CN101003569B - 炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶抗原表位及其突变体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶的抗原表位及其突变体与应用。其目的是提供一种炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶的抗原表位及其突变体与其在制备预防和/或治疗炭疽药物中的应用。炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG的抗原表位，是自氨基端第164位至第172位氨基酸残基。炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体是将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG缺失自氨基端第164位至第172位氨基酸残基中的一个或几个氨基酸残基后得到的蛋白质。MPlyG比野生型PlyG的抗原性显著降低，但是裂解酶活性和野生型PlyG相近，动物实验证明与野生型PlyG相比，MPlyG具有较低的免疫原性，因此MPlyG可作为野生型PlyG的替代品用于临床及制药领域，应用前景广阔。

Description

炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶抗原表位及其突变体与应用

技术领域

本发明涉及炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶的抗原表位及其突变体与应用，特别是涉及一种炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶的抗原表位及其突变体与其在制备炭疽的诊断、预防和/或治疗性药物中的应用。

背景技术

炭疽是一种人畜共患的急性传染病，由炭疽芽孢杆菌引起，主要易感动物为羊、牛、马等食草家畜，死于炭疽的动物尸体血液不凝固，常随自然孔道出血排出大量病菌。由于感染途径不同，临床上将炭疽分为皮肤型、胃肠型和吸入感染型。皮肤炭疽较为多见，主要表现为裸露部位皮肤炭疽痛；胃肠型炭疽较为少见，除有发热、胃肠症状外，常有血尿和血便；吸入感染型炭疽起病急，初期类似感冒，容易误诊，病死率高。

炭疽芽孢杆菌是备受关注的生物战剂，炭疽芽孢杆菌可产生抗性很强的芽孢，在干燥的土壤中能存活40年以上。911后，美国炭疽芽孢恐怖事件更是引起了全球的广泛关注，感染炭疽后快速有效的应急措施显得尤为重要。

但目前，对炭疽的快速诊断、预防和治疗均存在困难。由于炭疽芽孢杆菌与腊状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的某些菌株极其相似，从而给炭疽的准确、快速及特异诊断带来困难。现有的炭疽疫苗免疫效果低、保护时间短，若在恐怖攻击中使用战剂级的炭疽孢子，抗生素治疗将无效。

2002年，美国洛克菲勒大学的Raymond Schuch等人发现能专一裂解炭疽杆菌的γ噬菌体裂解酶PlyG(Schuch R，Nelson D，Vincent A，et al，A bacteriolytic agentthat detects and kills Bacillus anthracis，Nature，2002，418∶884-889)。炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG由233个氨基酸残基组成，由炭疽杆菌γ噬菌体编码产生，作为一种酰胺酶，专一催化水解炭疽杆菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键，从而快速裂解炭疽杆菌，释放装备好的噬菌体成熟颗粒。PlyG可识别炭疽杆菌细胞壁上种属特异的糖基，因此对炭疽杆菌的裂解作用是特异的。实验结果表明，致死剂量的炭疽杆菌感染小鼠后，150单位剂量的PlyG可以使80％小鼠存活。

上述研究结果表明，可将炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG开发成为一种诊断、预防和治疗炭疽的药物。但是，野生型的γ噬菌体裂解酶PlyG有一定的免疫原性，在动物及人的血清中用Western Blot法能检测到与PlyG交叉反应的抗体，而且抗PlyG的抗体能够一定程度地中和PlyG的裂解酶活性，因此限制了PlyG在临床上的应用。

发明内容

本发明的其中一个目的是提供炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG的抗原表位。

本发明所提供的炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG的抗原表位，是自氨基端(N端)第164位至第172位氨基酸残基，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：4所示。

编码上述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG抗原表位的基因，其核苷酸序列可如SEQID NO：5所示。

本发明还提供了一种免疫原性较低的炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体。

本发明所提供的炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体，名称为MPlyG，是将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG缺失自氨基端第164位至第172位氨基酸残基中的一个或几个氨基酸残基后得到的蛋白质。

所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体，可为将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG分别自氨基端第169位或第170位氨基酸残基、第164位至第170位氨基酸残基、第169位至第170位氨基酸残基、或者是第171位至第172位氨基酸残缺失后得到的蛋白质。

PlyG自氨基端第169位和第170位氨基酸残基是两个相同的异亮氨酸残基，因此缺失其中的任一位氨基酸残基后获得的是同一突变体。

具体来讲，将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG自氨基端第169位或第170位氨基酸残基缺失后得到的突变体的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示，序列表中SEQ ID NO：1由232个氨基酸残基组成；将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG自氨基端第164位至第170位氨基酸残基缺失后得到的突变体的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：6所示，序列表中SEQ ID NO：6由226个氨基酸残基组成；将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG自氨基端第169位至第170位氨基酸残基缺失后得到的突变体的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：7所示，序列表中SEQID NO：7由231个氨基酸残基组成；将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG自氨基端第171位至第172位氨基酸残基缺失后得到的突变体的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：8所示，序列表中SEQID NO：8由231个氨基酸残基组成。

编码上述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体的基因(MPlyG)，可为序列表中的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID NO：2由699个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-699位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQID NO：9由681个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-678位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：10由696个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-693位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：11由696个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-693位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因MPlyG的表达载体、转基因细胞系和宿主菌，以及扩增MPlyG中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体MPlyG的方法。

本发明所提供的表达上述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体的方法，是将含有上述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因MPlyG的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体MPlyG。

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)或E.coli Top10等，优选为E.coliBL21(DE3)。

用于构建所述重组表达载体的出发载体可为任意一种可在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，如pET系列载体(Novagen公司)、pGEX系列载体(Amersham Pharmacia公司)、pMAL系列载体(NEB公司)或pBAD系列载体(Invitrogen公司)，优选为pET-22b(+)、pGEX-4T-1、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c等。

以pET-22b(+)为出发载体，构建的所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因MPlyG的重组表达载体为pET-22b(+)-PlyG-Δ170、pET-22b(+)-PlyG-Δ171-172、pET-22b(+)-PlyG-Δ169-170或pET-22b(+)-PlyG-Δ171-172。

以pGEX-4T-1为出发载体，构建的所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因MPlyG的重组表达载体为pGEX-4T-1-PlyG-Δ169-170或pGEX-4T-1-PlyG-Δ164-170。

上述重组表达载体和重组菌均可按照常规方法构建。

可采用构建工程菌所用的出发菌株的常规培养条件对工程菌进行培养。

所述工程菌为重组大肠杆菌时，诱导表达的过程中添加IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度可为0.1-1.2mM，诱导温度可为20-35℃，诱导时间可为2-14小时。

本发明还提供了一种预防和/或治疗炭疽的药物。

本发明所提供的预防和/或治疗炭疽的药物，它的活性成分为上述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶突变体MPlyG。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊或口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为(1μg-lmg)炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶突变体MPlyG/kg体重，每天给药一次，疗程为(1-7天)。

本发明提供了炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG的抗原表位及其突变体MPlyG。MPlyG是将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG缺失自氨基端第164位至第172位氨基酸残基中的一个或几个氨基酸残基后得到的蛋白质。实验证明，PlyG自氨基端第164至第172位氨基酸残基是其主要的抗原表位，MPlyG比野生型PlyG的免疫原性显著降低，MPlyG与抗PlyG的兔血清的抗体结合能力约是野生型PlyG的58％，与人血清中交叉反应的抗体的结合能力约是野生型PlyG的55％，此外，抗PlyG的兔血清对MPlyG活性的中和作用也比野生型PlyG低，特别是缺失第169位或第170位异亮氨酸残基后得到的MPlyG的裂解酶活性还与野生型PlyG相近，该突变体免疫小鼠和家兔后产生抗体滴度较野生型低40-100倍，因此，该MPlyG可作为野生型PlyG的替代品用于临床及制药领域，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为Western Blot法检测兔血清中是否产生了与PlyG特异结合的抗PlyG抗体的结果

图2为PlyG-C63、C70、N170和Δ164-170的抗原性检测结果

图3为PlyG-Δ166-168和PlyG-Δ169-170的抗原性检测结果

图4为PlyG-Δ166-168和PlyG-Δ169-170的酶活性检测结果

图5为PlyG-Δ171-172的抗原性检测结果

图6为PlyG-Δ170的抗原性检测结果

图7为PlyG-Δ170的酶活性及与抗PlyG的兔血清的中和实验检测结果

图8为PlyG-Δ170的免疫原性检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物均由北京奥科公司合成。

实施例1、炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶突变体MPlyG的获得

一、制备抗PlyG抗体

取0.5mg纯化的PlyG(其原核表达及纯化方法见申请号：200610057298.5的专利申请，发明名称为“一种表达炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶的方法及其专用基因”)，将其与完全弗氏佐剂按体积比1∶1混合后免疫兔子，每10天免疫一次，35天后心脏取血，获得抗血清，然后用该抗血清通过Western Blot法检测血清中是否产生了抗PlyG抗体。检测结果如图1所示，表明血清中产生了可与PlyG特异结合的抗PlyG抗体。

二、含有PlyG缺失突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

为了确定PlyG抗原表位的位置，用基因工程的方法获得缺失不同长度氨基酸残基序列的PlyG突变体，以检测它们与抗PlyG抗体的结合能力，从而确定PlyG与其抗体结合的部位，即抗原表位，首先构建含有不同长度PlyG缺失突变体基因的大肠杆菌表达载体，具体方法如下：

1、含有GST-PlyG-C63突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

首先，根据人工构建的编码野生型PlyG的核苷酸序列(序列表中SEQ ID NO：3，该序列可见于上述名称为“一种表达炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶的方法及其专用基因”的专利中)设计一对用于PCR扩增具有PlyG C端63个氨基酸残基的PlyG突变体(命名为GST-PlyG-C63)基因的引物，引物序列如下：

P1(上游引物)：5’-CGCGGATCCCAGTCCGGTGCTTTCTCCC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

P2(下游引物)：5’-GCGGAATTC TCACTTGACTTCGTACCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)

然后，以PlyG为模板，在引物P1和P2的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃5分钟；然后94℃30秒，52℃30秒，72℃1分，共30个循环；最后72℃7分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了207bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶BamHI和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pGEX-4T-1(Amersham Pharmacia公司)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有GST-PlyG-C63突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pGEX-4T-1-PlyG-C63。

2、含有GST-PlyG-C70突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

首先，根据野生型PlyG的核苷酸序列设计一对用于PCR扩增具有PlyG C端70个氨基酸残基的PlyG突变体(命名为GST-PlyG-C70)基因的引物，引物序列如下：

P3(上游引物)：5’-CGCGGATCCCGACCAAACAGAACATC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

P4(下游引物)：5’-GCGGAATTCTCACTTGACTTCGTACCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)

然后，以PlyG为模板，在引物P3和P4的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件与步骤1相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了228bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pGEX-4T-1进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有GST-PlyG-C70突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pGEX-4T-1-PlyG-C70。

3、含有GST-PlyG-N170突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

首先，根据野生型PlyG的核苷酸序列设计一对用于PCR扩增具有PlyG N端170个氨基酸残基的PlyG突变体(命名为GST-PlyG-N170)基因的引物，引物序列如下：

P5(上游引物)：5’-CGCGGATCCATGGAAATCCAGAAAAAACT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

P6(下游引物)：5’-CGCGAATTCAATGATGTTCTGTTTGGTCG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)

然后，以PlyG为模板，在引物P5和P6的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件与步骤1相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了528bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pGEX-4T-1进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有GST-PlyG-N170突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pGEX-4T-1-PlyG-N170。

4、含有GST-PlyG-Δ164-170突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

根据野生型PlyG的核苷酸序列设计2对用于PCR扩增缺失自N端第164-170位氨基酸残基的PlyG突变体(命名为GST-PlyG-Δ164-170)基因的引物，引物序列如下：

PA1(上游引物)：5’-CGCGGATCCATGGAAATCCAGAAAAAACT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

PA2(下游引物)：5’-CGTACGGGGAGAAAGCACCGGACTGAGAAGTGGTAGCAACATTGC-3’；

PB1(上游引物)：5’-CGCGGATCCCAGTCCGGTGCTTTCTCCC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

PB2(下游引物)：5’-GCGGAATTCTCACTTGACTTCGTACCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)；

用重叠PCR的方法扩增GST-PlyG-N170突变体基因，需要两步：第一步，以PlyG为模板，分别在由引物PA1和PA2组成的引物对及由引物PB1和PB2组成的引物对的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃5分钟；然后94℃30秒，52℃30秒，72℃1分，30个循环；最后72℃7分钟。再以第一步扩增的522bp和207bp的两个重叠的DNA片段作为模板，在PA1和PB2的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃5分钟；然后94℃30秒，50℃30秒，72℃1分，30个循环；最后72℃7分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了699bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pGEX-4T-1进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有GST-PlyG-Δ164-170突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pGEX-4T-1-PlyG-Δ164-170，对其进行测序，测序结果表明缺失自N端第164-170位氨基酸残基后得到的PlyG突变体编码序列具有序列表中SEQ IDNO：6的核苷酸序列，编码SEQ ID NO：9的氨基酸残基序列，与预期结果相符。

5、含有GST-PlyG-Δ166-168突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

根据野生型PlyG的核苷酸序列设计2对用于PCR扩增缺失自N端第166-168位氨基酸残基的PlyG突变体(命名为GST-PlyG-Δ166-168)基因的引物，引物序列如下：

PA3(上游引物)：5’-CGCGGATCCATGGAAATCCAGAAAAAACT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

PA4(下游引物)：5’-GTACGGGGAGAAAGCACCGGACTGAATGATGGTCGGAGAAGTGGTAGC-3’；

PB3(上游引物)：5’-CGCGGATCCCAGTCCGGTGCTTTCTCCC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

PB4(下游引物)：5’-GCGGAATTC TCACTTGACTTCGTACCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)；

用与步骤4相同的重叠PCR方法扩增GST-PlyG-Δ166-168突变体基因，需要两步：第一步，以PlyG为模板，分别在由引物PA3和PA4组成的引物对及由引物PB3和PB4组成的引物对的引导下进行PCR扩增。第二步，再以第一步扩增的534bp和207bp的两个重叠的DNA片段作为模板，在PA 1和PB2的引导下进行PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了711bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pGEX-4T-1进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有GST-PlyG-Δ166-168突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pGEX-4T-1-PlyG-Δ166-168，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确且插入位置正确的含有缺失自N端第166-168位氨基酸残基后得到的PlyG突变体编码序列的重组载体。

6、含有PlyG-Δ166-168突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

根据野生型PlyG的核苷酸序列设计2对用于PCR扩增缺失自N端第166-168位氨基酸残基的PlyG突变体(命名为PlyG-Δ166-168)基因的引物，引物序列如下：

PA5(上游引物)：5’-GGTATACCATATGGAAATCCAGAAAAAAC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)

PA6(下游引物)：5’-GTACGGGGAGAAAGCACCGGACTGAATGATGGTCGGAGAAGTGGTAGC-3’；

PB5(上游引物)：5’-CGCGGATCCCAGTCCGGTGCTTTCTCCC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)

PB6(下游引物)：5’-GCGGAATTC TCACTTGACTTCGTACCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)；

用与步骤4相同的重叠PCR方法扩增PlyG-Δ166-168突变体基因，需要两步：第一步，以PlyG为模板，分别在由引物PA5和PA6组成的引物对及由引物PB5和PB6组成的引物对的引导下进行PCR扩增。第二步，再以第一步扩增的535bp和207bp的两个重叠的DNA片段作为模板，在PA5和PB6的引导下进行PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了712bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶NdeI和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pET-22b(+)(Novagen公司)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有PlyG-Δ166-168突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pET-22b(+)-PlyG-Δ166-168，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确且插入位置正确的含有缺失自N端第166-168位氨基酸残基后得到的PlyG突变体编码序列的重组载体。

7、含有GST-PlyG-Δ169-170突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

根据野生型PlyG的核苷酸序列设计2对用于PCR扩增缺失自N端第169-170位氨基酸残基的PlyG突变体(命名为GST-PlyG-Δ169-170)基因的引物，引物序列如下：

PA7(上游引物)：5’-CGCGGATCCATGGAAATCCAGAAAAAACT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

PA8(下游引物)：5’-GTACGGGGAGAAAGCACCGGACTGAATGATGGTCGGAGAAGTGGTAGC-3’；

PB7(上游引物)：5’-CGCGGATCCCAGTCCGGTGCTTTCTCCC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

PB8(下游引物)：5’-GCGGAATTCTCACTTGACTTCGTACCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)；

用与步骤4相同的重叠PCR方法扩增GST-PlyG-Δ169-170突变体基因，需要两步：第一步，以PlyG为模板，分别在由引物PA7和PA8组成的引物对及由引物PB7和PB8组成的引物对的引导下进行PCR扩增。第二步，再以第一步扩增的537bp和207bp的两个重叠的DNA片段作为模板，在PA7和PB8的引导下进行PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了714bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶BamHI和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pGEX-4T-1进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有GST-PlyG-Δ169-170突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pGEX-4T-1-PlyG-Δ169-170，对其进行测序，测序结果表明缺失自N端第169-170位氨基酸残基后得到的PlyG突变体编码序列具有序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列，编码SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列。

8、含有PlyG-Δ169-170突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

根据野生型PlyG的核苷酸序列设计2对用于PCR扩增缺失自N端第169-170位氨基酸残基的PlyG突变体(命名为PlyG-Δ169-170)基因的引物，引物序列如下：

PA9(上游引物)：5’-GGTATACCATATGGAAATCCAGAAAAAAC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)

PA10(下游引物)：5’-GTACGGGGAGAAAGCACCGGACTGAATGATGGTCGGAGAAGTGGTAGC-3’；

PB9(上游引物)：5’-CGCGGATCCCAGTCCGGTGCTTTCTCCC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)

PB10(下游引物)：5’-GCGGAATTCTCACTTGACTTCGTACCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)；

用与步骤4相同的重叠PCR方法扩增PlyG-Δ169-170突变体基因，需要两步：第一步，以PlyG为模板，分别在由引物PA9和PA10组成的引物对及由引物PB9和PB10组成的引物对的引导下进行PCR扩增。第二步，再以第一步扩增的538bp和207bp的两个重叠的DNA片段作为模板，在PA9和PB10的引导下进行PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了715bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶Nde I和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pET-22b(+)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有PlyG-Δ169-170突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pET-22b(+)-PlyG-Δ169-170，对其进行测序，测序结果表明缺失自N端第169-170位氨基酸残基后得到的PlyG突变体编码序列具有序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列，编码SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列。

9、含有PlyG-Δ171-172突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

根据野生型PlyG的核苷酸序列设计2对用于PCR扩增缺失自N端第171-172位氨基酸残基的PlyG突变体(命名为PlyG-Δ171-172)基因的引物，引物序列如下：

PA11(上游引物)：5’-GGTATACCATATGGAAATCCAGAAAAAAC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)

PA12(下游引物)：5’-CGCGAATTCAATGATGTTCTGTTTGGTCG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)；

PB11(上游引物)：5’-CCGACCAAACAGAACATCATTGGTGCTTTCTCCCCGTAC-3’

PB12(下游引物)：5’-GCGGAATTCTCACTTGACTTCGTACCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)；

用与步骤4相同的重叠PCR方法扩增PlyG-Δ171-172突变体基因，需要两步：第一步，以PlyG为模板，分别在由引物PA11和PA12组成的引物对及由引物PB11和PB12组成的引物对的引导下进行PCR扩增。第二步，再以第一步扩增的529bp和216bp的两个重叠的DNA片段作为模板，在PA11和PB12的引导下进行PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了715bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶Nde I和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pET-22b(+)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有PlyG-Δ171-172突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pET-22b(+)-PlyG-Δ171-172，对其进行测序，测序结果表明缺失自N端第171-172位氨基酸残基后得到的PlyG突变体编码序列具有序列表中SEQ ID NO：8的核苷酸序列，编码SEQ ID NO：11的氨基酸残基序列。

10、含有PlyG-Δ170突变体基因的大肠杆菌表达载体的构建

根据野生型PlyG的核苷酸序列设计2对用于PCR扩增缺失自N端第170或169位氨基酸残基(PlyG自氨基端第169位和第170位氨基酸残基是两个相同的异亮氨酸残基，因此缺失其中的任一位氨基酸残基后获得的是同一突变体)的PlyG突变体(命名为PlyG-Δ170)基因的引物，引物序列如下：

PA13(上游引物)：5’-GGTATACCATATGGAAATCCAGAAAAAAC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)

PA14(下游引物)：5’-GTACGGGGAGAAAGCACCGGACTGGATGTTCTGTTTGGTCGGAGAAG-3’；

PB13(上游引物)：5’-CGCGGATCCCAGTCCGGTGCTTTCTCCC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)

PB14(下游引物)：5’-GCGGAATTCTCACTTGACTTCGTACCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)；

用与步骤4相同的重叠PCR方法扩增PlyG-Δ170突变体基因，需要两步：第一步，以PlyG为模板，分别在由引物PA13和PA14组成的引物对及由引物PB13和PB14组成的引物对的引导下进行PCR扩增。第二步，再以第一步扩增的540bp和207bp的两个重叠的DNA片段作为模板，在PA13和PB14的引导下进行PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了718bp的DNA片段，回收纯化该目的片段，对其用限制性内切酶Nde I和EcoR I进行酶切后与经相同酶双酶切的载体pET-22b(+)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有PlyG-Δ170突变体基因的大肠杆菌表达载体，命名为pET-22b(+)-PlyG-Δ170，对其进行测序，测序结果表明缺失自N端第169或第170位氨基酸残基后得到的PlyG突变体编码序列具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，编码SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列。

三、炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶突变体MPlyG的获得

1、GST-PlyG-C63、GST-PlyG-C70、GST-PlyG-N170、GST-PlyG-Δ164-170突变体的表达及免疫原性检测

将步骤二构建的重组质粒pGEX-4T-1-PlyG-C63、pGEX-4T-1-PlyG-C70、pGEX-4T-1-PlyG-N170和pGEX-4T-1-PlyG-Δ164-170分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性重组子，再分别接种于5mL LB液体培养基(含羧苄青霉素100μg/mL)中，在37℃下培养12小时，然后按1∶100的体积比接种于200mL新鲜的LB液体培养基(含羧苄青霉素100μg/mL)中，在37℃、200rpm下培养至OD₆₀₀＝0.5后，添加IPTG至终浓度为1mM，然后在30℃下培养5小时收集菌体，用20mL冰浴的PBS缓冲液重悬后超声破碎菌体，离心，向上清液中加入0.2mL Glutathione Sepharose 4B(Amersham Pharmacia)4℃旋转孵育使GST融合蛋白与GSH凝胶珠充分交联，两小时后1000rpm离心2分钟，用冰浴的PBS洗涤3次，得到融合蛋白GST-C63，GST-C70，GST-N170和GST-Δ164-170。然后用Western Blot检测GST-C63，GST-C70，GST-N170和GST-Δ164-170与抗PlyG抗体的结合能力，一抗用步骤一制备的抗PlyG的兔血清(按1∶1000比例稀释)，二抗用HRP标记驴抗兔(购自Santa cruz公司，按1∶5000比例稀释)，同时用GST蛋白和GST-PlyG纯蛋白(GST-WT)作对照，检测结果如图2所示(Anti-GST表示作为量参的以抗GST抗体为一抗的检测结果)，结果GST-C70能与抗PlyG的抗体结合，而GST-C63，GST-N170和GST-Δ164-170与抗PlyG的抗体的结合能力非常微弱，表明PlyG自氨基端第164-170位氨基酸残基(PTKQNII)与PlyG的抗原性相关。

2、GST-PlyG-Δ166-168、GST-PlyG-Δ169-170突变体的表达及抗原性检测

采用与步骤1相同的方法将pGEX-4T-1-PlyG-Δ166-168和pGEX-4T-1-PlyG-Δ169-170转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性重组子并进行表达和纯化，得到GST融合蛋白GST-PlyG-Δ166-168、GST-PlyG-Δ169-170。然后用Western Blot法检测GST-PlyG-Δ166-168和GST-PlyG-Δ169-170与抗PlyG抗体结合能力，所用一抗、二抗与步骤1相同，检测结果如图3所示，PlyG-Δ166-168与抗PlyG的抗体的结合能力与野生型PlyG相近，而PlyG-Δ169-170显著减弱，表明PlyG自氨基端第169和170位两个氨基酸残基在抗原表位内部，缺失这两个氨基酸残基，裂解酶PlyG的抗原性将显著减弱。

3、PlyG-Δ166-168、PlyG-Δ169-170的表达及生物活性检测

将步骤二构建的重组质粒pET-22b(+)-PlyG-Δ166-168和pET-22b(+)-PlyG-Δ169-170转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性重组子，再分别接种于5mL LB液体培养基(含羧苄青霉素100μg/mL)中，在37℃下培养12小时，然后按1∶100的体积比接种于200mL新鲜的LB液体培养基(含羧苄青霉素100μg/mL)中，在37℃、200rpm下培养至OD₆₀₀＝0.5后，添加IPTG至终浓度为0.2mM，然后在23℃下培养10小时收集菌体，用20mL冰浴的PBS缓冲液重悬后超声破碎菌体，离心，通过离子交换层析的方法进行纯化，得到PlyG-Δ166-168和PlyG-Δ169-170蛋白。然后将炭疽杆菌疫苗菌A16R(购自中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所)培养至A600≈0.4，用PBS缓冲液洗涤后重悬成A600≈0.1的菌液，取500ul，分别加入10ug纯化的PlyG-Δ166-168、PlyG-Δ169-170蛋白，用紫外分光光度计动态测定A16R菌液A600值，A600值下降反映细菌被裂解，结果如图4所示，PlyG-Δ166-168具有较高的裂解活性，而PlyG-Δ169-170几乎没有裂解活性。

4、PlyG-Δ171-172的表达及抗原性和生物活性检测

采用与步骤3相同的方法将pET-22b(+)-PlyG-Δ171-172转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性重组子并进行表达和纯化，得到PlyG-Δ171-172。然后用Western Blot法检测PlyG-Δ171-172与抗PlyG抗体结合能力，所用一抗、二抗与步骤1相同，检测结果如图5所示(WT为PlyG对照，Coomassie Blue staining表示：考马斯亮兰染色；IB为Western Blot检测结果)，结果显示PlyG-Δ171-172结合抗PlyG抗体的能力与对照比显著减弱。再用与步骤3相同的方法检测PlyG-Δ171-172的裂解活性，结果表明PlyG-Δ171-172失去了生物活性。

5、PlyG-Δ170的表达及抗原性和生物活性检测

1)PlyG-Δ170的表达及抗原性检测

采用与步骤3相同的方法将pET-22b(+)-PlyG-Δ170转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性重组子并进行表达和纯化，得到PlyG-Δ170。然后用WesternBlot法检测PlyG-Δ170与抗PlyG抗体结合能力，所用一抗、二抗与步骤1相同，检测结果如图6所示(WT为PlyG对照，Coomassie Blue staining表示：考马斯亮兰染色；IB为Western Blot检测结果)，结果显示PlyG-Δ170结合抗PlyG抗体的能力与对照比显著减弱。再用ELISA法进一步检测PlyG-Δ170与抗PlyG抗体的结合能力，结果显示PlyG-Δ170与抗PlyG的兔血清的抗体结合能力约是野生型PlyG的58％，PlyG-Δ170与人血清中交叉反应的抗体的结合能力约是野生型PlyG的55％。

2)PlyG-Δ170的生物活性检测

用与步骤3相同的方法检测PlyG-Δ170的裂解活性，结果如图7所示，PlyG-Δ170与野生型PlyG(WT)的酶活性相近。此外，还用抗PlyG的兔血清(Serum)进行了中和实验，结果如图7所示，表明抗PlyG的兔血清对突变体PlyG-Δ170活性的中和作用比野生型PlyG(WT)低。

6、PlyG-Δ170的免疫原性检测

取纯化的PlyG和PlyG-Δ170蛋白各5μg，分别通过肌肉注射免疫昆明(KM)小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，每组6只，连续免疫4天，30天后连续加强免疫3次(每天一次)。用ELISA法检测PlyG、PlyG-Δ170免疫小鼠体内产生的抗体滴度，结果如图8所示(WT为PlyG免疫小鼠组的结果，Δ170为PlyG-Δ170免疫小鼠组的结果)，与PlyG-Δ170免疫小鼠相比，PlyG免疫小鼠在加强免疫后体内产生高滴度抗体，表明PlyG-Δ170的免疫原性显著低于野生型PlyG。

上述检测结果表明PlyG-Δ170不仅具有与野生型PlyG相近的酶活性，还具有较低的抗原性及免疫原性，是本发明优选的炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶突变体MPlyG(序列表中SEQ ID NO：1)，可作为野生型PlyG的替代品用于临床及制药领域。

序列表

<160>    11

<210>    1

<211>    232

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>

<400>    1

Met Glu Ile Gln Lys Lys Leu Val Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Thr Lys

1               5                   10                  15

Cys Pro Tyr Thr Met Lys Pro Lys Tyr Ile Thr Val His Asn Thr Tyr

        20                  25                  30

Asn Asp Ala Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Tyr Met Ile Ser Asn Asn

    35                  40                  45

Asn Glu Val Ser Phe His Ile Ala Val Asp Asp Lys Lys Ala Ile Gln

50                  55                  60

Gly Ile Pro Leu Glu Arg Asn Ala Trp Ala Cys Gly Asp Gly Asn Gly

65                  70                  75                  80

Ser Gly Asn Arg Gln Ser Ile Ser Val Glu Ile Cys Tyr Ser Lys Ser

            85                  90                  95

Gly Gly Asp Arg Tyr Tyr Lys Ala Glu Asp Asn Ala Val Asp Val Val

        100                 105                 110

Arg Gln Leu Met Ser Met Tyr Asn Ile Pro Ile Glu Asn Val Arg Thr

    115                 120                 125

His Gln Ser Trp Ser Gly Lys Tyr Cys Pro His Arg Met Leu Ala Glu

130                 135                 140

Gly Arg Trp Gly Ala Phe Ile Gln Lys Val Lys Asn Gly Asn Val Ala

145                 l50                 l55                 160

Thr Thr Ser Pro Thr Lys Gln Asn Ile Gln Ser Gly Ala Phe Ser Pro

            165                 170                 175

Tyr Glu Thr Pro Asp Val Met Gly Ala Leu Thr Ser Leu Lys Met Thr

        180                 185                 190

Ala Asp Phe Ile Leu Gln Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ile Ser Lys

    195                 200                 205

Pro Thr Ser Asp Ala Gln Leu Lys Ala Met Lys Glu Tyr Leu Asp Arg

210                 215                 220

Lys Gly Trp Trp Tyr Glu Val Lys

225                 230

<210>  2

<211>  699

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>

<400>  2

atggaaatcc agaaaaaact ggttgatccg tccaaatacg gtactaagtg cccgtacacc    60

atgaaaccga aatacattac tgtacacaac acttacaatg acgctccggc tgaaaacgaa    120

gtatcttaca tgatctctaa caataacgaa gtgtctttcc acatcgctgt agacgataag    180

aaagctatcc agggcattcc gctggaacgt aacgcttggg cttgtggtga tggcaacggc    240

tctggtaacc gtcagtctat cagcgtggaa atttgctatt ctaaatccgg tggcgaccgt    300

tactataaag ctgaagacaa cgccgtggat gtcgttcgtc aactgatgtc tatgtacaac    360

atcccgattg agaacgtgcg tacccaccaa tcttggtccg gtaaatactg cccgcaccgt    420

atgctggccg agggccgttg gggtgcattt atccaaaaag ttaagaacgg caatgttgct    480

accacttctc cgaccaaaca gaacatccag tccggtgctt tctCCCCgta cgaaacaccg    540

gacgtgatgg gtgccctgac ttctctgaag atgactgctg actttatcct gcagtccgac    600

ggcctgacct acttcatttc taaaccaact tccgacgctc aattgaaagc catgaaggaa    660

tacctggacc gtaaaggctg gtggtacgaa gtcaagtga                            699

<210>  3

<211>  702

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>

<400>  3

atggaaatcc agaaaaaact ggttgatccg tccaaatacg gtactaagtg cccgtacacc     60

atgaaaccga aatacattac tgtacacaac acttacaatg acgctccggc tgaaaacgaa     120

gtatcttaca tgatctctaa caataacgaa gtgtctttcc acatcgctgt agacgataag     180

aaagctatcc agggcattcc gctggaacgt aacgcttggg cttgtggtga tggcaacggc     240

tctggtaacc gtcagtctat cagcgtggaa atttgctatt ctaaatccgg tggcgaccgt     300

tactataaag ctgaagacaa cgccgtggat gtcgttcgtc aactgatgtc tatgtacaac     360

atcccgattg agaacgtgcg taCCCaCCaa tcttggtccg gtaaatactg CCCgCaCCgt     420

atgctggccg agggccgttg gggtgcattt atccaaaaag ttaagaacgg caatgttgct     480

accacttcrc cgaccaaaca gaacatcatt cagtccggtg ctttctcccc gtacgaaaca     540

ccggacgtga tgggtgccct gacttctctg aagatgactg ctgactttat cctgcagtcc     600

gacggcctga CCtacttcat ttctaaacca acttccgacg ctcaattgaa agccatgaag     660

gaatacctgg accgtaaagg ctggtggtac gaagtcaagt ga                        702

<210>    4

<211>    9

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>

<400>    4

Pro Thr Lys Gln Asn Ile Ile Gln Ser

1                   5

<210>  5

<2l1>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>

<400>  5

ccgaccaaac agaacatcat  tcagtcc                                27

<210>  6

<211>  266

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>

<400>  6

Met Glu Ile Gln Lys Lys Leu Val Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Thr Lys

1               5                   10                  15

Cys Pro Tyr Thr Met Lys Pro Lys Tyr Ile Thr Val His Asn Thr Tyr

        20                  25                  30

Asn Asp Ala Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Tyr Met Ile Ser Asn Asn

    35                  40                  45

Asn Glu Val Ser Phe His Ile Ala Val Asp Asp Lys Lys Ala Ile Gln

50                  55                  60

Gly Ile Pro Leu Glu Arg Asn Ala Trp Ala Cys Gly Asp Gly Asn Gly

65                  70                  75                  80

Ser Gly Asn Arg Gln Ser Ile Ser Val Glu Ile Cys Tyr Ser Lys Ser

            85                  90                  95

Gly Gly Asp Arg Tyr Tyr Lys Ala Glu Asp Asn Ala Val Asp Val Val

        100                 105                 110

Arg Gln Leu Met Ser Met Tyr Asn Ile Pro Ile Glu Asn Val Arg Thr

    115                 120                 125

His Gln Ser Trp Ser Gly Lys Tyr Cys Pro His Arg Met Leu Ala Glu

130                 135                 140

Gly Arg Trp Gly Ala Phe Ile Gln Lys Val Lys Asn Gly Asn Val Ala

145                 150                 155                 160

Thr Thr Ser Gln Ser Gly Ala Phe Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Asp Val

            165                 170                 175

Met Gly Ala Leu Thr Ser Leu Lys Met Thr Ala Asp Phe Ile Leu Gln

        180                 185                 190

Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ile Ser Lys Pro Thr Ser Asp Ala Gln

    195                 200                 205

Leu Lys Ala Met Lys Glu Tyr Leu Asp Arg Lys Gly Trp Trp Tyr Glu

210                 215                 220

Val Lys

225

<210>    7

<211>    231

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>

<400>    7

Met Glu Ile Gln Lys Lys Leu Val Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Thr Lys

l               5                   l0                  l5

Cys Pro Tyr Thr Met Lys Pro Lys Tyr Ile Thr Val His Asn Thr Tyr

        20                  25                  30

Asn Asp Ala Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Tyr Met Ile Ser Asn Asn

    35                  40                  45

Asn Glu Val Ser Phe His Ile Ala Val Asp Asp Lys Lys Ala Ile Gln

50                  55                  60

Gly Ile Pro Leu Glu Arg Asn Ala Trp Ala Cys Gly Asp Gly Asn Gly

65                  70                  75                  80

Ser Gly Asn Arg Gln Ser Ile Ser Val Glu Ile Cys Tyr Ser Lys Ser

            85                  90                  95

Gly Gly Asp Arg Tyr Tyr Lys Ala Glu Asp Asn Ala Val Asp Val Val

        100                 105                 11O

Arg Gln Leu Met Ser Met Tyr Asn Ile Pro Ile Glu Asn Val Arg Thr

    115                 120                 125

His Gln Ser Trp Ser Gly Lys Tyr Cys Pro His Arg Met Leu Ala Glu

130                 135                 140

Gly Arg Trp Gly Ala Phe Ile Gln Lys Val Lys Asn Gly Asn Val Ala

145                 150                 155                 160

Thr Thr Ser Pro Thr Lys Gln Asn Gln Ser Gly Ala Phe Ser Pro Tyr

            165                 170                 175

Glu Thr Pro Asp Val Met Gly Ala Leu Thr Ser Leu Lys Met Thr Ala

        180                 185                 190

Asp Phe Ile Leu Gln Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ile Ser Lys Pro

    195                 200                 205

Thr Ser Asp Ala Gln Leu Lys Ala Met Lys Glu Tyr Leu Asp Arg Lys

210                 215                 220

Gly Trp Trp Tyr Glu Val Lys

225    230

<210>   8

<211>   231

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>

<400>  8

Met Glu Ile Gln Lys Lys Leu Val Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Thr Lys

1               5                   10                  15

Cys Pro Tyr Thr Met Lys Pro Lys Tyr Ile Thr Val His Asn Thr Tyr

        20                  25                  30

Asn Asp Ala Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Tyr Met Ile Ser Asn Asn

    35                  40                  45

Asn Glu Val Ser Phe His Ile Ala Val Asp Asp Lys Lys Ala Ile Gln

50                  55                  60

Gly Ile Pro Leu Glu Arg Asn Ala Trp Ala Cys Gly Asp Gly Asn Gly

65                  70                  75                  80

Ser Gly Asn Arg Gln Ser Ile Ser Val Glu Ile Cys Tyr Ser Lys Ser

            85                  90                  95

Gly G1y Asp Arg Tyr Tyr Lys Ala Glu Asp Asn Ala Val Asp Val Val

        100                 105                 110

Arg Gln Leu Met Ser Met Tyr Asn Ile Pro Ile Glu Asn Val Arg Thr

    115                 120                 125

His Gln Ser Trp Ser Gly Lys Tyr Cys Pro His Arg Met Leu Ala Glu

130                 135                 140

Gly Arg Trp Gly Ala Phe Ile Gln Lys Val Lys Asn Gly Asn Val Ala

145                 150                 155                 160

Thr Thr Ser Pro Thr Lys Gln Asn Ile Ile Gly Ala Phe Ser Pro Tyr

            165                 170                 175

Glu Thr Pro Asp Val Met Gly Ala Leu Thr Ser Leu Lys Met Thr Ala

        180                 185                 190

Asp Phe Ile Leu Gln Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ile Ser Lys Pro

    195                 200                 205

Thr Ser Asp Ala Gln Leu Lys Ala Met Lys Glu Tyr Leu Asp Arg Lys

210                 215                 220

Gly Trp Trp Tyr Glu Val Lys

225    230

<210>  9

<211>  681

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>

<400>  9

atggaaatcc agaaaaaact ggttgatccg tccaaatacg gtactaagtg cccgtacacc    60

atgaaaccga aatacattac tgtacacaac acttacaatg acgctccggc tgaaaacgaa    120

gtatcttaca tgatctctaa caataacgaa gtgtctttcc acatcgctgt agacgataag    180

aaagctatcc agggcattcc gctggaacgt aacgcttggg cttgtggtga tggcaacggc    240

tctggtaacc gtcagtctat cagcgtggaa atttgctatt ctaaatccgg tggcgaccgt    300

tactataaag ctgaagacaa cgccgtggat gtcgttcgtc aactgatgtc tatgtacaac    360

atcccgattg agaacgtgcg tacccaccaa tcttggtccg gtaaatactg cccgcaccgt    420

atgctggccg agggccgttg gggtgcattt atccaaaaag ttaagaacgg caatgttgct    480

accacttctc agtccggtgc tttctccccg tacgaaacac cggacgtgat gggtgccctg    540

acttctctga agatgactgc tgactttatc ctgcagtccg acggcctgac ctacttcatt    600

tctaaaccaa cttccgacgc tcaattgaaa gccatgaagg aatacctgga ccgtaaaggc    660

tggtggtacg aagtcaagtg a                                              681

<210>  10

<211>  696

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>

<400>  10

atggaaatcc agaaaaaact ggttgatccg tccaaatacg gtactaagtg CCCgtacacc    60

atgaaaccga aatacattac tgtacacaac acttacaatg acgctccggc tgaaaacgaa    120

gtatcttaca tgatctctaa caataacgaa gtgtctttcc acatcgctgt agacgataag    180

aaagctatcc agggcattcc gctggaacgt aacgcttggg cttgtggtga tggcaacggc    240

tctggtaacc gtcagtctat cagcgtggaa atttgctatt ctaaatccgg tggcgaccgt    300

tactataaag ctgaagacaa cgccgtggat gtcgttcgtc aactgatgtc tatgtacaac    360

atcccgattg agaacgtgcg tacccaccaa tcttggtccg gtaaatactg cccgcaccgt    420

atgctggccg agggccgttg gggtgcattt atccaaaaag ttaagaacgg caatgttgct    480

accacttctc cgaccaaaca gaaccagtcc ggtgctttct ccccgtacga aacaccggac    540

gtgatgggtg CCCtgacttc tctgaagatg actgctgact ttatcctgca gtccgacggc    600

ctgacctact tcatttctaa accaacttcc gacgctcaat tgaaagccat gaaggaatac    660

ctggaccgta aaggctggtg gtacgaagtc aagtga                              696

<210>   11

<21l>   696

<212>   DNA

<213>   人工序列

<220>

<223>

<400>   11

atggaaatcc agaaaaaact ggttgatccg tccaaatacg gtactaagtg cccgtacacc    60

atgaaaccga aatacattac tgtacacaac acttacaatg acgctccggc tgaaaacgaa    120

gtatcttaca tgatctctaa caataacgaa gtgtctttcc acatcgctgt agacgataag    180

aaagctatcc agggcattcc gctggaacgt aacgcttggg cttgtggtga tggcaacggc    240

tctggtaacc gtcagtctat cagcgtggaa atttgctatt ctaaatccgg tggcgaccgt    300

tactataaag ctgaagacaa cgccgtggat gtcgttcgtc aactgatgtc tatgtacaac    360

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ctgacctact tcatttctaa accaacttcc gacgctcaat tgaaagccat gaaggaatac    660

ctggaccgta aaggctggtg gtacgaagtc aagtga                              696

Claims (11)

1.炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体，是将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG自氨基端第169位或第170位氨基酸残基缺失后得到的蛋白质；所述将野生型炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG自氨基端第169位或第170位氨基酸残基缺失后得到的突变体的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体的基因。

3.含有权利要求2所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因的表达载体。

4.含有权利要求2所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因的转基因细胞系。

5.含有权利要求2所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因的宿主菌。

6.一种表达权利要求1所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体的方法，是将含有权利要求2所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)或E.coli Top10。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述含有权利要求2所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因的重组表达载体的出发载体为pET系列载体、pGEX系列载体、pMAL系列载体或pBAD系列载体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：以pET系列载体为出发载体构建的重组表达载体为pET-22b(+)-PlyG-Δ170；

所述重组表达载体pET-22b(+)-PlyG-Δ170是将权利要求2所述炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体基因导入到pET系列载体中得到的。

11.权利要求1所述的炭疽杆菌γ噬菌体裂解酶PlyG突变体在制备预防和/或治疗炭疽的药物中的应用。

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