CN105801704A - 一种具有抗宫颈癌细胞活性的重组疫苗构建方法及应用 - Google Patents
一种具有抗宫颈癌细胞活性的重组疫苗构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种具有抗宫颈癌细胞活性的重组疫苗构建方法及应用。具体地，本发明提供了一种基于HPV致癌蛋白为抗原的融合蛋白、其编码序列以及在检测或治疗HPV相关疾病中应用。该融合蛋白用于免疫抗原能够同时诱导针对高危型HPV癌蛋白产生体液免疫(抗体活性),细胞免疫(T-细胞活性),并具有体内抗癌活性，能够用于HPV感染导致的相关癌症如宫颈癌的预防和治疗性疫苗的开发。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种具有抗宫颈癌细胞活性的重组疫苗构建方法及应用。
背景技术
人乳头状瘤病毒(HumanPapillomaVirus，HPV)，是一类专门感染人类表皮及粘膜细胞的小型无包膜的病毒。目前已发现100多种HPV亚型，根据致病力大小，将HPV分为低危型和高危型两种。高危型HPVs的持续感染与一些恶性肿瘤的发病密切相关，临床试验、分子生物学研究和病原学研究表明，HPV感染是宫颈癌发病的主要因素(zurHausenH.Papillomavirusesandcancer:frombasicstudiestoclinicalapplication.NatRevCancer2002；2:342–50)。大量的流行病学调查显示97％宫颈癌中都可检测到HPV，其中HPV16和HPV18亚型与宫颈癌的发生高度相关。除宫颈癌外，HPV还与其他癌症的发生高度相关，例如：口腔癌，食道癌，头颈癌，直肠，肛门癌，肺癌，及乳腺癌等。所以，研发HPV基因工程疫苗是预防和治疗宫颈癌和其他一些与HPV感染相关恶性肿瘤的一个重要手段。
HPV疫苗可分为预防性疫苗和治疗性疫苗两大类。HPV感染后，机体针对HPV衣壳蛋白L1和L2产生中和抗体，可以有效的保护宿主不受感染。因此，预防性HPV一般由病毒衣壳蛋白L1或L1-L2组成，在细胞内可自我组装成不含病毒DNA的空心病毒样颗粒(VLPs)(KirnbauerR，TaubJ,GreenstoneH，etal.Efficientself-assemblyofhumanpapillomavirustype16L1andL1-L2intoviruslikeparticles.JVirol[J].1993,67:6929-36.)，VLPs具有与完整病毒相同的抗原空间表位，在一定程度上，能够代替天然病毒激发机体的CD4+淋巴细胞介导的体液免疫反应，诱导产生针对天然病毒的保护性抗体，可以有效的保护宿主不受病毒感染(SchillerJ，LowyD.Papillomavirus-likeparticlevaccines.JNatlCancerInstMonogr2001；(28):50-4)。目前已有的两种预防性疫苗，Merck公司生产的四联疫苗Gardasil和GlaxoSmithKline公司生产的二联疫苗Cervarix能够通过降低HPV的感染率从而有效的预防宫颈癌的发生，但是这些疫苗不能治疗HPV感染，也不能治疗HPV感染相关的恶性疾病(TrimbleCL,FrazerIH.DevelopmentoftherapeuticHPVvaccines.LancetOncol2009；10:975–80)。HPV感染后，病毒DNA整合进入人体基因组，在宿主细胞内表达致癌蛋白。在宫颈高度病变和癌症患者的宫颈上皮细胞中E6，E7蛋白一般呈过度表达，导致被感染细胞过度增殖和恶性转化。由于病毒癌蛋白E6和E7能够在寄主的肿瘤细胞中持续表达，因而为HPV感染相关疾病提供免疫治疗的抗原靶标，故治疗性疫苗主要以HPV早期蛋白E6和E7作为靶蛋白，针对HPV感染后的治疗，可清除由HPV感染所引起的肿瘤残存病灶、宫颈不典型增生(CIN)，阻断低危型病变向高危型及癌症的转变过程(NonnM,SchinzM,ZumbachK,PawlitaM,SchneiderA,DürstM,KaufmannAM.Dendriticcell-basedtumorvaccineforcervicalcancerI:invitrostimulationwithrecombinantprotein-pulseddendriticcellsinducesspecificTcellstoHPV16E7orHPV18E7.JCancerResClinOncol.2003；129(9):511-20.)。
HPV治疗性疫苗大致可分为五类：载体疫苗、肽类疫苗、蛋白疫苗、基因疫苗和细胞疫苗。蛋白疫苗又可分为融合蛋白疫苗和嵌合疫苗。由于一种病变可能是由多个型别的HPV感染所致，因此开发针对多种型别HPV病毒的预防和/或治疗性疫苗，是目前HPV疫苗研究的一大挑战，具有重要的应用价值和前途。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗宫颈癌细胞活性的重组疫苗构建方法及该重组疫苗的应用。
本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一抗原元件、第二抗原元件、以及任选的标签序列和/或信号肽序列，
所述第一抗原元件包含衍生自结核杆菌Psts-1蛋白的多肽；所述第二抗原元件包含衍生自HPV基因编码蛋白的多肽。
在另一优选例中，所述HPV基因编码蛋白包括但不限于：HPVL1蛋白、HPVL2蛋白、HPVE6蛋白、HPVE7蛋白。
在另一优选例中，所述HPV病毒包括但不限于：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68。
在另一优选例中，所述第二抗原元件选自下组的一种或多种：
抗原元件A，所述抗原元件A为衍生自HPV16L2蛋白的多肽；
抗原元件B，所述抗原元件B为衍生自HPV16E6蛋白的多肽；
抗原元件C，所述抗原元件C为衍生自HPV16E7蛋白的多肽；和
抗原元件D，所述抗原元件D为衍生自HPV18E7蛋白的多肽。
在另一优选例中，所述第一抗原元件的长度为15-30个氨基酸，优选为19个氨基酸。
在另一优选例中，所述抗原元件A的长度为10-30个氨基酸，优选为20个氨基酸。
在另一优选例中，所述抗原元件B的长度为5-20个氨基酸，优选为10个氨基酸。
在另一优选例中，所述抗原元件C的长度为40-60个氨基酸，优选为55个氨基酸。
在另一优选例中，所述抗原元件D的长度为50-100个氨基酸，优选为70个氨基酸。
在另一优选例中，所述抗原元件包括：
抗原元件A、抗原元件B、抗原元件C、和抗原元件D。
在另一优选例中，所述结核杆菌Psts-1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:1所示。
在另一优选例中，所述HPV16L2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。
在另一优选例中，所述HPV16E6蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:3所示。
在另一优选例中，所述HPV16E7蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:4所示。
在另一优选例中，所述HPV18E7蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:5所示。
在另一优选例中，所述第一抗原元件包含结核杆菌Psts-1蛋白的第326-344位氨基酸。
在另一优选例中，所述抗原元件A包含HPV16L2蛋白的第17-36位氨基酸。
在另一优选例中，所述抗原元件B包含HPV16E6蛋白的第29-38位氨基酸。
在另一优选例中，所述抗原元件C包含HPV16E7蛋白的第36-90位氨基酸。
在另一优选例中，所述抗原元件D包含HPV18E7蛋白的31-100位氨基酸。
在另一优选例中，所述标签序列选自：His标签、MBP标签。
在另一优选例中，所述融合蛋白具有以下特性：
a)刺激机体产生针对HPV的体液免疫应答；
b)刺激机体产生针对HPV的细胞免疫应答；
c)诱导T淋巴细胞增殖；
d)诱导HPV特异性的CTL反应。
在另一优选例中，所述融合蛋白具有式I所述结构：
M-C-A-D-B-T(I)，
其中，
M为所述第一抗原元件；
A、B、C、D分别为所述抗原元件A、所述抗原元件B、所述抗原元件C、所述抗原元件D；
T为任选的标签序列和/或信号肽序列；
“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：
(A)具有SEQIDNO:11或14所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQIDNO:11或14所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)且保留所述特性的多肽；
(C)将SEQIDNO:11或14中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。
本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸为DNA和/或RNA。
在另一优选例中，所述RNA包括但不限于：mRNA序列、anti-senseRNA序列、smallinterferenceRNA序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQIDNO.:11或14所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQIDNO.:12或13所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQIDNO:12或13所示。
本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体包括本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体以pET-28a质粒为骨架。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达本发明第一方面所述的融合蛋白；和/或
所述宿主细胞基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸；和/或
所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体。
在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞(如酵母细胞)。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、果蝇S2细胞、CHO细胞、HEK293细胞、DC细胞等。
在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选为大肠杆菌BL21菌株。
本发明的第五方面，提供了一种制备融合蛋白的方法，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白；和
分离所述融合蛋白。
在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。更优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。
本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含：本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。
本发明的第七方面，提供了一种疫苗组合物，所述组合物包含：本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、Poly(I：C)、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、PEG(聚乙二醇，polyethyleneglycol)、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12和CpG)。
本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的融合蛋白的用途，用于制备药剂或试剂，所述药剂或试剂用于：
(1)治疗或预防HPV感染；和/或
(2)治疗或预防HPV感染相关疾病；和/或
(3)诱导针对HPV的免疫反应；和/或
(4)检测血清中抗HPV抗体。
在另一优选例中，所述HPV感染相关疾病包括但不限于：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、食道癌、头颈癌、直肠癌、口腔癌、肛门癌或膀胱肿瘤。
在另一优选例中，所述HPV的病毒亚型包括：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68。
本发明的第九方面，提供了一种治疗HPV感染或HPV导致相关疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的多核苷酸(DNA、RNA、RNAi、anti-senseRNA)、本发明第六方面所述的药物组合物或者本发明第七方面所述的疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的融合蛋白以单体和/或二聚体形式施用。
在另一优选例中，所述的对象是人。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了克隆载体酶切电泳图。A为4个pET-VAC-Pro克隆进行酶切鉴定的结果，B为pET–VAC克隆进行酶切鉴定的结果。
图2显示了His-Vac重组蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定结果。
图3显示了His-Vac重组蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定结果。
图4显示了不同剂量免疫后小鼠血清IgGELISA检测结果，1000倍稀释的小鼠血清IgG效价。
图5显示了不同剂量免疫后小鼠血清IgAELISA检测结果，1000倍稀释的小鼠血清IgA效价。
图6显示了不同剂量免疫后小鼠血清IgMELISA检测结果，1000倍稀释的小鼠血清IgM效价。
图7显示了重组融合蛋白抗原免疫后小鼠血清针对各个蛋白分子靶点的血清滴度测定结果。
图8显示了His-Vac诱导淋巴细胞增殖MTT检测结果。
图9显示了TC-1细胞注射小鼠建立肿瘤模型。
图10显示了His-Vac抑制小鼠肿瘤体积的实验结果；10A显示了肿瘤抑制实验(His-Vac3×100μg；n＝10)，10B显示了肿瘤抑制实验中每只小鼠单独成瘤的体积。
图11显示了His-Vac抑制小鼠肿瘤的体外检测结果；11A为小鼠肿瘤剥离后体外对比图片，11B为抑制实验中每只小鼠肿瘤单独称重结果；11C为抑制实验中实验组和对照小鼠肿瘤称重平均值结果。
图12显示了His-Vac治疗小鼠肿瘤实验30天的tumorburden(载瘤体积)结果。
图13检测His-Vac在人血清中的免疫原性结果，ELISA法检测病理阳性，感染阳性和未知人群血清。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种针对HPV致癌蛋白为靶点的融合蛋白，实验结果表明，该融合蛋白能够同时诱导针对高危型HPV产生体液免疫(抗体活性),细胞免疫(T-细胞活性),及体内抗癌活性(invivoanti-tumoractivity)，能够用于HPV感染相关癌症如宫颈癌的预防和治疗性疫苗的开发。
活性多肽
本发明提供的一种HPV相关融合蛋白，所述的融合蛋白包括衍生自结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MT)Psts-1蛋白的多肽；衍生自HPV16L2蛋白的多肽；衍生自HPV16E6蛋白的多肽；衍生自HPV16E7蛋白的多肽；衍生自HPV18E7蛋白的多肽，以及任选的标签序列和/或信号肽序列。
如本发明所用“衍生”包括：
(A)从一个较长的多肽上截取一段较短的多肽片段；
(B)多肽I与多肽II的某一片段相比，同源性≥80％(优选地≥90％，更优选地≥95％，最优选地≥98％)则可定义为多肽I衍生自多肽II。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述结核杆菌Psts-1蛋白的GenBank登录号为P9WGU0.1；HPV16-L2蛋白的GenBank登录号为AHK23261.1；HPV16-E6蛋白的GenBank登录号为ABK32509.1；HPV16-E7蛋白的GenBank登录号为AHK23257.1；HPV18-E7蛋白的GenBank登录号为AAP20595.1。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述结核杆菌Psts-1蛋白的氨基酸序列如下：
MKIRLHTLLAVLTAAPLLLAAAGCGSKPPSGSPETGAGAGTVATTPASSPVTLAETGSTLLYPLFNLWGPAFHERYPNVTITAQGTGSGAGIAQAAAGTVNIGASDAYLSEGDMAAHKGLMNIALAISAQQVNYNLPGVSEHLKLNGKVLAAMYQGTIKTWDDPQIAALNPGVNLPGTAVVPLHRSDGSGDTFLFTQYLSKQDPEGWGKSPGFGTTVDFPAVPGALGENGNGGMVTGCAETPGCVAYIGISFLDQASQRGLGEAQLGNSSGNFLLPDAQSIQAAAAGFASKTPANQAISMIDGPAPDGYPIINYEYAIVNNRQKDAATAQTLQAFLHWAITDGNKASFLDQVHFQPLPPAVVKLSDALIATISS(SEQIDNO.:1)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV16-L2蛋白的氨基酸序列如下：MRHKRSAKRTKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTSVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRPVARLGLYSRTTQQVKVVDPAFVTTPTKLITYDNPAYEGIDVDNTLYFPNNDNSINIAPDPDFLDIVALHRPALTSRRTGIRYSRIGNKQTLRTRSGKSIGAKVHYYYDFSTIDPAEEIELQTITPSTYTTTSHAASPTSINNGLYDIYADDFITDTFTTPVPSVPSTSLSGYIPANTTIPFGGAYNIPLVSGPDIPINITDQAPSLLPIVPGSPQYTIIADAGDFYLHPSYYMLRKRRKRLPYFFSDVSLAA(SEQIDNO.:2)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV16-E6蛋白的氨基酸序列如下：MHQKRTAMFQDPQERPRKLPHLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRYYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETLL(SEQIDNO.:3)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV16-E7蛋白的氨基酸序列如下：MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQIDNO.:4)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV18-E7蛋白的氨基酸序列如下：
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPW(SEQIDNO.:5)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述融合蛋白包括依次串联的结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MT)Psts-1蛋白(SEQIDNO.:1)的第350-368位氨基酸，HPV16E7蛋白(SEQIDNO.:4)的第36-90位氨基酸，HPV16L2蛋白(SEQIDNO.:2)的第17-36位氨基酸，HPV18E7蛋白(SEQIDNO.:5)的第31-100位氨基酸，HPV16E6蛋白(SEQIDNO.:3)的第29-38位氨基酸和His标签。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述融合蛋白氨基酸序列包括DQVHFQPLPPAVVKLSDAL(SEQIDNO.:6，衍生自结核杆菌Psts-1蛋白)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述融合蛋白氨基酸序列包括QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV(SEQIDNO.:7，衍生自HPV16L2蛋白)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述融合蛋白氨基酸序列包括TIHDIILECV(SEQIDNO.:8，衍生自HPV16E6蛋白)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述融合蛋白氨基酸序列包括DEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIV(SEQIDNO.:9，衍生自HPV16E7蛋白)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述融合蛋白氨基酸序列包括LSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPW(SEQIDNO.:10，衍生自HPV18E7蛋白)
在本发明的一个优选的实施方式中，所述融合蛋白氨基酸序列包括：
DQVHFQPLPPAVVKLSDALDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWTIHDIILECV(SEQIDNO.:11)
在本发明的一个优选的实施方式中，构建所述的HPV相关融合蛋白的方法包括，提供由增强免疫反应的MTPsts-1蛋白片段，HPV16E6蛋白片段、HPV16E7蛋白片段、HPV16L2蛋白片段,HPV18E7蛋白片段组成的融合蛋白的编码序列，用分子生物工程学的方法将其基因序列克隆到E.Coli表达载体中，并使其在E.Coli中表达。
在本发明的一个优选的实施方式中，编码所述融合蛋白的核酸序列包括atgggcgaccaggttcacttccagccgctgccgccggctgttgttaaactgtctgacgctctggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgcaactttataaaacatgcaaacaggcaggtacatgtccacctgacattatacctaaggttttaagcgactcagaggaagaaaacgatgaaatagatggagttaatcatcaacatttaccagcccgacgagccgaaccacaacgtcacacaatgttgtgtatgtgttgtaagtgtgaagccagaattgagctagtagtagaaagctcagcagacgaccttcgagcattccagcagctgtttctgaacaccctgtcctttgtgtgtccgtggactatacatgatataatattagaatgtgtgcatcatcatcatcatcac(SEQIDNO.:12)
在本发明的一个优选的实施方式中，编码所述融合蛋白的核酸序列包括：atgggtgatcaggtgcattttcaaccgctgccgccggctgtggtcaaactgtccgacgctctggatgaaatcgacggtccggctggtcaggcagaaccggatcgcgctcattacaacatcgtgaccttctgctgtaaatgcgattcaacgctgcgtctgtgtgtccagtcgacccacgtggatattcgcacgctggaagacctgctgatgggcaccctgggtatcgttcagctgtacaaaacctgcaaacaagcaggcacgtgtccgccggatattatcccgaaagttctgagtgactccgaagaagaaaacgatgaaattgacggtgtcaatcatcagcacctgccggcacgtcgcgcagaaccgcaacgtcataccatgctgtgcatgtgctgtaaatgtgaagcccgcatcgaactggtggttgaaagctctgcggatgacctgcgtgcctttcagcaactgttcctgaatacgctgtctttcgtgtgcccgtggacgattcacgacatcatcctggaatgcgttcatcatcatcaccatcac(SEQIDNO.:13，按E.Coli密码子优化后的基因序列)。
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明中所用的表达载体为：pET-VAC，该载体表达的重组蛋白为His-Vac,其氨基酸序列为DQVHFQPLPPAVVKLSDALDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWTIHDIILECVHHHHHH(SEQIDNO.:14)。
本发明所述融合蛋白具有以下活性：
a)刺激机体产生针对HPV的体液免疫应答；
b)刺激机体产生针对HPV的细胞免疫应答；
c)诱导T淋巴细胞增殖；和/或
d)诱导HPV特异性的CTL反应。
如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQIDNO：11或14序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式Ia或式Ib的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQIDNO:11所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽(融合蛋白)还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
编码序列
本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQIDNO:11所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:11所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。
在本发明较佳的实施方式中，所述多核苷酸的的序列如SEQIDNO.:12或13所示。
本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明酶的功能。
如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述酶的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产本发明融合蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化融合蛋白。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
制备方法
本发明的融合蛋白(多肽)可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。
一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
在一实施方式中，本发明的融合蛋白，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。
另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸来表达或生产本发明的融合蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
药物组合物和施用方法
本发明融合蛋白可作为免疫原在体内诱导产生抗HPV或HPV阳性细胞的抗体及淋巴T细胞活性，从而实现治疗效果。此外，本发明抗原肽具有优异的特异性和免疫活性，故可用于制备免疫治疗或预防的疫苗。
另一方面，本发明还提供了一种药物(包括疫苗)组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐(或其编码序列)；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为注射剂。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明融合蛋白或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入人的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于预防或治疗时，作为活性成分的本发明融合蛋白或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待预防或治疗的每个对象(病人)的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。
本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病，例如：预防HPV感染导致的癌症)或治疗性的(即在患病后治疗疾病，例如：宫颈癌或癌前病变)。
这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组蛋白)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。优选地，本发明的疫苗构建采用结核杆菌抗原的多肽片段。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。本发明优选采用干扰素诱导剂Poly(I：C)。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的融合蛋白用作用疫苗时能够诱发针对高危型HPV16，HPV18病毒亚型致癌蛋白oncoprotein的特异性免疫反应，以实现有抗癌活性相关抗原的高效免疫效应；
(2)本发明的融合蛋白用作用疫苗时还能够诱发针对其它的多种HPV病毒亚型的特异性免疫反应，以达到广谱的针对HPV的免疫效应。
(3)本发明的HPV融合蛋白能刺激机体免疫系统产生免疫应答，包括体液免疫应答和细胞免疫应答。
(4)使用本发明的HPV融合蛋白免疫动物显示了显著的肿瘤生长抑制作用。
(5)经过检测自然感染HPV人群血液样品的抗原性多肽序列的验证，证明本发明的融合蛋白在人体内有良好的抗原性。
6)本发明的HPV融合蛋白中各个分子靶点的序列选择体现了最大的安全性，减少副作用或毒性。全长的HPV致癌蛋白E6、7均有结合寄主DNA、和/或结合Transcriptionfactor的功能活性。该活性蛋白引入人体具较大的风险，可能引起副作用或毒性，可能会导致细胞转化以致癌症发生。本发明的抗原序列构建经过了深入分析研究各个HPV分子靶点的结构和功能。去除了非特异性(与非高位HPV亚型同源性)序列、去除了有转化细胞活性的多肽序列。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂均可从市售渠道获得。
实施例1：融合蛋白表达质粒的构建
1、将有关HPV16的E7、E6、L2基因序列及HPV18的E7基因序列
GenebankNo:
MT(SEQIDNO.:1，来源于genebankAccession:P9WGU0.1)
HPV16-L2(SEQIDNO.:2，来源于GenebankAccession:AHK23261.1)
HPV16-E6(SEQIDNO.:3，来源于GenebankAccession:AHK23256.1)
HPV16-E7(SEQIDNO.:4，来源于GenebankAccession：AHK23257.1)
HPV18-E7(SEQIDNO.:5，来源于GenebankAccession:AGU90424.1)
根据E.Coli密码子进行优化，将优化好的基因序列送GenScript公司(南京)合成。其产物进行鉴定，合成了全长为546bp的编码基因(atgggtgatcaggtgcattttcaaccgctgccgccggctgtggtcaaactgtccgacgctctggatgaaatcgacggtccggctggtcaggcagaaccggatcgcgctcattacaacatcgtgaccttctgctgtaaatgcgattcaacgctgcgtctgtgtgtccagtcgacccacgtggatattcgcacgctggaagacctgctgatgggcaccctgggtatcgttcagctgtacaaaacctgcaaacaagcaggcacgtgtccgccggatattatcccgaaagttctgagtgactccgaagaagaaaacgatgaaattgacggtgtcaatcatcagcacctgccggcacgtcgcgcagaaccgcaacgtcataccatgctgtgcatgtgctgtaaatgtgaagcccgcatcgaactggtggttgaaagctctgcggatgacctgcgtgcctttcagcaactgttcctgaatacgctgtctttcgtgtgcccgtggacgattcacgacatcatcctggaatgcgttcatcatcatcaccatcac，SEQIDNO.:13)。合成的基因片段先以NcoI/HindIII两个限制性酶切位点克隆至pET-28a质粒(购自上海生工)中，构建成pET-16L2E6E718E7(后面简称为pET-VAC)载体。
构建的载体基因序列未优化前的载体为pET-VAC-Pro，将构建的重组质粒，经NcoI/HindIII酶切鉴定，DNA电泳后的结果图1所示。
图1A为挑选的4个pET-VAC-Pro克隆进行酶切鉴定的结果，泳道M为Maker，泳道1～4分别为pET-VAC-Pro克隆1～4酶切后的电泳结果，结果显示仅克隆pET-VAC-Pro-4酶切后得到550bp左右的目的条带(红色箭头所示)。
图1B为构建的载体pET-VAC的酶切电泳图，泳道M为Maker，泳道1为pET-VAC质粒的电泳结果，泳道1为pET-VAC质粒经酶切后的电泳结果，红色箭头所示为550bp左右的目的条带。
2、转化E.ColiBL21菌株，诱导表达：
构建的重组质粒pET-VAC载体，经酶切鉴定正确后通过热击42s转化到BL21菌株中，BL21菌株购自上海英骏生物技术有限公司；经Kan抗性筛选获得阳性菌株。阳性菌株用终浓度为0.1mMIPTG诱导进行表达，23℃诱导4h后取菌液离心，SDS-PAGE鉴定结果如图2所示：泳道1为未诱导的全菌，泳道2为诱导后的全菌，泳道3为诱导后的裂解上清，泳道4为诱导后的裂解沉淀。图中红色箭头处为目的蛋白His-Vac(本发明的融合蛋白)，大小约为20KDa。
3、NI柱纯化目的蛋白
pET-VAC重组蛋白采用8M尿素溶解包涵体，经过Ni柱(Ni-NTA；GEHealthcare)HiTrapQHP型阴离子交换层析柱纯化，SDS-PAGE分析蛋白纯度，结果如图3所示：重组蛋白His-Vac蛋白纯度达到95％以上，泳道1为Maker，泳道2、3、4分别为纯化的蛋白5μl、10μl、15μl上样。
实施例2：小鼠免疫及免疫抗血清的制备
C57BL/6雌性小鼠，8周龄，约20克重，共24只，购自扬州大学实验动物中心。所有小鼠免疫前断尾取血100μl，离心取血清-20℃冻存，备用。将24只小鼠随机分为6个免疫剂量组，每组4只平行对照小鼠。首次免疫腹腔注射100μl，免疫剂量如表1所示。首免一周后断尾取血，然后皮下分5点注射，共注射100μl，剂量同首次免疫，如表1所示。第二次免疫后一周取血。三周处死小鼠，眼球取血，检测宫颈癌疫苗免疫小鼠血清效价。
表1免疫剂量
| No. | A | B | C | D | E | F |
| 剂量(μg) | 0 | 10 | 50 | 100 | 150 | 200 |
实施例3：ELISA检测免疫后的血清效价
1、检测不同剂量免疫后小鼠血清IgG效价
抗原选用His-Vac融合蛋白，2μg/ml，100μl/孔包被，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃孵育2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入免疫前，免疫一周，免疫二周和免疫三周的小鼠血清，血清按1：1000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h。PBST洗涤拍干后加入1:10000稀释的Goatanti-MouseIgG(subclasses1+2a+2b+3),Fcγfragmentspecific,HRP(Cat：115-035-164)购自Jackson公司。37℃孵育30min，PBST洗涤拍干后TMB显色，2MH2SO4终止，450nm处读数OD值。结果如图4所示，IgG是生物体液内主要的Ig，约占血液中Ig总量的70～75％。小鼠免疫两次后，血清中的IgG效价均升高，其中免疫后一周到二周之间小鼠血清效价开始上升。当免疫剂量大于50μg/只时，小鼠免疫后第二周和第三周的效价基本达到平台期。当His-Vac免疫剂量在100μg/只以下时，小鼠免疫血清中IgG效价随着His-Vac免疫剂量的加大而升高，至100μg/只时达到最大值。而当免疫剂量为150μg/只和200μg/只时，小鼠血清中IgG的效价反而有所下降。
2、检测不同剂量免疫后小鼠血清IgA效价
抗原选用His-Vac融合蛋白，2μg/ml，100μl/孔包被，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃孵育2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入免疫前，免疫一周，免疫二周和免疫三周的小鼠血清，血清按1：1000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h。PBST洗涤拍干后加入Mousemonoclonalantibodyisotypereagents(Cat：ISO2-1KT)中的Goatanti-MouseIgA购自SIGMA公司，37℃孵育30min，PBST洗涤拍干后加入1:10000稀释的RabbitAnti-GoatIgG(H+L)HRP(Cat：BS30503)购自BioworldTechnology公司，37℃孵育30min，PBST洗涤拍干，TMB显色，2MH2SO4终止，450nm处读数OD值。结果如图5所示，IgA在血清中的含量仅次于IgG，占血清免疫球蛋白含量的10～20％。当小鼠免疫剂量达到100μg/只时，小鼠的血清中的IgA效价在免疫后一周到二周之间开始上升，并在第三周基本达到平台。而当小鼠免疫剂量在小于或等于50μg/只时，小鼠免疫后IgA基本无变化，即未产生IgA抗体。
3、检测不同剂量免疫后小鼠血清IgM效价
抗原选用His-Vac融合蛋白，2μg/ml，100μl/孔包被，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃孵育2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入免疫前，免疫一周，免疫二周和免疫三周的小鼠血清，血清按1：1000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h。PBST洗涤拍干后加入Mousemonoclonalantibodyisotypereagents(Cat：ISO2-1KT)中的Goatanti-MouseIgM购自SIGMA公司，37℃孵育30min，PBST洗涤拍干后加入1:10000稀释的RabbitAnti-GoatIgG(H+L)HRP(Cat：BS30503)购自BioworldTechnology公司，37℃孵育30min，PBST洗涤拍干，TMB显色，2MH2SO4终止，OD450nm处读数。结果如图6所示，IgM抗体一般为保护性抗体，它是免疫应答中首先分泌的抗体，一经感染快速产生。在免疫前小鼠血清中，可能是由于IgM的交联作用使得测得到的本底值有些偏高。在当免疫剂量达到100μg/只小鼠时，免疫后一周内小鼠的血清中IgM效价就开始上升，持续上升至第二周，到第三周时基本达到平台。IgM在疫苗免疫后的产生速度快于IgG和IgA。
实施4：免疫后小鼠血清对疫苗各靶点血清滴度ELISA测定
宫颈癌疫苗His-Vac由HPV16L2，HPV16E7，HPV18E7和HPV16E6各个蛋白片段融合而成。检测His-Vac免疫后小鼠血清与His-Vac中各靶点的结合情况。取纯化的GST-HPV16E6，GST-HPV16E7，GST-HPV16L2和GST-HPV18E7，8μg/ml，100μl/孔包被，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃孵育2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入免疫后的D组小鼠血清，血清分别按1:1000，1:2000，1:5000，1:10000进行稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h。PBST洗涤拍干后加入1：10000稀释的Goatanti-MouseIgG(subclasses1+2a+2b+3),Fcγfragmentspecific,HRP(Cat：115-035-164)购自Jackson公司，37℃孵育30min，PBST洗涤拍干，TMB显色，2MH2SO4终止，OD450nm处读数。结果如图7所示，免疫后的小鼠血清能够较强的结合HPV18E7，HPV16E7。说明His-Vac免疫小鼠后能够刺激机体产生体液免疫,起到有效的预防作用。
实施例5：淋巴细胞的增殖实验
His-Vac对淋巴T细胞的增殖活性,以使用His-Vac蛋白免疫的动物淋巴细胞与未被免疫的动物淋巴细胞(对照组PBS)做活性实验。将10只C57BL/6小鼠随机分为2个组，每组5只平行对照小鼠。首次免疫腹腔注射100μlHis-Vac(1mg/ml)或PBS，His-Vac的免疫剂量为100μg/只,首免两周后皮下分5点注射，共注射100μl，剂量同首免，第二次免疫后两周进行三免方法与剂量同二免。三免后一周处死小鼠，分离淋巴细胞进行细胞增殖实验。96孔板每孔取20万个淋巴细胞铺板，待贴壁后无血清培养4小时。分别加入采用1％FBS/1640稀释的His-Vac(50μg/ml)、刀豆球蛋白A(ConA)(5μg/ml)和正常培养基(1％FBS/1640)，每孔200μl，培养72小时后加入20μlMTT作用四小时后洗掉上清液，然后每孔加入150μlDMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后492nm处测吸光值。ConA能够诱导小鼠T细胞活化和增殖，在此作为阳性对照。结果如图8所示：His-Vac免疫的小鼠分离获得的淋巴细胞贴壁培养后采用His-Vac刺激能够明显的观察到细胞的增殖(OD值和细胞图片)，而未采用His-Vac刺激的免疫淋巴细胞和采用His-Vac刺激的未免疫淋巴细胞均无增殖。
实施例6：C57BL/6小鼠成瘤实验
雌性C57BL/6小鼠，8周4只，随机分为两组，用TC-1肿瘤细胞(即HPV16E6、E7和ras基因共转化的C57BL/6小鼠肺上皮细胞)，该细胞株是研究高危亚型HPV16病毒活性，及抗HPV疫苗研究普遍使用的细胞模型，在C57BL/6小鼠中建立成瘤模型。取2只小鼠在小鼠左腹股沟皮下注射1.5×l05个TC-1细胞。另取2只小鼠在左腹股沟皮下注射5×l05个TC-1细胞，每天对肿瘤大小进行测量。肿瘤体积计算方法为体积＝(长×宽2)/2。结果如图9所示：当TC-1细胞数目为1.5×l05时，小鼠最初成瘤速度缓于1.5×l05，约第10天才开始成瘤，而后肿瘤迅速增大，符合预期实验要求。故后续实验采用1.5×l05注射肿瘤。
实施例7：His-Vac抑制小鼠肿瘤实验
疫苗蛋白的体内抑瘤活性实验，采用鼠源TC-1细胞成瘤模型。免疫实验采用C57BL/6雌性小鼠，8周龄20只，约20克重，购自扬州大学实验动物中心。实验组和对照组各10只小鼠。实验组免疫使用100μgHis-Vac+50μgPoly(I:C)，对照组使用等体积的PBS。首免使用完全弗氏佐剂腹腔注射，首免后10天进行第二次免疫，采用不完全弗氏佐剂背部皮下多点注射，2周后进行第三次免疫，免疫剂量与方式同第二次。首免后一周采血检测小鼠血清效价，之后每隔一周采血一次，首免第14天时小鼠血清效价到达平台期，进行TC-1肿瘤细胞的注射。以1.5×105个细胞每只小鼠注射到左腹股沟皮下。注射肿瘤细胞后15天后发现有直径为5mm左右的肿瘤形成，开始每周2次测量肿瘤大小，数据采集至33天。Poly(I：C)为一种干扰素诱导剂。在体内细胞诱导下产生干扰素，有类似干扰素的作用，故有广谱抗病毒和免疫调节功能。用于病毒感染性疾病和肿瘤的辅助治疗。采用His-Vac+Poly(I:C)预先免疫的小鼠，在注射TC-1细胞后，肿瘤形成明显被抑制,而给予PBS注射的小鼠成瘤明显。图10中A为实验组和对照组小鼠存活时所测量到的平均成瘤体积，图10B为每只小鼠单独成瘤的体积。实验组和对照组小鼠在33天首次免疫33天，眼球取血处死。剥离小鼠肿瘤称重，计算His-Vac对肿瘤形成的抑制率，肿瘤细其中A值为肿瘤重量。结果如图11(A,B,C)所示，实验组对肿瘤的抑制率达到91％。
实施例8：His-Vac治疗小鼠肿瘤实验
实验方案为待先注射TC-1肿瘤细胞7天后采用His-Vac疫苗进行治疗。C57BL/6雌性小鼠，8周龄，约20克重，共32只，购自扬州大学实验动物中心。小鼠随机分为A、B、C、D四组，每组8只小鼠。取对数生长期的新鲜TC-1肿瘤细胞进行左腹股沟皮下注射，每只小鼠1.5X105。注射7天后进行免疫。首免采用完全弗氏佐剂与蛋白乳化后进行腹腔注射，A组免疫使用100μgHis-Vac+50μgPoly(I:C)；B组使用等体积的PBS；C组为100μgHis-Vac；D组为50μgPoly(I:C),每只小鼠注射100μl。7天后进行第二次免疫，采用不完全弗氏佐剂与蛋白乳化后皮下多点注射，抗原使用量同首免，间隔7天后进行第三次免疫，免疫方法和剂量同第二次免疫。第15天开始测量肿瘤大小，每3-4天测量一次。结果如图12所示：A组His-Vac与Poly(I：C)联用后能够明显抑制肿瘤的生长速度，抑制率达73％，C组单独使用His-Vac也有一定的抑制肿瘤的作用，抑制率为52％，其抑制效果弱于His-Vac疫苗与Poly(I:C)联用。而单独使用Poly(I：C)的D组肿瘤抑制率仅为23％。说明His-Vac对于在生长过程中的肿瘤具有明显的治疗作用。
实施例9：ELISA检测HPV感染人群和未知人群血清
采用间接ELISA方法检测：使用pET-VAC以2ug/ml包被，检测病理诊断宫颈癌HPV阳性血清16例、HPV感染阳性血清10例和未知人群血清20例。血清1:20稀释度，37℃吸附1小时。结果如图13所示：病理诊断宫颈癌HPV阳性血清检测均为阳性(阳性率达100％)，HPV感染阳性检测部分为阳性(阳性率达60％)，未知人群检测绝大部分为阴性(阳性率仅为15％)。疫苗抗原pET-VAC检测结构显示血清抗体反应在三种不同人群区分部比较明显。说明本发明的pET-VAC抗原在人体内具有很好的免疫原性。
讨论：
本发明提供的His-Vac融合蛋白，经过对中国人群及阳性患者血清进行筛选，验证了其具有免疫活性很强的优势表位。该融合蛋白用作疫苗具有抗原性强，抗原表位特异性高的特点，而且具有广谱活性、可中和多种高危亚型的抗原表位(L2)。
本发明的融合蛋白能够刺激动物体内产生体液免疫，对高危型E7蛋白具有较强的中和作用，L2蛋白与中和抗体结合较弱，能够减弱血清中晚期蛋白抗体对疫苗蛋白的抑制作用。该融合蛋白能够刺激动物体内T细胞增殖，激发细胞免疫。因此，该疫苗对动物肿瘤形成具有明显的预防作用，与Poly(I:C)联用能够明显的抑制肿瘤的形成。另外，研究表明该疫苗在人群中具有较好的免疫原性。可开发为HPV感染相关疾病(如宫颈癌)的预防和/或治疗性疫苗，也可以用于HPV抗体的检测。
KaranamB等(VaccinationwithHPV16L2E6E7fusionproteininGPI-0100adjuvantelicitsprotectivehumoralandcell-mediatedimmunity.Vaccine.2009；27(7):1040-9.)报到了一种HPV融合蛋白(TA-CIN)是由HPV16型的L2、E6和E7蛋白串联组成，能够诱导产生抗HPV的抗体，用于宫颈癌的治疗。但是对于感染者来说,血清中经常存在抗晚期蛋白的抗体,这些抗体对嵌合蛋白的治疗可能具有抑制作用。而且该蛋白的免疫原性较低，本发明的融合蛋白与TA-CIN相比，具有更高的免疫原性，在诱导血清IgG滴度方面是TA-CIN的2.5倍，而且本发明的融合蛋白在诱导B细胞和T细胞增殖方面具有显著的优势，在HPV相关肿瘤的治疗上表现出了更好的效果。TA-CIN疫苗构建没有包括HPV18亚型抗原，大量研究报道，HPV18仅次于HPV16为第二常见致癌高危亚型。TA-CIN的另外一个潜在危险是使用了全长的E6和E7癌蛋白作为疫苗抗原。而近年来大量研究数据证明了E6、E7致癌蛋白的结构与功能关系，其致癌活性的分子及细胞机理已被阐述，这两个蛋白作为治疗靶点正是因为他们有转化细胞而导致癌变的活性。其中E6、E7结合寄主DNA及细胞因子的功能区(functionaldomain)仍然保留在TA-CIN疫苗上，作为疫苗对于被免疫对象的潜在风险不能排除。
本发明为提高疫苗的安全性，最大限度避免毒性及副作用对靶点抗原序列进行选择，去除了E6、E7蛋白中有转化活性的片段，而保留了在人体中能体现dominant抗原性的结构片段。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括第一抗原元件、第二抗原元件、以及任选的标签序列和/或信号肽序列，
所述第一抗原元件包含衍生自结核杆菌Psts-1蛋白的多肽；所述第二抗原元件包含衍生自HPV基因编码蛋白的多肽。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二抗原元件选自下组的一种或多种：
抗原元件A，所述抗原元件A为衍生自HPV16L2蛋白的多肽；
抗原元件B，所述抗原元件B为衍生自HPV16E6蛋白的多肽；
抗原元件C，所述抗原元件C为衍生自HPV16E7蛋白的多肽；和
抗原元件D，所述抗原元件D为衍生自HPV18E7蛋白的多肽；
优选地，所述融合蛋白具有式I所式结构：
M-C-A-D-B-T(I)，
其中，
M为所述第一抗原元件；
A、B、C、D分别为所述抗原元件A、所述抗原元件B、所述抗原元件C、所述抗原元件D；
T为任选的标签序列和/或信号肽序列；
“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白；优选地所述多核苷酸为DNA和/或RNA。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达权利要求1所述的融合蛋白；和/或
所述宿主细胞基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸；和/或
所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体。
6.一种制备融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和
分离所述融合蛋白。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含：权利要求1所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述的载体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
8.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包含：权利要求1所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述的载体，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
9.权利要求1所述的融合蛋白的用途，用于制备药剂或试剂，所述药剂或试剂用于：
(1)治疗或预防HPV感染；和/或
(2)治疗或预防HPV感染相关疾病；和/或
(3)诱导针对HPV的免疫反应；和/或
(4)检测血清中抗HPV抗体。
10.一种治疗HPV感染或HPV感染相关疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用权利要求1所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸(DNA、RNA、RNAi、anti-senseRNA)、权利要求7所述的药物组合物或者权利要求8所述的疫苗组合物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Construction method and application of recombinant vaccine with anti cervical cancer cell activity Effective date of registration: 20211020 Granted publication date: 20200602 Pledgee: Jiangsu Suzhou Rural Commercial Bank Co.,Ltd. science and Technology Financial Industrial Park sub branch Pledgor: ATTOGEN BIOMEDICAL (SUZHOU) Inc.,Ltd. Registration number: Y2021320010426 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20200602 Pledgee: Jiangsu Suzhou Rural Commercial Bank Co.,Ltd. science and Technology Financial Industrial Park sub branch Pledgor: ATTOGEN BIOMEDICAL (SUZHOU) Inc.,Ltd. Registration number: Y2021320010426 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Construction method and application of a recombinant vaccine with anti cervical cancer cell activity Granted publication date: 20200602 Pledgee: Suzhou Beiming Intelligent Manufacturing Co.,Ltd. Pledgor: ATTOGEN BIOMEDICAL (SUZHOU) Inc.,Ltd. Registration number: Y2024990000122 |