
本发明针对CVB3的VP1蛋白疫苗易降解、不易在引流淋巴结富集呈递等不足，通过引入旨在延长抗原体内滞留，同时高效靶向引流淋巴结的双功能佐剂分子，以期有效提高该蛋白疫苗的免疫保护效果。本发明将链球菌G蛋白的血清白蛋白结合结构域(ABD)与VP1重组制备了ABD-VP1重组蛋白疫苗，构建一种能够在体内有效滞留、有效引流至淋巴结的长效心肌炎重组蛋白疫苗，有效激活机体CVB3特异性免疫应答，预防病毒性心肌炎。
本发明的第一个目的是提供一种靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗，所述的重组蛋白疫苗由链球菌G蛋白的血清白蛋白结合结构域与柯萨奇病毒B3型来源的VP1蛋白重组而成。
进一步地，所述的链球菌G蛋白的血清白蛋白结合结构域的氨基酸序列如 SEQ IDO.5所示，所述的柯萨奇病毒B3型来源的VP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗的编码基因。
进一步地，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述的编码基因的重组质粒。
进一步地，所述的重组质粒是以pET系列、pGEX系列、pMAL系列、 pcDNA3.1系列或pVAX系列为载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗的重组菌。
进一步地，所述的重组菌是以细菌、真菌或动植物细胞为宿主。
本发明的第五个目的是提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗。
本发明的第六个目的是提供所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建编码CVB3 VP1原核表达质粒
以柯萨奇病毒B3型Nancy株DNA作为模板，PCR扩增CVB3抗原VP1 全长编码基因；将目的基因经Hind III和BamH I双酶切后与经同样双酶切的 pET28a载体连接，获得编码CVB3 VP1原核表达质粒pET28a-VP1；
(2)构建编码ABD-VP1蛋白疫苗的原核表达质粒
合成编码ABD的全长基因，通过PCR方法扩增ABD全长基因；以构建的pET28a-VP1质粒为载体，将经BamH I单酶切的ABD全长基因片段与经同样单酶切的pET28a-VP1载体连接，获得编码ABD-VP1蛋白疫苗的原核表达质粒pET28a-ABD-VP1；
(3)构建重组大肠杆菌
将表达质粒pET28a-ABD-VP1构建到BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落，筛选阳性克隆重组大肠杆菌BL21(DE3)pET28a-ABD-VP1；
(4)制备ABD-VP1重组蛋白疫苗
将重组大肠杆菌BL21(DE3)pET28a-ABD-VP1培养，加入IPTG诱导，产生的包涵体采用1.8-2.2M的尿素进行溶解，梯度透析后得到所述的ABD-VP1 重组蛋白疫苗。
本发明的有益效果是：
本发明通过引入旨在延长抗原体内滞留，同时高效靶向引流淋巴结的双功能佐剂分子，以期有效提高该蛋白疫苗的免疫保护效果。本发明将链球菌G蛋白的血清白蛋白结合结构域(ABD)与VP1重组制备了ABD-VP1重组蛋白疫苗，构建一种能够在体内有效滞留、有效引流至淋巴结的长效心肌炎重组蛋白疫苗，有效激活机体CVB3特异性免疫应答，预防病毒性心肌炎。本发明的病毒性心肌炎重组蛋白疫苗ABD-VP1通过皮下方式免疫小鼠，抗原可有效在引流淋巴结富集，有效诱导针对CVB3的特异性抗体及T细胞免疫应答，有效预防病毒性心肌炎，因此是一种优良的预防性病毒性心肌炎的备选蛋白疫苗。
附图说明
图1为ABD-VP1重组蛋白疫苗制备示意图；
图2显示了本发明的pET28a-VP1质粒(图2A)和pET28a-ABD-VP1的酶切鉴定结果(图2B)；
图3显示了本发明的重组蛋白疫苗的制备及其特性检测；ABD-VP1纯化结果经Western Blot(图3A)鉴定正确；图3B显示了ABD-VP1重组蛋白疫苗与鼠血清白蛋白(MSA)及牛血清白蛋白(BSA)的结合能力，并且在血清中重复了这一实验(图3C)；图3D显示了ABD-VP1在血清中的持久性；
图4A和图4B分别显示了VP1和ABD-VP1蛋白疫苗注射到小鼠体内后在各个器官的分布情况，图4C对两种蛋白在淋巴结的分布单独做了比较；
图5显示了显示了本发明的ABD-VP1重组蛋白疫苗皮下免疫小鼠诱生 CVB3特异性抗体应答：图5A显示血清特异性IgG水平；图5B显示血清特异性IgG抗体滴度；
图6显示了本发明的ABD-VP1重组蛋白疫苗免疫小鼠脾脏CVB3特异性细胞杀伤反应(图6A)和特异性T淋巴细胞增殖能力(图6B)；
图7显示了ABD-VP1重组蛋白疫苗免疫后可显著缓解攻毒小鼠体重减轻率；
图8显示了ABD-VP1重组蛋白疫苗的免疫保护作用；末次免疫后2周行 CVB3腹腔攻毒；病理切片显示第7天小鼠心脏病理改变。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、变态反应)、有合理效益/风险比的物质。
实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：
柯萨奇病毒B3型Nancy株(复旦大学中山医院卫生部病毒性心肌炎重点实验室提供)；质粒pET28a、宿主细菌DH5α、BL21(Invitrogen公司)。VP1237-249肽段合成委托上海吉尔生化公司；HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体 (SouthernBiotech公司)；限制性核酸内切酶Hind III、Xho I、BamHI(TaKaRa公司)、T4 DNA连接酶(MBI公司)；FastPfu Fly DNA聚合酶、5X FastPfu Fly Buffer(transgen)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)； LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、GelRed(blotlum)，Tris(USB 公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜公司)，大量质粒抽提试剂盒(Qiagen)，乳酸脱氢酶LDH试剂盒购自Roche。6-8周龄雄性BALB/c(H-2d)小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。
实施例1：ABD-VP1重组蛋白疫苗的制备
(1)构建编码CVB3 VP1原核表达质粒
以柯萨奇病毒B3型Nancy株DNA作为模板，用SEQ ID NO：7所示的 VP1上游引物和SEQ ID NO：8所示的VP1下游引物通过PCR方法扩增CVB3 优势抗原VP1全长编码基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；
将目的基因经Hind III和BamH I双酶切后与经同样双酶切的pET28a载体连接，获得编码CVB3 VP1原核表达质粒(pET28a-VP1)；
(2)构建编码ABD-VP1蛋白疫苗的原核表达质粒
化学合成编码ABD的全长基因并构建入质粒pUC57中，获得pUC57-ABD 质粒。以该质粒为模板，用SEQ ID NO：9所示的ABD上游引物和SEQ ID NO： 10所示的下游引物通过PCR方法扩增ABD全长基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.5，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；
以构建的pET28a-VP1质粒为载体，将经BamH I单酶切的ABD全长基因片段与经同样单酶切的pET28a-VP1载体连接，获得编码ABD-VP1蛋白疫苗的原核表达质粒(pET28a-ABD-VP1)；
(3)构建重组大肠杆菌
将表达质粒pET28a-ABD-VP1构建到BL21(DE3)感受态细胞中，涂板，挑取单菌落，筛选阳性克隆重组大肠杆菌BL21(DE3)pET28a-ABD-VP1；
(4)制备ABD-VP1重组蛋白疫苗
将重组大肠杆菌BL21(DE3)pET28a-ABD-VP1置冰上30min，42℃水浴 90s，冰上3min，于超净工作台中加入1ml LB液体培养基，37℃，250rpm摇床中震荡活化1h。收集菌体，12,000rpm离心1min，弃上清，预留100μl菌液上清重悬菌体，将重悬的菌液涂布到带有Kana抗性的LB固体培养基中，正置放入37℃培养箱中培养，1h后倒置平板，继续培养12h左右；
挑取单菌落，置37℃，250rpm摇床中震荡，当菌液的吸光度达到0.6-0.8 之间时，按1:1,000的比例加入原浓度为1M的IPTG，37℃诱导6h；
取出诱导后的菌液，转移到离心杯中，3,000rpm离心30min；弃上清，用适量PBS重悬沉淀，按1:100的比例加入PMSF(100mM)和溶菌酶(50ng/ml)，在4℃滚筒搅拌机(rollermixer)转动2h后将菌液反复冻融三次(此时会看到菌液变黏稠)；超声破碎：功率200W，工作5s，间歇5s，共超声30-40min 使菌液能够完全破碎；向破碎好的菌液中按1:500的比例加入DNase I，冰上放置30min，12,000rpm，4℃离心30min；分别将收集到的样品(未诱导，诱导，上清，沉淀)进行10％SDS-PAGE电泳分析及考马斯亮蓝蛋白染色和Western Blot检测；
经检测蛋白主要集中在包涵体中。将包涵体蛋白用包涵体洗涤液(IBS)洗三次，10ml/次，根据包涵体的量加入适量体积的2M尿素，置于-20℃过夜。 12,000rpm离心20min，此时蛋白会溶解到上清中。把上清液转移到透析袋中，先后置于1.5M尿素，1M尿素，0.5M尿素，PBS溶液中透析，得到ABD-VP1 重组蛋白疫苗。
重组蛋白疫苗ABD-VP1是由白蛋白结合结构域ABD和CVB3优势抗原 VP1重组而成，该重组蛋白本身带有His标签，以便于体外检测目的基因在原核细胞中的表达。并且这一重组蛋白编码了分子量大小约42KDa的蛋白。
实施例2：ABD-VP1重组蛋白疫苗的特性检测
1)ABD-VP1与小鼠血清白蛋白(MSA)的结合试验
在蛋白纯化完成后，我们通过ELISA法检测两种蛋白与MSA的结合能力。具体步骤如下：首先，用小鼠血清白蛋白(MSA)和牛血清白蛋白(BSA)包板， 10μg/ml，100μl/孔加到96孔Elisa板中，4℃过夜；用0.05％的PBST洗三次后 5％牛奶封闭，100μl/孔，室温孵育1h；0.05％的PBST洗三次，将 ABD-VP1/VP1(1μg/ml)加入对应孔中，100μl/孔，37℃孵育2h；0.05％的PBST 洗三次，加入VP1抗体(1：8,000稀释)，100μl/孔，室温孵育1h；0.05％的PBST洗三次，加入HRP-羊抗兔IgG抗体(1：6,000稀释)，100μl/孔，室温孵育1h；0.05％的PBST洗五次，加入TMB显色液，100μl/孔，显色后用50μl/ 孔终止液终止。OD 450nm检测吸光度值。结果显示(图3B)：ABD-VP1和 VP1均显示与BSA有较低的亲和力，与VP1相比，ABD-VP1和小鼠血清白蛋白之间可以高亲和力结合，并且这一实验进一步在小鼠血清中得到验证(图 3C)。
2)ABD-VP1在血清中的半衰期检测
我们将VP1和ABD-VP1蛋白通过尾静脉方式注射到小鼠体内(500μg/只)，分别在5min，10min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，12h，24h，48h等时间点取小鼠的血清，通过比较VP1蛋白含量来分析血液持久性的差异。具体步骤如下：将各时间点血清稀释500倍后包板，4℃过夜。用0.05％的PBST洗三次，5％的牛奶封闭，室温孵育1h。0.05％PBST洗3遍，加入VP1抗体(1：6,000 稀释)，100μl/孔，室温孵育2h；PBST洗3遍，加入100μl HRP-羊抗兔IgG 抗体(1：6,000)，室温孵育1h；PBST洗3遍，加入100μl TMB显色液，室温避光显色后，加50μl终止液终止，在OD 450nm读数。结果显示(图3D)：在注射后5min两种蛋白在小鼠体内的含量相近。在5min后，随着时间的变化，两组均有下降趋势，VP1在注射后15min下降最为明显，比ABD-VP1更强烈。
3)ABD-VP1在小鼠体内的生物分布情况
我们将VP1和ABD-VP1蛋白通过皮下方式注射到小鼠体内，分别在2h， 6h，12h，24h，48h，96h等时间点取小鼠的器官，观察蛋白在各个器官的分布。结果显示(图4A)：VP1在肾脏中积聚最多，ABD-VP1主要集中在淋巴结( 图4B)。图4C对两种蛋白在淋巴结的积累单独做了比较，显示ABD-VP1比 VP1有更高的淋巴结积累。
实施例3：ABD-VP1重组蛋白疫苗皮下免疫BALB/c小鼠
将6-8周龄BALB/c雄鼠分为3组，分别为：PBS、VP1、ABD-VP1，每组 6只小鼠。共免疫三次，隔周经眼眶后眦静脉采血，37℃静置30min，3,000rpm 离心30min，收集血清，分装冻存于-80℃用于后续检测。
免疫方法如下：
1)以注射器吸取25μg重组蛋白(溶于200μlPBS中)直接注射小鼠皮下部位，
2)一周后取血，
3)二周后重复1)+2)的免疫过程，
4)共免疫3次，VP1蛋白总量在50-100μg左右。
实施例4：皮下免疫ABD-VP1可诱导CVB3特异性抗体应答
间接ELISA法检测免疫小鼠血清中CVB3特异性IgG抗体水平和抗体滴度。以10μg/ml的VP1237-249肽段包被ELISA板，4℃过夜。用0.05％的PBST 洗三次，1％BSA-PBST封闭液封闭，室温孵育1h。0.05％PBST洗3遍，加入 100μl稀释后的血清(1：40稀释)，37℃孵育2h；PBST洗3遍，加入HRP- 羊抗小鼠IgG(1：6,000稀释)，100μl/孔，室温孵育1h；PBST洗5遍，加入 100μl TMB显色液，室温避光显色后，加50μl终止液终止，在OD 450nm读数。
测定抗体滴度时，抗原包被、封闭同上，血清原液倍比稀释(分别为20 倍，40倍，80倍，160倍，320倍，640倍，1280倍，2560倍)，读数后，选取能产生阳性结果的最大稀释度为抗体滴度。
如图5所示：ABD-VP1重组蛋白疫苗免疫三次后在小鼠体内诱生了高水平的CVB3特异性血清IgG，显著高于VP1组(图5A)。并且ABD-VP1心肌炎重组蛋白疫苗还显著增加了特异性血清IgG的抗体滴度(图5B)。
实施例5：ABD-VP1皮下免疫可诱导脾脏T细胞特异性增殖和CTL杀伤
1)小鼠脾脏T细胞CTL功能检测
分别取各实验组小鼠的脾脏，研磨后转移到15ml离心管中，1,500rpm离心5min，弃上清。加入1×ACK破裂红细胞，室温置3min，用3倍ACK体积的PBS终止反应，1,500rpm离心5min去除红细胞。将脾细胞悬液调整浓度为 1×106/ml/孔加入24孔细胞培养板中，用VP1237-249刺激细胞(20μg/ml)，置 CO2培养箱中静置培养48h后，每孔半数换液，新培养液为含20U/ml的IL-2 的培养基。后续依细胞变黄程度换液，体外培养6-7天后进行杀伤实验。
将用灭活的CVB3刺激的SP2/0细胞(30μl/ml)作为靶细胞加入96孔U 型板，经体外刺激再培养的脾脏细胞浓度调整为5×106/ml作为效应细胞，按 100μl/孔加入加有靶细胞的96孔U型板中，即效靶比分别为50：1。LDH释放对照组的设计(每组均设3个复孔)：(1)培养液对照组：200μl/孔无血清 1640培养液；(2)低释放组：100μl靶细胞SP2/0+100μl/无血清1640培养液； (3)高释放组：100μl靶细胞SP2/0+100μl细胞裂解液；(4)效应细胞：100μl 效应细胞+100μl完全培养液。37℃，5％CO2培养箱培养72h，250g离心 15min。取出100μl上清培养液，转移到96孔平底细胞培养板中，加入100μl Reaction mixture溶液，室温避光孵育后，加入50μl终止液终止反应。在OD 490nm处检测吸光度值。
特异性CTL活性的计算方法：
CTL细胞毒相对活性＝(A效靶细胞混合－A效应细胞对照－A低释放对照)/(A高释放对照－A)]×100％。
结果显示(图6A)：与对照组VP1相比，ABD-VP1组诱导的CTL杀伤活性增强。提示ABD-VP1重组蛋白疫苗有效诱生了较强的CVB3特异性T细胞CTL应答，有抵抗CVB3感染的潜能。
2)小鼠脾脏T细胞增殖功能检测
小鼠脾脏T细胞增殖功能使用Roche Brdu cell proliferation ELISA试剂盒进行检测，具体方法如下：分别取各实验组小鼠的脾脏，研磨后转移到15ml离心管中，1,500rpm离心5min，弃上清。加入1×ACK破裂红细胞，室温置3min，用3倍ACK体积的PBS终止反应，1,500rpm离心5min去除红细胞。将淋巴细胞悬液浓度调整为4×106/ml，100μl/孔加入96孔U型板中。同时用VP1237-249多肽刺激，浓度为20μg/ml，37℃培养箱中培养72h；用培养基将Brdu-labeling solution 1:100稀释。在96孔板中加入稀释后的Brdu-labelingsolution，10μl/孔 (Brdu终浓度为100μM)，37℃培养箱培养24h；300g离心10min，洗掉细胞上清，60℃烘箱1h干燥细胞；每孔加入200μl Fixdent溶液，室温孵育30min 后，轻轻拍掉板内液体；每孔加入100μl anti-Brdu-POD工作溶液(用抗体稀释液1：100稀释)，室温孵育90min；用1×washing solution洗板三次，200-300μl/ 孔；每孔加入100μl substratesolution显色后，25μl终止液终止反应，OD 450nm 检测吸光度值。
结果显示：与VP1免疫组相比，ABD-VP1免疫组脾脏细胞对VP1237-249产生了更强烈的增殖反应(图6B，P<0.05)。提示该重组蛋白疫苗皮下免疫可显著增强脾脏部位特异性T细胞增殖反应。
实施例6：CVB3感染后免疫小鼠体重改变情况
隔周免疫小鼠三次，末次免疫两周后以3LD50的CVB3剂量攻毒，逐日观察攻毒后小鼠的体重变化情况并记录。由于各组小鼠初始体重不同，所以我们采用体重减轻率的方式。结果显示(图7)：各个免疫小鼠攻毒后，PBS组小鼠体重下降最明显(22.58％)，其次为VP1对照组(19.31％)，ABD-VP1免疫组小鼠体重变化最小，为11.91％，说明ABD-VP1疫苗发挥了有效的抗病毒作用，导致小鼠体重变化最小。并且随着观察时间的延长，小鼠体重有回升的趋势。
实施例7：CVB3感染后免疫小鼠心肌病理改变情况
各免疫组的小鼠攻毒后，颈椎脱臼法处死小鼠。取各免疫组小鼠心脏组织，于福尔马林中浸泡48h，转移到全自动脱水机中脱水过夜；经石蜡包埋后用切片机切取组织最大横截面，烘箱中烘干后进行H&E染色，顺序从前到后分别为：二甲苯(7min)→二甲苯(7min)→二甲苯(7min)→无水乙醇(2min)→95％乙醇 (2min)→80％乙醇(2min)→自来水洗(20s)→苏木精染色(8min)→自来水洗 (20s)→1％盐酸酒精分化(3s)→自来水洗(10s)→55℃水浴反蓝(5min)→自来水或蒸馏水洗(3s)→伊红染色(35-40s)→自来水洗(3s)→80％酒精脱水(20s)→95％酒精脱水(20s)→无水乙醇(20s)→封片→吹风机吹干→中性树胶封片→加盖玻片，置于正置荧光显微镜下观察。
结果显示：PBS组心室内外壁均出现大量严重的灶性坏死，大量心肌细胞被破坏，而代之以成团的炎性淋巴细胞浸润，心肌坏死损伤比较严重；VP1组心肌坏死损伤较轻，心肌实质中仅可见到少量淋巴细胞浸润和坏死灶，炎症灶多集中于心内膜下，范围较小；ABD-VP1免疫组心肌损伤最轻，部分小鼠心肌除有细胞浊肿现象和少量的淋巴细胞浸润，无明显异常，近似于正常心肌细胞(图8)。结果提示：ABD-VP1疫苗皮下免疫可有效预防病毒性心肌炎的发生。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗及其制备方法
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 356
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Gly Pro Val Glu Asp Ala Ile Thr Ala Ala Ile Gly Arg Val Ala Asp
1 5 10 15
Thr Val Gly Thr Gly Pro Thr Asn Ser Glu Ala Ile Pro Ala Leu Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Thr Gly His Thr Ser Gln Val Val Pro Ser Asp Thr Met
35 40 45
Gln Thr Arg His Val Lys Asn Thr Tyr Glu His Ser Arg Ser Glu Ser
50 55 60
Thr Ile Glu Asn Phe Leu Cys Arg Ser Ala Cys Val Thr Tyr Glu Phe
65 70 75 80
Thr Glu Thr Tyr Glu Glu Asn Ser Gly Ala Lys Arg Thr Tyr Glu Ala
85 90 95
Glu Trp Val Ile Thr Pro Arg Gln Ala Ala Gln Leu Arg Arg Lys Leu
100 105 110
Glu Phe Phe Thr Thr Tyr Glu Val Arg Phe Asp Leu Glu Leu Thr Phe
115 120 125
Val Ile Thr Ser Thr Gln Gln Pro Ser Thr Thr Gln Asn Gln Asp Ala
130 135 140
Gln Ile Leu Thr His Gln Ile Met Thr Tyr Glu Val Pro Pro Gly Gly
145 150 155 160
Pro Val Pro Asp Lys Val Asp Ser Thr Tyr Glu Val Trp Gln Thr Ser
165 170 175
Thr Asn Pro Ser Val Phe Trp Thr Glu Gly Asn Ala Pro Pro Arg Met
180 185 190
Ser Val Pro Phe Leu Ser Ile Gly Asn Ala Thr Tyr Glu Ser Asn Phe
195 200 205
Thr Tyr Glu Asp Gly Trp Ser Glu Phe Ser Arg Asn Gly Val Thr Tyr
210 215 220
Glu Gly Ile Asn Thr Leu Asn Asn Met Gly Thr Leu Thr Tyr Glu Ala
225 230 235 240
Arg His Val Asn Ala Gly Ser Thr Gly Pro Ile Lys Ser Thr Ile Arg
245 250 255
Ile Thr Tyr Glu Phe Lys Pro Lys His Val Lys Ala Arg Ile Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Arg Leu Cys Gln Thr Tyr Glu Glu Lys Ala Lys Asn Val Asn
275 280 285
Phe Gln Pro Ser Gly Val Thr Thr Thr Arg Gln Ser Ile Thr Thr Met
290 295 300
Thr Asn Thr Lys Leu Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg
305 310 315 320
Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn
325 330 335
Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu
340 345 350
Ala Ala Leu Pro
355
<210> 2
<211> 990
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
ggccccgtgg aagacgcgat aacagccgcc atagggagag ttgcggacac cgtgggtaca 60
gggccaacca actcagaggc tataccagca ctcactgctg ctgagacagg tcacacgtcg 120
caagtagtgc cgagtgacac catgcagaca cgccacgtta agaactacca ttcaaggtct 180
gagtcgacca tagagaactt cctatgtagg tcagcatgcg tgtactttac agagtatgaa 240
aactcaggcg ccaagcggta tgctgaatgg gtaataacac cacgacaagc ggcacaactt 300
aggagaaagc tagagttctt tacctacgtc cggtttgacc tggagctgac gtttgtcata 360
acaagtactc aacagccctc aaccacacag aaccaggatg cacagatcct aacacaccaa 420
attatgtatg taccaccagg tgggcctgtg ccagacaaag tcgattctta cgtgtggcaa 480
acatctacga atcccagtgt gttttggacc gagggaaacg ccccgccgcg tatgtccgta 540
ccgtttttga gcattggcaa cgcttattca aatttctatg atgggtggtc tgaattttcc 600
aggaacgggg tttacggtat caacacacta aacaacatgg gcacgctata tgcaagacat 660
gtcaatgctg gaagcacggg accaataaaa agcaccatta gaatctactt caaacctaag 720
catgtcaaag cgcggatacc tagaccacct agactctgcc aatacgagaa ggcaaagaac 780
gtgaacttcc aacccagcgg agttaccact actaggcaaa gcatcactac aatgacaaat 840
acgaagctta tgttagctga agctaaagtc ttagctaaca gagaacttga caaatatgga 900
gtaagtgact attacaagaa cctaatcaac aatgccaaaa ctgttgaagg tgtaaaagca 960
ctgatagatg aaattttagc tgcattacct 990
<210> 3
<211> 307
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 3
Gly Pro Val Glu Asp Ala Ile Thr Ala Ala Ile Gly Arg Val Ala Asp
1 5 10 15
Thr Val Gly Thr Gly Pro Thr Asn Ser Glu Ala Ile Pro Ala Leu Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Thr Gly His Thr Ser Gln Val Val Pro Ser Asp Thr Met
35 40 45
Gln Thr Arg His Val Lys Asn Thr Tyr Glu His Ser Arg Ser Glu Ser
50 55 60
Thr Ile Glu Asn Phe Leu Cys Arg Ser Ala Cys Val Thr Tyr Glu Phe
65 70 75 80
Thr Glu Thr Tyr Glu Glu Asn Ser Gly Ala Lys Arg Thr Tyr Glu Ala
85 90 95
Glu Trp Val Ile Thr Pro Arg Gln Ala Ala Gln Leu Arg Arg Lys Leu
100 105 110
Glu Phe Phe Thr Thr Tyr Glu Val Arg Phe Asp Leu Glu Leu Thr Phe
115 120 125
Val Ile Thr Ser Thr Gln Gln Pro Ser Thr Thr Gln Asn Gln Asp Ala
130 135 140
Gln Ile Leu Thr His Gln Ile Met Thr Tyr Glu Val Pro Pro Gly Gly
145 150 155 160
Pro Val Pro Asp Lys Val Asp Ser Thr Tyr Glu Val Trp Gln Thr Ser
165 170 175
Thr Asn Pro Ser Val Phe Trp Thr Glu Gly Asn Ala Pro Pro Arg Met
180 185 190
Ser Val Pro Phe Leu Ser Ile Gly Asn Ala Thr Tyr Glu Ser Asn Phe
195 200 205
Thr Tyr Glu Asp Gly Trp Ser Glu Phe Ser Arg Asn Gly Val Thr Tyr
210 215 220
Glu Gly Ile Asn Thr Leu Asn Asn Met Gly Thr Leu Thr Tyr Glu Ala
225 230 235 240
Arg His Val Asn Ala Gly Ser Thr Gly Pro Ile Lys Ser Thr Ile Arg
245 250 255
Ile Thr Tyr Glu Phe Lys Pro Lys His Val Lys Ala Arg Ile Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Arg Leu Cys Gln Thr Tyr Glu Glu Lys Ala Lys Asn Val Asn
275 280 285
Phe Gln Pro Ser Gly Val Thr Thr Thr Arg Gln Ser Ile Thr Thr Met
290 295 300
Thr Asn Thr
305
<210> 4
<211> 843
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
ggccccgtgg aagacgcgat aacagccgcc atagggagag ttgcggacac cgtgggtaca 60
gggccaacca actcagaggc tataccagca ctcactgctg ctgagacagg tcacacgtcg 120
caagtagtgc cgagtgacac catgcagaca cgccacgtta agaactacca ttcaaggtct 180
gagtcgacca tagagaactt cctatgtagg tcagcatgcg tgtactttac agagtatgaa 240
aactcaggcg ccaagcggta tgctgaatgg gtaataacac cacgacaagc ggcacaactt 300
aggagaaagc tagagttctt tacctacgtc cggtttgacc tggagctgac gtttgtcata 360
acaagtactc aacagccctc aaccacacag aaccaggatg cacagatcct aacacaccaa 420
attatgtatg taccaccagg tgggcctgtg ccagacaaag tcgattctta cgtgtggcaa 480
acatctacga atcccagtgt gttttggacc gagggaaacg ccccgccgcg tatgtccgta 540
ccgtttttga gcattggcaa cgcttattca aatttctatg atgggtggtc tgaattttcc 600
aggaacgggg tttacggtat caacacacta aacaacatgg gcacgctata tgcaagacat 660
gtcaatgctg gaagcacggg accaataaaa agcaccatta gaatctactt caaacctaag 720
catgtcaaag cgcggatacc tagaccacct agactctgcc aatacgagaa ggcaaagaac 780
gtgaacttcc aacccagcgg agttaccact actaggcaaa gcatcactac aatgacaaat 840
acg 843
<210> 5
<211> 46
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 5
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 6
<211> 138
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
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<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
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<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
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<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
cgcggatcca tgttagctga agctaaagtc ttagctaaca g 41
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
cgcggatcca ggtaatgcag ctaaaatttc atcta 35

Claims (9)

1.一种靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗，其特征在于，所述的重组蛋白疫苗由链球菌G蛋白的血清白蛋白结合结构域与柯萨奇病毒B3型来源的VP1蛋白重组而成；所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗，其特征在于，所述的链球菌G蛋白的血清白蛋白结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID O.5所示，所述的柯萨奇病毒B3型来源的VP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种权利要求1-2任一项所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
5.一种携带权利要求3所述的编码基因的重组质粒。
6.一种表达权利要求1-2任一项所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗的重组菌。
7.权利要求1-2任一项所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗在制备病毒性心肌炎防治性药物中的应用。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1-2任一项所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗。
9.一种权利要求1-2任一项所述的靶向引流淋巴结的CVB3心肌炎重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建编码CVB3 VP1原核表达质粒
以柯萨奇病毒B3型Nancy株DNA作为模板，PCR扩增CVB3抗原VP1全长编码基因；将目的基因经Hind III和BamH I双酶切后与经同样双酶切的pET28a载体连接，获得编码CVB3 VP1原核表达质粒pET28a-VP1；
（2）构建编码ABD-VP1蛋白疫苗的原核表达质粒
合成编码ABD的全长基因，通过PCR方法扩增ABD全长基因；以构建的pET28a-VP1质粒为载体，将经BamH I单酶切的ABD全长基因片段与经同样单酶切的pET28a-VP1载体连接，获得编码ABD-VP1蛋白疫苗的原核表达质粒pET28a-ABD-VP1；
（3）构建重组大肠杆菌
将表达质粒pET28a-ABD-VP1构建到BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单菌落，筛选阳性克隆重组大肠杆菌BL21（DE3）pET28a-ABD-VP1；
（4）制备ABD-VP1重组蛋白疫苗
将重组大肠杆菌BL21（DE3）pET28a-ABD-VP1培养，加入IPTG诱导，产生的包涵体采用1.8-2.2M的尿素进行溶解，梯度透析后得到所述的ABD-VP1重组蛋白疫苗。
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