CN117003885A - H5n8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种H5N8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用，具体地，本发明提供了重组蛋白疫苗、灭活疫苗和核酸疫苗制备方法及其应用。实验表明，本发明方法制备的重组蛋白疫苗、灭活疫苗和核酸疫苗可有效防止禽流感病毒的感染。

Description

H5N8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及H5N8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用， 具体地，本发明是基于一种H5亚型流感病毒毒株的血凝素为骨架蛋白的一种 H5N8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用。
背景技术
H5N1、H5N6和H5N8高致病性禽流感已经引起了近千人感染，造成半数以 上的人死亡。现在散发的人类感染H5亚型高致病性禽流感感染病例，致死率超过 50％，如果病毒持续进化，具备了持续稳定的人与人之间传播能力，它将引起全球 的大流行，给人类的健康带来严重的威胁。
疫苗是H5亚型高致病性禽流感疫情最有效的防控手段。自H5亚型高致病性 禽流感大规模流行以来，多种禽用H5亚型高致病性禽流感疫苗被研发出来，包括 灭活疫苗、载体疫苗和DNA疫苗等。全球包括我国在内的多个国家也进行了人用 H5亚型高致病性禽流感储备疫苗的开发，包括灭活疫苗和载体疫苗。但H5亚型 高致病性禽流感的病毒已经进化出了十个亚类，其中，1、2和7亚类则进一步分 化出二级亚类、三级亚类等。多个亚类同时流行和新的亚类持续地出现，不同亚类 之间、甚至同亚类不同时间和不同地域流行的病毒株之间的血清交叉反应弱，导致 现有的禽用和人用H5亚型高致病性禽流感疫苗无法提供的很好的保护效果。
因此，本领域迫切需要开发一种H5亚型禽流感广谱性疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种H5亚型禽流感广谱性疫苗。
本发明的第一方面，提供了一种血凝素重组蛋白，所述重组蛋白含有来自 第一H5亚型流感病毒毒株的血凝素骨架，来自第二H5亚型流感病毒毒株的 AS1表位，所述AS1表位为AS1表位突变型，所述AS1表位突变型在野生型 的AS1表位的对应于来自第二H5亚型流感病毒毒株的血凝素序列(氨基酸序 列号：EPI547678)中的98位,129-138位,153-161位,183位,186-194位和221-228位氨基酸(H3numbering)的选自下组的氨基酸发生突变：
第159位的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D)；和
第160位的丙氨酸(Alanine,Ala,A)；
并且，所述第一H5亚型流感病毒毒株包括A/common magpie/Hong Kong/5052/2007(H5N1)；
所述第二H5亚型流感病毒毒株包括A/chicken/Netherland-14015526/2014(H5N8)。
在另一优选例中，所述来自第一H5亚型流感病毒毒株的血凝素骨架氨基 酸序列的序列号为ACJ26242。
在另一优选例中，通过159位和160位氨基酸突变，在所述重组蛋白的158 位、159位和160位氨基酸位置形成“Asn-Ser-Thr(N-S-T)”序列，并且在所述重 组蛋白的第158位的天冬酰胺(Asparagine,Asn,N)位点形成N-糖链，且所述N- 糖链位于受体结合位点外缘的高变区。
在另一优选例中，通过159位和160位氨基酸突变，160位丙氨酸(Alanine, Ala,A)突变为苏氨酸(Threonine,Thr,T)，159位的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp, D)突变为除丝氨酸和脯氨酸以外的氨基酸，在所述重组蛋白的158位、159 位和160位氨基酸位置形成“Asn-X-Thr(N-X-T)”序列(X氨基酸选自下组：甘氨 酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙胺酸、酪氨酸、色氨酸、苏氨 酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、 精氨酸、组氨酸、或其组合)，并且在所述重组蛋白的第158位的天冬酰胺(Asparagine,Asn,N)位点形成N-糖链，且所述N-糖链位于受体结合位点外缘的 高变区。
在另一优选例中，通过159位和160位氨基酸突变，160位丙氨酸(Alanine, Ala,A)突变为突变为丝氨酸(Serine,Ser,S)，159位的天冬氨酸(Aspartic acid, Asp,D)突变为除丝氨酸和脯氨酸以外的氨基酸，在所述重组蛋白的158位、 159位和160位氨基酸位置形成“Asn-X-Ser(N-X-S)”序列(X氨基酸选自下组： 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙胺酸、酪氨酸、色氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨 酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或其组合)，并且在所述重组蛋白的第158位的天冬酰胺(Asparagine,Asn,N)位点形成N-糖链，且所述N-糖链位于受体结合位 点外缘的高变区。
在另一优选例中，所述突变包括氨基酸的插入、缺失或替换。
在另一优选例中，所述的AS1表位突变型除所述突变(159位，160位)外，其余 的氨基酸序列与野生型的AS1表位的对应于来自第二H5亚型流感病毒毒株的血 凝素序列(氨基酸序列号：EPI547678)中的98位,129-138位,153-161位,183 位,186-194位和221-228位氨基酸(H3numbering)所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述来自第一H5亚型流感病毒毒株的血凝素骨架与 ACJ26242所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为 95％，最佳地至少为98％或99％。
在另一优选例中，所述的基本相同是至多有8个(较佳地为1-5个，更佳地为1-3个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，并且AS1 表位突变型内158氨基酸位点有N-糖链引入。
在另一优选例中，所述重组蛋白具有包含式I结构：
Z1-Z2(I)
式中，Z1为来自第一H5亚型流感病毒毒株A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素骨架；Z2为来自第二H5亚型流感病毒毒株 A/chicken/Netherland-14015526/2014的AS1表位；所述AS1表位为AS1表位 突变型，所述AS1表位突变型在野生型的AS1表位的对应于来自第二H5亚型 流感病毒毒株的血凝素序列(氨基酸序列号：EPI547678)中的98位,129-138 位,153-161位,183位,186-194位和221-228位氨基酸(H3numbering)的选自下 组的氨基酸发生突变：
第159位的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D)；和
第160位的丙氨酸(Alanine,Ala,A)；
其中，各“-”独立地为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述重组蛋白选自下组：
(A)具有SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同 源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％ 以上)的衍生多肽，且所述衍生多肽与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能；
(C)对(A)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸(比如1-10个，较佳地， 1-5个，更佳地，1-3个)添加、取代或氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生 多肽与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
在另一优选例中，所述的“基本相同的功能”指所述的衍生多肽具有N-糖链的 引入，可免疫产生具有广谱性的中和抗体。
在另一优选例中，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为具有SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多 肽、其活性片段、或其保守性变异多肽。
在另一优选例中，所述重组蛋白与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性至少为 80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％或99％。
在另一优选例中，所述重组蛋白为人工合成的或重组的重组蛋白。
在另一优选例中，所述重组蛋白为真核表达系统表达的重组蛋白。
在另一优选例中，所述重组蛋白为酵母细胞表达的重组蛋白。
在另一优选例中，所述重组蛋白为昆虫细胞表达的重组蛋白。
在另一优选例中，所述重组蛋白为嵌合蛋白。
在另一优选例中，所述昆虫细胞选自下组：Sf9、Sf21、Tni、Hi5-Sf细胞、 或其组合。
在另一优选例中，所述酵母包括毕赤酵母。
本发明第二方面提供了一种疫苗多肽，所述疫苗多肽包括本发明第一方面所 述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物、啮齿动物和家禽产生可 以中和H5亚型10个亚类大部分的代表毒株的中和抗体。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽所激发产生的中和抗体能够预防感染、阻 止病毒入侵和清除体内的流感病毒。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽诱导灵长动物，啮齿动物和家禽产生B细 胞免疫。
在另一优选例中，所述的灵长动物包括人、非人灵长类动物。
本发明第三方面提供了一种DNA或mRNA疫苗，所述的疫苗含有用于表达 本发明第一方面所述的重组蛋白的编码mRNA、以及DNA表达载体。
在另一优选例中，所述的mRNA疫苗的包装载体为鱼精蛋白、纳米颗粒脂 质体、化学合成多聚体。
本发明第四方面提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明 第一方面所述的重组蛋白或本发明第二方面所述的疫苗多肽。
本发明第五方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第四方面 所述的多核苷酸。
本发明第六方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第五方 面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括酵母、昆虫Hi5-Sf细胞、大肠杆菌、 猴来源Vero E6细胞、仓鼠CHO细胞、DC细胞。
本发明第七方面提供了一种H5亚型流感病毒株，所述病毒株的基因组中 包含外源性的重组蛋白基因序列，其中，所述重组蛋白基因序列编码本发明第 一方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述流感病毒是H5N8流感病毒。
本发明第八方面提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第一方 面所述的重组蛋白、本发明第二方面所述的疫苗多肽或本发明第三方面所述的 mRNA或DNA疫苗或本发明第四方面所述的多核苷酸或者本发明第五方面所 述的表达载体或者本发明第六方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的 病毒株，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗组合物。
在另一优选例中，所述疫苗组合物为单价或多价。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有佐剂，首选各种铝佐剂。
在另一优选例中，所述药物组合物中的重组蛋白、免疫多肽、mRNA或DNA 疫苗或病毒株、和佐剂(如铝)的摩尔数或重量比在1:100之间，优选为1:40到1:60 之间。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液态、固体、或凝胶态。
在另一优选例中，所述的药物组合物用选自下组的方式施用：皮下注射、皮 内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化 吸入。
本发明第九方面提供了一种疫苗组合物，所述的组合物含有本发明第一方 面所述的重组蛋白、本发明第二方面所述的疫苗多肽或本发明第三方面所述的 mRNA或DNA疫苗或本发明第四方面所述的多核苷酸或者本发明第五方面所 述的表达载体或者本发明第六方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的 病毒株，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。
在另一优选例中，所述颗粒型佐剂选自下组：铝盐、油包水乳剂、水包油 乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物，或其组合。
另一优选例中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂 苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结 核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。
在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、Quil A、胞壁酰二肽、 矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞 因子。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物包括注射剂型。
本发明第十方面提供了如本发明第一方面所述的重组蛋白或本发明第二 方面所述的疫苗多肽或本发明第三方面所述的mRNA或DNA疫苗或本发明第 七方面所述的病毒株或本发明第八方面所述的药物组合物或本发明第九方面 所述的疫苗组合物的用途，(a)用于制备针对禽流感病毒血凝素的抗体；和/或 (b)用于制备预防和/或治疗禽流感病毒感染或其相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述禽流感病毒包括H5亚型禽流感病毒。
在另一优选例中，所述禽流感病毒包括H5N8病毒。
在另一优选例中，所述抗体包括针对H5亚型禽流感病毒血凝素的抗体。
在另一优选例中，所述抗体包括针对H5亚型禽流感病毒的抗体。
本发明第十一方面提供了一种制备本发明第一方面所述的重组蛋白的方 法，包括步骤：
(i)在适宜条件下培养本发明第六方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第 一方面所述的重组蛋白；
(ii)纯化所述抗原肽。
在另一优选例中，所述方法步骤(i)中将转化的酵母单菌落分别接种到 BMGY培养基中，培养后离心去除上清，用BMMY培养基重悬菌体，28－ 30℃(优选为29.5℃)，诱导培养36－48小时(优选为48小时)。
本发明第十二方面提供了一种产生针对禽流感病毒的免疫反应的方法，包括 步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的重组蛋白、本发明第二方面所述的 疫苗多肽、本发明第三方面所述的mRNA或DNA疫苗或本发明第七方面所述的 病毒株或本发明第八方面所述的药物组合物或本发明第九方面所述的疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括非人灵长动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法在所述对象中诱导产生针对H5亚型禽流感病毒的 中和抗体。
本发明第十三方面提供了一种治疗方法，给需要的对象施用本发明第一方 面所述的重组蛋白、本发明第二方面所述的疫苗多肽、本发明第三方面所述 mRNA或DNA疫苗、本发明第四方面所述的多核苷酸或者本发明第五方面所 述的表达载体或者本发明第六方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的 病毒株或本发明第八方面所述的药物组合物或本发明第九方面所述的疫苗组 合物。
在另一优选例中，所述治疗方法包括基因治疗方法。
在另一优选例中，所示治疗方法包括体外使用电穿孔技术转染的人类DC 细胞移植，淋巴mRNA疫苗注射。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株血凝素的氨基 酸序列。
图2为本发明流感病假病毒制备使用的转移载体、包装载体和表达载体的 结构示意图。
图3为本发明构建和表达血凝素的DNA质粒图谱。
图4为本发明血凝素蛋白的空间构象和表位。血凝素蛋白分为头部区域和杆 部区域。头部区域有4个表位，分别是AS1、AS2、AS3和AS4。
图5为本发明构建A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株血凝素 头部和杆部互换的重组假病毒和A/Thailand/(KAN-1)/2004病毒株血凝素头部 和杆部互换的重组假病毒示意图。
图6为本发明构建A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株血凝素头部 表位互换的重组假病毒和A/Thailand/(KAN-1)/2004病毒株血凝素头部表位互换的 重组假病毒示意图。
图7为本发明比较A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株和 A/Thailand/(KAN-1)/2004病毒株血凝素头部不同表位内的氨基酸的比较。
图8为本发明流感血凝素头部氨基酸保守型分析。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现，包含来自第一H5亚型流 感病毒毒株(比如A/common magpie/Hong Kong/5052/2007)的血凝素骨架， 来自第二H5亚型流感病毒毒株(比如A/chicken/Netherland-14015526/2014)的 AS1表位突变型(比如159位和160位的氨基酸发生突变)的重组蛋白可有效 诱导出广谱的中和抗体，从而有效防止禽流感病毒(尤其是H5亚型的10个亚 类大部分的代表毒株)的感染。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如 “D159S”表示第159位的氨基酸D突变为S，以此类推。
术语“H3numbering”表示氨基酸编号使用H3numbering方法。
禽流感病毒
H5亚型高致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的一类 人兽共患传染病。血凝素(Hemagglutinin，HA)因可以诱导出具有中和活性的抗 体，并且这些抗体能够预防病毒感染、阻止病毒入侵和清除体内的流感病毒，是A 型流感广谱性疫苗主要的靶蛋白。
在本发明中，将H5N1亚型禽流感病毒株A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素HA作为流感疫苗的骨架(HA序列如图1所示，SEQ ID NO.:2所示)，其诱导的中和抗体识别的表位集中，表位内关键氨基酸位于血凝素 受体结合区域外缘的158、159和160位点或附近(H3numbering)。流感病毒血 凝素158、159和160位点及附近位于受体结合位点的外缘，氨基酸的保守性差， 属于血凝素的高突变区。
A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株的血凝素AS1表位包含39个 氨基酸，如表1所示(H3numbering)。
表1.A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株AS1表位氨基酸及编号
并且，在本发明中，以A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素HA 作为骨架蛋白，将其AS1表位用A/chicken/Netherland-14015526/2014病毒株的AS1 表位进行替换(AS1表位氨基酸序列如表2所示)，并将AS1表位159位置的天冬氨 酸(Aspartic acid,Asp,D)和160位置的丙氨酸(Alanine,Ala,A)分别突变为丝氨酸 (Serine,Ser,S)和苏氨酸(Threonine,Thr,T)，构建重组蛋白免疫原(命名为 NLAS1HK5052,氨基酸序列如SEQ IDNO.:1所示)。NLAS1HK5052在受体结合 位点外缘的高变区158位天冬酰胺(Asparagine,Asn,N)引入了N-糖链，可以诱 导出广谱性的中和抗体。
表2.A/chicken/Netherland-14015526/2014病毒株的AS1表位氨基酸及编号
(请注意，加粗斜体字表示A/common magpie/Hong Kong/5052/2007血凝素 AS1表位与A/chicken/Netherland-14015526/2014血凝素AS1表位中氨基酸不同的 位点)
本发明制备的H5N8突变疫苗株可以中和H5亚型10个亚类大部分的代表 毒株(以1997年至2014年间流行的病毒为例，如表3所示)。
表3.H5亚型10个亚类的代表毒株
病毒株 亚类
A/Hong Kong/156/1997 0
A/Thailand/(KAN-1)/2004 1
A/Cambodia/P0322095/2005 1
A/Indonesia/5/2005 2.1.3.2
A/Turkey/65596/2006 2.2.1
A/common magpie/Hong Kong/5052/2007 2.3.2.1
A/duck/Guangdong/S1322/2010(R6) 2.3.2.1
A/Shenzhen/406H/2006 2.3.4
A/chicken/Guizhou/4/2013(R8) 2.3.4.4
A/Sichuan/26221/2014 2.3.4.4
A/chicken/Netherland-14015526/2014 2.3.4.4
A/chicken/Guangxi/12/2004 2.4
A/chicken/Korea/es/2003 2.5
A/silky chicken/Hong Kong/SF189/2001 3
A/goose/Guiyang/337/2006 4
A/duck/Guangxi/1378/2004 5
A/blackbird/Hunan/1/2004 6
A/Duck/Hubei/wg/2002 6
A/Beijing/01/2003 7.1
A/chicken/Shanxi/2/2006 7.2
A/chicken/Henan/16/2004 8
A/goose/Shantou/1621/2005 9
重组蛋白
本发明提供了一种血凝素重组蛋白NLAS1HK5052，所述重组蛋白含有来自 第一H5亚型流感病毒毒株的血凝素骨架，来自第二H5亚型流感病毒毒株的 AS1表位，所述AS1表位为AS1表位突变型，所述AS1表位突变型在野生型 的AS1表位的对应于来自第二H5亚型流感病毒毒株的血凝素序列(氨基酸序 列号为EPI547678，氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示)中的98位,129-138位, 153-161位,183位,186-194位和221-228位氨基酸(H3numbering)的选自下组 的氨基酸发生突变：
第159位的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D)；和
第160位的丙氨酸(Alanine,Ala,A)；
并且，本发明所述第一H5亚型流感病毒毒株包括A/common magpie/Hong Kong/5052/2007(H5N1)，来自所述第一H5亚型流感病毒毒株的血凝素骨架 序列的序列号为ACJ26242(氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示)；
并且，本发明所述第二H5亚型流感病毒毒株包括 A/chicken/Netherland-14015526/2014(H5N8)。
A/common magpie/Hong Kong/5052/2007血凝素HA序列：
Mekivfllaivslvksdhicigyhannsteqvdtimeknvtvthaqdilekthngklcdlngvkplilkdcsvagwl lgnpmcdefinvpewsyivekanpandlcypgnfndyeelkhllsrinhfekiqiipkdswsdheaslgvssacp yqgnssffrnvvwlikkgnayptikksynntnqedllvlwgihhpndeaeqtrlyqnpttyisigtstlnqrlvpkiat rskvngqsgridffwtilkpndainfesngnfiapeyaykivkkgdstimkseveygncntrcqtpmgainssmpf hnihpltigecpkyvksnklvlatglrnspqrerrrkkrglfgaiagfieggwqgmvdgwygyhhsneqgsgyaa dkestqkaidgvtnkvnsiidkmntqfeavgrefnnlerrienlnkkmedgfldvwtynaellvlmenertldfhds nvknlydkvrlqlrdnakelgngcfefyhkcdnecmesvrngtydypqyseearlkreeisgvklesigtyqilsiy stvasslvlaimvaglsswmcsngslqcrici(SEQ ID NO.：2)
A/chicken/Netherland-14015526/2014血凝素HA序列：
Mekivlllavvslvksdqicigyhannstkqvdtimeknvtvthaqdilekthtgklcdlngvkplilkdcsvagwl lgnpmcdefirvpewsyiveranpandlcypgtlndyeelkhllsrinhfektliipksswpnhetslgvsaacpyq gassffrnvvwlikkndayptikisynntnredllilwgihhpnnaeeqtnlyknpdtyvsvgtstlnqrlvpkiatrs qvngqrgrmdffwtilkpndaihfesngnfiapeyaykivkkgdstimkseveyghcntkcqtpigainssmpfh nihpltigecpkyvksnklvlatglrnsplrerrrkrglfgaiagfieggwqgmvdgwygyhhsneqgsgyaadke stqkavdgvtnkvnsiidkmntqfeavgrefnnlerrienlnkkmedgfldvwtynaellvlmenertldfhdsnv knlydkvrlqlrdnakelgngcfefyhkcdnecmesvrngtydypkyseearlkreeisgvklesigtyqilsiystv asslalaiivaglslwmcsngslqcrici(SEQ ID NO.:3)
在本发明中，通过159位和160位氨基酸突变，在所述重组蛋白158位,159 位和160位的氨基酸形成“Asn-Ser-Thr(N-S-T)”序列，并且在所述重组蛋白的 158位的天冬酰胺(Asparagine,Asn,N)位点形成N-糖链，且所述N-糖链位于 受体结合位点外缘的高变区。
应理解，本发明A/common magpie/Hong Kong/5052/2007血凝素HA序列 (SEQ IDNO.：2)、A/chicken/Netherland-14015526/2014血凝素HA序列(SEQ ID NO.:3)和重组蛋白NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)中的氨基酸编号均基于统一 的H3numbering方法作出，便于准确的识别AS1表位氨基酸位点和突变的氨基 酸位点，也可避免常规的序列对比技术造成的氨基酸编号错位产生的序列同源 性差异。
重组蛋白NLAS1HK5052的氨基酸序列：
Mekivllfaivslvksdhicigyhannsteqvdtimeknvtvthaqdilekthngklcdlngvkplilkdcsv agwllgnpmcdefinvpewsyivekanpandlcypgnfndyeelkhllsrinhfekiqiipkdswsnhetslgvsa acpyqgnssffrnvvwlikknstyptikksynntnqedllvlwgihhpnnaeeqtnlyqnpttyisigtstlnqrlvp kiatrsqvngqrgridffwtilkpndainfesngnfiapeyaykivkkgdstimkseveygncntrcqtpmgainss mpfhnihpltigecpkyvksnklvlatglrnspqrerrrkrglfgaiagfieggwqgmvdgwygyhhsneqgsgy aadkestqkaidgvtnkvnsiidkmntqfeavgrefnnlerrienlnkkmedgfldvwtynaellvlmenertldfh dsnvknlydkvrlqlrdnakelgngcfefyhkcdnecmesvrngtydypqyseearlkreeisgvklesigtyqils iystvasslvlaimvaglsswmcsngslqcrici(SEQ ID NO.:1)
本发明的重组蛋白NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)是合成蛋白或重组蛋白， 即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵 母、植物)中产生。本发明的重组蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述重组蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语 “片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述重组蛋白相同的生物学功能 或活性的蛋白。
本发明的重组蛋白片段、衍生物或类似物可以是
(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取 代的重组蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码 的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的重组蛋白，或(iii)成熟重 组蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融 合所形成的重组蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此重组蛋白序列而形成的 重组蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此重组蛋白的序列或蛋白原序列， 或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和 类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸 最好根据表4进行氨基酸替换而产生。
表4
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明的活性重组蛋白具有基本相同的激发免疫反应的免疫原性，且诱导产 生的中和抗体具有中和H5亚型10个亚类大部分代表毒株的活性。
优选地，所述重组蛋白为NLAS1HK5052，如SEQ ID NO.:1所示。
应理解，本发明重组蛋白与SEQ ID NO.:1所示的序列相比，具有较高的 同源性(相同性)，优选地，所述的重组蛋白与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性至 少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％，最 佳地，≥99％。
此外，还可以对本发明的重组蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式 包括：体内或体外的重组蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基 化，如那些在重组蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生 的重组蛋白。这种修饰可以通过将重组蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的 糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解 性能或优化了溶解性能的重组蛋白。
术语“编码重组蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明重组蛋白的多核苷 酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸；核苷酸包括核糖核酸 (RNA，Ribonucleic Acid)，和脱氧核糖核酸(DNA，Deoxyribonucleic Acid)。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列 的多肽或重组蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形 式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码 的重组蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条 件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指： (1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或 (2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等； 或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的重组蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均 质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方 法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放 阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方 法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进 行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常 是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得 到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通 常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的蛋白(或其片段，或其 衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA 分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的蛋白序列 中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特 别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端 快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择， 并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA 片段。
疫苗多肽
在本发明中，“本发明表位肽”、“本发明疫苗多肽”、“本发明多肽”可互换使用， 指符合本发明第二方面中所述的疫苗多肽。
在本发明中，疫苗多肽还包括其他形式，例如药学上可接受的盐、偶联物、 或融合蛋白。
在本发明中，疫苗多肽包括对SEQ ID NO.:1所示的序列进行一个或多个(如 1-5个，优选地1-3个)氨基酸添加、一个或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸 的取代和/或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生前的原始 多肽具有基本相同的功能。
优选地，疫苗多肽包括对SEQ ID NO.:1所示的序列经过1-3个氨基酸添加(优 选添加在N端或C端)、和/或1-2个氨基酸的取代(优选保守性氨基酸替换)并仍具 有与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
优选地，所述的保守性氨基酸替换根据表5进行氨基酸替换。
表5
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多肽是没有分离纯化的， 但同样的多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的肽”是指本发明多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋 白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本 发明多肽。基本上纯化的多肽(融合蛋白)在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的 主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、或合成多肽，优选合成多肽。
在本发明中，当疫苗多肽的序列较短(如≤70aa，更佳地≤60aa时)，可用化学方法直接合成相关肽序列。
当疫苗多肽的序列较长或以融合蛋白形式提供疫苗多肽时，也可以用重组法 来大批量地获得相关肽序列。这通常是将编码所述抗原多肽或其融合蛋白的编码序 列克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相 关的抗原肽或融合蛋白。
mRNA疫苗、DNA疫苗或VLPs疫苗
本发明还提供了用于预防H5亚型禽流感病毒的mRNA疫苗、DNA疫苗 或VLPs疫苗。
mRNA疫苗是一种体外制备的具有翻译活性的RNA，其主要结构包括 5'UTR和3'UTR以及含有表达本发明的重组蛋白NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1) 的开放读码框。相比于DNA疫苗，它不需要进入细胞核无整合到基因组上的 风险。典型地，mRNA疫苗的方法包括：根据NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)氨 基酸序列，通过PCR方法或人工合成方法构建模板并体外转录得到mRNA初 产物，进一步加帽、加尾等获得结构完整的mRNA，通过递送系统进入体内。
DNA疫苗是一种含有NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)蛋白开放读码框的重 组真核表达载体，外源NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)基因可在活体细胞内进行转 录翻译表达，诱导机体特异性的体液和细胞免疫应答。DNA序列编码的仅是单一 的一段蛋白基因，基本没有毒性逆转的可能，是可注射的DNA分子。典型地，DNA 疫苗的方法包括：根据重组蛋白NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)的氨基酸序列，通 过PCR方法或人工合成方法，构建模版序列，并将序列与目标载体相连，形成能 被宿主细胞摄取并在体内转录和翻译表达相应NLAS1HK5052重组蛋白(SEQ ID NO.:1)的DNA疫苗。
VLPs(virus-like particles)为不含有病毒核酸的病毒样颗粒，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，但不具有感染性，具有很强的免疫原性和生物活性。 具有安全、高效的特点。典型地，VLPs疫苗的方法包括：含有编码重组蛋白 NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)的基因表达载体质粒、含有编码 A/chicken/Netherland-14015526/2014神经酰胺(NA)的基因表达载体、转移载 体质粒和包装载体质粒，共转染细胞制得。
应理解，一个氨基酸可能有多种碱基可能，重组蛋白NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)对应的核苷酸序列可能有很多种，但mRNA疫苗、DNA疫苗和含有重组 蛋白NLAS1HK5052(SEQID NO.:1)编码序列的表达载体，最后在体内翻译表达出 的蛋白氨基酸序列与NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)的氨基酸序列一致，或者同源 性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％， 最佳地，≥99％。且相应的翻译蛋白AS1表位内有N-糖链的引入。
灭活疫苗或减毒疫苗
本发明还提供了用于预防H5亚型禽流感病毒的灭活疫苗。
灭活疫苗是指通过对病毒或细菌进行培养，然后使用物理(如加热)或化 学试剂(如β-丙内酯)将其灭活，使其丧失感染性或毒性，但仍保持免疫原性。 灭活疫苗可以由整个病毒或细菌组成，也可由它们的裂解片段组成为裂解疫 苗，并进一步纯化，直至疫苗仅仅包含所需的抗原成分。减毒疫苗则是指病原 体经过各种处理后，病原微生物毒性减弱，但仍保留其免疫原性。
典型的，灭活疫苗和减毒疫苗的方法包括根据H5亚型禽流感病毒的核苷 酸序列，利用反向遗传技术，通过质粒共转染细胞，获得禽流感病毒，并进一 步通过细胞或者鸡胚进行病毒扩增后进行灭活或处理，从而使病毒的感染性 (或毒性)丧失或减弱。应理解，在本发明的一个优选例中，利用反向遗传技 术获得的流感病毒的血凝素蛋白为重组蛋白，氨基酸序列与 NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)的氨基酸序列一致，或者同源性至少为80％，较佳 地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％，最佳地，≥99％。且 相应的翻译蛋白AS1表位内有N-糖链的引入。
载体和宿主细胞
本发明还提供了一种包含本发明的重组蛋白编码序列的载体，以及含所述 载体的宿主细胞。
在本发明的一个优选例中，所述载体具有表达所述重组蛋白基因的表达盒， 所述表达盒从5’-3’依次具有下述元件：启动子，重组蛋白基因，和终止子。
本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得所述重组蛋白的上述优 化基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR 法。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可 用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA 片段。
本发明的多核苷酸序列可以通过常规的重组DNA技术，表达或生产目的蛋 白(重组蛋白)，包括步骤：
(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组 表达载体转化或转导合适的宿主细胞，较佳地为酵母。
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和 合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体如pPinkαHC或 pMT/BiP/V5-HisA。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重 组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此 外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿 主细胞的表型性状。
包含上述DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，表达目的蛋白。能够表达本发明重组蛋白的宿主细胞可以是原 核细胞，如大肠杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞(毕赤酵母、酿酒酵母)； 或是高等真核细胞，如昆虫细胞；优选为酵母细胞。用重组DNA转化宿主细胞 可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。工程细胞可以是快速利用甲醇型 (Mut+)或慢速利用甲醇型(Muts)。
工程细胞的培养和目的蛋白发酵生产
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基 因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种 常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当 的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细 胞再培养一段时间。
在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：
(a)就温度而言，本发明的重组蛋白的发酵及诱导温度保持在28-30℃；
(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；
(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在20-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混 合气体的通入来解决；
(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补 料或混合补料。
工程细胞表达目的蛋白可以采用层析技术进行纯化。层析技术包括阳离子 交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常 用的层析方法包括：
1.阴离子交换层析
阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如 果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层 析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行 平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进 行盐浓度或pH的梯度洗脱。
2.疏水层析
疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、 Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH4)2SO4等方式提高盐浓度，然后上 样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。
3.凝胶过滤层析
疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过 凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。
4.亲和层析
亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrapTM Heparin HP Columns。
制备方法
本发明的重组蛋白(多肽)可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可 以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也 可用重组方法生产。
一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、 Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的 肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固 相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯， 与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理 20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端 延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将 所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当 使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树 脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在 Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM) 除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后， 用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下， 同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一 步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所 需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残 基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四 脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用 反相高效液相和质谱分析进行确证。
在一实施方式中，本发明的重组蛋白，按其序列，采用固相合成的方法制 备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。
另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术， 可利用本发明的多核苷酸来表达或生产本发明的抗原肽。一般来说有以下步 骤：
(1).用本发明的重组蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重 组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要， 可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋 白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于： 常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、 超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后 获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
制备疫苗组合物
本发明还提供了一种制备疫苗组合物的方法，具体地，包括步骤：
将本发明制备的重组蛋白与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，较佳的为铝佐剂。
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有：(i)用本发明方法制备的重 组重组蛋白或疫苗多肽，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。本 发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。 因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。本发明的组合物可以是单价 的，也可以是多价的。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不 限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(i)药物组合物
本发明的药物组合物包括有效量的用本发明方法制备的重组蛋白或疫苗 多肽，所述重组蛋白或疫苗多肽可以是单价的，也可以是多价的。
本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量， 或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检 测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该 对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗 剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况 而言，可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.2μg/千克至2μg/千克。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指 用于治疗剂(例如重组蛋白或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂 载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有 过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、 聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知 的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到 关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另 外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。 通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适 合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受 的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗组合物可以是预防性的(即预防感染)，也可以是治疗性的。 所述的疫苗组合物包含免疫性抗原(包括本发明蛋白或自组装的病毒样颗粒)， 并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受 该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的 大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、 脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。 另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒 素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化 铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO 90/14837)，(b)SAF，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton， MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5) 细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰 素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6) 细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定 毒素LT)的脱毒变异体，参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为 免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受 的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助 性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原 性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分 给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和 生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的 保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。 预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或 悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制 剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
(iii)给药途径和剂量
所述组合物可以直接给予对象。对象可以是人或非人哺乳动物，较佳地为 人。当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通 常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、 皮内、肺内、静脉内、经鼻、阴道内、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要， 可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量 给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予病毒样颗粒疫苗，即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径 中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗新型冠状病毒感染。
在各疫苗剂份中所选用的病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无 明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约 1μg-1000μg，较佳地为1μg-100μg，更佳地10μg-50μg蛋白质或VLP。可用包括 观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用 量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清 中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂 就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径 通过注射给予免疫原性组合物。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明首次发现包含来自第一H5亚型流感病毒毒株(比如A/common magpie/Hong Kong/5052/2007)的血凝素骨架，来自第二H5亚型流感病毒毒株 (比如A/chicken/Netherland-14015526/2014)的AS1表位突变型(比如159位 和160位的氨基酸发生突变，H3numbering方法)的重组蛋白可有效诱导出广 谱的中和抗体，从而有效防止禽流感病毒(尤其是H5亚型的10个亚类大部分 的代表毒株)的感染。
(2)本发明首次选择了H5N1亚型禽流感病毒株A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素为骨架蛋白(仅识别单个表位：AS1)，将 A/chicken/Netherland-14015526/2014病毒株AS1表位转移至A/common magpie/Hong Kong/5052/2007血凝素蛋白上，替换原有的AS1表位，并将AS1 表位159位置的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D)和160位置的丙氨酸(Alanine,Ala, A)分别突变为丝氨酸(Serine,Ser,S)和苏氨酸(Threonine,Thr,T)，使得在受体结合 位点外缘的高变区引入N-糖链，使保守表位暴露出来，诱导出广谱的中和抗体。
(3)本发明首次开发了一种H5亚型禽流感广谱性疫苗的制备方法。本发 明制备的H5N8突变疫苗株可以中和H5亚型10个亚类大部分的代表毒株(尤 其是1997年至2014年间流行的代表毒株)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)；或按照制造厂商所建议的条件。除非另 外说明，否则百分比和份数按重量计算。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
A/common magpie/Hong Kong/5052/2007血凝素序列号为ACJ26242的序 列，A/chicken/Netherland-14015526/2014的AS1位点氨基酸序列(或包含AS1 位点的氨基酸序列)来源自序列号为EPI547678的序列，本发明方法中的重组 蛋白通过人工合成方式获得表达的核苷酸序列。本发明使用的H5亚型10个亚 类的代表毒株的假病毒以及HA重组假病毒均获自中国科学院上海巴斯德研究 所。
1.材料
1.1.细胞模型
HEK293FT细胞是转染腺病毒E1A基因并同时表达SV40大T抗原的人肾 上皮细胞(Invitrogen,1600 Faraday Avenue,Carlsbad,CA 92008 USA)，用于假 病毒和重组流感病毒制备和蛋白表达。
MDCK细胞：犬肾细胞(American Type Culture Collection,ATCC)，用于 假病毒中和实验。
实验中所用细胞支原体检测均为阴性，细胞培养条件：37℃，5％CO2。
1.2.动物模型
6-8周雌性BALB/c小鼠(上海灵畅生物科技有限公司，SPF级)。
1.3.血凝实验
将流感病毒或病毒样颗粒用生理盐水或PBS连续2倍稀释，每个稀释度的 病毒稀释度取50μl加入到96孔U型底细胞培养板，每孔加入50μl的0.5％SPF 鸡血红细胞并混匀，室温孵育约30分钟后观察红细胞凝集现象，并得到一个 凝血单位时的病毒稀释度，即为血凝效价(HA titer)。
1.4.流感病毒假病毒的制备和检测
1.4.1.流感假病毒和对照假病毒的制备(磷酸钙转染方法)
在T75细胞培养瓶(Thermo Fisher，货号156499)中铺入9×106个HEK293FT 细胞过夜培养，18小时后给细胞置换新的15ml培养液，2小时后加入转染质 粒。
包装假病毒的质粒为四质粒系统，包括基因表达载体质粒pCMV/R(用于 表达流感病毒HA和NA蛋白作为假病毒的囊膜蛋白以及用作阴性对照的水泡 性口炎病毒的G蛋白(VSV-G))、包装载体质粒pCMV/ΔR8.2(用于表达假 病毒的壳蛋白)和转移载体质粒pHR’CMV-luc(用于表达假病毒的报告基因蛋 白)，这四个质粒组装成含有HA和NA蛋白的假病毒和对照VSV-G假病毒。 包装载体质粒和转移载体载体质粒由Luigi Naldini教授(University Torino Medical School,Torino,Italy)赠送。质粒结构如图2所示。
流感假病毒的包装体系为：
18.9μg转移载体质粒pHR’CMV-Luc
18.9μg包装载体质粒pCMVΔR8.2
2.7μg血凝素表达载体质粒pCMV-HA
0.675μg神经氨酸酶表达载体质粒pCMV-NA
67.5μl CaCl2(2.5M)溶液
加入ddH2O至675μl的体积，然后逐滴加入675μl的2×HEPES缓冲液(PH 值7.10)，加入过程中用移液器轻吹混匀。
VSV-G对照假病毒的体系为：
18.9μg转移载体质粒pHR’CMV-Luc
18.9μg包装载体质粒pCMVΔR8.2
2.7μgVSV-G囊膜质粒pCMV-VSV-G
67.5μl CaCl2(2.5M)溶液
加入ddH2O至675μl的体积，然后逐滴加入675μl的2×HEPES缓冲液(PH 值7.10)，加入过程中用移液器轻吹混匀。
室温静置约20分钟后，质粒和钙离子形成颗粒均一沉淀物，将含沉淀物 的混合液体逐滴均匀地加入HEK293FT细胞中。细胞培养16-18小时后，置换 新鲜培养液并加入100μM的丁酸钠作用6-8小时，再次置换15ml新鲜培养液 并继续培养20小时左右，收集含有假病毒的上清。在4000rpm离心5分钟， 去除可能含有的细胞残渣后用0.45μm的滤器(MilliporeMillex,货号 SLHV033RB)过滤，将过滤好的假病毒上清-80℃保存备用。
1.4.2.流感假病毒和对照假病毒的定量
实验中以假病毒颗粒转导MDCK细胞后转移载体质粒pHR’CMV-Luc表达 出的中相对荧光素酶活性(Relative Luciferase Activity,RLA)作为流感病毒假病 毒感染能力的检测标准。方法如下：将MDCK细胞铺入96孔平底细胞培养板， 每孔5000个细胞，培养20小时后加入不同体积的待测假病毒上清，37℃，5％ CO2培养。65小时后弃去细胞上清，用PBS清洗1次后按照试剂盒(Promega, Luciferase assay system freezer pack,货号E4530)说明书操作：加入100μl细胞 裂解液，冻融使细胞充分裂解后加入50μl荧光素酶反应底物，测得的相对荧光 素酶活性可以直观表示待测假病毒的感染效价高低。
1.4.3.流感假病毒库的构建
流感假病毒库，用于检测免疫血清的广谱性，具体如表6所示。
表6 构建的H5亚型流感假病毒库
病毒株 简写 亚类 收录号
A/Hong Kong/156/1997 pHK156 0 AAC40508
A/Thailand/(KAN-1)/2004 pTH 1 AAS65615
A/Cambodia/P0322095/2005 pCA 1 ADM95463
A/Indonesia/5/2005 pID 2.1.3.2 ABP51969
A/Turkey/65596/2006 pTK 2.2.1 ABQ58925
A/common magpie/Hong Kong/5052/2007 pHK5052 2.3.2.1 ACJ26242
A/duck/Guangdong/S1322/2010(R6) pGD 2.3.2.1
A/Shenzhen/406H/2006 pSZ 2.3.4 ABO36644
A/chicken/Guizhou/4/2013(R8) pGZ 2.3.4.4
A/Sichuan/26221/2014 pSC 2.3.4.4
A/chicken/Netherland-14015526/2014 pNL 2.3.4.4
A/chicken/Guangxi/12/2004 pGX12 2.4 ABD14809
A/chicken/Korea/es/2003 pKR 2.5 ABP51986
A/silky chicken/Hong Kong/SF189/2001 pHKSF 3 AAO52864
A/goose/Guiyang/337/2006 pGY 4 ABJ96698
A/duck/Guangxi/1378/2004 pGX1378 5 ABC66526
A/blackbird/Hunan/1/2004 pHN01 6 AAW19638
A/Duck/Hubei/wg/2002 pHB 6 ABI94747
A/Beijing/01/2003 pBJ 7.1 ABQ58979
A/chicken/Shanxi/2/2006 pSX 7.2 ABK34764
A/chicken/Henan/16/2004 pHN16 8 AAX53508
A/goose/Shantou/1621/2005 pST 9 ABE68931
VSV-G假病毒用作对照病毒。
1.5流感假病毒中和实验
实验以中和抗体或血清孵育过后的假病毒颗粒转导MDCK细胞后转移载 体质粒pHR’CMV-Luc表达出的相对荧光素酶活性(RLA)作为该中和抗体或血 清中和对应流感病毒假病毒检测标准。方法如下：将系列稀释的待测抗体或血 清样品与适量的对应流感病毒假病毒混合37℃孵育。一小时后将上述混合液加 入提前铺入MDCK细胞的96孔细胞培养板，37℃,5％CO2培养。65小时后， 弃去细胞上清，用PBS清洗1次后按照试剂盒(Promega，Luciferase assay system freezer pack，货号E4530)说明书操作：加入100μl细胞裂解液，冻融使细胞充 分裂解后加入50μl荧光素酶反应底物，测得的相对荧光素酶活性用于计算该中 和抗体或血清中和对应流感病毒假病毒的效价，计算公式如下：
血清抑制百分数＝(完全培养液中的假病毒的荧光素酶相对数值-含有系列 稀释抗体的完全培养液中的假病毒的荧光素酶相对数值)/完全培养液中的假病 毒的荧光素酶相对数值×100％。
在本次研究中用于代表的血清中和效价的指标为IC50值，是指假病毒的 荧光素酶相对数值下降了50％时的血清稀释倍数，用软件GraphPad Prism对血 清稀释倍数和荧光素酶相对数值按Sigma曲线进行拟和，计算IC50值得到。 IC50的浓度通过GraphPadPrism软件对系列稀释的抗体或血清样品的中和效价 按Sigma曲线的拟和计算得到。
1.6DNA疫苗的制备
pCMV/R载体质粒的构建：将血凝素全长序列(包括跨膜区和胞内区)进 行哺乳动物密码子优化后，委托公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行全 基因序列合成并插入pCMV/R载体(构建的血凝素DNA质粒图谱如图3所示)， 大肠杆菌(JM109)转化和克隆扩增后，进行质粒提取(QIAGEN，货号12183) 并鉴定(包括：质粒浓度的检测、OD260/280的比例的测定、DNA琼脂糖凝 胶电泳和质粒测序)，质粒信息准确无误后将质粒分装并保存在-80℃备用。
1.7病毒样颗粒疫苗的制备
1.7.1病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP)的包装(磷酸钙转染法)
在T75细胞培养瓶(Thermo Fisher，货号156499)中铺入9×106个HEK293FT 细胞，培养18小时后给细胞置换新的15ml培养液，2小时后加入转染质粒。
流感病毒样颗粒的体系为：
18.9μg包装载体质粒pCMVΔR8.2
2.7μg血凝素表达载体质粒pCMV-HA
0.675μg神经氨酸酶表达载体质粒pCMV-NA
67.5μl CaCl2(2.5M)溶液
加入ddH2O至675μl的体积，然后逐滴加入675μl的2×HEPES缓冲液(PH 值7.10)，加入过程中用移液器轻吹混匀。
对照病毒样颗粒的体系为
18.9μg包装载体质粒pCMVΔR8.2
2.7μg VSV-G囊膜质粒pCMV-VSV-G
67.5μl CaCl2(2.5M)溶液
加入ddH2O至675μl的体积，然后逐滴加入675μl的2×HEPES缓冲液(PH 值7.10)，加入过程中用移液器轻吹混匀。
混合物室温静置约20分钟后，质粒和钙离子形成颗粒均一沉淀物，将混 合沉淀物逐滴均匀地加入到HEK293FT细胞中。细胞培养16-18小时后，置换 新鲜培养液并加入100μM的丁酸钠作用6-8小时，再次置换15ml新鲜培养液 并继续培养20小时左右，收集含有假病毒的上清。在4000rpm离心5分钟， 去除可能含有的细胞残渣后用0.45μm的滤器(MilliporeMillex,SLHV033RB)过 滤，将过滤好的假病毒上清-80℃保存备用。
1.7.2病毒样颗粒的浓缩和纯化
将收集的含有病毒的细胞上清离心和过滤后，25,000rpm，4℃离心2小时。 用PBS充分溶解VLP沉淀。重悬的VLP加到30％和45％(每个2ml)的非连 续蔗糖密度梯度上。4℃，110,000xg离心3小时后，可以看到离心管内有上下 两条浑浊的液体条带(upper fuzzyband&lower fuzzy band)。Upper fuzzy band 在这个梯度离心管的最上层，其主要为表面没有囊膜蛋白的Gag VLP和一些少 量的杂蛋白；lower fuzzy band主要为表面带有囊膜刺突蛋白的VLP。小心地 取出下面条带用PBS稀释后先用0.45μm的滤膜过滤，再用0.22μm的滤膜过滤。 将过滤后的VLP溶液加到20％蔗糖垫上，4℃，110,000xg离心2小时，离心得 到的VLP沉淀用无菌的PBS重悬，冰上充分溶解，然后免疫实验动物。
1.7.3病毒样颗粒的定量
病毒样颗粒的定量采用两种方法：血凝实验(仅适用含有血凝素蛋白的病 毒样颗粒)和酶联免疫吸附实验(ELISA)。血凝实验的方法如1.3所述，用 于病毒样颗粒表面的囊膜蛋白进行定量。酶联免疫吸附实验用于病毒样颗粒的 基质蛋白进行定量，具体步骤按照HIV-1抗原ELISA试剂盒的说明书进行 (ZeptoMetrix,货号0801200)，具体过程如下：取出适量的HIV-1P24antigen ELISA试剂盒的微孔条，室温平衡并洗涤后，将待测样品和P24蛋白标准品用 试剂盒中的稀释液梯度稀释后，取出200μl加入到微孔中，随后每孔加入20μl裂解液，37℃孵育4小时(P24标准品从125pg/ml开始对倍稀释直至7.8125pg/ml 并做两个复孔检测。另有两孔不加P24标准品作为阴性对照)。洗涤6次后， 每孔加入100μlreconstituted HIV-1 P24 Detector Ab一抗，37℃孵育一小时。 洗涤6次后，加入100μlStreptavidin-Peroxidase working solution二抗，37℃孵 育30分钟。洗涤6次后，每孔加入100μl Substrate working solution，室温避光 显色30分钟后每孔加入100μl Stopbuffer终止反应。最后在酶标仪中取波长 450nm，15分钟内读取样品光吸收值(OD Value)。根据标准品绘制的标准曲 线计算出待测样品所对应的P24的量。
1.8 DDV免疫策略
将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为6只每组，分别在第0天、21天、 42天对小鼠进行免疫。第一次和第二次均用表达HA蛋白的DNA质粒免疫， 每只小鼠后肢肌肉免疫100μg质粒，第三次用表面膜蛋白HA和NA病毒样颗 粒(VLP)免疫，每只小鼠腹腔免疫512个血凝单位，作为DDV免疫组；对 照组用空载质粒两次免疫，每只小鼠后肢肌肉免疫100μg质粒，加强免疫用仅 含HIV-1gag的VLP免疫，每只小鼠腹腔免疫。
1.9实验动物免疫和血清收集
DDV免疫的实验动物为小鼠。DDV免疫：H5N1亚型禽流感病毒株 A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素核苷酸碱基序列插入CMV/R 载体，构建质粒，免疫小鼠和雪貂，用A/common magpie/Hong Kong/5052/2007 的血凝素和神经氨酸酶作为囊膜蛋白，制备病毒样颗粒加强免疫。
1.10 A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株广谱性、识别表位和关 键氨基酸分析
1.10.1 A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素诱导的中和抗体广谱性差
我们选择A/common magpie/Hong Kong/5052/2007血凝素，作为骨架蛋白， 首先将A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株的血凝素和神经氨酸酶 制备免疫原，将6-8周雌性BALB/c小鼠随机分组，采用DDV免疫策略进行免 疫。最后一次免疫14天后，采集小鼠免疫血清，用假病毒中和实验检测免疫 血清的广谱性。表7结果显示：DDV免疫的血清针对A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株有较好的中和活性，但对其他病毒株的中和活性较差， 是典型的株特异性免疫原。
表7.A/common magpie/Hong Kong/5052/2007病毒株免疫的广谱性
1.10.2中和抗体识别的关键氨基酸集中，位于血凝素受体结合区域的外缘的氨基酸高变区
为鉴定A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素诱导的中和抗体 识别的表位及关键氨基酸位点，我们构建了一系列的突变株。血凝素蛋白空间 构象分为远离跨膜区的头部和靠近跨膜区的杆部，头部有包含四个抗体结合区 域，分别是AS1、AS2、AS3和AS4(血凝素蛋白的空间构象和头部区域表位 如图4所示)。A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素诱导的中和 抗体对病毒株A/common magpie/Hong Kong/5052/2007高，对病毒株 A/Thailand/(KAN-1)/2004中和活性低，以这两株病毒血凝素不同区域的氨基酸 互换的方式构建重组蛋白免疫原，构建头部和杆部互换的HA重组的假病毒 (头部杆部互换的重组HA构建示意图如图5所示)，不同表位互换的假病毒 (图6)。用这种含重组HA的假病毒检测免疫血清的中和活性的变化，推测 中和抗体识别的表位和关键性氨基酸的位置。
首先为确定A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素诱导的中和 抗体针对的是血凝素头部还是杆部，我们用头部和杆部互换的方式构建了包含 重组HA的假病毒。表8结果显示，假病毒结构完整具有血凝活性，表9结果 显示互换杆部不会影响免疫血清的中和滴度，互换头部可引起免疫血清的中和 滴度发生显著变化，相同头部的HA重组假病毒和野生型假病毒的中和滴度差 别不显著，提示A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素诱导的中和 抗体针对的是血凝素头部。
表8.构建的头部和杆部重组的HA假病毒
表9.DDV免疫策略诱导的中和抗体针对头部和杆部互换的HA重组假病 毒中和活性的比较
假病毒 HK5052DDV
TH ND
TH head/HK5052 stem ND
HK5052 103,085
HK5052 head/TH stem 102,786
血凝素头部包含4个抗原表位(如图7a所示)，为了确定A/common magpie/HongKong/5052/2007的血凝素诱导的中和抗体针对的血凝素头部的具 体表位，我们构建了A/common magpie/Hong Kong/5052/2007和 A/Thailand/(KAN-1)/2004病毒株头部表位互换的HA重组假病毒，表10所示 重组假病毒结构完整具有血凝活性，可以用于分析免疫血清识别的具体表位。 表11结果显示，互换AS2、AS3、AS4和单点突变94位氨基酸，不会影响免 疫血清的中和滴度，互换AS1表位可引起免疫血清的中和滴度发生显著变化， 相同AS1表位的重组假病毒和野生型假病毒的中和滴度差别不显著，提示 A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素诱导的中和抗体针对的是血 凝素头部AS1表位。
表10.重组假病毒的名称、血凝滴度、P24的含量及二者的比例
表11.DDV免疫策略诱导的中和抗体针对头部和杆部互换的重组假病毒 中和活性的比较
假病毒 HK5052DDV免疫
TH ND
THAS1HK5052 ND
THAS2HK5052 93,809
THAS3HK5052 93,809
THAS4HK5052 98,912
THS94HK5052 97,943
HK5052 118,231
HK5052AS1TH 119,218
HK5052AS2TH ND
HK5052AS3TH ND
HK5052AS4TH ND
HK5052S94TH ND
为了确定A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素诱导的中和抗 体针对的血凝素AS1表位内的关键氨基酸，本发明比较了A/common magpie/Hong Kong/5052/2007和A/Thailand/(KAN-1)/2004病毒株血凝素AS1表 位的氨基酸差异，发现只有5个氨基酸不同(如图7b所示)，分别位于血凝 素蛋白的受体结合位点190helix上的188和193位氨基酸和受体结合位点外缘 loop环上的158、159、160，我们构建这两个位置互换的突变假病毒如表12所 示，可以用于分析免疫血清。表13结果显示：互换190helix上的氨基酸，不 会影响免疫血清的中和滴度，互换受体结合位点外缘loop环上的158、159、 160可引起免疫血清的中和滴度发生显著变化，受体结合位点外缘loop环上的 158、159、160位置氨基酸相同的重组假病毒和野生型假病毒的中和滴度差别 不显著，提示A/common magpie/HongKong/5052/2007的血凝素诱导的中和抗 体针对的关键氨基酸位于158、159和160位置或附近,对血凝素蛋白头部的氨 基酸保守性分析发现，A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素158、 159和160位置或附近的氨基酸属于高变区，保守性差。
表12.突变假病毒的名称、血凝滴度、P24的含量和二者的比例
表13.DDV免疫诱导的中和抗体针对突变假病毒中和活性比较
/>
158、159和160位置位于血凝素蛋白的头部受体结合位点外缘，158、159 和160位置及附近是氨基酸高变区(图8)。
1.10.3制备H5N8亚型流感广谱性疫苗
以A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素作为骨架蛋白，将 A/chicken/Netherland-14015526/2014病毒株AS1表位转移至A/common magpie/Hong Kong/5052/2007的血凝素上，并将AS1表位的159和160位置的 天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D)和丙氨酸(Alanine,Ala,A)突变为丝氨酸 (Serine,Ser,S)和苏氨酸(Threonine,Thr,T)，在受体结合位点外缘的高变区引入 N-糖链，构建的HA重组免疫原，命名为NLAS1HK5052(SEQ ID NO.:1)， 采用“DDV”免疫方式免疫小鼠，最后一次免疫14天后收集小鼠血清，分析免 疫血清的广谱性。
表14结果显示，构建的HA重组免疫原NLAS1HK5052“DDV”免疫诱导的 中和抗体广谱性很好，而野生病毒株(A/chicken/Netherland-14015526/2014) “DDV”免疫诱导的中和抗体广谱性较差。
表14.A/chicken/Netherland-14015526/2014及突变疫苗株 DDV免疫血清的广谱性分析
/>
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中科南京生命健康高等研究院
<120> H5N8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用
<130> P2021-1836
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
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Claims (10)

1.一种血凝素重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白含有来自第一H5亚型流感病毒毒株的血凝素骨架，来自第二H5亚型流感病毒毒株的AS1表位，所述AS1表位为AS1表位突变型，所述AS1表位突变型在野生型的AS1表位的对应于来自第二H5亚型流感病毒毒株的血凝素序列(氨基酸序列号：EPI547678)中的98位,129-138位,153-161位,183位,186-194位和221-228位氨基酸(H3 numbering)的选自下组的氨基酸发生突变：
第159位的天冬氨酸(Aspartic acid，Asp，D)；和
第160位的丙氨酸(Alanine，Ala，A)；并且，所述第一H5亚型流感病毒毒株包括A/common magpie/Hong Kong/5052/2007(H5N1)；
所述第二H5亚型流感病毒毒株包括A/chicken/Netherland-14015526/2014(H5N8)。
2.一种疫苗多肽，其特征在于，所述疫苗多肽包括权利要求1所述的重组蛋白。
3.一种DNA或mRNA疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有用于表达权利要求1所述的重组蛋白的编码mRNA、以及DNA表达载体。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的重组蛋白或权利要求2所述的疫苗多肽。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种H5亚型流感病毒株，其特征在于，所述病毒株的基因组中包含外源性的重组蛋白基因序列，其中，所述重组蛋白基因序列编码权利要求1所述的重组蛋白。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的重组蛋白、权利要求2所述的疫苗多肽或权利要求3所述的mRNA或DNA疫苗或权利要求4所述的多核苷酸或者权利要求5所述的表达载体或者权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7所述的病毒株，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
9.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的重组蛋白、权利要求2所述的疫苗多肽或权利要求3所述的mRNA或DNA疫苗或权利要求4所述的多核苷酸或者权利要求5所述的表达载体或者权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7所述的病毒株，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
10.如权利要求1所述的重组蛋白或权利要求2所述的疫苗多肽或权利要求3所述的mRNA或DNA疫苗或权利要求7所述的病毒株或权利要求8所述的药物组合物或权利要求9所述的疫苗组合物的用途，其特征在于，(a)用于制备针对禽流感病毒血凝素的抗体；和/或(b)用于制备预防和/或治疗禽流感病毒感染或其相关疾病的药物。
CN202210471272.4A 2022-04-28 2022-04-28 H5n8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用 Pending CN117003885A (zh)

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