CN108498792B - 日本血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了日本血吸虫SjZF‑like重组抗原蛋白及其制备方法和用途，具体地，本发明提供的重组抗原蛋白能诱导产生较强的免疫保护力，并且减虫率显著提高，可达54.8％，是潜在的疫苗候选靶标。

Description

日本血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白及其制法和用途

技术领域

本发明涉及生物医药，具体地，涉及日本血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白及其制法和用途。

背景技术

血吸虫病是一种由血吸虫引起的疾病，在全球范围内有大约70个国家和地区，2亿人感染此病，7亿多人面临被感染的危险，每年导致大约28万人死亡。它是仅次于疟疾的第二大破坏性寄生虫病，同时，它也是一种被忽视的热带病(Neglected Tropical Diseases，NTDs)。血吸虫病大部分出现在环境卫生较差的地方，而生活其中的学龄儿童是最易感的人群。

人类感染的血吸虫病大多是由曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)和日本血吸虫(Schistosoma japonicum)引起的。曼氏血吸虫主要分布在非洲及南美洲，埃及血吸虫主要分布在非洲和中东地区，而日本血吸虫主要分布在印度尼西亚、中国及东南亚。

目前中国的血吸虫病流行区域主要分布在湖北、湖南、广东、安徽、广西、四川和云南等地。据统计，2014年，全国血吸虫病发病数为4212，相比2013年5699的发病数下降了26.1％。截至2014年底，全国12个血吸虫病流行省中，5省已达到传播阻断标准，4省已达到传播控制标准，3省尚处于疫情控制阶段。2014年，全国推算血吸虫病病人数为11万，较2013年下降了37.5％，虽然钉螺面积较2013年无显著下降，但没有发现感染性钉螺。通过有效的血吸虫病防控工作，全国血吸虫病疫情近年来整体下降，但是，数据显示我国部分局部地区仍存在较高的血吸虫病传播风险。在中国，日本血吸虫的宿主除了人以外，还有大约40种其他的哺乳动物，血吸虫病不仅威胁人类的健康，同时还能造成巨大的经济损失。

血吸虫有非常复杂的生活史，要经历7个时期，两个宿主。毛蚴进入合适的中间宿主后，经无性生殖发育为母胞蚴和子胞蚴，再释放出尾蚴，当哺乳动物接触到疫水后，尾蚴通过入侵皮肤感染宿主从而导致寄生虫病。血吸虫感染人类后，经过5-7周的发育变为成虫，成虫进行合抱从而产卵。虫卵则通过粪便或尿液排到环境中，或者滞留在宿主体内诱发炎症。排出体外的虫卵释放毛蚴进入水环境，从而完成整个生活史。

血吸虫的成虫能在其终末宿主中存活几年甚至几十年。成虫会寄居在不同位置的肠系膜静脉中，其寄居位置有时则具有种间特异性。例如：日本血吸虫常寄居在小肠的肠系膜上静脉，而曼氏则位于大肠的肠系膜上静脉，但是，他们也能在不同位置间移动。慢性感染病理中，很多都是由于宿主对于虫卵的免疫作用导致的，免疫作用能使虫卵引起的肉芽肿纤维化，进一步导致受感染器官的严重损伤。

血吸虫一旦感染人类后，其发育过程中的各个阶段均会对人体造成不同程度的伤害。尾蚴入侵皮肤后，部分患者会出现尾蚴性皮炎，而虫卵造成的危害最大。成虫在肠系膜静脉排卵之后，很多虫卵随着血液到达肝脏，引发肉芽肿、肝脏纤维化及门静脉高压症。目前普遍认为，血吸虫在宿主体内发育的各个时期，都能够诱导宿主产生多种免疫反应，引起一系列病理变化，进而严重影响宿主健康。

在血吸虫病流行区域，恶劣的环境卫生，有效健康政策及民众对疾病认识的缺失，促使血吸虫病不断扩散。由于缺少有效疫苗，血吸虫病的防控主要依赖一种药，吡喹酮，从1970s年代开始，吡喹酮已在多个地区进行了大规模使用。

吡喹酮具有疗效高、副作用小、口服方便和成本低等特点，即使依靠这种单一用药也已经治疗了大约2.5亿人。但是已经有研究报道在部分地区出现了抗药性，另外，吡喹酮不能有效作用于童虫。因此，新的抗血吸虫病药物的研发迫在眉睫。

传统的血吸虫病诊断方法是直接寄生虫学观察法，包括镜检虫卵和毛蚴孵化。虽然这些方法是检测动物感染血吸虫的金标准，但是劳动强度大、耗时，不适合大规模的流行病学调查。这种技术最主要的缺点是在低流行区域的灵敏度较低，从而导致高的假阴性率。基于PCR技术的分子检测方法是检测尿液、粪便或器官组织中的虫卵DNA。虽然分子检测具有高的灵敏度和特异性，但是需要昂贵的设备。

因此，本领域迫切需要开发一种能够有效预防和/或治疗血吸虫病的疫苗产品，以及可高效检测血吸虫病的检测试剂或试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种能够有效预防和/或治疗血吸虫病的疫苗产品。

本发明的另一目的在于提供了一种可高效检测血吸虫病的检测试剂或试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种SjZF-like重组抗原蛋白的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(i)在被施用的对象中引发针对血吸虫的免疫保护，所述的免疫保护使得所述对象有效抑制或减少血吸虫的数量；和/或(ii)有效减少被施用的对象中血吸虫的数量。

在另一优选例中，所述的“有效抑制或减少”指：与阴性对照(或空白对照)相比，所述的被施用对象中，血吸虫的减虫率为40-70％。

在另一优选例中，所述的“有效抑制或减少”指：与阴性对照(或空白对照)相比，所述的被施用对象中，血吸虫的减虫率为50-60％，较佳地52-60％。

在另一优选例中，所述的减虫率为成虫减虫率。

在另一优选例中，所述的重组抗原蛋白是真核细胞或原核细胞表达的重组蛋白。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物或疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物含有(a)SjZF-like重组抗原蛋白、(b)任选的佐剂；和(c)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的对象包括灵长动物、啮齿动物。

在另一优选例中，所述血吸虫选自下组：日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、或其组合。

在另一优选例中，所述的SjZF-like重组抗原蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列≥98％的同源性(优选地，≥99％的同源性)且保留所述特性的多肽；

(C)将SEQ ID NO:1中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述日本血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白任选的包含选自下组的标签序列：His标签、GST标签、sumo标签、或其组合。

在另一优选例中，所述佐剂选自下组：铝佐剂、MF59、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG佐剂、卡介菌核糖核酸、单磷酰脂A、或其组合。

在另一优选例中，所述疫苗组合物还包括(d)其他杀灭或抑制血吸虫的药物。

在另一优选例中，所述其他杀灭或抑制血吸虫的药物选自下组：吡喹酮、青蒿琥酯、环孢素A、奥沙尼喹、或其组合。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为单价疫苗组合物或多价疫苗组合物。

在另一优选例中，所述疫苗组合物中，组分(i)的含量为0.0001-99wt％，较佳地为0.001-90wt％，更佳地0.01-50wt％，按组合物的总重量计。

在本发明第二方面，提供了一种抗原－抗体复合物，所述的复合物包括：

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的阳性抗原；

(ii)与(i)阳性抗原特异性结合的抗体；

并且所述的抗原和抗体结合在一起。

在另一优选例中，所述复合物由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的阳性抗原及其特异性结合的抗体所构成。

在本发明第三方面，提供了一种本发明第二方面所述的抗原-抗体复合物的用途，所述复合物用于：

(a)制备检测血吸虫的试剂或试剂盒；和/或

(b)用作检测血吸虫的阳性对照。

在另一优选例中，所述的检测是血清学检测。

在本发明第四方面，提供了一种SjZF-like重组抗原蛋白的用途，用于制备检测血吸虫的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述血吸虫选自下组：日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测是血清学检测。

在另一优选例中，所述的试剂或试剂盒用于检测待测样本是否感染血吸虫。

在另一优选例中，所述待测样本来自血吸虫病流行区人群。

在另一优选例中，所述待测样本来自牛或其他哺乳动物。

在本发明第五方面，提供了一种体外杀灭或抑制血吸虫的方法，包括步骤：在存在抗SjZF-like重组抗原蛋白的抗体的情况下，培养血吸虫，从而杀灭或抑制血吸虫。

在另一优选例中，所述的抗SjZF-like重组抗原蛋白的抗体是抗血清。

在另有一优选例中，所述血吸虫选自下组：日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种疫苗组合物，包括：

(i)SjZF-like重组抗原蛋白、(ii)任选的佐剂；和(iii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述日本血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列≥98％的同源性(优选地，≥99％的同源性)且保留所述特性的多肽；

(C)将SEQ ID NO:1中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述日本血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白任选的包含选自下组的标签序列：His标签、GST标签、sumo标签、或其组合。

在另一优选例中，所述佐剂选自下组：铝佐剂、MF59、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG佐剂、卡介菌核糖核酸、单磷酰脂A、或其组合。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。

在另一优选例中，所述疫苗组合物还包括(d)其他杀灭血吸虫的药物。

在另一优选例中，所述其他杀灭血吸虫的药物选自下组：吡喹酮、青蒿琥酯、环孢素A、奥沙尼喹、或其组合。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为单价疫苗组合物或多价疫苗组合物。

在另一优选例中，所述疫苗组合物中，组分(i)的含量为0.0001-99wt％，较佳地为0.001-90wt％，更佳地0.01-50wt％，按组合物的总重量计。

在本发明第七方面，提供了一种预防和/或治疗血吸虫疾病的方法，向所需要的对象施用血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白。

在另一优选例中，所述的需要的对象包括哺乳动物，较佳地，为人、小鼠、大鼠、兔。

在本发明第八方面，提供了一种分离的血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白，所述蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列≥98％的同源性(优选地，≥99％的同源性)且保留所述特性的多肽；

(C)将SEQ ID NO:1中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白任选的包含选自下组的标签序列：His标签、GST标签、sumo标签、或其组合。

在另一优选例中，所述血吸虫包选自下组：日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、或其组合。

在本发明第九方面，提供了一种编码血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第八方面所述重组抗原蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸的序列选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(B)具有与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列≥98％的同源性(优选地，≥99％的同源性)且保留所述特性的衍生多核苷酸；

(C)将SEQ ID NO:2中任一所示核苷酸序列经过1-5个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述特性的衍生多核苷酸。

在本发明第十方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第九方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体为表达载体，包括原核表达载体和真核表达载体，更佳地，所述载体是大肠杆菌。

在本发明第十一方面，提供了一种宿主细胞，所述细胞含有本发明第十方面所述的载体，或者所述宿主细胞的染色体整合有本发明第九方面所述的多核苷酸或者基因组中整合有本发明第九方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母(如毕赤酵母、酿酒酵母、或甲醇酵母)、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌，较佳地为大肠杆菌BL21(DE3)。

在本发明第十二方面，提供了一种产生血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白的表达方法，所述方法包括步骤：

在适合表达所述蛋白的条件下，培养本发明第十一方面所述的宿主细胞，从而表达出所述蛋白；和

分离所述蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例1中日本血吸虫SjZF-like基因序列的扩增结果示意图。M：DNA分子量标准；1：SjZF-like；2：pET-28a(+)-SjZF-like。

图2显示了实施例4中日本血吸虫SjZF-like重组蛋白的SDS-PAGE分析结果。M：蛋白分子量标准；1：诱导后菌体沉淀；2：诱导后菌体；3：未诱导对照。

图3显示了实施例5中日本血吸虫SjZF-like重组蛋白纯化结果的SDS-PAGE。M：蛋白分子量标准；1：上样前；2：穿出液；3-6：洗脱收集液。

图4显示了实施例6种日本血吸虫重组蛋白SjZF-like引起的宿主免疫反应。蓝线：免疫组；红线：佐剂组；黑线：溶剂组。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，通过对大量候选物质的筛选和测试，意外地筛到一种重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白不仅能够在哺乳动物中有效引发特异性地针对血吸虫的免疫应答，并且与绝大多数抗原蛋白引发的免疫应答无法有效杀灭血吸虫相反，该抗原蛋白诱导的免疫应答可非常有效地杀灭或抑制血吸虫，从而提供极其高效和有力的免疫保护作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。

实验表明，当采用日本血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白免疫小鼠时，该重组抗原蛋白能诱导产生较强的免疫保护力，并且减虫率显著提高，可达54.8％，是潜在的疫苗候选靶标。

抗原编码序列

本发明还涉及编码SjZF-like重组抗原蛋白的多核苷酸。典型地，一种编码SjZF-like重组抗原蛋白的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO:1所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

在本发明中，编码本发明蛋白的DNA序列，可以全部人工合成，然后将其拼接在一起，形成编码本发明蛋白的DNA序列。

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。

引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

在获得了编码本发明新蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的蛋白。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)：能在真核细胞如CHO、COS系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是家蚕细胞。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抗原

如本文所用，术语“抗原”、“阳性抗原”可互换使用，都指能够与血吸虫抗体特异结合的蛋白或多肽。

原是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。在本发明中，“抗原”、“阳性抗原”、“日本血吸虫SjZF-like蛋白”“日本血吸虫SjZF-like蛋白抗原”、“SjZF-like重组抗原蛋白”、“日本血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白”具有同等意义。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。“分离的阳性抗原”是指所述抗原基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化阳性抗原。基本上纯的蛋白抗原在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。抗原的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的抗原可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的抗原可以是糖基化的和非糖基化的。本发明的抗原还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括抗原的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然抗原相同的生物学功能或活性的抗原。本发明的抗原片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的抗原，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的抗原，或(iii)抗原与另一个化合物(比如延长抗原半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的抗原，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此抗原序列而形成。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“抗原”还包括具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的抗原的化学衍生形式如乙酰化、羧基化、糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

SjZF-like重组抗原蛋白

在本发明中，所述“SjZF-like重组抗原蛋白”指日本血吸虫特有的一种抗原蛋白，具有如SEQ ID NO.:1所示的序列。所述术语还包括SEQ ID NO：1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括SjZF-like重组抗原蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持有治疗和/或预防血吸虫疾病的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I或式II的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。

表I

发明还提供SjZF-like重组抗原蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO:1所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

药物组合物和疫苗组合物

本发明还提供了预防日本血吸虫的药物组合物，所述的药物组合物可以是治疗性的或预防性的。一种优选的组合物是预防性的疫苗组合物，尤其是含有针对不同SjZF-like重组抗原蛋白基因簇的免疫原的多价疫苗组合物。

这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脱氧核糖核酸)，通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。

增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)ISA720佐剂；(3)福氏佐剂等。

疫苗组合物(包括抗原，药学上可接受的载体和/或佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。此外，包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物可含有在药学上可接受载体中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

一种疫苗方式是DNA疫苗，即含有编码本发明SjZF-like重组抗原蛋白的编码序列的DNA疫苗。

抗原制备方法

本发明抗原的制备方法有以下步骤：

(1).用编码本发明阳性抗原的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化本发明抗原。

本发明中，多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含抗原编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。包含上述适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明抗原蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

抗原蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化抗原蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

试剂盒

本发明还提供了一种检测血吸虫的试剂盒。一般地，本发明的试剂盒包括以下组分：容器或载体；以及位于所述容器内或载体上的本发明所述的阳性抗原或疫苗组合物。在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书。较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。一种优选的可用于检测日本血吸虫的试剂盒包括：容器以及位于容器内的包被液、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG(H+L)抗体、底物液TMB、稀浓硫酸反应终止液和样本稀释液。更佳地，还含有空白对照、阳性和阴性对照和作以监控检测过程是否符合标准。

施用方式

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或乳化液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。

常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服、栓剂和透皮应用等。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。

本发明的主要优点包括：

(1)通过大量筛选，本发明首次发现日本血吸虫的一个特有的SjZF-like重组抗原蛋白，它在体内能诱导产生较强的免疫保护力，是具有重要价值的抗血吸虫候选疫苗。

(2)本发明的SjZF-like重组抗原蛋白免疫保护后的减虫率大幅度降低，可达到54.8％。

(3)本发明的SjZF-like重组抗原蛋白经过优化可以原核表达，大大提高了重组蛋白的生产效率，具有大规模生产的应用前景。

(4)本发明的SjZF-like重组抗原蛋白具有非常高的效价，滴度为1:64000时依旧有极强的免疫反应。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非特别说明，否则本发明实施例中的材料和试剂均为市售产品。

材料和试剂

主要试剂：

主要设备：

试验材料：

含日本血吸虫SjZF-like基因序列的cDNA，大肠杆菌感受态细胞DH5α、BL21(DE3)，质粒pET-28a(+)，均由复旦大学和中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供。

实施例1日本血吸虫SjZF-like基因的克隆

设计引物

(1)根据SjZF-like基因的序列(如SEQ ID NO：2所示)设计引物，分别添加BamH I和Hind III酶切位点(划线部分)，如下：

SjZF-like forward:CGC GGATCC ATGTTAATCAAATTGGTTTTTCCA(如SEQ ID NO：3所示)；

SjZF-like reverse:CCC AAGCTT TCAAAGTAATGTCAACCGATTATTTC(如SEQ ID NO：4所示)

(2)SjZF-like基因的PCR扩增反应扩增程序：

将PCR产物进行凝胶电泳，验证条带大小是否正确，如图1所示，PCR扩增片段大小与SjZF-like基因762bp大小相符，表明成功从cDNA中扩增出SjZF-like基因。再送到上海生工生物有限公司测序。

(3)PCR产物的纯化

经过测序验证正确后，使用AxyPrep PCR纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。

1)向PCR反应液中，加入3个体积的Buffer PCR-A；混匀后，转移到制备管中，制备管置于2ml离心管，12000g离心1min，弃掉滤液。

2)再向制备管中加入700μl Buffer W2，12000g离心1min，弃掉滤液。

3)将制备管置于1.5ml离心管中，向膜中央加25μl去离子水，室温静置1min。12000g离心1min得到DNA。-20℃保存。

实施例2日本血吸虫SjZF-like重组质粒pET-28a(+)-SjZF-like的构建

(1)制备pET-28a(+)质粒

从-80℃冰箱取出实验室保存的pET-28a(+)质粒，转入制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

1)将DH5α感受态从-80℃冰箱中取出，冰浴融化。

2)融化后，取2μl质粒加入感受态细胞中，轻轻震荡混匀，冰浴30min.

3)在42℃水浴中热击90s，并迅速置于冰浴中，冷却10min.

4)将混合液接种到700μl LB培养基中，150rpm，37℃恒温培养2h.

5)培养结束后，取100μl菌液涂布到LB(Amp+/X-gal/IPTG)平板上。

6)37℃恒温培养过夜。

过夜培养后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，220rpm，37℃恒温培养8h后12000g，4℃离心收集菌体。使用AxyPrep质粒抽提试剂盒抽提质粒。-20℃冰箱保存备用。

(2)质粒和目的片段双酶切

将抽提的pET-28a(+)质粒和纯化的PCR片段用BamH I和Hind III限制性内切酶进行双酶切。酶切体系如下，37℃酶切2h。酶切产物进行凝胶电泳，验证酶切效果。

(3)切胶回收

酶切过后的质粒和目的片段进行琼脂糖凝胶电泳，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收目的条带。

1)在紫外灯下切下含有目的条带的凝胶，吸干净凝胶表面的液体，并切碎。测量凝胶质量作为一个凝胶体积。

2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混匀后于75℃加热直到凝胶完全熔化。

3)加入1.5个凝胶体积的Buffer DE-B，混匀

4)将上一步的混合液转移到DNA制备管中，制备管置于2ml离心管，12000g离心1min，弃滤液。

5)再加入500μl Buffer W1，12000g离心30s，弃掉滤液。

6)用700μl Buffer W2洗涤两次，12000g离心30s，弃掉滤液。

7)再次12000g离心1min.

8)将制备管置于1.5ml离心管中，向膜中央加25μl去离子水，室温静置1min。12000g离心1min得到DNA。

(4)质粒和目的片段的连接

按照下表添加各个成分，37℃连接2h。

标准反应(μl)对照反应(μl)

T4DNA连接酶2×Buffer 5 5

酶切后pET-28a(+)载体1 1

酶切后PCR产物X-

T4DNA连接酶1 1

ddH₂O补加至10 10

连接反应中PCR产物的量用如下公式计算：

(载体的量(ng)×插入片段(kb))/(载体大小(kb))×插入片段和载体的摩尔比"＝"插入片段的量(ng)

实施例3日本血吸虫SjZF-like表达载体的验证

将实施例2连接后的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。在培养平板上挑取几个白色阳性单克隆进行菌落PCR验证，以菌落为模板，观察是否出现目的大小的基因条带。经PCR鉴定显示在对应分子量大小处出现目的条带，表明质粒重组成功。

用通用引物T7F和T7-term扩增重组质粒pET-28a(+)-SjZF-like，经测序鉴定表明，与日本血吸虫SjZF-like基因序列一致。

实施例4日本血吸虫SjZF-like重组质粒在大肠杆菌中的表达

重组质粒构建成功后，选择大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株，并按照实施例3的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中。

(1)随机挑取单菌落接种于5ml LB(卡纳)培养基中，220rpm，37℃恒温培养过夜。

(2)从5ml菌液中取1ml置于4℃保存，再添加1ml LB(卡纳)培养基，220rpm，37℃恒温培养至OD600达到0.6-0.8左右，再进行诱导。

(3)诱导组取2ml加入适当浓度的IPTG进行诱导，另2ml作为空白对照，两管都置于37℃恒温培养4h。

(4)取经过诱导的1m1菌液，2000g，4℃离心1min，弃掉上清，取沉淀用1ml裂解液重悬菌体，之后超声破碎，200W，开3S，关10S，超声20次。

(5)超声结束后，将菌液12000g，4℃，离心10min，分离上清和沉淀，沉淀用1ml裂解液重悬。

(6)将诱导组的全菌液、上清及沉淀，未诱导组的蛋白样品进行SDS-PAGE分析。

如图2所示，在BL21(DE3)中表达后，于分子量30kDa处，诱导后菌体出现明显条带，此处即为日本血吸虫SjZF-like重组蛋白(SEQ ID NO.:1)，大小与预期相符。根据此结果筛选表达量较高的克隆，25％甘油冻存于-80℃冰箱中。

实施例5日本血吸虫SjZF-like重组蛋白的纯化

将保存的菌液按照5％的比例接种到50ml的LB培养基中作为种子液，然后再以5％的比例接种于1L LB(卡纳)培养基中，220rpm，37℃恒温培养至OD值为0.6-0.8左右，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，继续培养，4h后离心收集菌体。将收集到的菌体沉淀用裂解液复溶，然后超声破菌，离心后收集上清。

首先使用Buffer D平衡预装的镍柱5个CV，流速为1ml/min，然后取5ml重组蛋白溶液上样，收集流穿液。再用漂洗液漂洗5个CV，除去柱子中未结合蛋白。最后依次用洗脱液I、II和III洗脱目的蛋白，用紫外探测仪检测洗脱溶液A280吸光值，当A280出峰时，收集蛋白组分，用洗脱液洗脱直到吸光值开始下降并趋于稳定，再依次更换洗脱液。分别对发酵液上清、流穿液、洗脱蛋白I、洗脱蛋白II和洗脱蛋白III进行SDS-PAGE。

洗脱完成后，继续用洗脱液III漂洗5个CV，再用ddH₂O清洗5个CV，最后将柱子保存在20％的乙醇中。

SDS-PAGE电泳分析结果如图3所示，在用镍柱纯化后，镍柱结合重组蛋白的效率较高，纯化后重组蛋白的纯度较高，根据ImageJ软件分析，纯度达到95％以上。

实施例6日本血吸虫SjZF-like重组蛋白的免疫保护性试验

(1)分组及免疫方案

4-6周C57BL/6雌性小鼠，分为A蛋白免疫组(10只)，B佐剂对照组(10只)和C溶剂对照组(10只)三组。小鼠分别于0、2、4周背部或腹部皮下分为3点免疫。

具体免疫方案如下：

首先佐剂与蛋白混合后冰浴超声，至乳化剂滴加于水面成油滴状不散开

A重组蛋白免疫组(10只)：

第一次免疫(0d)：重组蛋白(25μg in 50μl 8M urea)+50μl弗氏完全佐剂

第二次免疫(14d)：重组蛋白(25μg in 50μl 8M urea)+50μl弗氏不完全佐剂

第三次免疫(28d)：重组蛋白(25μg in 50μl 8M urea)+50μl PBS

B佐剂对照组(10只)：

第一次免疫(0d)：50μl 8M urea+50μl弗氏完全佐剂

第二次免疫(14d)：50μl 8M urea+50μl弗氏不完全佐剂

第三次免疫(28d)：50μl 8M urea+50μl PBS

C溶剂对照组(10只)：

第一次免疫(0d)：100μl 8M urea

第二次免疫(14d)：100μl 8M urea

第三次免疫(28d)：100μl 8M urea

(2)采血

第一次：免疫前(-0d)

第二次：14d

第三次：28d

第四次：42d感染后小鼠摘眼球取血

采血方法：使用切割小鼠尾静脉的方法进行采血，手术之前将小鼠放置于一个仅上端开口的盒子中，在开口处使用100W的灯泡进行照射2min左右，待小鼠血管扩张(表现出烦躁不安的现象)时，将小鼠取出来，使用解剖刀轻轻切割尾静脉取血，采集血液60-100μl即可。

血样处理：血样放置室温下静置大约2h左后后，使用3000g转速离心10min，收集上面的血清，保存于-20℃备用。

(3)感染

在第三次免疫一周或两周后，对免疫后的小鼠进行尾蚴感染攻击，尾蚴感染量为每只小鼠40(±2)只。

(4)成虫、计数

尾蚴感染攻击42天后，剖杀小鼠进行日本血吸虫的收集。

计算方法：

减虫率(％)＝[1-(蛋白免疫组平均每只小鼠获取成虫数目/佐剂对照组平均每只小鼠获取成虫数)]×100％

试验结果表明，见表1，重组蛋白SjZF-like免疫保护后减虫率达到54.8％，说明其能诱导产生较强的免疫保护力，推测SjZF-like对日本血吸虫的与有较大影响，是具有重要价值的抗血吸虫候选疫苗。

表1

(5)间接ELISA法评价SjZF-like重组蛋白引起的宿主免疫反应

首先确定重组蛋白的宝贝浓度，将重组蛋白进行梯度稀释，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，5，10μg/ml。样本设置三组，分别是：混合阳性(有确定免疫效果的血清，8-10份)，混合阴性(免疫组对应的对照组血清，8-10份)及PBST组。其中，最佳包被浓度为0.5μg/ml。

之后，按照最佳包被浓度包被蛋白，4℃过夜孵育。第二天加入PBST洗涤三次，再加入7％山羊血清，4℃封闭过夜。第三天结合一抗和二抗，最后加入TMB进行显色。

重组蛋白SjZF-like所引起的宿主免疫反应如图4所示，在第一次免疫后宿主即产生抗体，在三次免疫之后宿主抗体保持高水平，一致持续到感染后42天。这说明宿主能产生较强的免疫保护力，是具有重要价值的抗血吸虫候选疫苗。

此外，发明人用正常鼠血清和免疫后的鼠血清进行了滴度评价，并且对血清进行稀释，如果以免疫鼠血清测定的OD₄₅₀值：正常鼠血清测定的OD₄₅₀值大于2为界，那么免疫后鼠血清的滴度超过了1:64000，说明重组SjZF-like具有很好的免疫原性(表2)。

表2

对比例

用本发明的方法，对另几个蛋白(SjRhoD、SjAR、SjOAR)进行了免疫保护实验。SjRhoD该基因在雌虫基本不表达，而在雄虫发育过程中特异性上调表达。RhoD蛋白作为信号通路重要的开关分子，在所有的真核细胞中发挥着重要生理功能。具有保守的GTPase结构域、GTP/GDP结合域和效应物结合域。在所有真核细胞中，Rho蛋白控制肌动蛋白细胞骨架的重组，还可通过参与调控细胞的凋亡活动来实现对细胞生存的影响。醛糖还原酶(AR)在转录水平上雄虫的表达水平显著高于雌虫。OAR蛋白主要参与饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的合成途径，脂肪酸是磷脂和鞘脂的组成成分，而磷脂和鞘脂又是组成细胞膜以及细胞器膜的主要成分，因此脂肪酸对于维持细胞的完整性至关重要。蛋白SjZF-like、SjRhoD、SjAR、SjOAR的具体信息如表3所示。

表3

结果表明，

(1)经SjRhoD免疫后，相比于佐剂组，减虫率达到30.4％，但是并没有统计学意义(P>0.5)。而经重组蛋白SjZF-like免疫保护后，灌注冲虫数相比佐剂组有显著下降，减虫率达到54.8％，这表明SjZF-like具有更好的免疫保护效果，而SjRhoD蛋白没有免疫保护效果。

(2)经重组SjAR蛋白免疫后，相比于佐剂组，减虫率达到32.9％，远远低于SjZF-like的效果。

(3)3-氧化酰基-酰基载体蛋白还原酶(OAR)重组蛋白免疫后，相比佐剂组，减虫率没有统计学意义(P>0.5)，减虫率为13％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

复旦大学

<120> 日本血吸虫SjZF-like重组抗原蛋白及其制法和用途

<130> P2016-1005

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 253

<212> PRT

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 1

Met Leu Ile Lys Leu Val Phe Pro Ser Leu Arg Ser Asn Thr Asn Gln

1 5 10 15

Glu Val Cys Arg Ile His Tyr Arg Arg Ser Ser Lys Ser Leu Asn Met

20 25 30

Asn Trp Ile Ala Lys Ala Ile Phe Gln Ile Thr Asn Leu Lys Arg Asp

35 40 45

Thr Leu Phe Ser Leu Tyr Tyr Tyr Asp Asn Lys Lys Phe Ile Pro Ile

50 55 60

Thr Thr Lys Ser Cys Phe Glu Asn Met Ile Lys Met Phe Ile Asn Asn

65 70 75 80

Gly Gln Ile Cys Arg Ile Tyr Ala Ile Pro His Leu Tyr Ser Asp Ser

85 90 95

Lys Pro Met Asn Ser Phe Phe Ser Tyr Cys Arg Ala Asp Glu Leu Pro

100 105 110

Asn Ile Leu Leu Gln Ser Pro Thr Ile Val Gln Lys Ser Ile Asn Asp

115 120 125

Thr Trp Leu Gln Ile Ser Cys Lys Leu Cys Glu Lys Ser Asn Trp Ser

130 135 140

Gly Glu Arg Tyr Thr Cys Leu Phe Cys Ser Asn Ile Val Leu Cys Lys

145 150 155 160

Glu Cys Phe Asn Thr Gly Tyr His Asn Glu His Pro Ile Leu Cys Thr

165 170 175

Arg Asn Thr Lys Leu Phe Ser Gln Lys Leu Leu Gln Phe Ser Arg Leu

180 185 190

Ala Val Ala Thr Val Pro Trp Lys Asn Val Leu Pro Lys Val Asn Lys

195 200 205

Asp Leu Arg Ile Asp Glu Gln Ile His Gln Ala Ile Thr Ala Ser Ile

210 215 220

Asn Met Ile Gln Asp Glu Ala Lys Asp Tyr Thr Ile Gln Glu Asp Asn

225 230 235 240

Ile Asn Asn Lys Lys Arg Asn Asn Arg Leu Thr Leu Leu

245 250

<210> 2

<211> 762

<212> DNA

<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400> 2

atgttaatca aattggtttt tccatcgtta agatcaaata ctaatcaaga agtttgtcgt 60

attcattatc gtcgatcatc taagtcactc aatatgaatt ggatcgctaa agctattttt 120

caaattacta atttaaaacg ggatacacta tttagtcttt attattatga taataaaaaa 180

ttcataccaa ttacaacaaa atcatgtttt gaaaatatga taaaaatgtt tatcaataat 240

ggtcaaatct gtcgaatcta tgctattcca catctatatt ctgattcaaa accaatgaat 300

tcatttttta gttattgtcg agctgatgaa ttaccaaata tcttattaca atcacctaca 360

attgtacaga aatcaattaa tgatacatgg ttacaaatat catgtaaatt atgtgaaaaa 420

tctaattggt caggtgaacg atatacatgt ttattttgtt caaatattgt tttatgcaaa 480

gaatgtttta atacaggtta tcataatgaa catcctattc tatgcacacg taatacaaag 540

ttattttcac aaaaactatt acaattttca cgtttagctg tagcaactgt accatggaag 600

aatgttttac cgaaagttaa taaagattta agaattgatg aacaaattca tcaagcaatt 660

actgcatcta tcaatatgat acaagatgaa gcaaaagatt atacaattca agaggataat 720

ataaataata agaaaagaaa taatcggttg acattacttt ga 762

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatcca tgttaatcaa attggttttt cca 33

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagcttt caaagtaatg tcaaccgatt atttc 35

Claims (13)

1.一种SjZF-like重组抗原蛋白的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于有效减少被施用的对象中血吸虫的数量，所述的SjZF-like重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物为药物组合物或疫苗组合物。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的疫苗组合物含有(a)SjZF-like重组抗原蛋白、(b)佐剂；和(c)药学上可接受的载体。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的疫苗组合物含有(a)SjZF-like重组抗原蛋白；和(c)药学上可接受的载体。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述血吸虫选自下组：日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、或其组合。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述疫苗组合物还包括（d）其他杀灭或抑制血吸虫的药物。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述其他杀灭或抑制血吸虫的药物选自下组：吡喹酮、青蒿琥酯、环孢素A、奥沙尼喹、或其组合。

8.一种抗原－抗体复合物，其特征在于，所述的复合物包括：

(i) 氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的阳性抗原；

(ii) 与(i)阳性抗原特异性结合的抗体；

并且所述的抗原和抗体结合在一起。

9.一种权利要求8所述的抗原-抗体复合物的用途，其特征在于，所述复合物用于：

(a) 制备检测血吸虫的试剂或试剂盒。

10.一种SjZF-like重组抗原蛋白的用途，其特征在于，用于制备检测血吸虫的试剂或试剂盒，所述的SjZF-like重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

11.一种体外杀灭或抑制血吸虫的方法，其特征在于，包括步骤：在存在抗SjZF-like重组抗原蛋白的抗体的情况下，培养血吸虫，从而杀灭或抑制血吸虫，所述的SjZF-like重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

12.一种疫苗组合物，其特征在于，包括：

(i)SjZF-like重组抗原蛋白、(ii)佐剂；和(iii)药学上可接受的载体，所述的SjZF-like重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

13.如权利要求12所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括（d）其他杀灭血吸虫的药物。

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