KR20000052831A - 헬리코박터 필로리에 관한 핵산 및 아미노산 서열 및 그의 백신조성물 - Google Patents

헬리코박터 필로리에 관한 핵산 및 아미노산 서열 및 그의 백신조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20000052831A
KR20000052831A KR1019990703660A KR19997003660A KR20000052831A KR 20000052831 A KR20000052831 A KR 20000052831A KR 1019990703660 A KR1019990703660 A KR 1019990703660A KR 19997003660 A KR19997003660 A KR 19997003660A KR 20000052831 A KR20000052831 A KR 20000052831A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
helicobacter
polypeptide
seq
nucleic acid
fragment
Prior art date
Application number
KR1019990703660A
Other languages
English (en)
Inventor
더글라스 스미스
리차드 에이. 알름
Original Assignee
클래스 빌헬름슨
아스트라 악티에볼라그
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 클래스 빌헬름슨, 아스트라 악티에볼라그 filed Critical 클래스 빌헬름슨
Publication of KR20000052831A publication Critical patent/KR20000052831A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 재조합 또는 실질적으로 순수한 제조 방법에 관한 것이다. 헬리코박터 필로리 폴리펩티드는 진단 및 백신 조성물에 유용하다.

Description

헬리코박터 필로리에 관한 핵산 및 아미노산 서열 및 그의 백신 조성물{Nucleic Acid and Amino Acid Sequences Relating to Helicobacter pylori and Vaccine Compositions thereof}
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 인간 위장 생검 표본으로부터 발견되어 배양된 S형 미호기성 그람 음성 세균이다 (Warren, J.R. and B. Marshall, (1983) Lancet 1:1273-1275: 및 Marshall et al., (1984) Microbios Lett. 25:83-88). 헬리코박터 필로리는 만성 위염 및 십이지장 궤양에 밀접하게 관련된다 (Rathbone et al., (1986) Gut:635-641). 또한, 비궤양성 소화불량, 위궤양 및 위 선암에 대한 헬리코박터 필로리의 병인학적 기능에 대한 증거가 증가하고 있다(Blaser M.J., (1993) Trends Microbiol. 1:255-260). 세균은 경구 경로를 통하여 전염되고, 감염 위험은 나이들어 감에 따라 증가한다 (Taylor, D.N. and M.J. Blaser, (1991) Epidemiol. Rev 13:42-50). 헬리코박터 필로리는 인간 위점막에 콜로니를 형성하여 일반적으로 수십년 동안 존속하는 감염을 확립한다. 헬리코박터 필로리의 감염은 전세계적으로 만연되어 있다. 선진국의 20세 이상의 성인 감염율은 50%를 초과하고, 개발도상국의 성인 감염율은 90% 이상이다 (Hopkins R.J. and J.G. Morris (1994) Am. J. Med. 97:265-277).
위장 환경에서의 콜로니 형성 및 세균의 병독성에 필요한 세균 인자에 대한 이해는 빈약하다. 병독성 인자로 추정되는 예는 위산 pH를 중화시키는 기능을 수행할 수 있는 우레아제(Eaton et al., (1991) Infect. Immunol. 59:2470-2475; Ferrero, R.L. and A. Lee (1991) Microb. Ecol. Hlth. Dis. 4:121-134; Labigne et al., (1991) J. Bacteriol. 173:1920-1931); 점액층을 통과하는 운동성을 부여하는 세균 플라겔라 단백질 (Hazell et al., (1986) J. Inf. Dis 153:658-663; Leying et al., (1992) Mol. Microbiol. 6:2863-2874; 및 Haas et al. (1993) Mol. Microbiol. 8:753-760); 상피세포에서 세포내 액포 형성을 유도하는 세균 독소 Vac A (Schmitt, W. and R. Haas, (1994) Molecular Microbiol. 12(2):307-319); 및 수종의 위 조직 특이적 유착물 (Boren et al., (1993) Science 262:1892-1895; Evans et al., (1993) J. Bacteriol. 175:674-683; 및 Falk et al., 91993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2035-203)을 포함한다.
시험관내 헬리코박터 필로리 감염을 근절하는 많은 치료제가 현재 시판되고 있다 (Huesca et al., 91993) Zbl. Bakt. 280:244-252; Hopkins, R.J. and J. G. Morris 상기 문헌). 그러나, 많은 상기 치료제는 세균 내성, 변형된 약물 분포, 환자의 비순응성 또는 빈약한 약물 허용성 때문에 최적 수준으로 효과적인 것은 아니다 (Hopkins, R.J. and J.G. Morris, 상기 문헌). 비스무트와 조합하여 항생제를 처리하는 것은 헬리코박터 필로리 감염 치료에 사용되는 표준 요법의 일부이다 (Malfertheiner, P. and J.E. Dominguez-Munoz (1993) Clinical Therapeutics 15 Supp. B:37-48). 최근에, 양성자 펌프 억제제와 단일 항생제의 조합물이 십이지장 궤양을 개선시키는 것으로 밝혀졌다 (Malfertheiner, P. and J.E. Dominguez-Munoz 상기 문헌). 그러나, 항생제를 사용하는 방법은 이들 항생제에 내성인 세균 균주의 출현이라는 문제를 가질 수 있다 (Hopkins, R.J. and J.G. Morris, 상기 문헌). 이러한 제한은 헬리코박터 필로리의 체내 감염을 제거하는 효과적인 신규 방법이 필요함을 입증한다. 특히, 상기 세균에 의한 감염을 억제할 수 있는 새로운 백신의 고안이 매우 바람직하다.
발명의 요약
본 발명은 신규 유전자, 예를 들어 헬리코박터 필로리(에이치. 필로리)로부터의 세균 표면 단백질과 같은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 다른 관련 유전자, 이들의 생산물 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 및 펩티드는 헬리코박터 필로리 및 다른 헬리코박터 종의 진단 및 치료제로서 유용성을 갖는다. 또한, 이들은 시료 내의 헬리코박터 필로리 및 다른 헬리코박터 종의 존재의 검출, 및 헬리코박터 필로리 라이프 싸이클을 방해하거나 헬리코박터 필로리 감염을 억제하는 능력을 갖는 화합물의 스크리닝에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 표면 또는 분비 단백질 또는 그의 일부를 포함하여 헬리코박터 필로리 단백질의 전체 코딩 서열에 대응하는 핵산의 조성물, 헬리코박터 필로리 단백질의 mRNA에 결합하여 단백질 해독을 차단할 수 있는 핵산, 및 펩티드 합성 및 재조합 DNA 기술을 사용하여 헬리코박터 필로리 단백질 또는 그의 일부를 생성시키는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 헬리코박터 필로리 감염 검출의 프로브로서 유용한 항체 및 핵산을 특징으로 한다. 또한, 헬리코박터 필로리 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물 및 방법도 본 발명의 범위에 포함된다.
도 1은 특정 헬리코박터 필로리 항원으로 면역처리한 후 마우스 혈청의 항체 역가를 도시한 막대 그래프이다.
도 2는 특정 헬리코박터 필로리 항원으로 면역처리한 후 마우스 점액의 항체 역가를 도시한 막대 그래프이다.
도 3은 HEPES 완충액 중에 용해된 특정 항원을 사용한 헬리코박터 필로리 감염 마우스의 치료적 면역처리를 도시한 막대 그래프이다.
도 4는 DOC를 함유하는 완충액 중에 용해된 특정 항원을 사용한 헬리코박터 필로리 감염 마우스의 치료적 면역처리를 도시한 막대 그래프이다.
도 5는 5종의 헬리코박터 필로리 단백질 서열의 일부의 아미노산 서열을 도시한 것이다(1문자 아미노산 코드로 도시함; 좌측이 N 말단이고 우측이 C 말단임).
도 6은 4종의 헬리코박터 필로리 단백질 서열의 일부의 아미노산 서열을 도시한 것이다(1문자 아미노산 코드로 도시함; 좌측이 N 말단이고 우측이 C 말단임).
도 7은 2종의 헬리코박터 필로리 단백질 서열의 일부의 아미노산 서열을 도시한 것이다(1문자 아미노산 코드로 도시함; 좌측이 N 말단이고 우측이 C 말단임).
도 8은 2종의 헬리코박터 필로리 단백질 서열의 일부의 아미노산 서열을 도시한 것이다(1문자 아미노산 코드로 도시함; 좌측이 N 말단이고 우측이 C 말단임).
한 특징에서, 본 발명은 서열 74의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 재조합 또는 실질적으로 순수한 제조법을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 서열 74의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 1에 포함된 서열을 포함한다. 본 발명의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 서열은 서열 목록에 기재되고, 본 발명의 헬리코박터 필로리를 코딩하는 핵산은 서열 목록에 기재된다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 75의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 76의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 77의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 78의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 79의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 80의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 81의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 82의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 83의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 84의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 85의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 86의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 87의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 88의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 89의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 90의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 91의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 92의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 93의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 94의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 95의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 22의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 96의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 23의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 97의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 98의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 99의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 100의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 27의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 101의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 102의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 103의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 104의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 31의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 105의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 106의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 33의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 107의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 108의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 35의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 109의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 36의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 110의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 37의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 111의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 38의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 112의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 39의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 113의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 40의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 114의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 41의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 115의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 42의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 116의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 43의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 117의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 118의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 45의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 119의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 46의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 120의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 47의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 121의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 48의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 122의 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 49의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 123 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 50의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 124 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 51의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 125 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 52의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 126 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 53의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 127 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 54의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 128 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 55의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 129 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 56의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 130 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 57 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 131 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 58 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 132 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 59 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 133 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 60 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 134 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 61 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 135 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 62 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 136 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 63 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 137 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 64 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 138 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 65 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 139 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 66 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 140 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 67 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 141 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 68 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 142 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 69 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 143 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 70 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 144 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 71 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 145 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 72 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
또다른 특징에서, 본 발명은 서열 146 아미노산 서열을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들어 서열 73 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다.
헬리코박터 필로리 엔벨로프(envelope) 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열이 특히 바람직하다. 이러한 핵산은 서열 3, 25, 48, 16, 10, 45, 35, 37, 7, 39, 55, 18, 19, 28, 30, 52, 54, 56, 58, 1, 42, 14, 43, 11, 71, 17, 57, 5, 6, 8 및 21로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
다른 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편은 서열 3, 25 및 48로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 헬리코박터 필로리 내막 폴리펩티드 또는 그의 단편이다.
다른 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편은 서열 16, 10, 45, 35, 37, 7, 39, 55, 18, 19, 28, 30, 52, 54, 56, 58, 1, 42, 14, 43, 11 및 71로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 헬리코박터 필로리 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이다.
다른 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편은 서열 1, 42, 14, 43, 11 및 71로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 말단 페닐알라닌 잔기 및 C 말단 티로신 클러스터를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편이다.
다른 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편은 서열 16, 45, 35, 37, 7, 39, 55, 18, 19, 28, 30, 52, 54, 56 및 58로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 말단 페닐알라닌 잔기를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편이다.
헬리코박터 필로리 분비 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열이 특히 바람직하다. 이러한 핵산은 서열 72, 32, 51, 2, 4, 9, 13, 22, 29, 31, 33, 34, 36, 38, 40, 41, 44, 46, 49, 53, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67 및 68로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
헬리코박터 필로리 세포 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열이 특히 바람직하다. 이러한 핵산은 서열 12, 15, 20, 23, 24, 26, 27, 47, 50, 60, 64, 69, 70 및 73으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
서열 76, 98, 121, 89, 83, 118, 108, 110, 80, 112, 128, 91, 92, 101, 103, 125, 127, 129, 131, 74, 115, 87, 116, 84, 144, 90, 130, 78, 79, 81 및 94로 이루어지는 군 중에서 선택되는 정제 또는 단리된 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편이 특히 바람직하다.
다른 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편은 서열 76, 98 및 121로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 내막 폴리펩티드 또는 그의 단편이다.
다른 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편은 서열 89, 83, 118, 108, 110, 80, 112, 128, 91, 92, 101, 103, 125, 127, 129, 131, 74, 115, 87, 116, 84, 144, 90 및 130으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이다.
다른 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편은 서열 74, 115, 87, 116, 84 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 말단 페닐알라닌 잔기 및 C 말단 티로신 클러스터를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편이다.
다른 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편은 서열 89, 118, 108, 110, 80, 112, 128, 91, 92, 101, 103, 125, 127, 129 및 131로 이루어지는 군 중에서 선택되는 말단 페닐알라닌 잔기를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편이다.
서열 145, 105, 124, 75, 77, 82, 86, 95, 102, 104, 106, 107, 109, 111, 113, 114, 117, 119, 122, 126, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140 및 141로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 정제 또는 단리된 헬리코박터 필로리 분비 폴리펩티드 또는 그의 단편이 특히 바람직하다.
서열 85, 88, 93, 96, 97, 99, 100, 120, 123, 133, 137, 142, 143 및 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 정제 또는 단리된 헬리코박터 필로리 세포 폴리펩티드 또는 그의 단편이 특히 바람직하다.
다른 특징에서, 본 발명은 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 상기 동정된 군의 각각의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 구성원 또는 상기 구성원을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
다른 특징에서, 본 발명은 헬리코박터 필로리의 mRNA에 결합할 수 있는 핵산을 특징으로 한다. 이러한 핵산은 헬리코박터 필로리의 mRNA의 해독을 조절하는 안티센스 핵산으로서 작용할 수 있다. 추가로, 본 발명은 헬리코박터 필로리 핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 특징으로 한다. 이들 핵산은 또한 본원에서 상보체로서 언급되고, 프로브 및 포착(capture) 시약으로서의 유용성을 갖는다.
또다른 면에서, 본 발명은 헬리코박터 필로리 핵산에 대응하는 개방 해독 프레임을 포함하는 발현 시스템을 특징을 한다. 핵산은 추가로 목적 숙주에 상용성인 조절 서열을 포함한다. 발현 시스템은 헬리코박터 필로리 핵산에 대응하는 폴리펩티드의 제조에 유동하다.
다른 면에서, 본 발명은 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현 시스템으로 형질전환된 세포를 특징으로 한다.
또다른 면에서, 본 발명은 헬리코박터 필로리 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드에 대해 작용하는 항체를 생성시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 항체는 헬리코박터 필로리 특이적 항원의 양 및 분포를 평가하는 면역분석법을 위한 시약으로서 유용성을 갖는다.
다른 면에서, 본 발명은 헬리코박터 필로리에 대해 개체를 면역처리하기 위한 백신을 생성시키는 방법을 특징으로 한다. 백신 처리 방법은 본 발명에 따른 1종 이상의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드, 예를 들어 표면 또는 분비 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편 및 제약상 허용되는 담체를 사용한 개체의 면역처리를 포함한다. 상기 백신은 치료 및(또는) 예방적 유용성을 갖는다.
다른 면에서, 본 발명은 변성 면역원성 헬리코박터 필로리 폴리펩티드, 예를 들어 표면 또는 분비 폴리펩티드 또는 그의 활성 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신을 생성시키는 방법을 제공한다.
다른 면에서, 본 발명은 화합물, 예를 들어 폴리펩티드, 예를 들어 숙주 세포 폴리펩티드 단편의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드에 결합하는 능력을 평가하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 후보 화합물을 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 접촉시키는 단계 및 화합물이 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 결합하거나 상호작용하는지를 측정하는 단계를 포함한다. 헬리코박터 필로리에 결합하는 화합물은 세균 라이프 싸이클의 활성제 또는 억제제로서 기능하는 후보 물질이다. 상기 분석은 시험관내 또는 체내에서 수행할 수 있다.
다른 면에서, 본 발명은 화합물, 예를 들어 폴리펩티드, 예를 들어 숙주 세포 폴리펩티드 단편의 헬리코박터 필로리 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 결합하는 능력을 평가하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 후보 화합물을 헬리코박터 필로리 핵산과 접촉시키는 단계 및 화합물이 헬리코박터 필로리 핵산과 결합하거나 상호작용하는지를 측정하는 단계를 포함한다. 헬리코박터 필로리에 결합하는 화합물은 세균 라이프 싸이클의 활성제 또는 억제제로서 기능하는 후보 물질이다. 상기 분석은 시험관내 또는 체내에서 수행할 수 있다.
본 발명은 헬리코박터 필로리 폴리펩티드, 바람직하게는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 실질적으로 순수한 제조물, 또는 재조합 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 특징으로 한다. 바람직한 실시형태에서, 폴리펩티드는 생물학적 활성을 갖고, 폴리펩티드는 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일하거나 상동성인 아미노산 서열을 갖고, 바람직하게는 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산 서열과 약 65%, 가장 바람직하게는 약 92% 내지 약 99%의 서열 상동성을 갖고, 폴리펩티드는 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 폴리펩티드의 길이는 5, 10, 20, 50, 100 또는 150개의 아미노산 잔기이고, 폴리펩티드는 5, 바람직하게는 10, 보다 바람직하게는 20, 가장 바람직하게는 50, 100 또는 150개의 인접하는 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산 잔기를 포함한다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 서열 목록에 기재된 헬리코박터 필로리 아미노산 서열과 서열 동일성이 약 7% 내지 약 8% 상이한 아미노산 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 폴리펩티드는 서열 목록에 기재된 본 발명의 핵산 또는 서열 목록에 기재된 본 발명의 핵산과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩된다.
바람직한 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 폴리펩티드는 서열 목록에 기재된 본 발명의 서열과 1, 2, 3, 5, 10 이상의 잔기에서 아미노산 서열이 상이하다. 그러나, 이러한 차이는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드가 헬리코박터 필로리의 생물학적 활성을 보이는, 예를 들어 헬리코박터 필로리 폴리펩티드가 천연 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유할 정도인 것이다.
바람직한 실시형태에서, 폴리펩티드는 추가의 아미노산 잔기, 바람직하게는 서열 목록에 기재된 본 발명의 서열을 코딩하는 게놈 DNA의 5' 또는 3'에 존재하는 게놈 DNA에 의해 코딩되는 잔기에 인 프레임(in frame)으로 융합된, 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산 서열의 전부 또는 단편을 포함한다.
또다른 바람직한 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 폴리펩티드는 제1 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 부분 및 제2 폴리펩티드 부분, 예를 들어 헬리코박터 필로리와 무관한 아미노산 서열을 갖는 제2 폴리펩티드 부분을 갖는 재조합 융합 단백질이다. 제2 폴리펩티드 부분은 예를 들어 글루타티온-S-트랜스퍼라제, DNA 결합 도메인 또는 폴리머라제 활성화 도메인일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 융합 단백질은 2-하이브리드 분석에 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 대체(alternative) 전사, 대체 RNA 스플라이싱 및 대체 해독 및 후해독 사건의 결과로서 발생한 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명은 면역원성 제조물 내의 1종 이상의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 성분, 헬리코박터 필로리 폴리펩티드에 특이적인 면역 반응, 예를 들어 체액 반응, 항체 반응 또는 세포 반응을 유도할 수 있는 면역원성 성분을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 면역원성 성분은 서열 목록에 기재된 본 발명의 폴리펩티드로부터의 1종 이상의 항원 결정기를 포함한다.
또다른 면에서, 본 발명은 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 실질적으로 순수한 핵산을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 코딩된 폴리펩티드는 생물학적 활성을 갖고, 코딩되는 폴리펩티드는 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖고, 코딩되는 폴리펩티드는 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 코딩되는 폴리펩티드의 길이는 5, 10, 20, 50, 100 또는 150개의 아미노산 잔기이고, 코딩되는 폴리펩티드는 5, 바람직하게는 10, 보다 바람직하게는 20, 가장 바람직하게는 50, 100 또는 150개의 인접하는 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 서열 목록에 기재된 것이고, 핵산은 서열 목록에 기재된 본 발명의 핵산과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 코딩되는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드는 서열 목록에 기재된 본 발명의 서열과 (예를 들어 1 이상의 아미노산 잔기의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에 의해) 1, 2, 3, 5, 10 이상의 잔기에서 아미노산 서열이 상이하다. 그러나, 이러한 차이는 코딩되는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드가 헬리코박터 필로리의 생물학적 활성을 보이는, 예를 들어 코딩되는 헬리코박터 필로리 효소가 천연 헬리코박터 필로리의 생물학적 활성을 보유할 정도에 불과한 것이다.
바람직한 실시형태에서, 코딩되는 폴리펩티드는 추가의 아미노산 잔기, 바람직하게는 서열 목록에 기재된 본 발명의 서열을 코딩하는 게놈 DNA의 5' 또는 3'에 존재하는 게놈 DNA에 의해 코딩되는 잔기에 인 프레임으로 융합된, 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산 서열의 전부 또는 단편을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 헬리코박터 필로리 핵산은 예를 들어 헬리코박터 필로리 유전자 서열을 재조합 숙주 세포에서의 발현에 적합하게 만들기 위해 헬리코박터 필로리 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 서열, 예를 들어 1종 이상의 전사 프로모터 또는 전사 인핸서 서열을 포함할 것이다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 목록에 기재된 본 발명의 8개, 보다 바람직하게는 12개, 보다 더 바람직하게는 20개, 보다 더 바람직하게는 40개 이상의 연속 뉴클레오티드에 대응하는 핵산 프로브에 혼성화한다.
바람직한 실시형태에서, 핵산은 서열 목록에 기재된 본 발명의 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 펩티드를 코딩한다.
바람직한 실시형태에서, 핵산은 서열 목록에 기재된 본 발명의 아미노산을 코딩하는, 서열 목록에 기재된 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 하나 이상의 뉴클레오티드가 상이하다.
다른 면에서, 본 발명은 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 상기 설명한 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질감염된 숙주 세포, 및 예를 들어 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계 및 예를 들어 세포로부터 또는 세포 배양 배지로부터 헬리코박터 필로리 또는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 변이체를 단리하는 단계를 포함하는 재조합 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 변이체를 생성시키는 방법을 포함한다.
다른 면에서, 본 발명은 서열 목록에 기재된 본 발명의 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 상동성을 갖는 정제된 재조합 핵산을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브 또는 프라이머를 제공한다. 올리고뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 목록에 기재된 본 발명의 8개 이상의 연속 뉴클레오티드의 센스 또는 안티센스 서열, 또는 그의 천연 변이체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 프로브 또는 프라이머는 추가로 자체에 부착된 표지기를 포함한다. 표지기는 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 및(또는) 효소 코팩터일 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 8 이상 10, 20, 30, 50, 100 또는 150 뉴클레오티드 미만의 길이이다.
또한, 본 발명은 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 목록에 기재된 핵산에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되는 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA를 제공한다. 이 핵산은 이중 가닥 핵산 및 코딩 및 안티센스 단일 가닥 핵산을 포함한다.
게노 서열이 결정된 헬리코박터 필로리 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC # 55679; 미국 02154 메릴랜드주 왈담 비버 스트리트 100 소재의 Genome Therapeutics Corporation에 의해 기탁됨)에 균주 HP-J99로서 기탁하였다.
본 발명에는 대립유전자 변이체, 자연 돌연변이체, 유도 돌연변이체, 고엄격성 또는 저엄격성의 조건 하에서 서열 목록에 기재된 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질 (고엄격성 또는 저엄격성에 대해서는 본원에 참고로 포함된 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1-6.3.6 and 6.4.1-6.4.10 참조), 및 헬리코박터 필로리 폴리펩티드에 대한 항혈청에 의해, 특히 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 활성 또는 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 본 발명은 단편, 바람직하게는 생물학상 활성 단편을 포함한다. 이들 및 다른 폴리펩티드도 헬리코박터 필로리 폴리펩티드유사체 또는 변이체로 언급된다.
본 발명의 수종의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 추정되는 기능을 조사하여 표 1에 나타내었다.
따라서, 상기 확인된 기능을 토대로 한 본 발명의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 용도 및 본원에서 기술된 다른 기능도 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명은 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 단백질, 헬리코박터 필로리 분비 단백질 및 헬리코박터 필로리 세포 단백질을 포함하여 하기 표 1에 나타낸 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 포함한다.
표 1에서, "nt"는 뉴클레오티드 서열 번호를 의미하고, "aa"는 아미노산 서열 번호를 의미한다.
정의
"정제 또는 단리된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 실질적으로 순수한 제제"는 본 명세서에서 바꿔어 사용가능하고, 본 명세서에 사용된 바와 같이 천연에서 함께 발생하는 다른 단백질, 지질 및 핵산으로부터 분리한 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 이 폴리펩티드를 그의 정제를 위해 사용되는 항체와 같은 물질 또는 폴리아크릴아미드와 같은 겔 매트릭스로부터도 분리시킨다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 정제 제제의 최소한 10, 20, 50, 70, 80 또는 95% 건조 중량을 이룬다. 바람직하게는, 이 제제는 단백질 서열을 결정하기에 충분한 폴리펩티드, 폴리펩티드 1, 10 또는 100 ㎍이상, 폴리펩티드 1, 10 또는 100 ㎎이상을 함유한다. 또한, 용어 정제 또는 단리된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 실질적으로 순수한 제제는 자연으로부터 수득된 폴리펩티드 또는 본원에서 설명되는 재조합 DNA 기술로부터 수득되는 폴리펩티드를 모두 의미한다.
예를 들어," 단리 또는 정제된 단백질 또는 그의 생물학상 활성 부분"은 세포 물질 또는 헬리코박터 필로리 단백질이 유래하는 세포 또는 조직 공급원으로부터 유래한 다른 오염 단백질을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 화학 합성시에 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질을 실질적으로 함유하지 않는다. 용어 "실질적으로 세포 물질이 없는"은 단백질이 단리되거나 재조합 방법에 의해 생성되는 세포의 세포 성분으로부터 단백질이 분리된 헬리코박터 필로리 단백질의 제제를 포함한다. 한 실시형태에서, 용어 "실질적으로 세포 물질이 없는"은 약 30% 미만, 보다 바람직하게는 약 20% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 비 헬리코박터 필로리 단백질(오염 단백질로도 칭함)을 갖는 헬리코박터 필로리 단백질 제제를 포함한다. 헬리코박터 필로리 단백질 또는 그의 생물학상 활성 부분이 재조합 방법에 의해 생성되는 경우, 배양 배지가 실질적으로 존재하지 않는다. 즉, 매양 배지는 단백질 제제의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만 존재한다.
용어 "실질적으로 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없는"은 단백질의 합성에 수반되는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 단백질이 분리되는 헬리코박터 필로리 단백질의 제제를 포함한다. 한 실시형태에서, "실질적으로 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없는"은 약 30% 미만(건조 중량 기준), 보다 바람직하게는 약 20% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 화학적 전구체 또는 비 헬리코박터 필로리 화학물질을 갖는 헬리코박터 필로리 단백질 제제를 포함한다.
세포의 정제 제제란 식물 또는 동물 세포의 경우 세포의 시험관내 제제를 의미하나, 완전한 무손상의 원래 식물 또는 동물을 의미하는 것은 아니다. 배양 세포 또는 미생물 세포의 경우, 정제 제제는 대상 세포가 10% 이상 및 보다 바람직하게는 50 % 이상인 제제로 구성된다.
정제 또는 단리된, 또는 실질적으로 순수한 핵산, 예를 들면 실질적으로 순수한 DNA (본 명세서에서 바꿔 사용될 수 있는 용어임)는 상기 핵산이 유래된 유기체의 천연 게놈 중에서 상기 핵산과 함께 바로 연속하는 양쪽의 코딩 서열(즉, 5' 말단에 존재하는 서열 및 3' 말단에 존재하는 서열)와 바로 연속되지 않는 핵산; 또는 상기 핵산이 유래된 유기체에서 상기 핵산과 함께 발생하는 핵산이 실질적으로 없는 핵산이다. 예를 들면 이 용어에는 벡터, 예를 들면 자가 복제 플라스미드 또는 비루스 내로, 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA 내로 도입되거나, 또는 다른 DNA 서열과 독립된 별도의 분자 (예를 들면, PCR 또는 제한 엔도뉴클라제 처리로 생산된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)으로서 존재하는 재조합 DNA가 포함된다. 실질적으로 순수한 DNA에는 또한 추가의 헬리코박터 필로리 DNA 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자에 속하는 재조합 DNA도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 "콘티그 (contig)"란 유기체의 게놈 서열의 연속하는 확장부를 나타내는 핵산이다.
본 명세서에서 ORF로도 언급되는 "오픈 리딩 프레임"이란 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 한 영역이다. 이 영역은 코딩 서열의 일부 또한 총 서열을 나타낼 수 있으며 정지 코돈으로부터 정지 코돈까지, 또는 개시 코돈으로부터 정지 코돈까지로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "코딩 서열"이란 적절한 조절 서열의 제어 하에 메신저 RNA로 전사 및(또는) 폴리펩티드로 해독되는 핵산이다. 코딩 서열의 경계는 5' 말단에서의 해독 개시 코돈 및 3' 말단에서의 해독 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열로는 메신저 RNA, 합성 DNA 및 재조합 핵산 서열 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 핵산의 "상보체"란 원래 서열과 와트슨-크릭 염기 대합에 참여하는 반대 방향 대응 (anti-parallel) 또는 안티센스 서열을 의미한다.
"유전자 생성물"이란 유전자에 의해 특이적으로 코딩되는 단백질 또는 구조 RNA이다.
본 명세서에서 사용된 "프로브"란 용어는 해당 분자에 특이적으로 결합하는 핵산, 펩티드 또는 다른 화학 물질을 의미한다. 프로브는 종종 표지와 연합하거나 또는 연합되어 있다. 표지는 검출가능한 화학적 잔기이다. 통상의 표지로는 염료, 방사성동위원소, 형광단 및 화학형광단, 발형광단, 효소, 침전제, 증폭 서열 등이 있다. 마찬가지로, 해당 분자에 특이적으로 결합하고 이러한 분자를 고정시키는 핵산, 펩티드 또는 다른 화학 물질을 본 명세서에서는 "포착 리간드"로 칭한다. 포착 리간드는 통상 니트로-셀룰로스, 유리, 나일론막, 비이드, 입자 등과 같은 지지체와 연합되어 있거나 또는 연합가능하다. 혼성화의 특이성은 뉴클레오티드의 염기쌍 조성, 및 반응 온도 및 염 농도와 같은 조건에 좌우된다. 이러한 조건은 통상의 실헙법을 사용하여 당업자라면 용이하게 식별할 수 있을 것이다.
상동성이란 두 개의 폴리펩티드 사이의, 또는 두 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 의미한다. 두 개의 비교 서열 모두의 특정 위치를 동일한 염기 또는 아미노산 모노머 서브유닛이 차지하고 있는 경우, 예를 들어 만약 2개의 DNA 분자 각각의 특정 위치를 아데닌이 차지하고 있다면 이 분자들은 그 위치에서 상동성인 것이다. 두 서열 사이의 상동성 %는 두 서열이 공유하고 있는 일치 또는 상동 위치의 수를 비교 위치 수로 나누어 100을 곱한 함수이다. 예를 들면, 두 서열의 위치 10개 중 6개가 일치하거나 상동성이면, 두 서열은 60% 상동성이다. 예를 들면, DNA서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 두 서열이 최대 상동성을 제공하도록 정렬된 때에 비교를 한다.
핵산은 그의 1개 이상의 가닥이 소정의 엄격도 조건 하에서 다른 핵산에 어닐링할 수 있는 경우 서로 혼성화할 수 있다. 혼성화의 엄격도는 (a) 혼성화 및(또는) 세정을 실시하는 온도, 및 (b) 혼성화 및 세정액의 이온 강도 및 극성에 의해 결정된다. 혼성화는 두 핵산이 상보 서열을 함유할 것과, 그렇지만 혼성화의 엄격도에 따라 불일치가 허용될 수 있을 것을 필요 조건으로 한다. 전형적으로, 고 엄격도 (예를 들면 0.5X SSC 용액, 65 ℃)에서의 두 서열의 혼성화는 이 서열들이 근본적으로 완전히 상동성일 것을 요구한다. 중간 엄격도의 조건(예를 들면, 2X SSC, 65 ℃) 및 저엄격도의 조건(예를 들면, 2X SSC, 55 ℃)은 혼성화 서열들 사이의 상응하게 더 적은 전체 상보성을 요구한다. (1X SSC는 0.15 M NaCl, 0.015 M Na 시트레이트임). 엄격한 혼성화 존건의 바람직한 비제한적인 예는 약 65 ℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 중에서 수행한 후, 50-65 ℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 주에서 1회 이상 세척하는 것이다.
펩티드, 단백질 및 폴리펩티드란 용어는 본 명세서에서 바꿔 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "표면 단백질"이란 용어는 표면 접근이 가능한 모든 단백질, 예를 들면 내막 및 외막 단백질, 세포벽에 부착하는 단백질 및 분비 단백질을 의미한다.
폴리펩티드가 하기의 특성 중 하나, 둘 및 바람직하게 2개 이상을 갖는다면 그 폴리펩티드는 헬리코박터 필로리의 생물학적 활성을 갖는다: (1) 그 폴리펩티드가 헬리코박터 필로리 감염 중에 발현될 때, 헬리코박터 필로리가 세포에 부착하는 것을 촉진, 또는 매개할 수 있음; (2) 그 폴리펩티드가 헬리코박터 필로리 단백질의 효소 활성, 구조 또는 조절 기능 특성을 가짐; (3) 그 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 헬리코박터 필로리 유전자에 있어 치사 변이로부터 보호할 수 있음; 또는 (4) 대상에게 면역원 특성을 가짐. 특정 폴리펩티드가 상기 기재된 특성 중 하나를 갖는 폴리펩티드의 길항제, 아고니스트 또는 슈퍼-아고니스트라면 그 폴리펩티드는 생물학적 활성을 갖는 것이다.
생물학적으로 활성인 단편 또는 유사체는 서열 목록에 기재된 본 발명의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드, 또는 다른 천연 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 특성인 생체내 또는 시험관내 활성, 예를 들면 본 명세서에 기재된 생물학적 활성을 1개 이상 갖는 것이다. 생체내에 존재하는 단편, 예를 들면 후전사 과정에서 야기되거나 또는 대체 슬플라이싱된 RNA의 해독으로부터 야기되는 단편이 특히 바람직하다. 단편으로는 천연 또는 내인성 세포에서 발현된 단편 뿐만아니라 발현계, 예를 들면 CHO 세포에서 만들어진 단편도 포함된다. 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 같은 펩티드가 생리학적 특성의 한 범위를 종종 나타내고, 이러한 특성이 분자 중의 상이한 부분들로 기인하기 때문에 유용한 헬리코박터 필로리 단편 또는 헬리코박터 필로리 유사체는 헬리코박터 필로리 활성에 대한 임의 생물학적 분석에서 생물학적 활성을 나타내는 것이다. 가장 바람직하게는, 이 단편 또는 유사체는 체내 또는 시험관내 분석 어느 것에서든 헬리코박터 필로리 활성의 10%, 바람직하게는 40%, 보다 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상을 갖는다.
유사체는 아미노산 서열이, 또는 서열과 관련이 없는 방식으로, 또는 둘 다에 의해 천연 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 다를 수 있다. 비-서열 변형은 아세틸화, 메틸화, 포스포릴화, 카르복실화 또는 글리코실화에 의한 변형을 포함한다. 바람직한 유사체로는 1개 이상의 보존 아미노산 치환에 의해, 또는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 없애지 않는 1개 이상의 비보전 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 야생형 서열과 서열이 상이한 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 (또는 그의 생물학적으로 활성인 단편)이 포함된다. 보존 치환에는 통상 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 한 아미노산을 치환하는 것, 예를 들면, 하기 군들 내의 치환이 포함된다: 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소루신, 루신; 아스팔트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 하기 표에 비추어 다른 보존 치환도 가능하다.
보존 아미노산 치환체
아미노산 코드 대체가능한 아미노산
알라닌 A D-Ala, Gly, β-Ala, L-cys, D-Cys
아르기닌 R D-Arg, Lys, D-Lys, 호모-Arg, D-호모-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn
아스파라긴 N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
아스파르트산 D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
시스테인 C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
글루타민 Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
글루탐산 E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn D-Asn, Gln, D-Gln
글리신 G Ala, D-Ala, Pro, β-Ala, Acp
이소루신 I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
루신 L D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
리신 K D-Lys, Arg, D-Arg, 호모-Arg, D-호모-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
메티오닌 M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
페닐알라닌 F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, 트랜스-3,4 또는 5-페닐프롤린, 시스-3,4 또는 5-페닐프롤린
프롤린 P D-Pro, L-I-티아졸리딘-4-카르복시산, D- 또는 L-1-옥사졸리딘-4-카르복시산
세린 S D-Ser, Thr, D-Thr, 알로-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys
트레오닌 T D-Thr, Ser, D-Ser, 알로-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
티로신 Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
발린 V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
본 발명 내의 다른 유사체는 펩티드 안정성을 증가시키도록 변형된 것들이다. 이러한 유사체는 예를 들면 펩티드 서열 내에 1개 이상의 비-펩티드 결합 (펩티드 결합을 대체)을 함유할 수 있다. 또한 천연 L-아미노산 이외의 잔기, 예를 들면 D-아미노산 또는 비천연 또는 합성 아미노산, 예를 들면 β 또는 γ 아미노산을 포함하는 유사체 및 환형 유사체도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 "단편"이란 용어는 헬리코박터 필로리 유사체에 해당되는 바와 같이, 길이가 보통 약 20개 이상의 잔기, 보다 전형적으로 약 40개 이상의 잔기, 바람직하게는 약 60개 이상의 잔기일 것이다. 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 단편은 당업자에게 공지된 방법을 제조할 수 있다. 후보 단편의, 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 생물학적 활성을 나타내는 능력을 본 명세서에 기재된 바의 당업자에게 공지된 방법으로 평가할 수 있다. 또한 이 펩티드의 생물학적 활성에 필요하지 않거나 또는 대체 mRNA 스플라이싱 또는 대체 단배질 프로세싱 작업으로부터 야기되는 잔기를 함유하는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 "면역원 성분"이란 호르몬계 및(또는) 세포 면역 응답을 숙주 동물 내에서 유발할 수 있는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드, 그의 유사체 또는 단편과 같은 성분이다.
본 명세서에서 사용된 "항원 성분"이란 검출가능한 항원-항체 복합체를 형성하기에 충분하게 높은 친화도를 갖는 특이적 항원에 결합할 수 있는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드, 그의 유사체 또는 단편과 같은 성분이다.
본 명세서에 사용된 "트랜스진 (transgene)"이란 용어는 일부 또는 전부가 그 유전자가 도입되는 형질전환 동물 또는 세포에 대해 이종성, 즉 외인성이거나, 또는 그 유전자가 도입되는 형질전환 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 상동성이지만, 그 유전자가 삽입되는 세포의 게놈을 변형시키는 방식으로 세포 게놈내로 삽입되도록 설계되거나(예를 들면 천연 유전자와 상이한 위치에 삽입되거나 또는 삽입이 낙아웃(knockout)을 야기), 또는 삽입되는 핵산(예를 들면, 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩함)을 의미한다. 트랜스진으로는 1종 이상의 전사 조절 서열 및 분비 핵산의 최적 발현에 필수적이고, 모두 선택된 핵산에 작동가능하게 결합되며, 인핸서 서열을 포함할 수 있는 임의 다른 핵산, 예를 들면 인트론을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "형질전환 세포"란 용어는 트랜스진을 함유하는 세포를 말한다.
본 명세서에서 사용된 "형질전환 동물"은 동물의 세포 중 1개 이상, 및 바람직하게는 본질적으로 모든 세포가 트랜스진을 포함하는 임의 동물이다. 트랜스진을 세포 전구체로의 도입에 의해, 적당한 세포의 형질전환 과정 또는 미량 주사법과 같은 계획적인 유전자 조작에 의해, 또는 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 직간접적으로 세포에 도입시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "항체"란 용어는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드과 특이적으로 반응성이 있는 그의 단편을 포함하는 것이다.
본 명세서에 사용된 "세포-특이성 프로모터"란 용어는 프로모터로서 작용하는, 즉 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택된 DNA 서열의 발현을 조절하고, 조직의 특정 세포에서 선택된 DNA 서열의 발현을 수행하는 DNA 서열을 의미한다. 이 용어는 또한 "리키(leaky)" 프로모터를 포함하며, 이 프로모터는 한 조직에서는 선택된 DNA의 발현을 주로 규제하지만, 또 다른 조직에서는 발현을 야기한다.
본 명세서에서 사용된 착오 발현(misexpression)은 유전자 발현의 비야생형 패턴을 말한다. 착오발현에는 비야생형 수준의 발현, 즉 과도한 또는 불충분한 발현; 유전자가 발현되는 시간 또는 단계의 면에서 야생형과 상이한 발현 패턴, 예를 들면 예정된 발생 기간 또는 단계에서 (야생형에 비하여) 증대 또는 감소된 발현; 예정된 세포형 또는 조직형에서 (야생형에 비하여) 발현이 감소된다는 면에서 야생형과 상이한 발현 패턴; 스플라이싱 크기, 아미노산 서열, 해독후 변형, 또는 발현된 폴리펩티드의 생물학적 활성의 면에서 야생형과 상이한 발현 패턴; 유전자 발현에 대한 환경 자극 또는 세포질외 자극의 효과 면에서 야생형과 다른 발현 패턴, 예를 들면 자극 강도의 증가 또는 감소 하에 (야생형에 비하여) 증대 또는 감소된 발현 패턴이 포함된다.
본 명세서에 사용된 "숙주 세포" 및 미생물 또는 무성체로서 배양된 고등 진핵세포계를 나타내는 기타의 용어는 재조합 벡터 또는 다른 트랜스퍼 DNA의 수용체가 될 수 있거나 수용체로서 사용되어온 세포를 의미하며, 트랜스펙트되어 있는 모세포의 자손도 포함된다. 당업자라면 단일 모세포의 자손이 우연한 또는 계획된 변이 때문에 원래의 부모로부터의 게놈 또는 전체 DNA에 완전히 동일해야할 필요는 없음을 알 것이다.
본 명세서에서 사용된 "조절 서열"이란 용어는 숙주 유기체에 의해 인식되어 코딩 서열의 발현을 수행하는 염기 서열을 갖는 핵산을 의미하며, 조절 서열은 코딩 서열에 리게이션된다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이한데; 원핵세포의 경우 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 종결인자, 및 몇몇 경우에 오퍼레이터를 포함하고; 진핵세포의 경우는 일반적으로 이러한 조절 서열이 프로모터, 종결인자 및 몇몇 경우에 인핸서를 포함한다. 조절 서열이란 용어는 발현을 위해 필수적으로 존재해야하는 최소의 모든 성분을 포함하는 것으로 쓰이며, 존재하면 불이익한 부가의 성분, 예를 들면 리더 서열을 포함할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "작동가능하게 연결된"이란 용어는 원하는 방식으로 기능하도록 연결 또는 리게이션된 서열들을 의미한다. 예를 들면, 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 숙주 세포와 양립가능한 조건하에서 성취되는 그러한 방식으로 리게이션에 의해 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 명세서에서 사용된 대사란 물질의 발현, 기능, 작용 또는 조절의 모든 측면을 의미한다. 한 물질의 대사란 변형, 예를 들면 그 물질의 공유 또는 비공유 변형을 포함한다. 한 물질의 대사는 그 물질이 다른 물질에서 유도하는 공유 또는 비공유 변형을 포함한다. 한 물질의 대사는 그 물질의 분포를 변경시키는 것을 포함한다. 한 물질의 대사는 다른 물질의 분포에 있어 그 물질이 유발하는 변화를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "시료"란 예를 들면 개체, 또는 시험관내 세포 배양 성분으로부터 단리된 조직, 또는 유체와 같은 생물학적 시료(혈장, 혈청, 뇌척수액, 림프, 눈물, 타액, 및 조직 박편을 포함) 뿐만아니라 환경으로부터 시료를 의미한다.
본 발명의 실시는 달리 언급되지 않는한 종래의 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 기술을 사용할 것이며, 이들 기술은 당업계의 기술 내이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 하기 문헌 참조 [Sambrook, Fritsch, 및 Maniatis, Molecular Cloning; Laboratory Manual 2nd ed. (1989); DNA Cloning, I 및 II권 (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); 시리즈, Methods in Enzymoloqy (Academic Press, Inc.), 특히 154권 및 155권 (Wu 및 Grossman, eds.) 및 PCR-A Practical Approach (McPherson, Quirke, 및 Taylor, eds., 1991)].
I. 헬리코박터 필로리의 핵산 단리 및 그의 용도
헬리코박터 필로리 게놈 서열
본 발명은 헬리코박터 필로리의 게놈의 뉴클레오티드 서열을 제공하며, 따라서 이는 헬리코박터 필로리 게놈 DNA의 DNA 서열 라이브러리를 포함한다. 하기의 상세한 설명은 헬리코박터 필로리의 뉴클레오티드 서열들을 제공하며, 또한 서열을 얻는 방법 및 ORF 및 단백질-코딩 서열을 확인하는 방법을 기재하고 있다. 또한, 기재된 헬리코박터 필로리 서열들을 진단 및 치료 용도를 비롯한 방법에 사용하는 방법도 기재되어 있다. 또한, 이 라이브러리를 헬리코박터 필로리 균주 및 다른 균주에서 의학상 중요한 서열의 확인 및 비교를 위한 데이터베이스로 사용될 수 있다.
헬리코박터 필로리의 게놈 서열을 결정하기 위하여, 헬리코박터 필로리 (ATCC# 55679) 균주로부터 DNA를 단리시켜 분무화에 의해 2 kb의 중간 크기로 기계적으로 전단시켰다. 겔 전기 영동에 의해 크기 분획시킨후, 단편을 블런트(blunt) 말단으로 만들고, 어댑터 올리고뉴클레오티드에 리게이션시키고, 20종의 상이한 pMPX 벡터의 각각에 클로닝시켜 (Rice et al., Meeting of Genome Mapping and Sequencing의 초록, Cold Spring Harbor, NY, 5/11-5/15, 1994, 225 페이지) 일련의 "샷건" 서브클론 라이브러리를 제조했다.
근본적으로 처치(Church et al.)의 하기 문헌에 기재된 다양한 서열 결정법을 사용하여 DNA 서열 결정을 하였다. 문헌[Church et al., 1988, Science 240:185; 미국 특허 제4,942,124호 및 제5,149,625호]. 풀(pool)을 만든 배양물로부터 DNA를 추출하여 화학적 또는 효소적 서열 결정법을 실시했다. 서열 결정 반응은 전기영동에 의해 분석했고, 생성물을 이동시켜 나일론 막에 공유 결합시켰다. 마지막으로, 이 막을 상이한 샷건 클로닝 벡터에 존재하는 "태그(tag)" 서열에 대해 상보성인 일련의 표지된 올리고뉴클레오티드와 혼성화시켰다. 이 방식으로, 한 세트의 서열 결정 반응으로부터 다수의 서열들을 얻을 수 있었다. 클로닝 및 서열 결정 절차는 실시예에 보다 상세히 기재되어 있다.
이 방식으로 얻어진 개개의 서열 판독 결과를 FALCON(상표명) (Church et al., 1994, Automated DNA Sequencing 및 Analysis, J.C. Venter, ed., Academic Press) 및 PHRAP (P. Green, Abstracts of DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop V. Jan. 1966, 157페이지)를 사용하여 조립하였다. 평균 콘티그 길이는 약 3 내지 4 kb였다.
다양한 접근법을 사용하여 전체 헬리코박터 필로리 게놈을 대표하는 연속 서열이 얻어지도록 콘티그를 배열하였다. 합성 올리고뉴클레오티드가 각각의 콘티그 단부의 서열에 대해 상보성이 되도록 설계했다. 이 올리고뉴클레오티드를 예를 들면 람다 파지 벡터 또는 플라스미드 벡터 중의 헬리코박터 필로리 게놈 DNA의 라이브러리에 혼성화시켜 개별 콘티그들 사이의 접합 영역에 상응하는 서열들을 함유하는 클론을 확인할 수 있다. 이어서, 이러한 클론을 사용하여 주형 DNA를 단리하고 상기 올리고뉴클레오티드를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에서 프라이머로 사용하여 접합 단편들을 증폭시키고, 이어서 이의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.
이 헬리코박터 필로리 서열을 180개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 존재 여부에 대해 분석하였다. 정지 코돈 대 정지 코돈 판독에 기초한 ORF 분석의 결과로서, ORF가 천연 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 ORF와 상응하지 않을 수 있음은 자명하다. ORF는 천연 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 단백질 합성의 개시를 의미하는 개시 코돈을 함유할 수 있다. 본 명세서에 제공되어 있는 ORF 내의 이러한 개시 코돈은 관련 업계의 통상의 지식을 가진자라면 확인할 수 있을 것이고, 생성되는 ORF 및 코딩된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드는 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들면, ORF 내에 단백질 합성의 개시 시그널의 일부인 AUG 또는 GUG (메티오닌 또는 발린을 코딩함)와 같은 코돈을 확인할 수 있고, ORF를 천연 헬리코박터 필로리 폴리펩티드에 상응하도록 변형시킬 수 있다. 예상 코딩 영역은 프로그램 GENEMARK(상표명) (Borodovsky 및 McIninch, 1993, Comp. Chem. 17:123)으로 이 서열의 코딩 가능성을 평가함으로써 정의했다.
다른 헬리코박터 필로리 핵산
본 발명의 핵산은 상기 언급된 헬리코박터 필로리 균주의 DNA로부터 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 직접 얻을 수 있다. PCR의 자세한 사항은 문헌 ["PCR, A Practical Approach" (McPherson, Quirke 및 Taylor, eds., IRL Press, Oxford, UK, 1991] 참조. 발현 전에 신뢰할만한 DNA 카피를 확고히 하기 위하여 고신뢰도 PCR를 사용할 수 있다. 또, 증폭된 생성물의 확실성을 통상의 서열 결정 방법에 의해 검토할 수 있다. 본 발명에 기재된 원하는 서열을 담지한 클론도 또한 PCR에 의해 라이브러리를 스크리닝하거나 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 라이브러리 콜로니의 당업계에 공지된 필터 리프트 또는 플라크에 혼성화시켜 얻을 수 있다. 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd edtion, 1989, Cold Spring Harbor Press, NY] 참조.
본 명세서에 기재된 프로토콜에 따라 cDNA로부터 헬리코박터 필로리를 코딩하는 핵산을 얻는 것도 가능하다. 헬리코박터 필로리를 코딩하는 cDNA는 적당한 균주로부터 전체 mRNA를 단리함으로써 얻을 수 있다. 그다음, 이중 가닥 cDNA를 전체 mRNA로부터 제조할 수 있다. 이어서, cDNA를 적당한 플라스미드 또는 바이러스 (예를 들면, 박테리오파지) 벡터에 무수한 공지 기술 중 하나를 사용하여 삽입할 수 있다. 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 본 발명에 제공된 뉴클레오티드 서열 정보에 따라, 확립된 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 클로닝시킬 수 있다. 본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 발명의 바람직한 핵산은 서열 목록에 기재되어 있다.
본 발명의 핵산은 또한 표준 기술을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 폴리데옥시뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 다양한 방법이 공지되어 있으며, 이 방법으로는 펩티드 합성과 마찬가지로 시판되는 DNA 합성기로 완전 자동화된 고체상 합성이 있다. 예를 들면, 문헌[Itakura et al., 미국 특허 제4,598,049호; Caruthers et al., 미국 특허 제4,458,066호; 및 Itakura 미국 특허 제4,401,769호 및 제4,373,071호, 본 명세서에 참고로 인용됨] 참조.
본 발명의 특징에 따라 단리 또는 합성된 핵산은 한정하는 것이 아니라, 일례로 프로브, 프라이머, 포착 리간드, 안티센스 유전자로서, 및 이러한 서열에 상응하는 단백질 및 펩티드의 합성을 위한 발현계 개발에 유용하다. 프로브, 프라이머, 포착 라긴드 및 안티센스제로서는, 핵산이 서열 목록에 기재된 본 발명의 핵산들의 전부 또는 일부 (특이성 및 안정한 혼성화 생성물을 형성하는 능력에 대한 약 20 개 이상의 뉴클레오티드)로 구성되는 것이 보통이다. 이러한 용도는 하기에 보다 자세히 기재되어 있다.
프로브
서열 목록에 기재된 본 발명의 서열에 따라 단리 또는 합성된 핵산을 프로브로서 사용하여 헬리코박터 필로리를 특이적으로 검출할 수 있다. 본원에 기재된 서열 정보에 있어서는, 헬리코박터 필로리에 대한 원하는 포괄성 및 배타성을 제공하는 20개 이상의 뉴클레오티드 서열이 확인되어 있으며, 혼성화 조건 중에 외래 핵산을 우연히 만날 가능성이 있다. 보다 바람직하게는, 이 서열은 프로브와 원하는 표적 분자 사이에 형성된 혼성화 생성물에 대한 안정성을 전달하도록 최소한 20개 내지 30개 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
길이가 1000개 뉴클레오티드 보다 긴 서열은 합성하기 어렵지만, 재조합 DNA 기술에 의해서는 제조할 수 있다. 당업자들은 혼성화 생성물의 검출을 용이하게 하기 위하여 프로브로서 유용한 핵산에 표지을 구비할 수 있음을 쉽게 알 것이다.
서열 목록에 기재된 본 발명의 서열에 따른 단리 및 합성된 핵산은 또한 본 명세서에 기재된 적당한 엄격도 혼성화 조건을 사용하여 다른 헬리코박터 종의 상동 영역 (특히 상동 유전자)을 검출하기 위한 프로브로서 유용하다.
포착 리간드
포착 리간드로 사용하는 경우, 프로브에 대해 상기 기재된 방식으로 선택된 핵산을 지지체와 용이하게 연합시킬 수 있다. 핵산을 지지체와 연합시키는 방법은 공지되어 있다. 서열 목록에 기재된 본 발명의 서열 중 20개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 핵산은 서로 및 다른 유기체의 핵산으로부터의 헬리코박터 필로리 핵산을 분리시키는데 유용하다. 서열 목록에 기재된 본 발명의 서열 중 20개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 핵산은 또한 각기 다른 헬리코박터 종을, 또는 각기 다른 유기체로부터의 다른 헬리코박터 종을 분리시키는데 유용하다. 바람직하게는, 이 서열은 프로브와 원하는 표적 분자 사이에 형성된 혼성화 생성물에 안정성을 전달하도록 최소한 20개 뉴클레오티드를 포함한다. 길이가 1000개 뉴클레오티드보다 긴 서열은 합성하기 어렵지만 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다.
프라이머
본 명세서에 기재된 서열에 따라 단리 또는 합성된 핵산은 헬리코박터 필로리 핵산의 증폭을 위한 프라이머로서 유용하다. 이 핵산은 또한 다른 헬리코박터 종에 있어 핵산의 증폭을 위한 프라이머로서도 유용하다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술에 있어, 서열 목록에 기재된 본 발명의 10 내지 15개 이상의 뉴클레오티드의 핵산 서열은 적당한 효소 및 시약과 함께 헬리코박터 필로리 핵산의 카피를 제조하는데 유용하다. 보다 바람직하게는, 이 서열은 프라이머와 원하는 표적 분자 사이에 형성된 혼성화 생성물에 안정성을 전달하도록 최소한 20개 뉴클레오티드를 포함한다. 100개 뉴클레오티드 보다 많은 프라이머의 결합 조건은 특이성을 갖도록 제어하기가 보다 어렵다. 고신뢰도 PCR을 사용하여 발현전에 신뢰할만한 DNA 카피를 확고히 할 수 있다. 게다가, 증폭된 생성물을 종래의 서열 결정 방법에 의해 검토할 수 있다.
이 카피는 헬리코박터 필로리 및(또는) 다른 헬리코박터종으로부터의 유전자를 비롯하여 특이 서열을 검출하는 진단 분석에 사용될 수 있다. 이 카피는 본 명세서에 더 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 클로닝 및 발현 벡터에 도입하여 PCR에 의해 합성된 핵산에 상응하는 폴리펩티드를 생성할 수도 있다.
안티센스
본 명세서에 기재된 서열에 따라 단리 또는 합성된 핵산 또는 핵산-혼성화 유도체는 안티센스 인자로서 헬리코박터 필로리 유전자의 발현을 방지하는데 유용하다. 이 서열은 안티센스 인자로서 다른 헬리코박터 종의 유전자 발현을 방지하는데도 유용하다.
일례로, 핵산 또는 헬리코박터 필로리 핵산에 상응하는 유도체를 리포솜과 같은 적당한 담체 또는 세균 세포 내로의 도입을 위한 박테리오파지에 적재시킨다. 예를 들면, 20개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 핵산은 세균 핵산 또는 세균 메신저 RNA에 결합할 수 있다. 안티센스 핵산이 비천연 핵산 및 세균 핵산 및(또는) 세균 메신저 RNA의 혼성화 생성물의 필수 안정성을 제공하기 위해서는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 길이가 1000개 뉴클레오티드 보다 긴 서열을 갖는 핵산은 합성하기 어렵지만 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 리포솜에 안티센스 핵산을 적재하는 방법은 예들 들면 파파하조파울로스 (Papahadjopoulos et al.) 등의 1980년 12월 23일에 허여된 미국 특허 제4,241,046호에서와 같이 당업계에 공지되어 있다.
II. 헬리코박터 필로리 핵산의 발현
본 명세서에 기재된 서열에 따라 단리 또는 정제된 핵산은 폴리펩티드 생산에 유용하다. 서열 목록에 예시된 본 발명의 핵산 또는 헬리코박터 필로리의 활성 부분을 코딩하는 상기 핵산의 단편을 적당한 벡터에 클로닝하거나 또는 이를 사용하여 핵산을 단리할 수 있다. 단리된 핵산을 적당한 DNA 링커와 조합하여 적당한 벡터에 클로닝시킨다.
특이 유전자 또는 오페론의 기능은 해당 유전자 또는 오페론에 의해 특정된 유전자 생성물의 활성을 특이적으로 측정할 수 있는 조건 하에서 세균주에서 발현시킴으로써 확인할 수 있다. 별법으로는, 유전자 생성물을 항원으로서의 공업용 시약용으로, 구조 연구용으로 발현 균주에서 대량 생산할 수 있다. 이러한 발현은 시험되는 유전자의 활성이 결여된 변이 균주에서, 또는 동일한 유전자 생성물을 생산하지 않는 균주에서 수행할 수 있다. 이에는 다른 헬리코박터 균주 또는 이. 콜라이, 노르카디아 (Norcardia), 코리네박테리아속 (Corynebacterium), 캄파이로박터 (Campylobacter) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종들이 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 몇몇 경우에, 발현 숙주는 천연 헬리코박터 프로모터를 사용하는 반면, 다른 경우에는 발현하는 유기체로부터 유래된 프로모터 서열(예를 들면, 이, 콜라이에서 발현시키는 경우 이. 콜라이 베타-갈락토시다제 프로모터)로 유전자를 작동시키는 것이 필수적이다.
천연 헬리코박터 필로리 프로모터를 사용하여 유전자 생성물을 발현시키는데 하기와 같은 절차를 사용할 수 있다. 해당 유전자를 함유하는 제한 단편을 그에 연합된 천연 프로모터 인자 및 조절 서열 (DNA 서열 자료를 사용하여 확인)와 함께 숙주 유기체 및 적당한 선별가능한 마커 내에서 기능하는 복제 개시점을 갖는 적당한 재조합 플라스미드에 클로닝시킨다. 이는 당업계의 업자들에게 공지된 무수한 절차를 사용하여 실시할 수 있다. 클로닝시키고자하는 플라스미드와 단편을 상기의 제한 효소로 절단하여 리게이션에 의해 두 개의 조각을 함께 연결할 수 있는 적합한 말단을 생산함으로써 실시하는 것이 가장 바람직하다. 이 재조합 플라스미드를 숙주 세포 내로 예를 들면, 일렉트로포레이션을 사용하여 도입시키고, 재조합 플라스미드를 함유하는 세포를 플라스미드에 대한 마커로 선별하여 확인하였다. 원하는 유전자 생성물의 발현은 유전자 생성물에 대해 특이적인 분석법을 사용하여 검출한다.
상이한 프로모터를 필요로하는 유전자의 경우에, 유전자체 (코딩 서열)을 특이적으로 절단하고 적당한 발현 플라스미드에 클로닝시킨다. 이 서브클로닝은 몇가지 방법에 의해 수행할 수 있으며, 특이 단편의 PCR 증폭, 및 제한 효소 또는 엑소뉴클라제로 이 PCR 생성물을 처리한 후 발현 플라스미드 내로의 리게이션에 의해 클로닝에 적당한 말단을 만듦으로써 가장 용이하게 실시된다.
유전자의 발현에 적당한 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들면, 헬리코박터 필로리를 이. 콜라이와 같은 세균 세포, 곤충 세포 (바쿨로바이러스), 효모, 또는 차이니즈 햄스터 난모세포 (CHO)와 같은 포유동물 세포에서 발현시킬 수 있다. 다른 적당한 숙주 세포들도 당업계에 공지되어 있다.
포유동물, 효모 또는 곤충 세포와 같은 진핵 세포에서의 발현은 부분 또는 전체 글리코실화 및(또는) 재조합 펩티드 생성물의 관여하는 사슬 이황화물내 결합 또는 사슬 이황화물간 결합의 형성을 초래할 수 있다. 효모, 에스. 세리비지에 (S.cervisae)에서의 발현을 위한 벡터의 예로는 pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan 및 Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88(Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), 및 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) 등을 들 수 있다. 배양된 곤충 세포 (SF9 세포)에서의 단백질 발현에 사용될 수 있는 바쿨로바이러스 벡터로는 pAc계 (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL계 (Lucklow, V. A., 및 Summers, M.D., (1989) Virology 170:31-39)를 들 수 있다. 일반적으로는, COS 세포(Gluzman, Y., (1981) Cell 23:175-182)는 pCDM 8 (Aruffo, A. 및 Seed, B., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577)와 같은 벡터와 함께 포유 동물에서의 증폭/발현에 사용되며, 한편으로 CHO (차이니즈 햄스터 난모)세포는 pMT2PC (Kaufman et al. (1987), ENBO J. 6:187-195)와 같은 벡터와 함께 포유 동물 세포에서의 안정한 증폭/발현을 위해 사용된다. 벡터 DNA를 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 공침전, DEAED-덱스트란-매개 트랜스펙션, 또는 일렉트로포레이션과 같은 종래의 기술을 통해 포유동물 세포에 도입할 수 있다. 적당한 숙주 세포 형질전환 방법은 샘브룩의 하기 문헌 및 다른 실험실 자료에서 찾아볼 수 있다. 문헌[Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)].
원핵 세포에서의 발현은 가장 흔하게는 융합 또는 비융합 유도성 발현 벡터와 함께 이. 콜라이에서 수행된다. 융합 벡터는 보통 발현된 표적 유전자에 다수의 NH2말단 아미노산을 추가한다. 이러한 NH2말단 아미노산은 흔히 리포터기라고 불린다. 이러한 리포터기는 보통 두가지 목적으로 쓰이는데, 1) 표적 재조합 단백질의 용해도를 증가시키기 위해, 및 2) 친화 정제에서 리간드로서 작용함으로써 표적 재조합 단백질의 정제를 돕기 위하여 쓰인다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질 분해 효소에 의한 분열 부위를 리포터기와 표적 재조합 단백질의 접점에 도입하여 융합 단백질의 정제에 이어서 리포터기로부터 표적 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소, 및 그의 동족 인식 서열로는 팩터 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제등이 있다. 통상의 융합 발현 벡터로는 pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 등이 있으며, 이들 벡터는 표적 재조합 단백질에 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 말토즈 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 각각 융합시킨다. 바람직한 리포터기는 폴리(His)이며 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합될 수 있고, 이 리포터기에 의해 재조합 융합 단백질을 금속 킬레이트 크로마토그래피에 의해 용이하게 정제할 수 있다.
유도성 비융합 발현 벡터로는 pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) 및 pET11d (Studier et al., Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89)등이 있다. 표적 유전자 발현이 pTrc에서 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머라제 전사에 달려있지만, pET11d에 삽입되는 표적 유전자의 발현은 동시에 발현되는 바이러스의 RNA 폴리머라제 (T7 gnl)에 의해 매개된 T7 gn10-lac 0 융합 프로모터로부터의 전사에 달려있다. 이러한 바이러스 폴리머라제는 lacUV5 프로모터의 전사 제어하에 T7 gnl을 갖고 있는 내재 λ 프로파지로부터 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다.
예를 들면, 헬리코박터 필로리를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 핵산 벡터로 트랜스펙트된 숙주 세포를 이 폴리펩티드의 발현을 일으키는 적당한 조건 하에서 배양할 수 있다. 이 폴리펩티드는 분비되어 그를 함유하는 세포와 배지의 혼합물로부터 단리될 수 있다. 별법으로 폴리펩티드는 세포질로 보유하고 이 세포를 채취, 용해시켜 단백질을 단리할 수 있다. 세포 배양물로는 숙주세포, 배지 및 다른 부산물 등이 있다. 세포 배양에 적당한 배지는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 이 둘다로부터 단리시킬 수 있다. 이러한 정제 기술에는 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동 및 상기 폴리펩티드에 특이성이 있는 항체를 이용한 면역친화 정제법 등이 있다. 게다가, 많은 상황에 있어 폴리펩티드는 천연 단백질의 화학적 절단 (예를 들면, 트립신에 의한 절단)에 의해 생산할 수 있고, 이 절단 생성물은 표준 기술로 정제할 수 있다.
막 결합 단백질의 경우에는 막에 연합된 단백질 파편을 세정제와 접촉시켜 가용화된 복합체를 형성함으로써 숙주 세포로부터 단리할 수 있고, 여기서 막에 연합된 단백질은 막 파편에 더 이상 완전히 끼워넣어져 있지 않고 적어도 크로마토그래피에 의한 막 파편으로부터의 단리가 가능한 정도로 용해된다. 이러한 복합체 용해에 적당한 세정제 선택에는 몇몇 상이한 기준이 사용된다. 예를 들면, 한가지의 고려될 성질은 단백질의 재구성 시에 막에 연합된 단백질의 활성 또는 기능을 복구할 수 있도록 막에 연합된 단백질을 최소한으로 변성시키면서 막 파편 내의 헬리코박터 필로리 단백질을 용해시키는 세정제의 능력이다. 세정제 선택 시에 고려될 또다른 성질은 세정제의 임계 미셀 농도(CMC)로 선택된 세정제가 재구성 후에 제거하기 용이하도록 높은 CMC 값을 갖는 것이 바람직하다. 세정제 선택 시에 고려될 세 번째 성질은 세정제의 소수성도이다. 통상, 막에 연합된 단백질은 매우 소수성이고 따라서 또한 소수성인, 예를 들면 트리톤계의 세정제가 소수성 단백질의 용해에 유용할 것이다. 세정제에 있어 중요한 또다른 성질은 추가의 정제가 용이하도록 최소한의 단백질-단백질 상호작용하에 헬리코박터 필로리 단백질을 제거하는 세정제의 능력이다. 고려되어야할 세정제의 다섯 번째 성질은 세정제의 전하이다. 예를 들면, 정제 과정에 이온 교환 수지를 사용하는 것이 바람직하다면, 세정제가 전하를 띠지 않는 세정제이어야한다. 최종 정제 단계에 사용될 수 있는 크로마토그래피 기술은 당업계에 공지되어 있으며 소수성 상호작용, 렉틴 친화, 이온 교환, 염료 친화 및 면역친화법 등이 있다.
이. 콜라이에서 재조합 헬리코박터 필로리의 발현을 최대화하는 한가지 전략은 재조합 단백질을 단백질 분해 효소에 의해 분열시키는 능력이 손상된 숙주 세균에서 단백질을 발현시키는 것이다. (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). 또다른 전략은 발현 벡터에 삽입될 헬리코박터 필로리 펩티드를 코딩하는 핵산을 각 아미노산에 대한 개개의 코돈이 고도로 발현된 이. 콜라이 단백질이 우선적으로 사용하는 것들이 되도록 변경시키는 것이다. (Wada et al., (1992) Nuc. Acids Res. 20:2111-2118). 본 발명의 이러한 핵산 변경은 표준 DNA 합성 기술로 수행할 수 있다.
본 발명의 핵산은 또한 표준 기술을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 폴리데옥시뉴클레오티드의 다양한 화학 합성 방법이 공지되어 있으며, 이 방법으로는 고체상 합성법이 있는데, 이 방법은 펩티드 합성과 마찬가지로 시판된 DNA 합성기로 완전히 자동화되어 있다 (예를 들면, 참고 문헌으로 본 명세서에서 인용되는 이타쿠라(Itakura et al.)의 미국 특허 제4,598,049호, 카루더스 (Caruthers et al.)등의 미국 특허 제4,458,066호; 및 아타쿠라의 미국 특허 제4,401,796호 및 제4,373,071호 참조).
III. 헬리코박터 필로리 폴리펩티드
본 발명은 서열 목록에 기재된 본 발명의 폴리펩티드를 비롯하여 공개된 헬리코박터 필로리 게놈 서열에 의해 코딩된 단리 헬리코박터 필로리를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 길이가 5개 아미노산 잔기 이상이 바람직하다. 본 명세서에 제공된 DNA 서열 정보를 이용하여, 본 발명에 포함되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 당업계에 공지된 방법으로 추론할 수 있다. 헬리코박터 필로리를 코딩하는 전체 핵산의 서열을 동족 단백질-코딩 영역의 단편만을 코딩하는 ORF에 기초하여 단리 및 확인할 수 있음은 물론이다. 이는, 예를 들면 ORF를 코딩하는 단리된 핵산을 사용하거나, 그의 단편으로 사용하여 주형으로서의 게놈 헬리코박터 필로리 DNA와의 폴리머라제 연쇄 반응을 개시하고 이어서 증폭된 생성물을 서열 결정함으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 헬리코박터 필로리 핵산이 도입되어 발현된 야생형 또는 변이형 헬리코박터 필로리 세포로부터 또는 이종 유기체 또는 세포 (세균, 효모, 곤충, 식물 및 포유동물 세포 등을 포함)로부터 단리할 수 있다. 또한, 폴리펩티드가 재조합 융합 단백질의 일부일 수도 있다.
본 발명의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드는 본 명세서에 인용된 것들과 같은 상업적인 자동화 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
IV. 헬리코박터 필로리에 대해 효과적인 물질에 대한 백신 성분 및 표적을 코딩하는 핵산의 확인
기재된 헬리코박터 필로리 게놈 서열은 리보핵산 및 폴리펩티드의 합성을 지시하는 세그먼트 뿐만아니라 복제 개시점, 프로모터, 다른 유형의 조절 서열 및 내유전자 핵산을 포함한다. 본 발명은 헬리코박터 필로리에 대항해 효과가 있는 인자에 대한 표적 및 백신의 면역원 성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 면역원 성분의 확인은 기재된 서열의 기능을 결정하는데 관련되며, 다양한 접근법을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 접근법의 비제한적인 예가 간략히 하기에 기재되어 있다.
공지 서열에 대한 상동성: 기재된 헬리코박터 필로리 서열과 상용 데이터베이스로 존재하는 이미 보고된 서열의 컴퓨터 보조 비교는 기능성 헬리코박터 필로리 핵산과 폴리펩티드 서열을 확인하는데 유용하다. 예를 들면 단백질 코딩 서열을 전제적으로 비교할 수 있고, 아미노산 수준에서 두 단백질 간의 서열 상동성이 고도이면 (예를 들면 80 내지 90% 보다 크면) 두 단백질이 또한 어느 정도의 기능 상동성, 예를 들면 대사, DNA 합성, 또는 세포벽 합성에 관여하는 효소, 및 트랜스포트, 세포 분열 등에 관여하는 단백질과 같은 상동성도 가짐을 의미한다. 게다가, 특정 단백질 부류의 많은 구조상 특성이 확인되었고 이 특성은 예를 들면 뉴클레오티드, DNA, 금속 이온 및 다른 소분자에 대한 결합 도메인; 포스포릴화, 아실화 등과 같은 공유 결합 변성 부위; 단백질:단백질 상호작용 부위 등과 같은 특이성 공통 서열들과 상호 관련이 있다. 이러한 공통 서열은 매우 짧고 따라서 전체 단백질 코딩 서열의 단지 한 파편을 나타낼 것이다. 따라서, 헬리코박터 필로리 서열 중에 이러한 특징을 확인하는 것은 코딩된 단백질의 기능 결정 및 항균 약물의 유용한 표적의 확인에 유용하다.
본 발명의 특별한 관련성은 분비 시그널 펩티드 및 소수성 막통과 도메인을 포함하여, 분비, 막통과 및 표면 단백질에 공통인 구조 특징이다. 추정상 시그널 서열 및(또는) 막통과 도메인을 함유하는 것으로 판정된 헬리코박터 필로리 단백질은 백신의 면역원 성분으로서 유용하다.
필수 유전자의 확인: 헬리코박터 필로리의 증식 또는 생존에 필수적인 단백질을 코딩하는 핵산이 바람직한 약물 표적이다. 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 유전자를 결실 및(또는) 파괴하는 효과를, 즉 소위 유전자 "낙아웃"을 조사함으로써 유기체에 대한 헬리코박터 필로리 유전자의 생물학적 관련성을 시험할 수 있다. 이러한 방식으로, 필수 유전자를 확인할 수 있다.
균주-특이성 서열: 상이한 헬리코박터 필로리 균주 사이의 진화상의 관련성 때문에, 현재 공개된 헬리코박터 필로리 서열이 이미 공지 및 신규 헬리코박터 필로리 균주들 사이의 확인 및(또는) 식별에 유용하다고 생각된다. 다른 헬리코박터 필로리 균주가 현재 공개된 서열과 70% 이상 서열 상동성을 나타낼 것으로 생각된다. 헬리코박터 필로리 균주를 함유하는 시료로부터 유래된 DNA 서열의 체계적이고 일상적인 분석, 및 기존 서열과의 비교를 통해 균주 식별에 사용될 수 있는 서열 뿐만아니라 모든 헬리코박터 필로리 균주에 공통인 서열들의 확인도 가능하다. 일례로, 본 발명은 상이한 헬리코박터 필로리 균주를 식별할 수 있는 프로브를 비롯한 핵산, 펩티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 또한 균주 특이성 성분은 1종 이상의 헬리코박터 필로리 균주를 선택적으로 인식하는 항체를 유발하거나 그와 반응하는 능력에 의해 기능상 확인할 수 있다.
또다른 예로, 본 발명은 모든 헬리코박터 필로리 균주에 대해 공통이나 다른 세균 종에서는 발견되지 않는 프로브를 비롯한 핵산, 및 펩티드 및 폴리펩티드 서열을 제공한다.
구체예: 항체 및 백신 개발을 위한 후보 단백질 항원의 결정
백신 개발을 위한 후보 단백질 항원의 선택은 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로부터 기인할 수 있다. 먼저, ORF를 다른 공지의 배출(exported) 단백질 및 막 단백질에 대해 분석하고 클레인 (Klein, et al.)이 배출 단백질 및 막 단백질 예측에 대해 기술한 식별인자 분석법을 사용하여 상동성에 대해 분석했다. (Klein, P., Kanehsia, M., 및 DeLisi, C. (1985) Biochimica et Biophysica Acta 815, 468-476).
상동성 검색은 위스콘신 서열 분석 패키지 (Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)에 담긴 BLAST 알고리즘을 사용하여 수행하여 현재의 GenBank, SWISS-PROT 및 PIR 데이터베이스에 있는 모든 서열과 각각의 예측 ORF 아미노산 서열을 비교할 수 있다. BLAST는 ORF와 데이터뱅크 서열 사이의 국소 배열을 검색하여 자료데이터베이스에서 우연히 이 서열을 찾을 가능성을 나타내는 가능도 점수를 나타낸다. 막 또는 배출 단백질에 대해 유의한 상동성(예를 들면, 상동성이 단지 무작위적인 기회로 인하여 1x10-6이하의 가능성)을 갖는 ORF는 백신 개발용의 단백질 항원을 나타낸다. 다른 유기체에서 클로닝된 유전자에 대한 서열 상동성에 근거하여 적당한 기능을 헬리코박터 필로리 유전자에 제공할 수 있다.
식별인자 분석 (Klein, et al., 상기 문헌)을 사용하여 ORF 아미노산 서열을 조사할 수 있다. 이 알고리즘은 ORF 아미노산 서열에 담긴 고유한 정보를 사용하여 그것을 공지의 막 및 배출 단백질의 특성으로부터 유래되는 정보와 비교한다. 이러한 비교로 단백질이 배출 단백질, 막에 연합된 단백질 또는 세포질 단백질인지를 추정할 수 있다. 이 알고리즘에 의해 배출 또는 막 연합 단백질로 판정된 ORF 아미노산 서열이 백신 개발용 단백질 항원인 것으로 보인다.
표면에 노출된 외막 단백질은 헬리코박터 필로리에 대한 방호적인 면역 반응을 제공하는 가장 우수한 항원을 제시하는 것으로 생각된다. 상기 외막 단백질의 예측시에 사용될 수 있는 알고리즘은 그의 C 말단에 양쪽성 베타-시트 영역의 존재를 포함한다. 그람 음성 세균의 매우 많은 외막 단백질에서 검출된 상기 영역은 종종 C 말단으로부터 교호 위치에서 클러스터된 소수성 잔기 (Phe 또는 Tyr)에 의해 특성화된다 (예를 들어 도 5의 블록 F; 도 7의 블록 E 참조). 중요한 것은, 이들 서열이 페리플라즘 단백질의 C 말단에서 검출되지 않아서 1차 서열 데이타를 기초로 하여 이들 종류의 단백질을 구별할 수 있게 한다는 것이다. 이러한 현상은 문헌[Struyve et al., J. Biol. 218:141-148, 1991)에 보고되었다.
또한, 도 5에는 헬리코박터 필로리의 많은 외막 단백질에서 발견되는 추가의 아미노산 서열 모티브가 예시되어 있다. 도 5에서 아미노산 서열 배열은 그의 아미노산 서열 번호로 나타내고 좌측에서 우측으로 N 말단에서 C 말단으로 도시한 5종의 헬리코박터 필로리의 서열(1문자 아미노산 코드로 나타냄)의 일부를 도시한 것이다. 외막 단백질의 C 말단 근처의 위치에서 자주 발견되는 별개의 소수성 잔기 (Phe 또는 Tyr; 아미노산 잔기의 1문자 코드에 따른 F 또는 Y)를 포함하여 유사한 아미노산 잔기의 5 또는 6의 별개의 블록 (A 내지 E 또는 F로 나타냄)이 발견된다. 몇개의 공유 모티브의 존재는 상기 군의 단백질의 구성원 사이의 유사성을 분명하게 확립한다.
헬리코박터 필로리로부터 단리된 4종의 외막 단백질의 추가의 아미노산 배열은 도 6에 도시하였다.
헬리코박터 필로리로부터 단리된 외막 단백질은 C 말단의 소수성 잔기를 공유하는 도 7의 2종의 단백질에 대해 도시하고 C 말단 소수성 잔기 모티브를 공유하지 않지만 상이한 C 말단 모티브를 공유하는 도 8의 2종의 단백질에 대해 도시한 추가의 모티브를 종종 공유한다.
당업계의 숙련가는 이들 공유 서열 모티브가 매우 중요하고 상기 군의 단백질 사이의 유사성을 확립한다는 것을 알 것이다.
흔치 않지만, 핵산 서열 중의 소정 위치에 있을 수 있는 다수의 핵산들을 식별하는 것이 가능하지 않다. 이 경우에, 다음과 같이 확장된 알파벳으로 모호성을 표시한다.
다음은 공식 IUPAC-IUB 단문자 염기 코드이다.
코드 염기 설명
G 구아닌
A 아데닌
T 티민
C 시토신
R 푸린 (A 또는 G)
Y 피리미딘 (C 또는 T 또는 U)
M 아미노 (A 또는 C)
K 케톤 (G 또는 T)
S 강한 상호작용 (C 또는 G)
W 약한 상호작용 (A 또는 T)
H G가 아님 (A 또는 C 또는 T)
B A가 아님 (C 또는 G 또는 T)
V T가 아님(U가 아님) (A 또는 C 또는 G)
D C가 아님 (A 또는 G 또는 T)
N 임의의 염기 (A 또는 C 또는 G 또는 T)
본 발명의 아미노산 해독으로 인해 문자 "X"의 불명료한 코돈을 해독함으로써 핵산이 불명료하게 된다. 모든 경우에, 특정 위치에서의 허용가능한 아미노산 잔기는 표준 유전자 코드에 기초하여 핵산 서열을 조사하면 명확하다.
V. 헬리코박터 필로리 핵산 및 폴리펩티드의 단편 및 유사체의 생산
서열 목록에 제공된 본 발명의 헬리코박터 필로리 유전자 생성물의 발견에 기초하여 당업자는 (헬리코박터 필로리 유전자의) 공개된 구조를, 예를 들면 단편 또는 유사체 생산에 의해 변경시키고, 새로이 생산된 구조의 활성을 시험할 수 있다. 단편 및 유사체를 생산 및 시험할 수 있는 관련 업계의 숙련자에게 공지된 기술의 예들이 하기에 논의되어 있다. 이러한, 또는 유사 방법을 사용하여 폴리펩티드의 라이브러리, 예를 들면 랜덤 펩티드의 라이브러리 또는 세포질 단백질의 단편 또는 유사체의 라이브러리를 만들어 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 결합하는 능력을 스크리닝할 수 있다. 이러한 스크린은 헬리코박터 필로리의 저해제 확인에 유용하다.
단편의 제조
단백질의 단편은 예를 들어 재조합, 단백질 분해 효소 소화, 또는 화학적 합성에 의해 몇가지 방법으로 생산할 수 있다. 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 한 말단 (말단 단편의 경우) 또는 양말단 (내부 단편의 경우)으로부터 1개 이상의 뉴클레오티드를 제거하여 제조할 수 있다. 변이된 DNA의 발현은 폴리펩티드 단편을 생산하다. 따라서 "말단을 조금씩 절단하는(end-nibbling)" 엔도뉴클라제로 절단시키면 일 열의 단편을 코딩하는 DNA를 제조할 수 있다. 또한 단백질의 단편을 코딩하는 DNA는 무작위 전단, 제한 절단 또는 상기 논의된 방법의 조합에 의해 제조할 수도 있다.
또한 종래의 멜리필드 (Merrifield) 고체상 f-Moc 또는 t-Boc 화학법과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 단편을 화학적으로 합성할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드는 임의로, 단편의 중첩이 없는 원하는 길이의 단편으로 분할되거나 또는 원하는 길이의 중첩 단편으로 분할될 수 있다.
핵산 및 폴리펩티드의 변경: 무작위 방법
단백질의 아미노산 변이체는 그 단백질 또는 그 단백질의 특정 도메인 또는 영역을 코딩하는 DNA의 무작위 돌연변이에 의해 제조할 수 있다. 유용한 방법으로는 PCR 변이유발법 및 포화 변이유발법이 있다. 무작위 아미노산 서열 변이체의 라이브러리는 한세트의 변성 올리고뉴클레오티드 서열의 합성에 의해 제조할 수도 있다 (변이체 라이브러리에서 단백질을 스크리닝하는 방법은 본 명세서의 다른 부분에 기재되어 있다).
(A) PCR 변이유발법
PCR 변이유발법에서, 저신뢰도 Taq 폴리머라제를 사용하여 DNA의 클로닝된 단편에 무작위 변이를 도입한다 (Leung et al., 1989, Technique 1:11-15). 변이될 DNA 영역을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여, 예를 들면 5의 dGTP/dATP 비율을 사용하고 PCR 반응에 Mn2+를 첨가함으로써 Taq DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성의 신뢰도를 저하시키는 조건하에서 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편의 풀을 적당한 클로닝 벡터에 삽입하여 무작위 변이체 라이브러리를 얻는다.
(B) 포화 변이유발법
포화 변이유발을 통해 다수의 일염기 치환을 클로닝된 DNA 단편내로 신속히 도입하는 것이 가능하다 (Mayers et al., 1985, Science 229:242). 이 기술은 예를 들면 생체외에서 단일 가닥 DNA의 화학적 처리 또는 조사에 의한 변이 발생을 포함한다. 변이 빈도는 처리의 심각도를 조정하여 조정할 수 있고 근본적으로 모든 가능한 염기 치환을 얻을 수 있다. 이 절차가 변이 단편에 대한 유전적 선택을 수반하지 않기 때문에, 중립 치환 뿐만아니라 기능이 변경된 치환도 모두 얻어진다. 점 변이의 분포는 보전된 서열 요소를 향하여 편향되지 않는다.
(C) 변성 올리고뉴클레오티드
상동물의 라이브러리는 또한 한 세트의 변성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 제조할 수 있다. 변성 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기로 수행할 수 있고 그 다음 합성 유전자를 적당한 발현 벡터 내로 리게이션시킬 수 있다. 변성 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd ClevelandSympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev, Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al, (1983) Nucleic Acid Res. 11:477 참조). 이러한 기술은 다른 단백질의 조작 변경에도 사용된다. (예를 들면, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87:6378-6382; 및 미국 특허 제5,223,409호, 제5,198,346호 및 제5,096,815호 참조).
핵산 및 폴리펩티드의 변경: 지시된 변이유발 방법
작위성 또는 지시된 변이유발 기술을 사용하여 특정 영역에 특정 서열 또는 변이를 제공할 수 있다. 이러한 기술을 사용하여 예를 들면, 단백질의 공지된 아미노산 서열의 잔기가 결실, 삽입 또는 치환된 변이체를 제조할 수 있다. 변이 부위는 예를 들면 (1) 보존 아미노산으로 처음 치환한 다음 얻어진 결과에 따라 보다 근본적인 선택에 의해 치환하거나, (2) 표적 잔기를 결실시키거나, 또는 (3) 위치한 부위에 인접한 동일 또는 상이한 부류의 잔기를 삽입하거나 1 내지 3의 임의 조합에 의해 개별적으로 또는 시리즈로 변성시킬 수 있다.
(A) 알라닌 주사(scanning) 변이유발
알라닌 주사 변이유발은 변이유발에 바람직한 위치 또는 도메인인 원하는 단백질의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법이다 (Cunningham 및 Well, Science 244:1081-1085, 1989). 알라닌 주사 시에, 표적 잔기 또는 표적 잔기군을 확인하여 (예를 들면, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같이 전하를 띤 잔기) 중성 또는 음전하 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환한다. 아미노산을 치환하면 세포내 또는 세포외측 주위의 수성 환경과 그 아미노산 서열의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 그 다음, 치환 부위에 또는 그에 대해 부가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 치환에 대해 기능상의 민감성을 나타내는 도메인을 개선한다. 따라서, 아미노산 서열 변이 도입 부위는 미리 결정되나, 변이 성질 자체는 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들면, 지정 부위에서의 변이 수행을 최적화하기 위하여 알라닌 주사 또는 무작위 변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행할 수 있고 발현된 원하는 단백질 서브유닛 변이체를 원하는 활성의 최적 조합에 대해 스크리닝했다.
(B) 올리고뉴클레오티드-매개 변이유발
올리고뉴클레오티드-매개 변이유발은 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하는 유용한 방법이다. 예를 들면, 하기 문헌 참조[Adelman et al., (DNA 2:183, 1983)]. 간략하게, 변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 DNA 주형에 혼성화하여 원하는 DNA를 변경시키는데, 여기서 주형이란 원하는 단백질의 미변경 또는 천연 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 또는 박테리오파지의 단일 가닥 형태이다. 혼성화 후에, DNA 폴리머라제를 사용하여 이 주형의 전체의 제1 상보 가닥을 합성하고, 이리하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입시키고 원하는 단백질 DNA내에 선택된 변경을 코딩할 것이다. 일반적으로 길이가 25 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적 올리고뉴클레오티드는 12 내지 15개 뉴클레오티드를 가지며, 변이를 코딩하는 뉴클레오티드의 양측에 대한 주형에 대해 완전히 상보성이다. 이는 이 올리코뉴클레오티드가 단일 가닥의 DNA 주형 분자에 적절히 혼성화함을 확고히 한다. 올리고뉴클레오티드는 크레아(Crea et al.) 등이 기재한 바와 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 용이하게 합성된다. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765[1978]).
(C) 카셋트 변이유발
또다른 변이체 제조 방법, 카세트 변이유발법은 웰즈 (Wells et al)의 기술에 기초한다 (Gene, 34:315(1985]). 출발물질은 변이될 단백질 서브유닛 DNA를 포함하는 플라스미드 (또는 다른 벡터)이다. 변이될 이 단백질 서브유닛 DNA의 코돈을 확인한다. 확인된 변이 부위의 각 측면에 독특한 제한 엔도뉴클라제 부위가 있을 것이다. 이러한 제한 부위가 존재하지 않는다면, 상기 기재된 올리고뉴클레오티드-매개 변이 유발법을 사용하여 제한 부위를 원하는 단백질 서브유닛 DNA내의 적절한 위치에 도입함으로써 만들 수 있다. 제한 부위를 플라스미드 내로 도입한 후에, 이 플라스미드를 이들 부위를 절단하여 선형화한다. 제한 부위 사이의 DNA 서열을 코딩하나 원하는 변이를 함유하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 표준 절차를 사용하여 합성한다. 이 두 개의 가닥을 따로따로 합성한 다음 표준 기술을 사용하여 함께 혼성화한다. 이 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 카세트라 칭한다. 이 카세트는 플라스미드에 직접 리게이션될 수 있도록, 선형화된 플라스미드의 양 말단과 양립가능한 3' 및 5' 말단을 갖도록 설계한다. 이 플라스미드는 이제 변이된 원하는 단백질 서브유닛 DNA 서열을 함유한다.
(D) 조합 변이유발
또한, 조합 변이유발법을 사용하여 변이체를 제조할 수 있다 (Ladner et al., WO88/06630). 이 방법으로는, 상동물의 군 또는 다른 관련 단백질에 대한 아미노산 서열을 정렬하여 바람직하게는 최고의 상동성이 가능하도록 촉진시킨다. 정렬된 서열의 소정 위치에서 나타나는 모든 아미노산을 선택하여 조합 서열의 변성 세트를 만들 수 있다. 변이체의 변화된 라이브러리를 핵산 수준의 조합 변이유발에 의해 만들고, 이를 다양한 유전자 라이브러리에 의해 코딩한다. 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을, 가능한 서열의 변성 세트를 개별 펩티드로서, 또는 별법으로 변성 서열의 세트를 함유하는 더 큰 융합 단백질의 세트로서 발현가능하도록 유전자 서열에 효소를 이용하여 리게이션시킬 수 있다.
헬리코박터 필로리 핵산 및 폴리펩티드의 다른 변성
용해도 증진, 안정도 향상 (예를 들면 생체외 저장 수명 및 생체내 단백질 분해 효소에 의한 분해 내성)과 같은 목적을 위해 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 구조를 변성하는 것이 가능하다. 본 명세서에 기재된 아미노산 치환, 결실 또는 추가에 의한 것과 같이 아미노산 서열이 변경된 변성 헬리코박터 필로리 단백질 또는 펩티드를 제조할 수 있다.
또, 시스테인계 잔기, 바람직하게는 알라닌, 세린, 트레오닌, 루신 또는 글루탐산 잔기의 치환에 의해 변성시켜 이황화물 결합을 통한 이합체화를 최소화할 수 있다. 게다가, 본 발명의 단백질의 단편의 아미노산 측쇄도 화학적으로 변성시킬 수 있다. 또다른 변성 방법은 펩티드의 환형화이다.
안정도 및(또는) 반응도를 향상시키기 위하여, 헬리코박터 필로리를 임의 천연 대립형질 변이로부터 야기되는 단백질의 아미노산 서열에서의 1종 이상의 다형성이 도입되도록 변성시킬 수 있다. 게다가, D-아미노산, 비-천연 아미노산, 또는 비-아미노산 유사체도 치환 또는 추가하여 본 발명의 범위 내에의 변성 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 에이. 세혼 및 공동 작업자 (Wie at al., 앞의책)의 방법에 따라 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 사용하여 변성시켜 PEG와 접합된 단백질을 생산할 수 있다. 또한, PEG는 단백질의 화학 합성 중에도 첨가할 수 있다. 헬리코박터 필로리의 다른 변성법으로는 환원/알킬화 (Tarr, Methods of Protein Microcharacterization, J.E. Silver ed., Humana Press, Clifton NJ 155-194 (1986)); 아실화 (Tarr, 앞의책); 적당한 담체로의 화학적 커플링 (Mishell 및 Shiigi, eds. Selected Methods in Cellular immunology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980), 미국 특허 제4,939,239호) 또는 온화한 포르말린 처리 (Marsh (1971) Int, Arch of Allergy 및 Appl. Immunol., 41:199-215)등이 있다.
헬리코박터 필로리 단백질 또는 펩티드의 정제를 용이하게 하고 용해도를 증가시키기 위하여, 펩티드 주쇄에 아미노산 융합 잔기를 추가하는 것도 가능하다. 예를 들면 헥사-히스티딘을, 고정 금속 이온 친화 크로마토그래피에 의한 정제를 위해 단백질에 추가할 수 있다 (Hochuli, E. et al., (1988) Bio/Technology, 6:1321-1325). 게다가, 무관한 서열이 없는 펩티드의 단리를 용이하기 하기 위하여 특이성 엔도프로테아제 분열 부위를 융합 잔기와 펩티드 서열 사이에 도입할 수도 있다.
헬리코박터 필로리 폴리펩티드 내에 에피토프의 적절한 항원 프로세싱을 효과적으로 돕기위하여, 각각 재조합 또는 합성 방법에 의해 1개 이상의 에피토프를 포함하는 영역 사이에 규범적인 프로테아제 민감성 부위를 조작할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띤 아미노산 쌍, 예를 들면 KK 또는 RR을 재조합 제조 중에 단백질 또는 단편 내의 영역 사이에 도입할 수 있다. 생성된 펩티드는 1개 이상의 에피토프를 함유하는 단백질의 부분을 생성하는 캐페신 및(또는) 다른 트립신-유사 효소에 의한 분열에 민감하게 된다. 또한, 이러한 전하를 띤 아미노산 잔기는 펩티드의 용해도 증가를 초래할 수 있다.
폴리펩티드 및 유사체를 스크리닝하는 1차 방법
생성된 변이 유전자 생성물을 스크리닝하는 각종 기술이 당업계에 공지되어 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 기술로는 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터내로 클로닝시키고, 생성된 벡터 라이브러리로 적당한 세포를 형질전화시키고, 원하는 활성의 검출, 예를 들면 이 경우에 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 상호작용 단백질에 대한 결합 활성의 검출은 생성물이 검출될 유전자를 코딩하는 벡터의 단리를 비교적 용이하게 할 수 있는 조건 하에서 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 하기 기재된 각 기술은 만들어진 다수의 서열을 스크리닝하기 위한 고 처리량 분석법으로, 예를 들면 무작위 변이 기술에 의해 보정할 수 있다.
(A) 2 하이브리드계
상기 기재된 시스템과 같은 2 하이브리드 분석법 (본 명세서에 기재된 다른 스크리닝 방법과 같이)를 사용하여 폴리펩티드, 예를 들면 천연 헬리코박터 필로리 폴리펩티드, 예를 들면 헬리코박터 필로리 단백질에 결합하는 세포질 단백질, 또는 무작위로 생성된 폴리펩티드의 단편 또는 유사체를 확인할 수 있다. (헬리코박터 필로리를 미끼(bait) 단백질로 사용하고 변이체의 라이브러리를 피쉬 패션 단백질로 발현시킨다). 유사한 방식으로, 2 하이브리드 분석법 (본 명세서에서 기재된 다른 스크리닝 방법에서와 같이)를 사용하여 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드를 찾을 수 있다.
(B) 디스플레이 라이브러리
스크리닝 분석법의 한 접근법으로는, 후보 펩티드를 세포 또는 바이러스 입자의 표면에 디스플레이하고, 특정 세포 또는 바이러스 입자가 적당한 리셉터 단백질에 상기 디스플레이된 생성물을 통해 결합하는 능력을 "패닝 분석법(panning assay)"으로 검출한다. 예를 들면, 유전자 라이브러리를 세균 세포의 표면막 단백질에 대한 유전자에 클로닝시키고, 생성된 융합 단백질을 패닝에 의해 검출한다 (Ladner et al., WO88/06630; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1371; 및 Goward et al. (1992) TIBS 18:136-140). 유사한 방식으로, 검출가능한 표지된 리간드를 사용하여 잠재적으로 기능성인 펩티드 유사체에 대해 점수를 매긴다. 형광단으로 표지한 리간드, 예를 들면 리셉터를 사용하여 리간드-결합 활성을 가진 상동체를 검출할 수 있다. 형광단으로 표지한 리간드를 사용하면 세포를 가시적으로 조사할 수 있고 형광 현미경으로 분리할 수 있게되고, 또는 여기서 세포의 형태가 허용할 경우 형광-활성화 세포 쇼터(sorter)로 분리될 수도 있다.
유전자 라이브러리는 바이러스 입자의 표면의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들면, 필라멘트상 파지 시스템으로 감염성 파지의 표면에서 외래 펩티드 서열을 발현시킬 수 있으며, 이로써 두가지의 중요한 잇점을 제공한다. 첫째는 이들 파지를 ml 당 파지가 1013개가 훨씬 넘는 농도로 친화 매트릭스에 적용시킬 수 있기 때문에, 한번에 다수의 파지를 스크리닝할 수 있다. 둘째로는 각 감염성 파지가 자신의 표면에 유전자 생성물을 디스플레이하기 때문에, 특정 파지가 친화 매트릭스로부터 저 수율로 회수되면 이 파지를 또다른 감염 순환에 의해 증폭시킬 수 있다. 거의 동일한 이. 콜라이 필라멘트상 파지 M13, fd 및 fl 군은 파지 디스플레이 라이브러리에 가장 흔히 사용된다. 파지 gIII 또는 gVIII 코트 단백질 중 하나를 사용하여 바이러스 입자의 궁극적인 패키징을 파괴하지 않은 채로 융합 단백질을 생성할 수 있다. 외래 에피토프는 pIII의 NH2-말단에서 발현될 수 있고, 에피토프를 갖는 파지는 이 에피토프가 없는 과잉량의 파지로부터 회수할 수 있다. (Ladner et al. PCT 공개 WO90/02909; Garrard et al., PCT 공개 WO 92/09690; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:6007-16010; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; 및 Barbas et al. (1992) PNAS 89:4457-4461).
공통의 접근법으로 펩티드 융합 파트너로서 이. 콜라이의 말토즈 리셉터 (외막 단백질, LamB)를 사용한다. (Charbit et al. (1986) EMBO 5, 3029-3037). 올리고뉴클레오티드를 LamB 유전자를 코딩하는 플라스미드에 삽입하여 단백질의 세포질외 루프 중의 하나에 융합된 펩티드를 생산한다. 이 펩티드는 리간드, 예를 들면 항체에 결합할 수 있고, 이 세포를 동물에게 투여할 때 면역 응답을 유도할 수 있다. 다른 세포 표면 단백질, 예를 들면 OmpA (Schorr et al (1991) Vaccines 91, pp. 387-392), PhoE (Agterberg, et al. (1990) Gene 88, 37-45) 및 PAL (Fuchs et al. (1991) Bio/Tech 9, 1369-1372) 및 큰 세균 표면 구조는 펩티드 디스플레이용의 비히클로서 작용했다. 펩티드는 중합하여 세균내의 유전자 정보 교환을 위한 파일러스-a 관을 형성하는 단백질인 필린 (pilin)에 융합될 수 있다. (Thiry et al. (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55, 984-993). 다른 세포와의 상호작용에서의 역할 때문에, 이 파일러스는 펩티드를 세포질외 환경으로 배출하는데 유용한 지지체를 제공한다. 펩티드 디스플레이에 사용되는 또다른 큰 표면 구조물은 세균 운동 기관인 편모이다. 펩티드를 서브유닛 단백질 편모에 융합시키면 숙주 세포에서 많은 펩티드 카피의 조밀한 배열이 주어진다. (Kuwajima et al. (1988) Bio/Tech. 6, 1080-1083). 다른 세균 종의 표면 단백질도 또한 펩티드 융합 파트너로서 사용되어왔다. 예에는 스타필로코커스 단백질 A 및 네이세리아 (Neisseria)의 외막 IgA 프로테아제가 포함된다 (Hansson et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 4239-4245 및 Klauser et al. (1990) EMBO J. 9, 1991-1999).
상기 기재된 필라멘트상 파지 시스템 및 LamB 시스템에서는, 펩티드와 그를 코딩하는 DNA 사이의 물리적인 연결은 표면상에 펩티드를 갖고 있는 입자 (세포 또는 파지) 내에 DNA를 봉쇄함으로써 일어난다. 펩티드 포착은 이 입자 내부에 DNA를 포착한다. 대안 방법은 DNA-결합 단백질 LacI를 사용하여 펩티드와 DNA 사이에 연결부를 형성하는 것이다 (Culle t al. (1992) PNAS USA 89:1865-1869). 이 시스템은 LacI 유전자와 그의 3' 말단에 올리고뉴클레오티드 클로닝 부위를 함유하는 플라스미드를 사용한다. 아라비노스에 의한 유도 제어 하에, LacI-펩티드 융합 단백질이 생산된다. 이 융합은 LacO 오퍼레이터 (LacO)로서 공지된 짧은 DNA 서열에 결합하는 LacI의 고유한 능력을 유지한다. 발현 플라스미드에 LacO의 2개의 카피를 설치함으로써, LacI-펩티드 융합체가 그것을 코딩하는 플라스미드에 강하게 결합한다. 각 세포내의 플라스미드가 단일한 올리고뉴클레오티드 서열만을 함유하고, 각 세포가 단일한 펩티드 서열만을 발현하기 때문에, 이 펩티드는 그의 합성을 지시하는 DNA 서열과 특이적으로 안정하게 연합되게 된다. 이 라이브러리의 세포를 온화하게 용균시키고 펩티드-DNA 복합체를 고정 리셉터의 매트릭스에 노출시켜 활성 펩티드를 함유하는 복합체를 회수한다. 이어서, 연합된 플라스미드 DNA를 증폭 및 DNA 서열 결정을 위해 세포에 재도입시켜 펩티드 리간드의 동일성을 결정했다. 이 방법의 실제 유용성에 대한 판단으로서, 도데카펩티드의 큰 무작위 라이브러리를 만들고 오피오이드 펩티드 다이노핀 B에 대항해 야기된 모노클로날 항체로 선별하였다. 일군의 펩티드를 회수했고, 모두가 다이노핀 B의 6개 잔기 부분에 대응하는 공통 서열이 관련있었다. (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89-1869).
때때로 펩티드-온 플라스미드 (peptides-on-plasmids)로 불리는 이 방법은 두가지 중요한 방식이 파지 디스플레이 방법과 상이하다. 첫째로, 펩티드가 융합 단백질의 C-말단에 부착하여 자유 카르복시 말단을 갖는 펩티드로서의 라이브러리 성원의 디스플레이를 야기한다. 필라멘트상 파지 코트 단백질, pIII 및 pVIII 모두가 그의 C-말단을 통해 파지에 앵커링되고, 게스트 펩티드가 외향으로 신장하는 N-말단 도메인에 배치된다. 몇가지 설계에서는 파지에 의해 디스플레이된 펩티드가 융합 단백질의 아미노 말단의 오른쪽에 존재한다 (Cwirla, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6378-6382). 두 번째 차이점은 라이브러리에 실제 존재하는 펩티드의 수에 영항을 미치는 생물학적 편향인자의 세트이다. LacI 융합 분자는 숙주 세포의 세포질에 한정된다. 파지 코트 융합체는 해독 중에 세포질에 간단히 노출되나 내막을 통하여 페리플라즘 구획으로 신속하게 분비되어 C-말단 소수성 도메인에 의해 막에 앵커링된 채로 파지 입자에 조립되는 것을 기다리면서 펩티드를 함유하는 N-말단이 페리플라즘에 돌출한다. LacI 및 파지 라이브러리 내의 펩티드는 상이한 단백질 효소 분해 작용에 노출되었기 때문에 상당히 상이할 것이다. 이 파지 코트 단백질은 파지내로의 도입에 선행하여 내막의 통과하는 이송과 시그날 펩티다제 프로세싱이 필요하다. 특정 펩티드는 이 프로세스에 불리한 영향을 미치며, 이 라이브러리내에는 덜 나타난다 (Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37(9):1233-1251). 이들 특정 편향인자는 LacI 디스플레이 시스템에서는 한 인자가 아니다.
재조합 무작위 라이브러리에 있는 소펩티드의 수는 무수하다. 107내지 109개의 독립 클론의 라이브러리가 일상적으로 제조된다. 1011개 재조합체 만큼 많은 라이브러리가 만들어지나, 이러한 크기는 클론 라이브러리의 실제 한계에 다다른 것이다. 이러한 라이브러리 크기의 한계는 숙주 세균 세포에 DNA를 함유하는 무작위 세그먼트를 형질전환시키는 단계에서 일어난다. 이러한 한계를 피하기 위하여, 폴리솜 복합체 중의 발생기의 펩티드 디스플레이에 기초한 시험관내 시스템이 최근 개발되었다. 이 디스플레이 라이브러리 방법은 현재 이용되는 파지/파지미드 또는 플라스미드 라이브러리 보다 3 내지 6승 대량의 라이브러리를 생산하는 능력이 있다. 또한, 라이브러리의 제조, 펩티드의 발현 및 스크리닝은 완전히 무세포 방식으로 실시한다.
이 방법의 일례로 (Gallop et al. (1994) J.Med.Chem. 37(9):1233-1251), 1012데카펩티드를 코딩하는 분자 DNA 라이브러리를 제조하고, 이를 이. 콜라이 S30에서 생체외 커플링된 전자/해독 시스템으로 발현시켰다. 리보솜을 mRNA 상에 넣는 조건을 선택하여 폴리솜 내의 RNA의 실제 개체수를 축적하고 코딩 RNA에 여전히 연결된 발생기의 펩티드를 함유하는 복합체를 얻는다. 이 폴리솜은 보다 통상의 재조합 펩티드 디스플레이 라이브러리가 스크리닝되는 것과 동일한 방식으로 고정 리셉터 상의 치환 정제에 충분할 정도로 간고하다. 결합 복합체로부터 RNA를 회수하고, cDNA로 전환시키고, PCR에 의해 증폭시켜 다음 회의 합성 및 스크리닝을 위한 주형을 생산한다. 이 폴리솜 디스플레이 방법을 파지 디스플레이 시스템과 결합시킬 수 있다. 몇회의 스크리닝 후에, 폴리솜의 풍부한 풀로부터의 cDNA를 파지미드 벡터에 클로닝시켰다. 이 벡터는 코트 단백질에 융합된 펩티드를 디스플레이하는 펩티드 발현 벡터로, 또 펩티드 확인용의 DNA 서열 결정 벡터로서 기능을 한다. 파지에서 폴리솜-유래 펩티드를 발현시킴으로써 이 포맷으로 친화 선별 절차를 계속하거나 파지 ELISA로 결합 활성, 또는 완결 파지 ELISA로 결합 특이성에 대해 각각의 클론에 대한 펩티드를 분석할 수 있다 (Barret, et al. (1992) Anal. Biochem 204, 357-364). 활성 펩티드의 서열을 확인하기 위하여 파지미드 숙주에 의해 생산된 DNA를 서열 결정했다.
폴리펩티드 및 유사체의 2차 스크리닝
예를 들면 길항체로부터 아고니스트를 당업자가 분리시킬 수 있도록 생물학적 활성을 더 확인하기 위하여 상기 기재된 고처리량 분석법에 이어 2차 스크린을 행할 수 있다. 2차 스트린의 사용 유형은 시험하고자하는 원하는 활성에 좌우된다. 예를 들면, 해당 단백질과 그의 각 리간드 사이의 상호작용을 저해하는 능력을 사용하여 상기 1차 스크린 중 하나로부터 단리된 일군의 펩티드 단편으로부터 길항체를 확인하는 분석법을 개발할 수 있다.
따라서, 단편 및 유사체의 제조 및 그의 활성 시험 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일단 해당 코어 서열이 확인되면, 유사체와 단편을 얻는 것은 당업계의 당업자에게는 일상적인 일이다.
헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 펩티드 모방체
본 발명은 또한 대상 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 단백질 결합 도메인을 감소시켜 모방체, 예를 들면 펩티드 또는 비-펩티드 제제를 제공한다. 이 펩티드 모방체는 폴리펩티드가 그의 카운터 리간드에 결합하는 것, 예를 들면 헬리코박터 필로리의 경우 천연 리간드에 결합하는 것을 방해할 수 있다. 폴리펩티드의 분자 인식에 관여하는 대상 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 중요한 잔기를 결정할 수 있고, 이 잔기를 사용하여 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 상호작용 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 또는 비경쟁적으로 저해하는 헬리코박터 필로리 유래 펩티드 모방체를 제조할 수 있다. (예를 들면, 유럽 특허 출원 EP-412,762A 및 EP-B31,080A 참조).
예를 들면, 주사 변이유발을 이용하여 상호작용 폴리펩티드 결합에 관여하는 특정 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 지도를 작성할 수 있고, 상호작용 폴리펩티드에의 결합에서 상기 잔기를 모방하고 따라서 상호작용하는 폴리펩티드에 헬리코박터 필로리 폴리펩티드가 결합하는 것을 저해하며 이로써 헬리코박터 필로리의 기능을 장애하는 펩티드 모방 화합물 (예를 들면, 디아제핀 또는 이소퀴놀린 유도체)를 생산할 수 있다. 예를 들면, 상기 잔기의 비가수분해성 펩티드 유사체를 벤조디아제핀 (예를 들면, Freidinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands. 1988), 아제핀 (예를 들면, Huffman et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands. 1988), 치환된 감마 락탐 고리 (Garvey, in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands. 1988), 케토-메틸렌 의사펩티드 (Ewenson et al. (1986) J med Chem 29:295; 및 Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th Amercan Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), β-터언 디펩티드 코어 (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26:647; 및 Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1:1231), β-아미노알콜 (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419; 및 Dann et al (1986) Biochem Biophys Res Commun 1234:71)을 이용하여 제조할 수 있다.
VI. 헬리코박터 필로리 핵산 및 폴리펩티드에 대한 백신 제형화
본 발명은 또한 헬리코박터 필로리에 의한 감염에 대항한 방어 또는 헬리코박터 필로리 감염의 치료를 위한 백신 조성물 또는 제형(서로 바꾸어 사용 가능)을 특징으로 한다. 용어 "헬리코박터 필로리 감염의 치료"는 존재하거나 만성 헬리코박터 필로리 감염의 치료적 처리를 의미한다. 용어 "헬리코박터 필로리 감염에 대항한 방어" 또는 "예방적 처리"는 헬리코박터 필로리 감염 위험이 있는 대상의 감염 위험을 저하시키거나 감염을 억제하는 헬리코박터 필로리 백신 제형의 사용을 의미한다. 한 실시형태에서, 백신 조성물은 헬리코박터 필로리로부터 단리된 표면 단백질과 같은 1종 이상의 면역원 성분 또는 그의 일부, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 예를 들어, 한 실시형태에서 본 발명의 백신 제형은 동일하거나 상이한 헬리코박터 필로리 항원으로부터 단리된 표면 단백질과 같은 헬리코박터 1종 이상의 필로리 폴리펩티드 또는 조합물을 함유한다. 본 발명의 제형에 사용되는 핵산 및 헬리코박터 필로리 폴리펩티드는 서열목록에 나타낸 핵산 및 폴리펩티드, 바람직하게는 표면 단백질을 코딩하는 헬리코박터 필로리 핵산 및 표면 단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 바람직한 핵산 및 헬리코박터 필로리 폴리펩티드는 표 1에 제시된 세포 엔벨로프 단백질을 코딩하는 핵산 및 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 단백질로부터 선택된다. 그러나, 세포 중에서 발현할 수 있는 면역원 헬리코박터 필로리 단백질 또는 그의 일부를 코딩하는 어떠한 핵산이라도 본 발명에서 사용될 수 있다. 이 백신은 치료 및(또는) 예방에 있어 유용성을 갖는다.
본 발명은 한 측면은 헬리코박터 필로리 단백질의 면역원 단편 1종 이상 및 제약학적으로 하용가능한 담체를 함유하는, 헬리코박터 필로리에 의한 감염에 대항한 방어를 위한 백신 조성물을 제공한다. 바람직한 단편에는 길이가 약 10개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 10 내지 20개 아미노산 잔기, 보다 바람직하게 약 12 내지 16 아미노산 잔기인 펩티드가 포함된다.
본 발명의 면역원 성분은 예를 들면 전체 길이 헬리코박터 필로리 단백질을 코딩하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합법에 의해 생산된 폴리펩티드를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 또한, 종래의 Merrifield 고체상 f-MOC 또는 t-BOC 화학법과 같이 당업계에 공지된 기술을 사용하여 단편을 화학적으로 합성할 수 있다.
한 실시형태에서, 면역원 성분은 펩티드의 T 세포 자극 능력으로 확인할 수 있다. T 세포를 자극하는 펩티드를 본 명세서에서는, 예를 들면 T 세포 급증 또는 시토킨 분비로 판정할 수 있으므로 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 함유하는 것으로 정의한다. T 세포 에피토프는 알레르기의 임상적 증상의 원인인 알레르겐 단백질에 대한 면역 응답의 개시 및 보존과 관련이 있다고 생각된다. 이 T 세포 에피토프는 항원이 존재하는 세포의 표면에 적당한 HLA 분자를 결합시킴으로써 T 헬퍼 세포 수준에서 조기 작업을 시발하여 이로써 상기 에피토프에 대한 관련 T 세포 리셉터와 함께 T 세포 부차집단을 자극한다고 생각된다. 이러한 작업으로 T 세포 급증, 림포카인 분비, 국부적인 염증 반응, 부가적인 면역 세포의 항원/T 세포 상호작용 부위에로의 보충, 및 B 세포 캐스캐이드의 활성화를 초래하여 항체를 생산하게 된다. T 세포 에피토프가 기본 요소 또는 T 세포 리셉터에 의한 최소 인식 단위이고, 여기서 이 에피토프는 리셉터 인식에 필수적인 아미노산 (예를 들면, 약 6 또는 7개 아미노산 잔기) 들을 포함한다. T 세포 에피토프의 서열을 모방하는 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 있다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 면역원 성분은 게놈 백신 처리를 통하여 동정된다. 기본 프로토콜은 병원체 게놈, 예를 들어 헬리코박터 필로리 게놈의 전부 또는 일부로 구성되는 발현 라이브러리는 유전학적인 숙주의 면역 처리에 사용시에 방어를 제공할 수 있다는 생각에 기초한 것이다. 이 발현 라이브러리 면역처리(ELI)는 발현 클로닝에 유사하고, 유전자 백신으로서 작용할 수 있는 플라스미드로 병원체, 예를 들어 헬리코박터 필로리의 게놈 발현 라이브러리가 도입되는 것을 저하시킴을 수반한다. 또한, 플라스미드는 체액 반응을 크게 자극할 수 있는 유전자 보조물이 먼 부위에 도입되어 세포내 및 세포외에서 잘 작용할 수 있다.
이것은 살아있는/약독화시킨 병원체의 많은 잇점을 갖고 감염 위험이 적은 백신 생성을 위한 새로운 방법이다. 병원체 DNA의 발현 라이브러리를 사용하여 숙주를 면역처리하고 이에 의해 위험이 없이 살아있는 백신의 항원 제공 효과를 생성시킨다. 예를 들어, 본 발명에서 헬리코박터 필로리 게놈 또는 코스미드 또는 플라스미드 클론으로부터의 무작위 단편 및 게놈 서열 결정에 의해 확인된 유전자로부터의 PCR 생성물을 사용하여 숙주를 면역처리할 수 있다. 상기 방법의 실행 가능성은 마이코플라스마 풀모니스(Mycoplasma pulmonis) (Barry et al., Nature 377:632-635, 1995)를 사용하여 입증되었고, 여기서 설치류의 천연 병원체인 마이코플라스마 풀모니스의 부분적인 발현 라이브러리인 경우에도 병원체의 도전에 대해 보호를 제공하였다.
ELI는 후보 유전자를 스크리닝하기 위해 면역 시스템을 사용하기 때문에, 병원체의 생물학에 대해 잘 모르는 경우에도 여러 부분으로 나뉜 비감염성 백신을 생산할 수 있는 기술이다. 일단 단리된 후에는, 이들 유전자는 유전자 백신으로서 또는 재조합 단백질 백신의 개발을 위해 사용될 수 있다. 따라서, ELI는 체계적인, 주로 기계적인 방식으로 백신을 생산할 수 있다.
면역원 성분의 스크리닝은 1종 이상의 몇몇 상이한 분석법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 생체외에서 펩티드 T 세포 자극 활성은 판정된 또는 면역원이라고 추정되는 펩티드를, T 세포 배양 중에 적당한 MHC 분자를 제공하는, 항원이 존재하는 세포와 접촉시킴으로써 분석한다. 적당한 MHC 분자와 함께 면역원 헬리코박터 필로리 펩티드를 필요 동시 자극과 함께 T 세포에 제공하면 T 세포에 시그널을 전달하여 시토킨, 특히 인터루킨-2 및 인터루킨-4의 생산 수준을 증가시킨다. 배양 상등액을 얻어 인터루킨-2 또는 다른 공지된 시토킨에 대해 분석할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 종래의 인터루킨-2 분석법 중 어느 것이라도 사용가능하다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 인용되는 문헌 [Proc. natl. Acad. Sci USA, 86: 1333 (1989) 에 기재된 분석법을 사용할 수 있다. 인터페론의 생산을 위한 분석용 킷트도 또한 젠자임 코포레이션 (Genzyme Corporation, 매사츄세츠주 캠브리지 소재) 에서 시판하고 있다.
별법으로, T 세포 급증에 대한 일반적인 분석법은 삼중 티미딘 도입량 측정을 수반한다. T 세포의 급증은 배양 세포의 복제 DNA에 도입된3H-표지된 티미딘의 양을 결정함으로써 생체외에서 측정할 수 있다. 따라서, DNA 합성 속도 및 세포 분열 속도를 정량할 수 있다.
1 이상의 면역원 성분 (예를 들면, 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산)을 함유하는 본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. "제약학적으로 허용가능한 담체"란 용어는 제약 투여에 적합한 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하는 의미이다. 적당한 제약학적으로 허용가능한 담체에는 예를 들면 1종 이상의 물, 염수, 인산 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합이 있다. 제약학적으로 허용가능한 담체는 헬리코박터 필로리 핵산 또는 폴리펩티드의 저장 수명 또는 효과를 증진시키는 습윤화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다. 헬리코박터 필로리를 함유하는 본 발명의 백신 제제에 있어서는 이 폴리펩티드를 적당한 보조약 및(또는) 전달 시스템과 함께 동시 투여할 수 있다.
당업계의 당업자들은 본 발명의 DNA 또는 단백질의 치료 유효량이 투여 스케줄, 투여되는 헬리코박터 필로리 핵산 또는 폴리펩티드의 단위 투여량, 단백질 또는 DNA가 다른 치료제와 함께 투여되는지 여부, 환자의 면역 상태 및 건강도, 및 특정 단백질 또는 DNA의 치료 활성에 따라 좌우됨이 알 것이다.
백신 조성물은 통상 비경구, 예를 들면 피하 또는 근육내 주사에 의해 통상적으로 투여된다. 근육내 면역 처치 방법은 하기 문헌에 기재되어 있다. 문헌 [Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468 및 Sedegah et al. (1994) Immunology 91:9866-9870]. 다른 투여 방법에는 경구 및 폐 제형, 좌약 및 피부 도포형이 포함된다. 경구 면역 처치가 헬리코박터 필로리에 의한 감염에 대한 방어를 유발하는 데 있어 비경구 방법보다 바람직하다. [Czinn et al., (1993) Vaccine 11:637-642]. 경구 제형에는 통상 사용되는 부형제가 포함되며, 예로는 제약 등급의 만니톨, 락토오즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 쇼듐 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등이 있다.
본 발명의 백신 조성물은 보조약을 포함할 수 있으며, 그 예에는 수산화알루미늄; N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP); N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, 노르-MDP로 칭함); N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1',2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시프로스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835A, MTP-PE로 칭함); RIBI (세균으로부터의 3가지 성분을 함유함); 모노포스포릴 지질 A; 트레할로즈 디마이코로에이트; 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀젼 중의 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS); 및 콜레라 독소가 포함되며, 이에 한정지는 않는다. 사용될 수 있는 다른것으로는 B 서브유닛을 비롯하여 콜레라 독소의 비독성 유도체 및(또는) 콜레라 독소 또는 그의 B 서브유닛과 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 접합체 또는 유전학적으로 조작된 융합체, 프로콜렐라게노이드, 슈이조필란을 비롯한 진균 다당류, 뮤라밀 디펩티드, 뮤라밀 디펩티드 유도체, 포르볼 에스테르, 이. 콜라이의 불안정한 독소, 비 헬리코박터 필로리 용균물, 블록 중합체 또는 사포닌이 있다.
또다른 실시형태에서, 백신 제제는 제약상 허용되는 담체로서 전달 시스템을 포함한다. 본 발명의 백샌 제제에 사용하기 적합한 전달 시스템에는 생분해성 마이크로캡슐 또는 면역-자극 복합체 (ISCOM), 코킬레이트, 또는 리포좀, 바이러스 또는 세균과 같이 유전학적으로 조작된 약독화된 생백터, 및 재조합 (키메라형) 바이러스-유사 입자, 예를 들면 bluetongue가 포함된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 백신 제제는 전달 시스템 및 보조약을 모두 포함한다.
인간에서의 전달 시스템은 융합 단백질로서 불용성 형태의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 포함하여 위의 산성 환경으로부터 항원을 보호하는 장애 방출 캡슐을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신에 적합한 담체는 장용피 캡슐 및 폴리락티드-글리콜리드 미소구이다. 적합한 희석액은 0.2N NaHCO3및(또는) 염수이다.
본 발명의 백신은 성인 또는 아동에게 1차 예방제로서, 감염 숙주내에서 헬리코박터 필로리를 성공적으로 없앤 후에 2차 예방으로서, 또는 헬리코박터 필로리에 감염되기 쉬운 숙주에 있어 면역 반응을 유발할 목적으로 치료제로서 투여할 수 있다. 본 발명의 백신은 당업계의 통상의 지식을 가지 사람이면 쉽게 결정할 수 있는 양으로 투여된다. 따라서, 성인의 경우 적당한 투여량은 10㎍ 내지 1 g, 바람직하게는 10 ㎍ 내지 100 mg, 예를 들면 50 ㎍ 내지 50 mg의 범위이다. 성인의 적당한 투여량은 또한 5 ㎍ 내지 500 mg이다. 유사한 투여량 범위가 아동에게도 해당된다.
보조약의 사용량은 사용된 보조약의 유형에 따라 좌우된다. 예를 들면 뮤코살 보조약이 콜레라 독소이면, 5 ㎍ 내지 50 ㎍, 예를 들면 10 ㎍ 내지 35 ㎍의 양을 사용하는 것이 적당하다. 마이크로캡슐의 형태를 사용되는 경우에 사용량은 원하는 투여량를 달성하기 위해 마이크로캡슐의 매트릭스에 사용되는 양에 따라 좌우된다. 이러한 양은 당업계에 통상의 지식으로 가진 자라면 결정할 수 있을 것이다.
당업계의 숙련자라면 최적 투여량이 환자의 체중, 질병, 투여 경로 및 다른 요인들에 따라 다소 좌우될 수 있음을 알 것이다. 당업계의 숙련자라면 또한 적당한 투여량 수준이 공지된 경구 백신에 있어 그 결과에 기초하여 얻어지며, 예를 들면 이. 콜라이 용균물을 기재로 한 백신의 경우 1일 총 투여량이 6 mg 내지 540 mg이고, 장독소원 이. 콜라이 정제 항원은 1 mg을 4회 투여한다 (Schulaman et al., J. Urol. 150:917-921 (1993); Boedecker et al., American Gastroenterological Assoc. 999; A-222 (1993)). 투여 횟수는 질병, 제형 및 임상 시도의 효능 자료에 따라 좌우된다. 치료 코스에 대해 어떠한 한정을 두려하는 것은 아니지만, 1 개월에 걸쳐 1차 면역 처치 스케줄 동안 3 내지 8회 투여로 치료를 할 수 있다. (Boedeker, American Gastroenterological Assoc. 888:A-222 (1993)).
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 백신 조성물은 표면에서 발현된 본 발명의 헬리코박터 필로리 단백질의 면역원 단편을 갖는 죽은 전체 이. 콜라이 제제를 주성분으로 하거나, 또는 죽은 이. 콜라이가 담체 또는 보조약으로 기능하는 이. 콜라이 용균물을 주성분으로 할 수도 있다.
본 발명의 백신 조성물 중 몇몇은 헬리코박터 필로리 감염을 방지하는데만 유용하고, 몇몇은 헬리코박터 필로리 감염을 치료하는데만 유용하며, 몇몇은 헬리코박터 필로리 감염의 방지와 치료에 모두 유용함이 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 바람직한 예로, 본 발명의 백신 조성물은 헬리코박터 필로리에 대항해 호르몬 및(또는) 세포-매개 면역에 의해 헬리코박터 필로리 감염에 대항하여 방어한다. 헬리코박터 필로리 감염으로 야기된 질병을 치료하는데 사용되는 약물 투여량의 감소 또는 환자의 혈청 또는 점막에서의 항체 생산을 증가시키는 것을 비롯하여, 헬리코박터 필로리 감염의 임의의 증상을 개선하는 것이 원하는 임상 목표임은 물론이다.
VII. 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 반응성인 항체
본 발명은 또한 대상 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 특이적으로 반응성인 항체를 포함한다. 항-단백질/항-펩티드 항혈청 또는 모노클로날 항체는 표준 프로토콜에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 하기 문헌 참조. 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow 및 lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)]. 마우스, 햄스터 또는 라빗과 같은 포유동물을 펩티드의 면역원 형태로 면역 처치할 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 대한 면역원성을 부여하는 기술에는 담체로의 접합 또는 당업계에 널리 공지된 다른 기술들이 포함된다. 대상 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 면역원 분량을 보조약의 존재하에 투여할 수 있다. 면역 처치의 진전은 혈장 또는 혈청의 항체 역가를 검출함으로써 모니터링할 수 있다. 표준 ELISA 또는 다른 면역 분석을 항원으로서의 면역원과 함께 사용하여 항체의 수준을 평가할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 대상 항체는 본 발명의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 항원 결정인자, 예를 들면 서열 목록에 기재된 본 발명의 폴리펩티드의 항원 결정인자, 또는 밀접하게 관련된 사람 또는 사람외의 포유 동물 상동체 (예를 들면, 90% 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성)에 대해 면역특이성이다. 또다른 바람직한 본 발명의 예로, 항 헬리코박터 필로리 항체는 예를 들면 서열 표에 기재된 본 발명의 서열에 80% 미만이 상동성인 단백질과는 실질적으로 교차 반응을 하지 않는다 (즉, 특이적으로 반응하지 않는다). "실질적으로 교차 반응하지 않는"이란 그 항체가 서열 목록에 기재된 본 발명의 특정 단백질에 대한 결합 친화도의 10 % 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만인 비-상동성 단백질에 대한 결합 친화도를 가짐을 의미한다. 가장 바람직한 예로, 세균과 포유 동물 항원 사이에는 교차 반응성이 없다.
본 명세서에서 사용된 항체란 용어는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와도 특이적으로 반응성인 그의 단편도 포함하는 것으로 쓰인다. 항체는 통상의 기술을 이용하여 단편화시킬 수 있고 전 항체에 대해 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 단편을 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, F(ab')2단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 만들 수 있다. 생성된 F(ab')2단편 중의 이황화물 다리를 환원 처리하여 Fab' 단편들을 생산할 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 항 헬리코박터 필로리 부분을 갖는 양특이적 및 키메라 분자를 포함하는 것으로 쓰인다.
헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 헬리코박터 필로리 변이체에 대항해 지시되는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 Fab' 및 F(ab')2 와 같은 항체 단편을 사용하여 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 작용을 차폐할 수 있고, 이상 신호 또는 원하지 않는 신호 시에 본 발명의 특정 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 역할과 헬리코박터 필로리의 정상 세포 기능에 대한 연구가 본 발명의 항-헬리코박터 필로리 항체의 미세 주사에 의해 가능하다.
헬리코박터 필로리 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체도 헬리코박터 필로리 항원의 발현 양 및 패턴을 평가하기 위하여 조직 시료의 면역 조직 화학적 염색에 사용할 수 있다. 항 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 항체를 면역-침강 및 면역-블롯팅으로 진단에 사용하여 임상 시험 절차로서 조직 또는 체액에서의 헬리코박터 필로리 수준을 검사 및 평가할 수 있다. 마찬가지로, 개체에서의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 수준을 모니터링하는 능력을 통해 그런 질병으로 고통을 겪는 개체에 대한 소정 치료 방식의 효능을 결정할 수 있다. 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 수준은 소변 시료와 같은 체액에 있는 세포에서 측정할 수도 있고, 또는 위장 생체 검출로 만들어지는 바와 같이 조직에서 측정할 수도 있다. 항 헬리코박터 필로리 항체를 이용한 진단 분석에는 예를 들면 헬리코박터 필로리 감염의 조기 진단을 돕도록 설계된 면역분석법도 포함된다. 본 발명은 특이적 헬리코박터 필로리 항원을 사용하여 이 세균에 의해 감염된 개체로부터 시료에 담긴 항체를 검출하는 방법으로서도 사용할 수 있다.
본 발명의 항 헬리코박터 필로리 항체의 또다른 응용은 λgt11, λgt18-23, λZAP 및 λORF8과 같은 발현 벡터에서 제조된 cDNA 라이브러리의 면역학적 스크리닝에서 이다. 정확한 해독 프레임에 삽입된 코딩 서열 및 배향을 갖는 이러 유형의 메신저 라이브러리는 융합 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들면, λgt11은 아미노 말단이 β-칼락토시다제 아미노산 서열이고 카르복시 말단이 외래 폴리펩티드로 구성되는 융합 단백질을 생산할 수 있다. 그 다음에, 대상 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 항원 에피토프를 항체, 예를 들면 감염된 플레이트로부터 이동된 니트로셀룰로스 필터를 항 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 항체와 반응시켜 검출할 수 있다. 이어서, 이 분석법으로 점수가 매겨진 파지를 감염 플레이트로부터 단리시킬 수 있다. 이리하여, 헬리코박터 필로리 유전자 상동체를 검출하여 다른 종으로부터 클로닝할 수 있고, 대체 유사형태 (스플라이싱 변이체 포함)를 검출, 클로닝할 수 있다.
VIII. 본 발명의 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 함유하는 킷트
본 발명의 핵산, 폴리펩티드 및 항체를 다른 시약 및 물품과 조합하여 킷트를 형성할 수 있다. 진단용 킷트는 통상 바이알 또는 다른 적당한 용기 내의 핵산, 폴리펩티드 또는 항체로 이루어진다. 킷트는 통상 혼성화 반응, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 수행을 위한, 또는 동결건조 성분의 재용해를 위한 다른 시약들, 예를 들면 수성 매질, 염, 완충액등을 포함한다. 킷트는 또한 세정제, 카오트로픽제 등과 같은 시료 처리용 시약을 포함할 수도 있다. 킷트는 또한 입자, 지지체, 벽, 계량봉 등과 같은 고정 수단을 포함할 수도 있다. 킷트는 또한 염료, 전개제, 방사성동위원소, 발광제, 형광제 또는 화학형광제, 효소, 삽입제 등와 같은 표지 수단을 포함할 수도 있다. 본 명세서에 제공된 핵산 및 아미노산 서열의 경우, 당업계의 숙련자라면 특정 목적에 맞게 용이하게 킷트를 조립할 수 있을 것이다. 또한, 킷트에 사용 지침을 포함시킬 수 있다.
IX. 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 이용한 약물 스크리닝 분석
이용가능한 정제 및 재조합 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 제조함으로써 본 발명은 대상 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 정상 세포질 기능, 또는 세포질간 신호에서의 작용에 대한 아고스트 또는 길항제인 약물을 스크리닝하는데 사용될 수 있는 분석법을 제공한다. 이러한 저해제 또는 효능제는 사람의 헬리코박터 필로리 감염 치료에 신규한 치료제로서 유용할 것이다. 각종 분석법이 만족스러울 것이고 본 발명에 비추어 당업자에게 이해될 것이다.
화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 시험하는 많은 약물 스크리닝 프로그램에 있어서, 소정 시간 동안 운반되는 화합물의 수를 최대화하기 위하여 고처리량 분석법이 바람직하다. 정제 또는 반정제 단백질로 유래될 수 있는 것처럼 무세포 시스템으로 수행되는 분석이 시험 화합물에 의해 매개되는 분자 표적의 변경을 신속하게 전개하고 비교적 용이하게 검출할 수 있도록 제조할 수 있는 "1차" 스크린으로서 종종 바람직하다. 또한, 시험 화합물의 세포 독성의 효과 및(또는) 생체내 이용율을 생체외 시스템에서 일반적으로는 무시할 수 있고, 대신에 분석은 분자 표적의 효소 특성 변화 또는 다른 단백질과의 결합 친화도 변경에 나타날 수 있는 바와 같이 분자 표적에 대한 약물의 효과에 주로 초점을 맞춘다. 따라서, 본 발명의 실험 스크리닝 분석에서는 해당 화합물을 단리 및 정제 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 접촉시킨다.
스크리닝 분석은 폴리펩티드의 활성이 검출가능한 반응 생성물을 생산하는 정도로 효소 활성을 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드와 같은 정제 헬리코박터 필로리 또는 그의 단편과 생체외에서 제조한다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 사험 화합물을 사용하여 얻어진 자료로부터 투여량 응답 곡선을 만들어 평가할 수 있다. 또한, 비교를 위한 기준선을 제공하기 위하여 대조 분석도 할 수 있다. 적당한 생성물은 특유 흡광도, 형광, 화학-발광 특성을 갖는 것들을, 예를 들면 용이하게 자동 검출할 수 있기 때문에 포함한다. 각종 합성 또는 천연 화합물을, 이 분석법으로 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 활성을 저해 또는 증진하는지에 대해 시험할 수 있다. 이들 활성 화합물 중의 몇몇은 직접, 또는 막 통과성 또는 용해성을 촉진하도록 화학적으로 변경시켜 전체적으로 생 헬리코박터 필로리 세포와 동일한 활성 (예를 들면, 효소 활성)을 저해 또는 증진시킬 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 본원에서 언급되는 모든 참고 문헌 및 공개된 특허 출원은 본원에 참고로 포함된 것이다.
I. 헬리코박터 필로리 DNA의 클로닝 및 서열 결정
하기 문헌에 개괄된, 사소하게 변형된 기본 DNA 프로토콜에 따라 헬리코박터 필로리 염색체 DNA를 단리했다. 문헌[Schleif R.F. 및 Wensink P.C., Practical Methods in Molecular Biology, p.98, Springer-Verlag, NY., 1981]. 간략하게, 세포를 펠렛화하고, TE (10 mL Tis, 1 mM EDTA, pH 7.6)에 재현탁시키고, GES 용해 완충액 (5.1 M 구아니듐 티오시아네이트, 0.1 M EDTA, pH 8.0, 0.5% N-라우릴사르코신)를 첨가했다. 현탁액을 냉각시키고 아세트산암모늄 (NH4Ac)를 2.0 M의 최종 농도로 첨가했다. DNA를 먼저 클로포름, 그 다음 페놀-클로로포름으로 추출하고 클로로포름으로 재추출했다. DNA를 이소프로판올로 침전시키고, 70% EtOH로 2회 세척하고, 건조시키고 TE 중에 재현탁시켰다.
단리 후에, 전체 게놈 헬리코박터 필로리 DNA를 2000 bp의 중간 크기로 분무시켰다 (Bodenteich et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (J.C. Venter, ed), Academic Press, 1994). 분무후에, DNA를 농축시키고 표준 1% 세파로스 겔 상에서 분리시켰다. 약 크기 900 내지 1300 bp, 1300 내지 1700 bp, 1700 내지 2200 bp, 2200 내지 2700 bp에 상응하는 몇몇 분획을 겔로부터 절단하고 GeneClean 절차 (Bio 101, Inc.)에 의해 정제했다.
이어서, 정제된 DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트 말단으로 만들었다. 이어서, 처리된 DNA를 특이한 BstXI-링커 어댑터 100 내지 1000 배 몰과량에 리게이션시켰다. 이 링커는 BstXI-절단된 pMPX 벡터에 대해 상보적이며, 오버행(overhang)는 자체 상보성이 아니다. 따라서, 이들 링커는 그자체로 용이하게 재리게이션하는 절단-벡터이다. 링커-채택 삽입체를 1% 아가로스 겔 상에서 미삽입 링커로부터 분리시키고 GeneClean을 사용하여 정제했다. 이 링커-채택 삽입체를 각각의 20종 pMPX 벡터에 리게이션시켜 일련의 "샷건" 서브클론 라이브러리를 제조했다. 이 벡터는 어댑터-이량체가 클로닝된 경우에 인-프레임(in-frame)으로 되는 클로닝 부위에 이웃-오브-프레임(out-of-frame)의 lacZ 유전자를 함유하여 청색을 방지할 수 있다.
모든 후속 단계들은 하기 문헌에 개괄되어 있는 다중 DNA 서열 결정 프로토콜을 기초로 하였다. 문헌[Church G.M. 및 Kieffer-Higgins S., Science 240: 185-188, 1988]. 프로토콜에 대한 주된 변형만을 강조하고자 한다. 간략하게, 각 20종 벡터를 DH5α의 적절한 세포 (Gibco/BRL, DH5α 형질전환 프로토콜)에 형질전환시켰다. 암피실린, 메티실린 및 IPTG/Xgal을 포함하는 항생제 플레이트 상에 도포하여 이 라이브러리를 평가했다. 플레이트를 37 ℃에서 밤새도록 인큐베이션했다. 그 다음에, 성공적인 형질전환체를 클론의 착상 및 다수의 풀로의 풀링을 위해 사용했다. 클론을 취해 40 ml 증식 배지에 풀링했다. 배지를 37 ℃에서 밤새도록 증식시켰다. DNA를 Qiagen Midi-pre 킷트 및 Tip-100 칼럼 (Qiagen, Inc.사 제품) 을 이용하여 정제했다. 이런 방식으로, 풀 당 100 ㎍의 DNA를 얻었다. 15개의 DNA 96-웰 플레이트를 만들어 평균 판독 길이가 250 내지 300개 염기로 추정되는 5 내지 10 배 서열 중복물을 얻었다.
이 정제된 DNA 시료를 화학 분해 방법에 기초한 다수 DNA 서열 결정법 (Church G.M. 및 Kieffer-Higgins S., Science 240:185-188, 1988)을 사용하거나, 또는 세퀴트렘 (Epicenter Technologies) 디데옥시 서열 결정 프로토콜에 의해 서열 결정하였다. 서열 결정 반응을 전기 영동하고 40 cm 겔로부터 직접 이동 전기 영동에 의해 (Richterich P. 및 Church G.M., Methods in Enzymology 218:187-222, 1993) 또는 일렉트로블롯팅 (Church, 상기 문헌)에 의해 나일론 막 상에 이동시켰다. 겔 당 24개 시료를 주행시켰다. 45개의 성공적인 막을 화학적 서열 결정에 의해 생산했고 8개가 디데옥시 서열 결정에 의해 생산되었다. DNA를 자외선광에 노출시켜 막에 공유결합시키고, 벡터의 tag 서열에 대해 상보적인 표지된 올리고뉴클레오티드와 혼성화시켰다 (Church, 상기 문헌). 이 막을 세정하여 비-특이적으로 결합된 프로브를 헹궈내고, X-선 필름에 노출시켜 각각의 서열 사다리를 가시화했다. 자동 방사성 사진을 찍은 후에, 혼성화된 프로브를 65 ℃에서 인큐베이션하여 제거하고, 막이 화학적 서열 결정 막의 경우 38배 및 디데옥시 서열 결정 막의 경우 10배 프로빙될 때까지 다른 tag 서열과 함께 혼성화 주기를 반복했다. 이리하여, 각각의 겔은 매우 다수의 필름을 생산했고, 각각은 신규한 서열 결정 정보를 담고 있다. 새로운 블롯팅을 진행하면 언제나, 그것은 초기에 각각의 풀에 첨가된 내부 표준 서열에 프로빙되었다.
상기 막의 디지털 화상을 레이저 주사 덴시토메터 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 만들었다. 디지털화된 화상을 컴퓨터 워크스테이션 (VaxStation 4000's) 에서 프로그램 REPLICA(상표명)을 사용하여 처리했다 (Church et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (J.C. Venter, ed.), Academic Press, 1994). 화상 처리에는 레인 직선화, 농도 차이를 줄이기 위해 대조 조정, 및 반복 가우스 탈회선에 의한 해상도 증진이 포함된다. 그다음, 이 서열을 REPLICA에서 자동적으로 택하여 프로젝트 데이터베이스에 저장하기 전에 상호 교정을 위해 디스플레이했다. 필름 화상의 고속 가시 주사와 이어서 디스플레이된 화상의 밴드상에 마우스를 클릭하여 베이스콜을 변형함으로써 교정했다. 게놈 DNA의 동일 부분을 커버하는 다수의 서열 판독물이 편집에 있어 적당한 서열 중복을 제공하므로 많은 서열 에러가 검출되고 교정될 수 있다. 각 서열은 확인 번호를 자동적으로 부여받는다 (확인 번호는 마이크로타이퍼 플레이트, 프로브 정보 및 레인 셋트 번호에 상응한다). 이 번호는 특별한 데이터베이스에 의존하지 않고 임의 특정 서열의 원천을 확인하는 것이 가능하도록 서열의 영구적인 확인 표시로서 사용된다.
프로그램 FALCON (Church, Church et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (J.C. Venter, ed.), Academic Press, 1994)를 사용하여 헬리코박터 필로리 서열의 통상적인 조립을 수행하였다. 이 프로그램이 대부분의 서열에 대해 신속하고 믿을만하다고 판명되어 있다. 조립된 콘티그를 REPLICA(상표명)와 상호작용하는 제네틱스 컴퓨터 그릅(GCG) (Devereux et al., Nucleic Acid Res. 12:387-95, 1984) 이 개발한 GelAssemble 의 개정 버전을 사용하여 디스플레이했다. 이는 REPLICA(상표명) 데이타베이스로부터 다수의 서열 겔 화상을 동시에 불러들이는 것이 가능한 집적 에디터를 제공했고 조립물 중에 상이한 서열 판독물 사이의 차이가 있는 겔 트레이스의 교정 및 콘티그의 신속한 주사가 가능하도록 디스플레이했다.
II. 재조합 헬리코박터 필로리 DNA 서열의 확인, 클로닝 및 발현
헬리코박터 필로리로부터의 막 및 분비 단백질의 클로닝, 발현 및 정제를 용이하게 하기 위하여, 강력한 유전자 발현 시스템, 이. 콜라이 내에서의 재조합 단백질의 클로닝 및 발현을 위한 pET 시스템 (Novagen)을 선택했다. 또한, 재조합 단백질 생성물의 정제를 용이하게 하기 위하여 펩티드 태그, His-Tag를 코딩하는 DNA 서열을 해당 DNA 서열의 3' 말단에 융합시켰다. 임의 5' 말단 시그널 서열의 교체를 피하기 위하여 융합에 3' 말단을 선택했다. 발현 연구에서 대조용으로 사용되는 클로닝된 유전자인 ppiB는 예외이다. 이 연구에서, 헬리코박터 필로리 ppiB의 서열은 이 유전자의 단백질 생성물이 시그널 서열을 함유하지 않고 세포질졸 단백질로서 발현되기 때문에 전체 길이 유전자의 5' 말단에 융합된 His-Tag를 코딩하는 DNA 서열을 함유한다.
헬리코박터 필로리의 J99 균주로부터의 막 및 분비 단백질에 대한 ORF를 함유하는 DNA 서열의 PCR 증폭 및 클로닝
헬리코박터 필로리의 J99 균주로부터 클로닝용으로 (본 발명의 DNA 서열 목록으로부터) 선택된 서열을 증폭 클로닝을 위해 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 제조했다. 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 5' 및 3' 말단에 대해 특이성인 합성 올리고클레오티드 프라이머 (표 4)를 설계하고 구입했다 (GibcoBRL Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). 모든 순방향 프라이머 (서열의 5' 말단에 대해 특이적임)가 최외 5' 말단에 NcoI 클로닝 부위를 함유하도록 설계하고, 단 HpSeq. 4821082 (서열 820)의 경우에는 NdeI를 사용했다. 이들 프라이머가 메티오닌 잔기, 이어서 발린 진기 및 천연 헬리코박터 필로리 DNA의 나머지에 대해 코딩 서열에서 단백질 해독의 개시를 허용하도록 설계했다. 개시제 메티오닌에 바로 이어 천연 헬리코박터 필로리 DNA 서열의 나머지 서열이 있는 헬리코박터 필로리 4821082 (서열 82)는 예외이다. 모든 역방향 프라이머 (임의 헬리코박터 필로리 ORF의 3' 말단에 대해 특이적)는 최외 5' 말단에 EcoRI 부위를 포함하므로 각각의 헬리코박터 필로리 서열을 pET-28b의 판독 프레임 내로 클로닝하는 것이 가능하다. pET-28B 벡터는 His-Tag를 포함하는 6개의 히스티딘 잔기 (최외 C-말단)를 비롯하여 추가의 20개 카르복시 말단 아미노산 (19개 아미노산만이 HpSeq. 26380138 (서열 658) 및 HpSeq. 14640637 (서열: 447)에 있음)을 코딩하는 서열을 제공한다. 앞서 지적한 바와 같이 ppiB 유전자의 벡터 제조에서는 예외이다. ppiB 유전자의 5' 말단에 특이성인 합성 올리고뉴클레오티드는 최외 5' 말단의 BamHI 부위를 코딩하고 ppiB 유전자의 3' 말단은 최외 5' 말단의 Xhol 부위를 코딩했다.
헬리코박터 필로리 (ATCC #55679)의 J99 균주로부터 제조된 게놈 DNA를 PCR 증폭 반응을 위한 주형 DNA 공급원으로서 사용했다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). 헬리코박터 필로리 ORF를 함유하는 DNA 서열을 증폭시키기 위하여, 게놈 DNA (50 나노그램)을 2 mM MgCl2, 정의된 헬리코박터 필로리 ORF에 상보적이고 측접하는 1 mM 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 (순방향 또는 역방향 프라이머), 0.2 mM의 각 데옥시뉴클레오티드 삼인산염; dATP, dGTP, dCTP, dTTP 및 2.5 유닛의 열안정성 DNA 폴리머라제 (Amplitaq, Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ, USA)를 100 mL의 최종 체적으로 함유하는 반응 바이알에 도입시켰다. 다음의 열 순환 조건을 사용하여 Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR System 9600 열 순환기를 사용하여 각 ORF에 대한 증폭 DNA 생성물을 얻었다.
단백질 26054702, 단백질 7116626, 단백질 29479681, 단백질 30100332 및 단백질 4821082;
94 ℃에서 2 분간 변성,
94 ℃에서 15초, 30 ℃에서 15초 및 72℃에서 1.5분 간 2회 순환
94 ℃에서 15 초, 55 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5분간 23회 순환
72 ℃에서 6분 동안 반응을 종결했다.
단백질 16225006;
94 ℃에서 2 분간 변성.
95 ℃에서 15초, 55 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5 분 간 25회 순환
72 ℃에서 6분 동안 반응을 종결했다.
단백질 4721061;
94 ℃에서 2 분간 변성.
94 ℃에서 15초, 36 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5 분 간 2회 순환
94 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5 분 간 23 회 순환
72 ℃에서 6 분 동안 반응을 종결했다.
단백질 26380318;
94 ℃에서 2 분간 변성.
94 ℃에서 15초, 38 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5 분 간 2회 순환
94 ℃에서 15 초, 62 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5 분 간 23 회 순환
72 ℃에서 6 분 동안 반응을 종결했다.
단백질 14640637;
94 ℃에서 2 분간 변성.
94 ℃에서 15초, 33 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5 분 간 2회 순환
94 ℃에서 15 초, 55 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5 분 간 30 회 순환
72 ℃에서 6 분 동안 반응을 종결했다.
헬리코박터 필로리 ppiB의 증폭 조건;
94 ℃에서 2 분간 변성.
94 ℃에서 15초, 32 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5 분 간 2회 순환
94 ℃에서 15 초, 56 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5 분 간 25 회 순환
72 ℃에서 6 분 동안 반응을 종결했다.
열 순환 반응의 종결 후에, 증폭된 DNA의 각 시료를 세정하고, 쿠아퀵 스핀 PCR 정제 킷트 (Qiaquick Spin PCR purification kit) (Qiagen Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 정제시켰다. 모든 증폭 DNA 시료를 제한 효소 NcoI 및 EcoRI로, 또는 HpSeq. 4821082 (서열 1309)의 경우에는 NdeI 및 EcoRI로 절단시켰다 (Current Protocols in Molecular Biology, John wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). 이어서, DNA 시료를 1.0 % NuSeive (FMC BioProducts, Rockland, ME USA) 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다. 브롬화에티듐 및 장파장 uv 조사에 노출시켜 DNA를 가시화했다. 이 아가로스 겔로부터 단리된 슬라이스에 함유된 DNA를 Bio 101 GeneClean Kit 프로토콜 (Bio 101 Vista, CA, USA)를 사용하여 정제시켰다.
헬리코박터 필로리 서열의 pET-28b 원핵 생물 발현 벡터 내로의 클로닝
pET-28b를 제한 효소 NcoI 및 EcoRI로, 또는 HpSeq. 4821082 (서열 820)의 경우에는 NdeI 및 EcoRI로 절단시킴으로써 클로닝을 위해 준비했다 (Current Protocols in Molecular Biology, John wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). ppiB 클로닝의 경우에, 삽입된 유전자의 5' 말단에 융합될 수 있는 His-Tag를 코딩하는 pET-28a 벡터를 사용하여 BamHI 및 XhoI 제한 효소로 절단시킴으로써 ppiB 유전자와의 클로닝을 위한 클로닝 부위를 만들었다.
절단 후에, DNA 삽입체를 미리 절단시킨 pET-28b 발현 벡터에 클로닝시켰고 (Current Protocols in Molecular Biology, John wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994), 예외로 ppiB의 증폭 삽입체는 pET-28a에 클로닝시켰다. 리게이션 반응의 생성물을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 이. 콜라이의 BL21 균주를 형질전환시켰다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994).
재조합 플라스미드를 사용한 수용 세균의 형질전환
표준 방법에 따라, 적절한 세균, 즉 이. 콜라이 BL21 균주, 또는 이. 콜라이 BL21 (DE3) 균주를 클로닝된 헬리코박터 필로리를 함유하는 재조합 pET 발현 플라스미드로 형질전환시켰다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). 간략하게, 리게이션 반응물 1 마이크로리터를 전기허용 세포 50 마이크로리터와 혼합하고 고전압 펄스를 걸고, 그 후에 시료를 0.45 밀리리터 SOC 배지 (0.5% 효모 추출물, 2.0% 트립톤, 10 Mm NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4및 20 mM 글루코스) 중에서 37 ℃에서 교반하면 1 시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 시료를 25 ㎍/ml 카나마이신 황산염을 함유하는 LB 한천평판 상에 도말하여 밤새도록 증식시켰다. 그 다음, BL21의 형질전환된 콜로니를 취해 분석하여 하기 기재된 바와 같이 클로닝된 삽입체에 대해 평가했다.
헬리코박터 필로리 서열을 갖는 재조합 pET 발현 플라스미드의 확인
pET-28b-헬리코박터 필로리 ORF로 형질전환된 각각의 BL21 클론을 상기 원래의 PCR 증폭 클로닝 반응에 사용된, 각 헬리코박터 필로리 서열에 대해 특이성인 동일한 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 클로닝된 삽입체를 PCR 증폭시킴으로써 분석했다. 성공적인 증폭 결과는 발현 벡터 내에 헬리코박터 필로리 서열이 합체되었음을 확증했다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994).
BL21 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA의 단리 및 정제
적절하게 클로닝된 헬리코박터 필로리 ORF를 함유하는 재조합 pET-28b 벡터의 각 클론을 취하여 LB 브로쓰 5 ml와 25 ㎍/ml 카나마이신 황산염 중에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 플라스미드 DNA를 퀴아겐 플라스미드 정제 프로토콜 (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA)를 사용하여 단리 및 정제했다.
이. 콜라이에서 재조합 헬리코박터 필로리 서열의 발현
클로닝 또는 플라스미드 제조를 위하여 pET 벡터를 임의의 이. 콜라이 K-12 균주, 예를 들면 HMS174, HB101, JM109, DH5 등에 전파시킬 수 있다. 발현용 숙주에는 T7 RNA 폴리머라제의 염색체 카피를 함유하는 이. 콜라이 균주가 포함된다. 이들 숙주는 박테리오파지 DE3의 용원균으로서 lacI 유전자, lcaUV5 프로모터 및 T7 RNA 폴리머라제에 대한 유전자를 함유하는 람다 유도체이다. T7 RNA 폴리머라제는 이소프로필-B-D-티오갈락토시다제 (IPTG)의 첨가에 의해 유발시키며, T7 RNA 폴리머라제는 T7 프로모터 및 해당 유전자를 함유하는 pET-28b와 같은 임의 표적 플라스미드를 전사시킨다. 사용 균주에는 BL21 (DE3) 가 포함된다 (Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., 및 Dubendorff, J.W. (1990) Meth. Enzymol. 185, 60-89).
재조합 헬리코박터 필로리 서열을 발현시키기 위하여, 상기 기재된 바대로 단리된 플라스미드 DNA 50 나노그램을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 적절한 BL21 (DE3) 세균 (pET 발현게 킷트의 일부로 노바겐사에서 공급함) 을 형질전환시켰다. lacZ 유전자 (베타-갈락토시다제)를 헬리코박터 필로리 재조합체 제조를 위해 기재된 바와 같은 pET-시스템으로 발현시켰다. 형질전환된 세포를 SOC 배지에서 1 시간 동안 배양하고, 이어서 배양물을 25 ㎍/ml 카나마이신 황산염을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅시켰다. 다음날, 세균 클로니를 풀링하고 카나마이신 황산염을 함유하는 LB 배지에서 600 nM에서 0.5 내지 1.0 O.D. 유닛의 광학 밀도까지 증식시키고, 이때에 1 mM IPTG를 3시간 동안 배지에 첨가하여 헬리코박터 필로리 재조합 DNA 제조물의 유전자 발현을 유도한다.
IPTG로 유전자 발현을 유발시킨 후에, 세균을 4 ℃에서 15 분 동안 3500xg에서 솔발(Sorvall) RC-3B 센트리퓨즈로 원심분리하여 펠렛화했다. 펠렛을 차가운 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCl 및 0.1 mM EDTA (STE 완충액) 50 ml에 재현탁시켰다. 이어서 세포를 4 ℃에서 2000xg로 20 분 동안 원심분리시켰다. 습윤 펠렛을 칭량하고 단백질 정제에 쓰일 때까지 -80 ℃로 동결시켰다.
III. 이. 콜라이로부터의 재조합 단백질 정제
분석 방법
정제된 단백질 제제의 농도는 아미노산 함량으로부터 계산된 흡광계수를 이용하여 분광사진측정법으로 정량했다 (Perkins, S.J. 1986 Eur. J. Biochem. 157, 169-180). 또한 표준으로서 소혈청 알부민을 사용하여 브래드포드법 (M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254), 및 로우리법, (O.H., Rosebrough, N., Farr, A.L. & Randall, R.J. (1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275쪽))으로 단백질 농도를 측정했다.
BioRad (Hercules, CA, USA)사로부터 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (12% 또는 4.0 내지 25 % 아크릴아미드 구배 겔)을 구입하여, 쿠마시 블루로 염색시켰다. 분자량 마커에는 라빗 골격근 미요신 (200 kDa), 이. 콜라이 갈락토시다제 (116 kDa), 라빗 근육 포스포릴라제 B (97.4 kDa), 소혈청 알부민 (66.2 kDa), 오브알부민 (45 kDa), 소 탄소 무수화제 (31 kDa), 대두 트립신 저해제 (21.5 kDa), 달걀 흰자 리소자임 (14.4 kDa) 및 소 아프로티닌 (6.5 kDa)가 포함된다.
1. 가용성 단백질의 정제
모든 단계는 4 ℃에서 수행했다. 동결 세포를 해동시키고, 5배 용적의 용해 완충액 (20 mM Tris, pH 7.9, 0.5 M NaCl, 5 mM 이미다졸과 10% 글리세롤, 0.1 % 2-머캅토에탄올, 200 ㎍/ml 리소자임, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 10 ㎍/ml 각각의 루펩틴, 아프로티닌, 펩스타틴, L-1-클로로-3-[4-토실아미도]-7-아미노-2-헵타논 (TLCK), L-1-클로로-3-[4-토실아미도]-4-페닐-2-부타논 (TPCK), 및 대두 트립신 저해제) 에 재현탁시키고, 소용적 마이크로플루이다이저 (Model M-110S, Microfluidics International Corporation, Newton, MA)를 통하여 수회 통과시켜 파열시켰다. 생성된 0.1 % Brij 35로 만들고 100,000xg에서 1 시간 동안 원심분리시켜 맑은 상등액 (조 추출물)을 얻었다.
0.8 ㎛ 서포 필터 (Gelman Sciences, FRG)를 통하여 여과한 후에, 조 추출물을 5 ml의 베드 용적으로 10% 글리세롤, 0.1% Brij 35 및 1 mM PMSF를 함유하는 용해 완충액으로 미리 평형을 맞춘 Ni2+니트로트리아세테이트-아가로스 (NTA) 상에 직접 적하했다 (Hochuli, E., Dbeli, H., 및 Schacheer, A. (1987) J. Chromatography 411, 177-184). 이 칼럼을 10% 글리세롤, 0.1% Brij 35를 함유하는 용해 완충액 250 ml (베드 용적의 50배)로 세정하고, 후속 단계로 10% 글리세롤, 0.05% Brij 35, 1 mM PMSF 및 20, 100, 200 및 500 mM 아미다졸을 함유하는 용해 완충액으로 연속적으로 용출시켰다. 분획을 OD280nm에서의 흡광도로 모니터링하고, 피크 분획을 SDS-PAGE로 분석했다. 재조합 단백질을 함유하는 분획은 100 mM 이미다졸로 용출되었다.
재조합 단백질 14640637 및 단백질, 베타-갈락토시다제 (lacZ) 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 아이소머라제 (ppiB)
Ni2+-NTA 아가로스 칼럼으로부터의 재조합 단백질을 함유하는 분획을 풀링한 다음 원심 분리 여과(Centriprep-10, Amicon, MA)로 약 5 ml로 농축하고, 완충액 A (10 mm Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 mm EGTA)로 평형을 맞춘 세파크릴 S-100 HR 겔 여과 배지 180 ml 칼럼 (1.6X91 cm) 상에 직접 적하하여 완충액 A 중에서 10 ml/h로 흘려 보냈다. 재조합 단백질을 함유하는 분획을 280 nm에서의 흡광도로 확인하고 SDS-PAGE로 분석했다. 분획을 풀링하고 원심분리 여과에 의해 농축시켰다.
재조합 단백질 7116626
Ni2+-NTA 아가로스 칼럼으로부터의 재조합 단백질으로 함유하는 분획을 풀링하고 투석 완충액 (10 mM MOPS, pH 6.5, 50 mM naCl, 0.1 mM EGTA, 0.02% Brij 및 1 mM PMSF) 1 리터에 대해 밤새도록 투석했다. 다음날 아침에, 미세한 백색 침전을 원심분리에 의해 제거하고 생성된 상등액을 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 B (10 mM MOPS, pH 6.5, 0.1 mM EGTA) 중에 평형을 맞춘 8 ml (8x75 mm) 모노 S 고성능 액상 크로마토그래피 칼럼 (Pharmacia Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ, USA) 상에 적하하였다. 이 칼럼을 50 mM NaCl을 함유하는 베드 용적 10배의 완충액 B로 세정하고 NaCl 50 ml를 구배를 증가시키면서 (50 내지 500 mM)로 전개시켰다. 재조합 단백질 7116626 (서열 865)는 300 mM NaCl에서 예리한 피크로서 용출되었다.
2. 봉입체로부터 가용성 단백질의 정제
다음의 단계는 4 ℃에서 수행했다. 세포 펠렛을 10 % 글리세롤 200 ㎍/ml 리소자임, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF 및 0.1 %-머캅토에탄올을 갖는 용해 완충액에 재현탁시켰다. 세포 분쇄기를 통과시킨 후에, 생성된 균질화물을 0.2 % 데옥시콜레이트로 만들고, 10 분 교반하고, 20,000 xg에서 30 분 간 원심분리시켰다. 이 펠렛을 10% 글리세롤, 10 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 1 mM PMSF 및 0.1% 머캅토에탄올을 함유하는 용해 완충액을 세정하고 이어서 1 M 우레아, 1 mM PMSF 및 0.1% 2-머캅토에탄올을 함유하는 용해 완충액으로 세정했다. 생성된 백색 펠렛은 비분쇄 세포와 막 물질이 없이 봉입체를 주로 포함했다.
재조합 단백질 26054702, 16225006, 30100332, 4721061
하기 단계들은 실온에서 수행했다. 정제 봉입체를 1 mM PMSF 및 0.1% 2-머캅토에탄올을 갖는 용해 완충액 중의 8.0 M 우레아 20 ml 중에 용해시키고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 용해되지 않은 물질을 원심분리에 의해 제거하였다. 여과된 맑은 상등액을 용해 완충액 중에 8.0 M 우레아 용액으로 미리 평형을 맞춘 Ni2+-NTA 아가로스 칼럼 상에 적하하였다. 이 칼럼을 8 M 우레아, 1.0 mM PMSF 및 0.1% 2-머캅토에탄올을 함유하는 용해 완충액 250 ml (베드 용적의 50 배)로 세정하고, 8 M 우레아, 1 mM PMSF, 0.1% 2-머캅토에탄올 및 20, 100, 200 및 500 mM 아미다졸을 함유하는 용해 완충액의 후속 단계로 연속적으로 전개시켰다. 분획을 OD280nm에서의 흡광도로 모니터링하고 피크 분획을 SDS-PAGE로 분석했다. 재조합 단백질을 함유하는 분획은 100 mM 이미다졸에서 용출되었다.
재조합 단백질 29479681, 26380318
봉입체를 함유하는 펠렛을 8 M 우레아, 1 mM PMSF 및 0.1 % 2-머캅토에탄올을 함유하는 완충액 B 중에 용해시키고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 불용성 물질을 20,000 xg에서 30 분 동안 원심분리하여 제거하고, 맑은 상등액을 6 M 우레아, 1 mM PMSF, 0.1 % 2-머캅토에탄올을 함유하는 완충액 B로 미리 평형을 맞춘 15 ml (1.6x7.5 cm) SP-세파로스 칼럼 상에 적하시켰다. 이 칼럼을 10배의 베드 용적으로 세정하고 이 칼럼을 0으로부터 500 mM NaCl에 이르는 선형 구배로 전개시켰다.
단백질 시료의 투석 및 농축
우레아 농도가 순차적으로 6M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5 M로 감소되는 0.5% 데옥시콜레이트 (DOC)를 함유하는 트리스-완충 염수 (TBS; 10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl), 및 최종적으로 우레아가 없는 TBS에 대한 투석에 의해 단백질로부터 우레아를 천천히 제거했다. 각 투석 단계는 실온에서 최소 4 시간 수행했다.
투석 후에, 시료를 아미콘-교반 세포를 이용하여 가압 여과에 의해 농축시켰다. 단백질 농축물을 퍼킨 (Perkins (1986) Eur. J. Biochem. 157, 169-180)), 브래드포드 (Bradford (1976), Anal. Biochem. 72, 248-254) 및 로우리 (Lowray (1951), J. Biol. chem. 193, 265-275쪽) 의 방법을 이용하여 측정했다
상기 기재된 방법에 의해 정제된 재조합 단백질은 하기 표 4에 요약되어 있다.
IV. 백신 후보로서의 헬리코박터 필로리 단백질의 분석
헬리코박터 필로리 단백질의 면역조절 효과를 조사하기 위하여, 마우스/헬리코박터 필로리 모델을 사용했다. 이 모델은 많은 면에서 인간 헬리코박터 필로리 감염과 유사하다. 치료요법으로 경구 면역치료의 개념을 시험하기 위하여 헬리코박터 필로리 감염 동물의 경구 면역 치료의 효과에 초점을 맞추었다.
동물: 암컷 SPF BALB/c 마우스를 봄홀트 브리딩 센터 (덴마크)로부터 구입했다. 보통의 맥롤론 우리 안에 자유롭게 급식 및 급수하면서 가두어 두었다. 이 동물들은 도착시에 4 내지 6주령이었다.
감염
최소한 1 주일간 환경에 순응시킨 후에, 동물들을 헬리코박터 필로리의 타입 2 균주 (VacA 음성) (244 균주, 원래 궤양 환자로부터 단리됨)로 감염시켰다. 이 균주는 마우스 위에서의 우수한 콜로니 형성체인 것으로 앞서 입증되었었다. 이 세균을 37 ℃에서 미호기성 분위기 (10 % CO2, 5% O2) 에서 10 % 우태아 혈청을 보충한 브루셀라 브로쓰 중에서 밤새 증식시켰다. 동물에게 오메프라졸 (400 μmol/kg)을 경구 투여하고 3 내지 5 시간 후에 브로쓰 중의 헬리코박터 필로리 (약 108cfu/동물) 을 경구 접종했다. 접종으로부터 2 내지 3 주 후에 몇몇 동물에게서 양성 감염 획득을 조사하였다.
항원
재조합 헬리코박터 필로리를 외부에 노출된 헬리코박터 필로리 세포 막과의 연합능에 근거하여 선택했다. 이들 항원은 하기 군으로부터 선택했다. (1) 외막 단백질, (2) 페리플라즘/분비 단백질; (3) 외부 표면 단백질, 및 (4) 내막 단백질, 모든 재조합 단백질을 정제 때문에 헥사-HIS 태그와 함께 제조했고, 비-헬리코박터 필로리 대조 단백질 (이. 콜라이로부터의 β-갈락토시다제; LacZ)도 동일한 방식으로 제조했다.
모든 항원은 가용성 형태, 예를 들면 HEPES 완충액 또는 0.5 % 데옥시콜레이트 (DOC)를 함유하는 완충액 중에 용해된 형태로 얻었다.
항원을 하기 표 5에 기재했다.
헬리코박터 필로리 단백질
외막 단백질
단백질 7116626
단백질 4721061
단백질 16225006
단백질 29479681
단백질 14640637
페리플라즘/분비 단백질
단백질 30100332
다른 세포 엔벨로프 단백질
단백질 4821082
편모-연합 단백질
단백질 26380318
대조 단백질
β-갈락토시다제; LacZ
면역 처리
각 군의 10 마리 동물을 34일의 기간에 걸쳐 4회 (1, 15, 25 및 35일째에) 면역처리하였다. 용액 또는 현탁액상의 정제 항원을 100 ㎍/마우스의 양으로 투여했다. 또한, 보조약으로서 콜레라 독소 (CT) 10 ㎍/마우스를 매 면역처리 마다 동물에게 투여했다. 항원이 산 분해되는 것을 방지하기 위한 방편으로 오메프라졸 (400 μmol/kg)을 면역처리하기 3 내지 5 시간 전에 동물에게 경구 투여하였다. 감염된 대조 동물에게는 HEPES 완충액 + CT 또는 DOC 완충액 + CT를 투여하였다. 최종 면역처리로부터 2 내지 4 주 후에 동물을 죽였다. 이 연구의 일반적인 개괄 내용이 하기 표 6에 제시되어 있다.
30 일째에 헬리코박터 필로리 균주로 마우스를 모두 감염시켰다. 단백질을 서열 번호로 기재했다.
연구 개괄, 치료용 면역처리:
물질 마우스 종류(n=10) 투여량/마우스 투여일자
1. 대조용, PBS Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
2. 콜레라 독소, 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
3. 단백질 16225006, 100 ㎍+CT 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
4. 단백질 26054702, 100 ㎍+CT 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
5. 단백질 26380318, 100 ㎍+CT 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
6. 단백질 29479681, 100 ㎍+CT 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
7. 단백질 30100332, 100 ㎍+CT 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
8. 단백질 4721061, 100 ㎍+CT 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
9. 단백질 4821082, 100 ㎍+CT 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
10. 단백질 7116626, 100 ㎍+CT 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
11. 단백질 14640637, 100 ㎍+CT 10 ㎍ Balb/c 0.3 ml 0, 14, 24, 34
감염 분석
점막 감염: CO2및 경부 탈구에 의해 마우스를 죽였다. 개복하여 위를 떼어냈다. 큰 곡율을 따라 위를 절단하고 염수로 헹궜다. 25 mm2면적의 위전정부 및 내체로부터 점막을 수술용 메스로 따로따로 벗겨냈다. 벗겨낸 점막을 브루셀라 브로쓰 중에 현탁시키고 블러드 스키로우 (Blood Skirrow) 선별 플레이트 상에 플레이팅시켰다. 이 플레이트를 미호기성 조건 하에 3 내지 5 일 동안 인큐베이션시키고, 콜로니의 수를 계수했다. 헬리코박터 필로리의 동일성을 우레아제 및 카탈라제에 의해 및 직접 현미경 사진 또는 그람 염색에 의해 평가했다.
우레아 아가 베이스 농축물 시약을 DIFCO 연구소 (Detroit, MI, 카타로그#0284-61-3)으로부터 구입했다. 우레아 아가 베이스 농축물을 몰로 1:10 비로 희석했다. 희석 농축물 1 ml를 활발히 증식 중인 헬리코박터 필로리 세포 100 내지 200 ml와 혼합했다. 자홍색으로의 색 변화는 세포가 우레아제 양성임을 의미한다.
카탈라제 시험은 본질적으로 다음과 같이 수행했다. N,N,N',N"-테트라메틸-p-페닐렌디아민 시약을 시그마사 (Sigma, St. Louis, MO, 카타로그 # T3134)로부터 구입했다. 시약 용액 (물 중의 1% w/v)를 제조했다. 헬리코박터 필로리 세포를 왓트만 여지 상에 면봉으로 문지르고, 1 % 용액으로 덮었다. 어두운 청색으로 색이 변하면 헬리코박터 필로리가 카탈라제 양성임을 의미하는 것이다.
혈청 항체: 모두로부터, 심장을 천공하여 나온 혈액으로부터 마우스 혈청을 만들었다. 혈청 항체를 헬리코박터 필로리의 특이 항원이 플레이팅된 정식 ELISA 기술에 의해 확인했다.
점막 항체: 점막내의 항체 존재 여부를 검출하기 위하여 마우스의 50% 에 대해 내체의 소정 부분과 십이지장 4 cm를 부드럽게 벗겨내었다. 항체 역가는 형청 항체에서의 정식 ELISA 기술을 사용하여 측정했다.
통계적 분석: 헬리코박터 필로리 콜로니 형성에 대한 항체의 유의 효과를 결정하기 위하여 윌콕슨-만 위트니 사인 랭크 테스트 (Wilcoxon-Mann-Whitney sign rank test)를 사용했다. P<0.05면 유의한 것으로 간주된다. 위전정부가 헬리코박터의 주요 콜로니 형성 부위이기 때문에 위전정부의 콜로니 형성의 변화가 가장 강조된다.
결과
혈청 중의 항체: CT와 함께 주어진 모든 시험 항체는 혈청 중에서 측정가능한 특이 역가를 나타냈다. 최고의 반응은 단백질 7116626, 단백질 4721061, 단백질 26380318, 단백질 14640637 및 단백질 4821082에서 나타났다 (도 1 참조).
점막 중의 항체: 벗겨낸 점막에서 모든 시험 항원에 대항한 특이 항체가 나타났다. 가장 강한 반응은 단백질 30100332, 이어서 단백질 14640637 및 단백질 26380318에서 나타났다 (도 2 참조).
치료 면역처리 효과:
모든 대조 동물 (BALB/c 마우스)에 있어 위의 위전정부 및 내체 모두에 헬리코박터 필로리 (AH244 균주)의 콜로니를 매우 많이 형성시켰다. 시험된 항원 중에 3 개의 단백질 (단백질 4721061, 단백질 4821082 및 단백질 14640637)은 헬리코박터 필로리 감염에 대해 우수하고 상당히 감소 및(또는) 근절시켰다. 위전정부의 콜로니 형성 정도가 대조 표준에 비해 단백질 7116626 및 단백질 26380318로 면역처리한 후에 낮아졌다. 단백질 16225006, 29479681 및 30100332의 효과는 대조 표준과 다르지 않았다. 대조 단백질 lacZ, 즉 비-헬리코박터 필로리 단백질은 근절 효과가 없었고, 사실 HEPES + CT 대조에 비하여 헬리코박터 콜로니 형성이 더 많았다. 모든 자료는 각각 HEPES 및 DOC에 용해된 단백질의 경우로 도 3 및 4에 도시되어 있다. 자료는 기하 평균값으로 표시되어 있다. n= 8 내지 10, 윌콕슨-만-위트니 사인 랭크 테이스 *=p<0.05; x/10=시험 마우스 총 수에 대해 헬리코박터 필로리의 근절 효과를 나타내는 마우스의 수.
제시된 자료는 모든 헬리코박터 필로리 관련 단백질이 이 연구에 포함되며, 경구 보조약 CT와 함께 경구 면역원으로 사용될 경우 특이 혈청 및 점막의 항체로 측정한 바 면역 반응을 자극함을 의미한다. 대부분의 단백질이 이 동물 모델에서 헬리코박터 필로리의 집락 형성을 감소시키고, 몇몇 경우에는 완전히 제거하였다. 감소 또는 일소는 동종 방어라기 보다는 이종 방어에 의한 것으로 (폴리펩티드는 헬리코박터 필로리 J99 균주 서열을 기초로 하며 상이한 (AH244) 공격 균주에 대항한 치료 면역처리 연구에 사용했음) 광범위하게 다양한 헬리코박터 필로리 균주에 대해 백신이 효능이 있음을 의미하는 것임에 주의해야 한다.
비-헬리코박터 단백질 lacZ로 처리된 동물의 위전정부에서 최다의 콜로니 형성이 나타났으며, 이는 헬리코박터 필로리 항체에서 나타난 효과가 특이적임을 의미한다.
이 자료는 헬리코박터 필로리 감염 치료 및(또는) 예방에 있어 인간에게 사용하기 위한 제약학적 제형에 대한 헬리코박터 필로리 단백질의 용도를 강하게 뒷받침한다.
V. 헬리코박터 필로리 균주에서 유전자의 서열 변화 분석
몇몇 균주로부터 4개의 유전자를 클로닝하고 서열 결정하여 DNA 및 유도된 아미노산 서열을 비교하였다. 이 정보를 이용하여 헬리코박터 필로리 균주, J99와 인간 환자로부터 단리된 다른 헬리코박터 필로리 균주 사이의 서열 변화를 결정하였다.
염색체 DNA의 제조
헬리코박터 필로리 균주 (표 9에 기재되어 있음)의 배양물을 BLBB (1 % 트립톤, 1 % 펩타민 0.1 % 글루코스, 0.2% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 5% 우태아 혈청) 중에서 0.2의 OD600에 이를 때까지 증식시켰다. 세포를 4 ℃에서 솔발 RC-3B에서 3500xg로 15 분 동안 원심분리시키고, 펠렛을 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA (TE) 0.95 ml에 재현탁시켰다. 최종 농도로 SDS를 1%로, 및 각각 RNAse A+T1을 0.5 mg/ml 및 5 유닛/ml로 함께 리소자임을 최종 농도로 1 mg/ml로 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 프로테이나제 K를 최종농도 0.4 mg/ml로 첨가하고 시료를 55 ℃ 이상에서 1 시간이 넘게 인큐베이션시켰다. NaCl을 시료에 0.65 M의 농도가 되도록 첨가하고, 조심하여 혼합하고, 0.7 M NaCl 중의 10 % CTAB 0.15 ml (최종 농도는 1% CTAB/70 mM NaCl)를 첨가하여 65 ℃에서 20 분 동안 인큐베이션했다. 이때, 시료를 클로로포름:이소아밀 알콜로 추출시키고, 페놀로 추출하고 클로로포름:이소아밀 알콜로 다시 추출했다. DNA를 -70 ℃에서 10 분 동안 EtOH (1.5배 용적) 또는 이소프로판올 (0.6배 용적)으로 침전시키고, 70% EtOH로 세정하고 TE 중에 재현탁시켰다.
PCR 증폭 및 클로닝
12 개의 헬리코박터 필로리 균주로부터 제조된 게놈 DNA를 PCR 증폭 반응용의 주형 DNA원으로 사용했다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). 헬리코박터 필로리 ORF를 함유하는 DNA 서열을 증폭시키기 위하여, 게놈 DNA (10 나노그램)을 2 mM MgCl2,정의된 헬리코박터 필로리 ORF에 대해 상보적이고 바로 인접하는(flanking) 1 mM 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 (순방향 또는 역방향 프라이머, 표 7 참조), 0.2 mM의 각 데옥시뉴클레오티드 삼인산염; dATP, dGTP, dCTP, dTTP 및 0.5 유닛의 열안정성 DNA 폴리머라제 (Amplitaq, Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ, USA)를 20 마이크로리터의 최종 부피로 함유하는 반응 바이알에 도입했다.
하기의 열 순환 조건을 사용하여 퍼킨 엘마 세튜스/젠암프 PCR 시스템 9600 열 순환기로 각 ORF에 대한 증폭 DNA 생성물을 얻었다:
단백질 7116626 및 단백질 346:
94 ℃에서 2 분간 변성,
94 ℃에서 15초, 30 ℃에서 15초 및 72℃에서 1.5분 간 2회 순환
94 ℃에서 15 초, 55 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5분간 23회 순환
72 ℃에서 6분 동안 반응을 종결했다.
AH5, 5155, 7958, AH24 및 J99 균주에 대한 단백질 26054702:
94 ℃에서 2 분간 변성,
94 ℃에서 15초, 30 ℃에서 15초 및 72℃에서 15분 간 2회 순환
94 ℃에서 15 초, 55 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5분간 25회 순환
72 ℃에서 6분 동안 반응을 종결했다.
AH4, AH15, AH61, 5294, 5640, AH18 및 Hp244 균주에 대한 단백질 26054702 및 단백질 294796813:
94 ℃에서 2 분간 변성,
94 ℃에서 15초, 30 ℃에서 15초 및 72℃에서 1.5분 간 2회 순환
94 ℃에서 15 초, 55 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 1.5분간 25회 순환
72 ℃에서 8분 동안 반응을 종결했다.
열 순환 반응을 완료한 후에, 각 쌍의 시료를 조합하고 하기 기재된 바와 같이 pCR 클로닝 벡터에 직접 클로닝하는데 사용했다.
pCR TA 클로닝 벡터에 헬리코박터 필로리 DNA 서열의 클로닝
모든 증폭 삽입체를 오리지날 TA 클로닝 킷트 (Invitrogen, San Diego, CA)에 기재된 방법으로 pCR 2.1에 클로닝시켰다. 이어서 리게이션 반응의 생성물을 사용하여 하기 기재되는 이. 콜라이의 TOP10F' (헬리코박터 필로리 서열 350의 경우에는 INVaF')를 형질전환시켰다.
재조합 플라스미드에 의한 수용성 세균의 형질전환
수용성 세균, 즉 이. 콜라이 균주 TOP10F' 또는 이. 콜라이 균주 INVaF'을 클로닝된 헬리코박터 필로리 서열을 함유하는 재조합 pCR 발현 플라스미드로 표준 방법에 따라 형질전환시켰다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). 간략하게, 0.5 mM BME 2 ml를 50 ml의 적절한 세균 바이알 각각에 첨가했다. 이어서, 리게이션 반응물 2 ml를 적절한 세포와 혼합하고 얼을 상에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 이 세포 및 리게이션 혼합물을 42 ℃에서 30 초간 "열 쇼크"를 받게하고, 이어서 추가로 2 분 동안 얼음 상에 둔 다음, 시료를 37 ℃에서 1시간 동안 진탕하면서 SOC 배지 (0.5% 효모 추출물, 2.0% 트립톤, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4및 20 mM 글루코스) 45 ml에서 인큐베이션했다. 그 다음, 25 ㎍/ml 카나마이신산 황산염 또는 100 ㎍/ml 암피실란을 함유하는 LB 한천 평판 상에 시료를 도말하여 밤새도록 증식시켰다. 이어서 TOP10F' 또는 INVaF'의 형질전환된 콜로니를 분석하여 하기 기재된 바대로 클로닝된 삽입체를 평가했다.
헬리코박터 필로리 서열을 함유하는 재조합 PCR 폴라스미드의 확인
재조합 pCR-헬리코박터 필로리 ORF로 형질전환된 각각의 TOP10F' 또는 INVaF' 클론을, 원래의 PCR 증폭 클로닝 반응에 사용되었고 각 헬리코박터 필로리 서열에 대해 특이성인 동일한 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 클로닝된 삽입체의 CPR 증폭에 의해 분석했다. 성공적인 증폭은 클로닝 벡터에서 헬리코박터 필로리 서열이 합체되었음을 입증했다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994).
적절하게 클로닝된 헬리코박터 필로리 ORF를 함유하는 재조합 pCR 벡터의 각 클론을 취하여 서열을 분석했다. 서열 분석은 벡터 특이적 프라이머 (예를 들면, PCRII 또는 pCR2.1, Invtrogen, San Diego, CA) 및 하기 표 8에 기재된 바와 같은 ORF에 특이적인 서열 결정 프라이머를 사용하여 표준 프로토콜 (Perkin Elmer)에 따라 AB1 서열 결정기로 수행했다.
결과
이 실험에서 PCR 에러율을 정하기 위하여, 헬리코박터 필로리 J99 균주로부터의 5개의 별개의 PCR 반응 혼합물로부터 제조한 서열 649의 5개의 각 클론을 DNA 서열의 총 4485 개 염기 누적치에 대한 897 뉴클레오티드의 총 길이에 대해 서열 결정을 하였다. 5개의 클론에 대한 DNA 서열을 다른 방법, 즉 랜덤 샷건 클로닝 및 서열 결정에 의해 미리 얻은 서열 649의 DNA 서열과 비교했다. 여기 기재된 실험에 대한 PCR 에러율을 4485 염기 중 2개 염기가 바뀐 것으로 결정되었으며, 이는 0.04% 이하의 평가 에러율에 상응한다.
헬리코박터 필로리 세균속의 12 가지 상이한 균주로부터 PCR 방법에 의해 유전자로서 확인되고 증폭된 4개의 상이한 오픈 리딩 프레임에 대한 DNA 서열 분석을 수행했다. 이 연구를 위해 선택된 4개 오픈 리딩 프레임의 유도된 아미노산 서열은 다른 세균 종에 존재하는 소정의 단백질에 대해 통계학적으로 유의한 BLAST 상동성을 나타냈다. 이들 ORF는 에프. 노비시다 (F. novicida)에서 ABC 트랜스포터를 코딩하는 val A&B 유전자에 상동성인 단백질 26054702; 에이취. 인플루엔자의 외막에 존재하는 리포단백질 e (P4)에 상동성인 단백질 7116626; 이. 콜라이에서 이시트르산철 (III) 이송에서의 외막 리셉터인 fecA에 상동성인 단백질 29479681을 포함한다. 단백질 346은 공개된 데이터베이스에 있는 서열과 낮은 상동성을 나타냈기 때문에 미공지 오픈 리딩 프레임으로 확인했다.
각종 헬리코박터 필로리 균주 간의 ORF 보존 또는 변이 정도를 평가하기 위하여, DNA 서열 및 유도된 단백질 서열의 변화를 헬리코박터 필로리의 J99 균주에서 발견된 DNA 및 유도된 단백질 서열과 비교했다 (하기 표 9 참조). 결과는 램던 샷건 클로닝에 의해 서열 결정된 헬리코박터 필로리의 J99 균주에 대한 동일성 %로 제시되어 있다. J99 서열에서의 임의의 변화를 제어하기 위하여, 4개의 오픈 리딩 프레임 각각을 클로닝하고 J99 세균주로부터 다시 서열 결정하고 이 서열 정보를 J99 균주의 랜던 샷건 서열 결정에 의해 클로닝된 삽입체로부터 수집된 서열 정보와 비교했다. 이 자료는 DNA 서열에 있어 0.12 % 차이 (단백질 346, J99 균주) 내지 약 7% 변화 (단백질 26054702, AH5 균주)에 이르는 범위의 차이가 있음을 나타내었다. 유도된 단백질 서열은 차이를 나타내지 않거나 (단백질 346, AH18 및 AH24 균주) 또는 7.66% (단백질 26054702, 균주 AH5) 정도 까지의 많은 아미노산 변화를 나타내었다.
VI. 효능있는 치료 표적으로서의 필수 헬리코박터 필로리 유전자 결정을 위한 낙아웃 실험 프로토콜
단백질 생성물이 세포 엔벨로프 합성, DNA 합성, 전사, 해독, 조절 및 콜로니 형성/병독성과 같은 필수 세포 경로에 중요한 역할을 하는 듯한 유전자 중에서 치료 표적을 선택했다.
필수 유전자를 확인하기 위하여 헬리코박터 필로리 유전자/ORF의 일부의 결실 및 카나마이신-내성 카세트의 삽입 변이 유발을 위한 프로토콜을 이전의 공개된 방법으로부터 수정하였다 (Labigne-Roussel et al., 1988, J. Bacteriology 170, pp. 1704-1708; Cover et al., 1994, J. Biological Chemistry 269, pp. 10566-10573; Reyrat et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 8768-8772). 이 결과가 유전자 "낙아웃"이다.
헬리코박터 필로리 유전자 서열의 확인 및 클로닝
낙아웃 표적으로 선택된 유전자 또는 ORF (오픈 리딩 프레임)의 서열을 헬리코박터 필로리 게놈 서열로부터 확인하여 유전자/ORF를 특이적으로 증폭시키는 프라이머 설계에 사용했다. 모든 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 OLIGO 프로그램 (National Biosciences, Inc., Plymouth, MN 55447, USA) 의 도움으로 설계했고, 기브코/BRL 라이프 테크놀로지 (Gaithersburg, MD, USA) 로부터 구입할 수 있다. ORF가 800 내지 1000 염기쌍 보다 작으면 오픈 리딩 프레임 외부의 측접 프라이머를 선택한다.
헬리코박터 필로리 HpJ99 균주 (ATCC 55679)로부터 제조된 게놈 DNA를 PCR (폴리머라제 연쇄 반응)에 의한 ORF의 증폭을 위한 주형 DNA원으로 사용했다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). 헬리코박터 필로리로부터의 게놈 DNA의 제조에 대해서는 실시예 I 참조. PCR 증폭은 게놈 HpJ99 DNA 10 나노그램을 10 mM Tris pH 8.3, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 (순방향=F1 및 역방향=R1), 0.2 mM의 각 데옥시뉴클레오티드 삼인산염 (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 및 1.25 유닛의 열안정성 DNA 폴리머라제 (Amplitaq, Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ, USA)를 40 mL의 최종 체적으로 함유하는 반응 바이알에 도입시킴으로써 수행했다. Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR System 9600 열 순환기를 사용하여 PCR을 수행한다.
열 순환 반응의 종결 후에, 증폭된 DNA의 각 시료를 브롬화에티듐으로 염색된 2% TAE 아가로스겔 상에 가시화하여 (Current Protocols in Molecular Biology, John wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994) 예측 크기의 단일 생성물이 이 반응으로부터 야기되었는지를 판단했다. 그 다음, 증폭된 DNA를 세정하고, 쿠아퀵 스핀 PCR 정제 킷트 (Qiaquick Spin PCR purification kit) (Qiagen Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 정제시켰다.
PCR 생성물을 TA 클로닝 전략을 사용하여 pT7Blue T-벡터 (카탈로그 #69820-1, Novagen, Inc., Madison, WI, USA)에 클로닝시켰다 (Current Protocols in Molecular Biology, John wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). 이 벡터로의 PCR 생성물의 리게이션은 6 배 몰 과량의 PCR 생성물을 pT7Vlue-T 벡터 (Novargen) 10 ng, T4 DNA 리가아제 완충액 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) 1 ml, 및 T4 DNA 라가아제 (New England Biolabs) 200 유닛을 10 ml의 최종 반응물 체적이 되도록 혼합함으로써 수행했다. 리게이션을 16 ℃에서 16 시간 동안 진행시켰다.
리게이션 생성물을 일렉트로포레이션에 적절한 XL-1 Blue 또는 DH5-α 이. 콜라이 세포 (Clentech Lab., Inc. Palo Alto, CA, USA)에 일렉트로포레이션시켰다 (Current Protocols in Molecular Biology, John wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). 간략하게, 리게이션 반응물 1 ml를 전기허용에 적절한 세포 40 ㎕와 혼합하고, 고전압 펄스 (25 마이크로패러드, 2.5 kV, 200 오옴) 를 걸고, 그 후에 시료를 0.45 밀리리터 SOC 배지 (0.5% 효모 추출물, 2.0% 트립톤, 10 Mm NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4및 20 mM 글루코스) 중에서 37 ℃에서 교반하면 1 시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 시료를 암피실린 100 ㎍/ml, 0.3% X-gal, 및 100 ㎍/ml IPTG를 함유하는 LB (10g/l 박토 트립톤, 5 g/l 박토 효모 추출물, 10 g/l 염화 나트륨) 플레이트 상에 도말하였다. 이 플레이트를 37 ℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 흰색을 갖는 암피실린-내성 콜로니를 선택하고, 암피실린 100 ㎍/ml를 함유하는 액상 LB에서 증식시키고, 퀴아겐 미니프렙 프로토콜 (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 단리시켰다.
정확한 헬리코박터 필로리 DNA 삽입체가 클로닝되었는지 확인하기 위하여, pT7Blue 플라스미드 DNA를 J99 헬리코박터 필로리 서열의 초기 증폭용으로 사용된 동일한 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 클로닝된 삽입체의 PCR 증폭용 주형으로 사용한다. 프라이머의 인식 및 2% TAE, 브롬화 에티듐 염색된 아가로스겔 상에서 가시화된 정확한 크기의 PCR 생성물은 정확한 삽입체가 클로닝되었다는 확증이다. 2 내지 6 개의 상기 증명된 클론을 각각의 낙아웃 표적으로부터 얻고, -70 ℃에서 저장을 위해 동결시켰다. PCR로 인한 에러를 최소화하기 위하여, 이들 확증된 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 풀링하고, 이를 후속 클로닝 단계에 사용했다.
유전자/ORF의 서열을 다시 사용하여 ORF 내에 차단되거나 결실된 (250 염기쌍 까지) 헬리코박터 필로리 DNA에 측접하나 서로 떨어져 배향된 제2 쌍의 프라이머를 설계한다. 미리 단리된 클론의 환형 플라스미드 DNA의 풀을 이번 회의 PCR용 주형으로서 사용한다. 이 결실 프라이머 쌍의 프라이머 증폭 배향이 서로 떨어져 있기 때문에 프라이머 사이의 ORF 부분이 생성된 PCR 생성물에 포함되지 않는다. PCR 생성물은 각 말단에 헬리코박터 필로리 DNA 및 그들 사이에 pT7Blue 벡터 주쇄를 갖는 DNA의 선형 조각이며, 근본적으로 ORF 일부의 결실을 초래한다. 1 % TAE, 브롬화에티듐으로 염색된 아가로스 겔 상에 PCR 생성물을 가시화함으로써 정확한 크기의 단일 생성물만이 증폭되었음을 확인한다.
카나마이신 내성 카세트 (Labigne-Roussel et al., 1988, J. Bacteriology 170, 1704-1708)을 앞서 사용된 TA 클로닝 방법으로 이 PCR 생성물에 리게이션시켰다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., eds., 1994). 캄파일로박터 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 카나마이신 카세트를, 재조합 플라스미드 pCTB8:kan의 EcoRI 절단을 수행함으로써 얻는다 (Cover et al., 1994, J. Biological Chemistry 269, 10566-10573쪽). 적당한 단편 (1.4kb)를 1% TAE 겔 상에서 단리시키고, QIAquick 겔 추출 킷트 (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 단리했다. DNA 단편 4 ㎍, 0.5 mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 1 ㎕, 클레노우 완충액 2 ㎕ (New England Biolabs) 및 5 유닛의 클레노우 DNA 폴리머라제 I (클레노우) 대단편 (New England Biolabs)를 20 ㎕ 반응물로 혼합하고, 30 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션하고, 75 ℃에서 10 분 동안 가열함으로써 이 효소를 실활시킴을 수반하는 클레노우 충전 프로토콜을 사용하여 이 단편의 말단 수복했다. 그다음, 이 블런트 말단이 된 카나마이신 카세트를 퀴아퀵 칼럼 (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)를 통하여 정제하여 뉴클레오티드를 제거했다. 이어서 "T" 오버행을, 100 ㎕ 반응물 중에 블런트 말단이 된 카나마이신 카세트 5 ㎍, 10 mM Tris pH 8.3, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2, DNA 폴리머라제 5 유닛 (Amplitaq, Roche Moleculat Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA), 5 mM dTTP 20 ㎕를 혼합하고 37 ℃에서 2 시간 동안 이 반응물을 인큐베이션시켰다. 이 "Kan-T' 카세트를 QIAquick 칼럼 (Qiagen, Gathersburg, MD, USA)를 사용하여 정제한다. 결실 프라이머 (F2 및 R2)의 PCR 생성물을 Kan-T 카세트에, 결실 프라이머 PCR 생성물 10 내지 25 ng, Kan-T 카세트 DNA 50 내지 75 ng, 10x T4 DNA 라가아제 반응 혼합물 1 ㎕, T4 DNA 라가아제 0.5 ㎕ (New England Biolabs, Beverly, MA, USA)를 10 ㎕ 반응물 중에 혼합하고 16 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션함으로써 리게이션시켰다.
이 리게이션 생성물을 앞서 기재된 일렉트로포레이션에 의해 XL-1 Blue 또는 DH5-α 이. 콜라이 세포에 형질전환시켰다. SOC에서 회수한 후에, 세포를 암피실린 100 ㎎/ml를 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 37 ℃에서 밤새도록 증식시켰다. 그다음, 이 플레이트를 카나마이신 25 ㎍/ml를 함유하는 플레이트 상에 복제 플레이팅시키고 밤새도록 증식시켰다. 생성된 콜로니는 pT7Blue 벡터에 존재하는 암피실린 내성 유전자 및 새로이 도입된 카나마이신 내성 유전자를 모두 갖는다. 콜로니를 카나마이신 25 ㎍/ml를 함유하는 LB에 취하고, 플라스미드 DNA를 퀴아겐 미니플렙 프로토콜 (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 배양된 세포로부터 단리시킨다.
이들 플라스미드에 대해 PCR 증폭에 의한 몇가지 시험을 수행하여 카나마이신이 헬리코박터 필로리 유전자/ORF 중에 삽입되었음을 확증하고, 헬리코박터 필로리 유전자/ORF에 대한 카나마이신 내성 유전자의 삽입 배향을 결정한다. 카나마이신 카세트가 헬리코박터 필로리 서열에 삽입됨을 확증하기 위하여, 이 플라스미드 DNA를 헬리코박터 필로리 유전자/ORF를 클로닝하는데 원래 사용된 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭용 주형으로서 사용한다. 정확한 PCR 생성물의 크기는 결실된 유전자/ORF의 크기이지만, 1.4 kb 카나마이신 카세트를 추가함으로써 크기가 증가된다. 카나마이신 내성의 헬리코박터 필로리 유전자 발현에 대한 잠재적인 극성 효과를 피하기 위해, 낙아웃 유전자/ORF에 대한 카나마이신 내성 유전자의 배향을 결정하고 양 배향을 때에 따라 헬리코박터 필로리 형질전환에 사용했다 (하기 참조). 카나마이신 내성 유전자의 삽입 배향을 결정하기 위하여, 카나마이신 내성 유전자의 말단으로터 프라이머를 설계한다 ("Kan-1" 5'-ATCTTACCTATCACCTCAAAT-3' (서열 207), 및 "Kan-2" 5'-AGACAGCAACATCTTTGTGAA-3' (서열 208)). 각 Kan 프라이머와 함께 각 클로닝 프라이머를 사용함으로써 (4개의 프라이머 조합), 헬리코박터 필로리 서열에 대한 카나마이신 카세트의 배향을 결정한다. 양성 클론을 "A" 배향으로 (헬리코박터 필로리 유전자 및 카나마이신 내성 유전자 모두에 대해 동일 전사 방향이 존재함), 또는 "B" 배향으로 (헬리코박터 필로리 유전자에 대한 전사 방향이 카나마이신 내성 유전자의 방향과 반대임) 분류된다. 동일 배향 (A 또는 B)를 공유하는 클론을 후속 실험을 위해 풀링하고 독립적으로 헬리코박터 필로리에 형질전환시켰다.
플라스미드 DNA를 사용한 헬리코박터 필로리 세포의 형질전환
2가지의 헬리코박터 필로리 균주를 형질전환에 사용했다: ATCC 55679 (헬리코박터 필로리 서열 데이터베이스가 얻어진 DNA를 제공한 임상적 단리물), 및 AH224 (마우스 위를 통과했고 그에 콜로니를 형성할 능력이 있는 단리물). 형질전환용 세포를 37 ℃, 10 % CO2, 100 % 습도에서 쉬프-블런드 한천 평판 또는 브루셀라 브로쓰 액즙에서 증식시킨다. 세포를 지수상으로 증식시키고, 세포가 "건강" (활동적으로 움직이는 세포)하고 오염되지 않았는지를 현미경으로 조사하여 판단한다. 플레이트에서 증식시킨 경우에는 플레이트로부터 멸균 루프로 세포를 벗겨내어 수확하고, 브루셀라 브로쓰 1 ml에 현탁시키고, 회전 하강시키고 (1 분, 에펜도르프 마이크로퓨즈의 최고 속도), 브루셀라 브로쓰 200 ㎕에 재현탁시켰다. 브루셀라 브로쓰 액즙에서 증식시킨 경우에는 세포를 원심분리시키고 (베크만 TJ6 센트리퓨즈에서 3000 rpm에서 15 분), 세포 펠렛을 브루셀라 브로쓰 200 ㎕에 재현탁시켰다. 세포의 부분시료를 취하여 세포 농도를 계산하기 위하여 600 nm에서의 광학 밀도를 측정했다. 현탁된 세포의 분취량 (1 내지 5 OD600유닛/25 ㎕)를 미리 데운 쉬프-블러드 한천 평판에 플레이팅시키고, 이 플레이트는 37 ℃, 6 % CO2, 100% 습도에서 4 시간 동안 더 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 후에, 플라스미드 DNA (100 ㎍/㎕) 10 ㎕를 이들 세포 상에 점 찍는다. 양성 대조 (카나마이신 내성 유전자에 의해 파괴된 리보뉴클라제 H 유전자를 갖는 플라스미드 DNA) 및 음성 대조 (플라스미드 DNA가 없음)를 평행하게 수행한다. 이 플레이트를 37 ℃, 6 % CO2에서 추가의 4 시간 인큐베이션 동안 복귀시킨다. 그 다음, 세포를 브루셀라 브로쓰에 적신 면봉을 사용하여 그 플레이트 상에 도말하고, 37 ℃, 6% CO2에서 20 시간 동안 증식시킨다. 그다음, 세포를 카나마이신 25 ㎍/ml를 함유하는 쉬프-블러드 한천 평판에 옮겨 37 ℃, 6 % CO2, 100 % 습도하에 3 내지 5 일 동안 증식시킨다. 콜로니가 나타나면, 이들 취하여 카나마이신 25 ㎍/ml를 함유하는 새로운 쉬프-블러드 한천 평판에 패취로서 재증식시킨다.
3 세트의 PCR 시험을 수행하여 형질전환체의 콜로니가 적당한 염색체 위치에서 상동 재조합으로부터 야기되었음을 확증한다. PCR용 주형 (콜로니로부터의 DNA)를 하기와 같은 신속 비등 DNA 제조 방법에 의해 얻는다. 콜로니의 부분 시료 (이쑤시개로 콜로니를 찔러 취함)를 1 % 트리톤 X-100, 20 mM Tris, pH 8.5 100 ㎕에 도입시키고 6 분 동안 비등시킨다. 동일 용적의 페놀:클로로포름 (1:1)을 첨가하고 볼텍싱했다. 이 혼합물을 5 분 동안 원심분리하고 상등액을 하기 프라이머와 함께 PCR용 DNA 주형으로 사용하여 적절한 염색체 위치에서의 상동 재조합을 확증한다.
시험 1. 유전자/ORF 증폭에 원래 사용된 클로닝 유전자를 사용한 PCR. 정확한 염색체 위치에서의 상동 재조합에 대한 양성 결과란 크기가 결실 유전자/ORF의 크기라고 예상되나 1.4 kb 카나마이신 카세트 부가에 의해 증가된 단일한 PCR 생성물을 나타내야 한다. 정확하게 유전자/ORF 크기의 PCR 생성물은 이 유전자가 낙아웃되지 않았으며 형질전환체가 정확한 염색체 위치에서의 상동 재조합에 의한 결과가 아니라는 증거이다.
시험 2. F3 (유전자/ORF 상류 서열로부터 설계되고 플라스미드에 존재하지 않는 프라이머), 및 사용된 플라스미드 DNA가 "A" 또는 "B" 배향을 갖는지에 따라 프라이머 Kan-1 또는 Kan-2 (카나마이신 내성 유전자의 양 말단으로부터 설계된 프라이머)를 사용한 PCR. 정확한 염색체 위치에서의 상동 재조합은 예상 크기 (즉, F3의 위치로부터 카나마이신 내성 유전자의 삽입 위치까지) 의 단일한 PCR 생성물을 생성할 것이다. 부정확한 크기의 PCR 생성물 또는 PCR 생성물(들)의 부재는 플라스미드가 정확한 위치에서 합체되지 않았고 유전자가 낙아웃되지 않았음을 입증하는 것이다.
시험 3. R3 (유전자/ORF의 하류 서열로부터 설계되고 플라스미드에 존재하지 않는 프라이머), 및 사용된 플라스미드 DNA가 "A" 또는 "B" 배향을 갖는지에 따라 프라이머 Kan-1 또는 Kan-2를 사용한 PCR. 정확한 염색체 위치에서의 상동 재조합은 예상 크기 (즉, 카나마이신 내성 유전자의 삽입 부위로부터 R3의 하류 위치까지) 의 단일한 PCR 생성물을 생성할 것이다. 또, PCR 생성물의 부재 또는 부정확한 크기의 PCR 생성물은 플라스미드가 정확한 위치에서 합체되지 않았고 유전자가 낙아웃되지 않았음을 입증하는 것이다.
상기 3가지 시험 모두에 대해 양성의 결과를 나타내는 형질전환체는 그 유전자가 생체외에서의 생존에 필수적이지 않음을 의미하는 것이다.
상기 3가지 시험 중 어느것에 음성 결과가 있으면 그 유전자가 파괴되지 않았고, 생체외 생존에 필수적임을 의미하는 것이다.
파괴된 리보뉴클라제 H 플라스미드 DNA에서의 양성 대조군이 형질전환체를 생산하는 한편, 2개의 독립적인 형질전환체로부터 콜로니가 생성되지 않는 경우에, 이 플라스미드 DNA를 콜로니 형성을 위해 플레이팅하기 전에 형질전환체 집단으로부터의 DNA에 대해 PCR함으로써 더 분석한다. 이를 통해 플라스미드 세포에 들어가 정확한 위치에서 상동 재조합을 수행할 수 있음이 증명될 것이다. 간략하게, 플라스미드 DNA를 상기 기재된 형질전환 프로토콜에 따라 인큐베이션한다. 이 플라스미드 DNA를 인큐베이션한 후에 바로 헬리코박터 필로리 세포로부터 DNA를 추출하고 이 DNA를 상기 시험 2 및 시험 3을 위한 주형으로 사용한다. 시험 2 및 시험 3에서의 양성 결과는 그 플라스미드 DNA가 세포에 들어가 정확한 염색체 위치에서의 상동 재조합을 수행할 수 있었음을 증명할 것이다. 만약 시험 2 및 시험 3이 양성이면, 생존 형질전환체를 얻는데 실패한다는 것은 이 유전자가 필수 유전자이며 이 유전자가 파괴된 세포는 콜로니 형성을 할 수 없음을 의미한다.
VII. 고처리량 약물 스크리닝 분석
클로닝, 발현 및 단백질 정제
고처리량 약물 스크린 분석에 사용되는 헬리코박터 필로리 표적 유전자 및 그의 단백질 생산물, 예를 들면 헬리코박터 필로리 효소의 클로닝, 형질전환, 발현 및 정제를 실질적으로 상기 실시예 II 및 III에 기재된 바와 같이 수행한다. 특정 헬리코박터 필로리 유전자 생성물, 펩티딜-프로필 시스-트랜스 아이소머라제에 대한 스크리닝 분석의 개발 및 응용이 구체예로서 하기에 기재되어 있다.
효소 분석
이 분석은 실질적으로 피셔의 문헌 [Fischer, G., et al. (1984) Biomed. Biochim. Acta 43:1101-1111)에 기재된 분석에 따른 것이다. 이 분석법은 시험 펩티드 N-숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐리드 (시그마 #S-7388, 로트#84H5805)에서의 Ala-Pro 결합의 시스-트랜스 이성체화도를 측정한다. 이 분석법은 시험 펩티드를 분열시키는 프로테아제 능력이 Ala-Pro 결합이 트랜스 상태인 경우에만 발생되는 α-키모트립신과 결부된다. 이 분석에서 트랜스 이성질체로의 시험 펩티드의 전환을 베크만 모델 DU-650 분광계에서 390 nm에서 분석한다. 이 자료를 매 초마다 수집하고, 이때 평균 주사 시간은 0.5 초이다. 최종 용적 400 ㎕로 pH 8.0의 35 mM Hepes, 10 μM α-키모트립신 (소 췌장으로부터의 1-5 유형, 시그마 #C-7762, 로트 23H7020) 및 10 nM PPIase를 사용하여 수행한다. 반응을 개시하기 위하여, 기질 (DMSO 중의 2 mM N-숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐리드) 10 ㎕를 실온에서 반응 혼합물 390 ㎕에 첨가한다.
세균 조추출물의 효소 분석
브루셀라 브로쓰 중의 헬리코박터 필로리 (J99 균주) 배양물 50 ml을 중간 대수상 (OD600nm∼1)에서 수확하고 하기 프로테아제 저해제: 1mM PMSF, 및 각각의 아프로티닌, 루펩틴, 펩스타틴, TLCK, TPCK 및 대두 트립신 저해제 10 ㎍/ml와 함께 용해 완충액에 재현탁시킨다. 이 현탁액을 동결-해동 (-70 ℃에서 15 분, 이어서 실온에서 30분)에 3회 순환시키고 이어서 초음파 (20초 3회 파열) 처리한다. 용해물을 원심분리하고 (12,000gx30 분) 상등액을 상기 기재된 바와 같이 효소 활성에 대해 분석한다.
많은 헬리코박터 필로리 효소를 이. 콜라이내에서 활성형태로 대량 발현시킬 수 있다. 이러한 정제 단백질의 고수율은 다양한 고처리량 약물 스크리닝 분석법의 설계를 가능하게 한다.
동등물
당업계의 숙련자는 일상 실험만을 사용하여서도 본 명세서에 기재된 구체예 및 방법에 대한 많은 등가의 예와 방법을 알거나, 또는 추론할 수 있을 것이다. 이러한 동등물들도 하기 청구 범위의 범위에 포함된다.

Claims (65)

  1. 서열 74 내지 서열 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 약 60% 이상 상동성인 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  2. 서열 74 내지 서열 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  3. 서열 1 내지 서열 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 약 60% 이상 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 또는 그의 상보체.
  4. 제1항에 있어서, 서열 1 내지 서열 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 그의 상보체.
  5. 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 1 내지 서열 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 그의 상보체.
  6. 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 1 내지 서열 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 혼성화하는, 길이가 8 뉴클레오티드 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 그의 상보체.
  7. 서열 3, 25, 48, 16, 10, 45, 35, 37, 7, 39, 55, 18, 19, 28, 30, 52, 54, 56, 58, 1, 42, 14, 43, 11, 71, 17, 57, 5, 6, 8 및 21로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 그의 상보체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 3, 25 및 48로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 헬리코박터 필로리 내막 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 핵산 또는 그의 상보체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 16, 10, 45, 35, 37, 7, 39, 55, 18, 19, 28, 30, 52, 54, 56, 58, 1, 42, 14, 43, 11 및 71로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 헬리코박터 필로리 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 핵산 또는 그의 상보체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 1, 42, 14, 43, 11 및 71로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 말단 페닐알라닌 잔기 및 C 말단 티로신 클러스터를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 핵산 또는 그의 상보체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 16, 45, 35, 37, 7, 39, 55, 18, 19, 28, 30, 52, 54, 56 및 58로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 말단 페닐알라닌 잔기를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 핵산 또는 그의 상보체.
  12. 서열 76, 98, 121, 89, 83, 118, 108, 110, 80, 112, 128, 91, 92, 101, 103, 125, 127, 129, 131, 74, 115, 87, 116, 84, 144, 90, 130, 78, 79, 81 및 94로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 76, 98 및 121로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 내막 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 핵산.
  14. 제12항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 89, 83, 118, 108, 110, 80, 112, 128, 91, 92, 101, 103, 125, 127, 129, 131, 74, 115, 87, 116, 84, 144, 90 및 130으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 74, 115, 87, 116, 84 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 말단 페닐알라닌 잔기 및 C 말단 티로신 클러스터를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 핵산.
  16. 제14항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 89, 118, 108, 110, 80, 112, 128, 91, 92, 101, 103, 125, 127, 129 및 131로 이루어지는 군 중에서 선택되는 말단 페닐알라닌 잔기를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 핵산.
  17. 서열 72, 32, 51, 2, 4, 9, 13, 22, 29, 31, 33, 34, 36, 38, 40, 41, 44, 46, 49, 53, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67 및 68로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 헬리코박터 필로리 분비 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열 또는 그의 상보체.
  18. 서열 145, 105, 124, 75, 77, 82, 86, 95, 102, 104, 106, 107, 109, 111, 113, 114, 117, 119, 122, 126, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140 및 141로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 헬리코박터 필로리 분비 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  19. 서열 12, 15, 20, 23, 24, 26, 27, 47, 50, 60, 64, 69, 70 및 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 헬리코박터 필로리 세포 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열 또는 그의 상보체.
  20. 서열 85, 88, 93, 96, 97, 99, 100, 120, 123, 133, 137, 142, 143 및 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 세포 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  21. 서열 1 내지 서열 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열의 8개 이상의 뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보체를 포함하는 프로브.
  22. 전사 조절 성분에 작동가능하게 결합된 제1 내지 7항, 12항 및 17항 내지 20항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  23. 제22항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 세포.
  24. 폴리펩티드가 발현될 수 있는 조건 하에서 제23항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드의 생산 방법.
  25. 제24항에 있어서, 세포로부터 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. (a) 시료를 제6항 또는 21항의 핵산과 접촉시켜 프로브와 시료 내의 헬리코박터 핵산 사이에 하이브리드를 형성시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 형성된 하이브리드를 검출하는 단계(여기서, 하이브리드의 검출은 시료 내에 헬리코박터 핵산의 존재를 나타냄)로 이루어지는, 시료 내의 헬리코박터 핵산의 존재를 검출하는 방법.
  27. 서열 74 내지 서열 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드에 약 60% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드.
  28. 서열 1 내지 서열 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 약 60% 이상 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 1 내지 서열 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드.
  30. 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 1 내지 서열 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 또는 그의 상보체에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되는 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드.
  31. 서열 74 내지 서열 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드.
  32. 서열 76, 98, 121, 89, 83, 118, 108, 110, 80, 112, 128, 91, 92, 101, 103, 125, 127, 129, 131, 74, 115, 87, 116, 84, 144, 90, 130, 78, 79, 81 및 94로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단리된 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편.
  33. 제32항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 76, 98 및 121로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 내막 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 폴리펩티드.
  34. 제32항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 89, 83, 118, 108, 110, 80, 112, 128, 91, 92, 101, 103, 125, 127, 129, 131, 74, 115, 87, 116, 84, 144, 90 및 130으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 74, 115, 87, 116, 84 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 말단 페닐알라닌 잔기 및 C 말단 티로신 클러스터를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 폴리펩티드.
  36. 제34항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 89, 118, 108, 110, 80, 112, 128, 91, 92, 101, 103, 125, 127, 129 및 131로 이루어지는 군 중에서 선택되는 말단 페닐알라닌 잔기를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 폴리펩티드.
  37. 서열 3, 25, 48, 16, 10, 45, 35, 37, 7, 39, 55, 18, 19, 28, 30, 52, 54, 56, 58, 1, 42, 14, 43, 11, 71, 17, 57, 5, 6, 8 및 21로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 단리된 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편.
  38. 제37항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 3, 25 및 48로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 헬리코박터 필로리 내막 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 폴리펩티드.
  39. 제37항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 16, 10, 45, 35, 37, 7, 39, 55, 18, 19, 28, 30, 52, 54, 56, 58, 1, 42, 14, 43, 11 및 71로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 헬리코박터 필로리 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 폴리펩티드.
  40. 제39항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 1, 42, 14, 43, 11 및 71로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 말단 페닐알라닌 잔기 및 C 말단 티로신 클러스터를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 폴리펩티드.
  41. 제39항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리 세포 외막 폴리펩티드 또는 그의 단편이 서열 16, 45, 35, 37, 7, 39, 55, 18, 19, 28, 30, 52, 54, 56 및 58로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 말단 페닐알라닌 잔기를 갖는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편인 단리된 폴리펩티드.
  42. 서열 85, 88, 93, 96, 97, 99, 100, 120, 123, 133, 137, 142, 143 및 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단리된 헬리코박터 필로리 세포 폴리펩티드 또는 그의 단편.
  43. 서열 12, 15, 20, 23, 24, 26, 27, 47, 50, 60, 64, 69, 70 및 73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 단리된 헬리코박터 필로리 세포 폴리펩티드 또는 그의 단편.
  44. 서열 145, 105, 124, 75, 77, 82, 86, 95, 102, 104, 106, 107, 109, 111, 113, 114, 117, 119, 122, 126, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140 및 141로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단리된 헬리코박터 필로리 분비 폴리펩티드 또는 그의 단편.
  45. 서열 72, 32, 51, 2, 4, 9, 13, 22, 29, 31, 33, 34, 36, 38, 40, 41, 44, 46, 49, 53, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67 및 68로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산에 의해 코딩되는 단리된 헬리코박터 필로리 분비 폴리펩티드 또는 그의 단편.
  46. 비헬리코박터 필로리 폴리펩티드에 조작 연결된 서열 74 내지 서열 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  47. 제1항 내지 7항, 12항, 17항 내지 20항 중 어느 한 항의 1종 이상의 단리된 핵산을 유효량 포함하는 헬리코박터 필로리 감염의 예방 또는 치료용 백신 제제.
  48. 제26항 내지 32항, 37항, 42항 내지 45항 중 어느 한 항의 1종 이상의 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편을 유효량 포함하는 헬리코박터 필로리 감염의 예방 또는 치료용 백신 제제.
  49. 제47항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 더 포함하는 백신 제제.
  50. 제48항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 더 포함하는 백신 제제.
  51. 제49항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 보조약을 포함하는 것인 백신 제제.
  52. 제50항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 보조약을 포함하는 것인 백신 제제.
  53. 제49항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 전달 시스템을 포함하는 것인 백신 제제.
  54. 제50항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 전달 시스템을 포함하는 것인 백신 제제.
  55. 제53항에 있어서, 전달 시스템이 생 벡터를 포함하는 것인 백신 제제.
  56. 제54항에 있어서, 전달 시스템이 생 벡터를 포함하는 것인 백신 제제.
  57. 제55항에 있어서, 생 벡터가 세균 또는 바이러스인 백신 제제.
  58. 제56항에 있어서, 생 벡터가 세균 또는 바이러스인 백신 제제.
  59. 제53항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 보조약을 더 포함하는 것인 백신 제제.
  60. 제54항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 보조약을 더 포함하는 것인 백신 제제.
  61. 헬리코박터 필로리 감염의 치료 또는 감염 위험의 저하를 위해 제47항의 백신 제제를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 헬리코박터 필로리 감염의 치료 또는 감염 위험의 저하 방법.
  62. 헬리코박터 필로리 감염의 치료 또는 감염 위험의 저하를 위해 제48항의 백신 제제를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 헬리코박터 필로리 감염의 치료 또는 감염 위험의 저하 방법.
  63. 서열 74 내지 서열 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1종 이상의 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제약상 허용되는 담체와 혼합하여 백신 제제를 형성시키는 것으로 이루어지는 백신 제제의 제조 방법.
  64. (a) 서열 74 내지 서열 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1종 이상의 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제공하는 단계, 및 (b) 상기 1종 이상의 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제약상 허용되는 담체와 혼합하여 백신 제제를 형성시키는 단계로 이루어지는 백신 제제의 제조 방법.
  65. (a) 서열 74 내지 서열 146으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계, (b) 상기 세포로부터 상기 헬리코박터 필로리 폴리펩티드를 단리하는 단계, 및 (c) 상기 1종 이상의 단리된 헬리코박터 필로리 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제약상 허용되는 담체와 혼합하여 백신 제제를 형성시키는 단계로 이루어지는 백신 제제의 제조 방법.
KR1019990703660A 1996-10-28 1997-10-28 헬리코박터 필로리에 관한 핵산 및 아미노산 서열 및 그의 백신조성물 KR20000052831A (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73915096A 1996-10-28 1996-10-28
US8/739,150 1996-10-28
US75973996A 1996-12-06 1996-12-06
US8/759,739 1996-12-06
US89192897A 1997-07-14 1997-07-14
US8/891,928 1997-07-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20000052831A true KR20000052831A (ko) 2000-08-25

Family

ID=27419246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019990703660A KR20000052831A (ko) 1996-10-28 1997-10-28 헬리코박터 필로리에 관한 핵산 및 아미노산 서열 및 그의 백신조성물

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0973394A4 (ko)
JP (1) JP2001504329A (ko)
KR (1) KR20000052831A (ko)
CN (1) CN1235513A (ko)
AR (1) AR009600A1 (ko)
AU (1) AU734052B2 (ko)
BR (1) BR9712587A (ko)
CA (1) CA2265523A1 (ko)
EE (1) EE9900176A (ko)
ID (1) ID22065A (ko)
IL (1) IL129397A0 (ko)
IS (1) IS5005A (ko)
NO (1) NO991995L (ko)
NZ (1) NZ334568A (ko)
PL (1) PL333169A1 (ko)
SA (1) SA98180918A (ko)
SK (1) SK34699A3 (ko)
TR (1) TR199900940T2 (ko)
WO (1) WO1998018323A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115724922A (zh) * 2022-07-19 2023-03-03 四川大学华西医院 一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB及其制备方法与应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406703B1 (en) 1993-07-27 2002-06-18 Csl Limited Treatment of H. pylori associated gastroduodenal disease
NZ314585A (en) * 1993-07-27 2000-08-25 Univ New South Wales Method of treating H. Pylori associated gastroduodenal disease
DE19730425A1 (de) 1997-07-16 1999-01-21 Henkel Teroson Gmbh Heißhärtende wäschefeste Rohbau-Versiegelung
WO2000006743A2 (en) * 1998-07-27 2000-02-10 Connaught Laboratories Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
SE9901548D0 (sv) * 1999-04-29 1999-04-29 Astra Ab Helicobacter pylori antigens
GB9914945D0 (en) * 1999-06-25 1999-08-25 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
AUPQ347199A0 (en) * 1999-10-15 1999-11-11 Csl Limited Novel polypeptide fragments
JP5571274B2 (ja) 2000-03-08 2014-08-13 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 改変された特性を有する変異体
GB0010370D0 (en) * 2000-04-29 2000-06-14 Astrazeneca Ab Helicobacter pylori antigens
GB0010371D0 (en) * 2000-04-29 2000-06-14 Astrazeneca Ab Helicobacter pylori antigens
WO2012124764A1 (ja) 2011-03-17 2012-09-20 国立大学法人三重大学 抗体の製造方法
WO2017102779A1 (en) * 2015-12-14 2017-06-22 Technische Universität München Helicobacter pylori vaccines
CN115581201A (zh) * 2022-08-26 2023-01-10 云南省农业科学院花卉研究所 以茎段为外植体诱导的二倍体月季f1-61的植株再生方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9300139L (sv) * 1993-01-19 1994-07-20 Medicarb Ab Framställning av ett nytt läkemedel

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115724922A (zh) * 2022-07-19 2023-03-03 四川大学华西医院 一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB及其制备方法与应用
CN115724922B (zh) * 2022-07-19 2023-08-22 四川大学华西医院 一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2001504329A (ja) 2001-04-03
BR9712587A (pt) 1999-10-26
TR199900940T2 (xx) 1999-09-21
EP0973394A4 (en) 2005-03-30
EP0973394A1 (en) 2000-01-26
NO991995D0 (no) 1999-04-27
AU5093398A (en) 1998-05-22
CN1235513A (zh) 1999-11-17
SA98180918A (ar) 2005-12-03
NZ334568A (en) 2000-04-28
AU734052B2 (en) 2001-05-31
CA2265523A1 (en) 1998-05-07
IL129397A0 (en) 2000-02-17
NO991995L (no) 1999-06-28
PL333169A1 (en) 1999-11-22
SK34699A3 (en) 2000-04-10
ID22065A (id) 1999-08-26
IS5005A (is) 1999-03-18
EE9900176A (et) 1999-12-15
WO1998018323A1 (en) 1998-05-07
AR009600A1 (es) 2000-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7074914B1 (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
WO1996040893A1 (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics
US20040052799A1 (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to Helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics
KR20000052831A (ko) 헬리코박터 필로리에 관한 핵산 및 아미노산 서열 및 그의 백신조성물
US7135560B1 (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
CA2248985A1 (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori and vaccine compositions thereof
AU739641B2 (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori and vaccine compositions thereof
WO1999021959A2 (en) Helicobacter pylori vaccine formulations
WO1997019098A9 (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics
WO1997019098A1 (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics
KR19990022600A (ko) 진단및치료용의헬리코박터피롤리관련핵산및아미노산서열
AU710880C (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics
CZ198899A3 (cs) Sekvence nukleových kyselin a aminokyselin související s Helicobacter pylori a vakcínové kompozice z nich připravené
MXPA99004890A (en) Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori
CZ148399A3 (cs) Sekvence nukleových kyselin a aminokyselin Helicobacter pylori a vakcinační prostředky

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid