CN115581201A - 以茎段为外植体诱导的二倍体月季f1-61的植株再生方法 - Google Patents

以茎段为外植体诱导的二倍体月季f1-61的植株再生方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了以茎段为外植体建立二倍体月季F1‑61的再生植株方法，包括如下步骤：(1)基因型预筛选；(2)外植体的获取与处理；(3)初代培养；(4)继代培养；(5)胚性愈伤组织诱导培养；(6)胚性愈伤组织增殖培养；(7)胚性愈伤组织分化培养；(8)不定芽成苗培养；(9)生根培养。本发明成功实现以茎段为外植体建立了高效的月季F1‑61胚性愈伤组织的再生方法，并通过胚性愈伤组织获得再生植株，为目的基因的遗传转化打下了良好的基础。

Description

以茎段为外植体诱导的二倍体月季F1-61的植株再生方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种以茎段为外植体诱导的月季F1-61的植株再生方法。
背景技术
月季是蔷薇科蔷薇属多年生木本植物，是全球应用形式最为广泛、经济价值最高的观赏植物，有些品种也被用于花茶、食用和药用。OW-BT群体是由月季‘月月粉’(Rosachinensis‘OldBlush’，2×)与‘无刺光叶蔷薇’(Rosa wichurana‘Basye’s Thornless’，2×)杂交获得(周宁宁等.2017)(周宁宁,李淑斌,李远波,等.二倍体月季F1群体的SSR鉴定与遗传分析.园艺学报,2017,44(01):151–160.)。
目前，月季新品种选育几乎完全依靠传统杂交育种。由于现代四倍体月季基因组高度杂合和马赛克特性，亲本的优良性状在杂交后代中分离严重，优良子代的获得率越来越低。因此，为了获得一个综合性能好且具有突破性的品种，育种家只得加大杂交量，这样的育种方法效率低下、成本巨大。
植物基因工程技术已成功应用于许多作物的目标性状改良上。该技术在月季中的应用必然是月季育种未来的发展趋势。随着21世纪测序成本的降低，‘月月粉’高质量的基因组序列草图已完成，大量的蔷薇属植物的高通量基因组和转录组数据已先后被发布，这将极大地加快对目标性状遗传信息的挖掘，不难想象基于蔷薇属植物的基础研究在未来几年内将有质的飞跃，大量针对目标性状的候选基因将等待被验证其功能。然而，由于月季其再生效率低和遗传转化效率低，在月季中进行目标基因的编辑、干扰或过表达仍然是个难题。这不仅阻碍了基础研究‘目标基因的功能研究’的进程，同时也阻碍了基因工程技术在月季育种中的推广应用。
基因型是影响植株再生效率的重要因素之一(Nguyen et al.2017)(Nguyen THN,Schulz D,Winkelmann T,Debener T(2017)Genetic dissection ofadventitious shootregeneration in roses by employing genome-wide association studies.Plant CellRep 36:1493–1505.)。以不同的月季品种、外植体、不同激素配方等方法诱导月季植株再生体系的研究已有一些报道，但其多数的再生效率并不高。由于基因型的遗传特性对其再生的影响较大，很难找到一种通用的方法诱导不同月季基因型的再生体系。月季F1-61是从OW-BT群体中筛选出的，胚性愈伤诱导率很高的基因型，该胚性愈伤增值能力和分化能力均较强，繁殖保存均简单，可直接用于遗传转化实验。目前，国内外还没有关于月季F1-61胚性愈伤组织诱导的报道。本发明筛选出的该基因型为半直立灌木、非连续开花、花粉红色、无香、花瓣半重瓣、非腺体皮刺均匀的分布与主枝和花枝、叶片易感白粉病，可以作为月季重要性状目的基因验证的优良受体材料，如非连续/连续开花、有/无皮刺、花瓣数量、花香、花色、抗白粉病等性状。因此，以F1-61建立的高效再生体系，对月季重要观赏和农艺性状的目的基因的功能研究具有重大意义。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种以月季F1-61的茎段为外植体，建立月季F1-61的高效植株再生方法。同时本发明方法既能在较短时间内直接获得再生芽也能在较长时间段内维持胚性愈伤组织的增殖与分化能力，可作为月季遗传转化的受体材料，包括如下步骤：
(1)基因型预筛选：首先在OW-BT群体中选择一次开花和皮刺性状稳定且在主枝和花枝上分布均匀的基因型F1-23、F1-46、F1-61，然后以三个基因型的叶片为外植体分别在含有(1mg/L)2,4-D或TDZ的MS培养基下进行初步筛选，获得综合诱导效果最好的基因型为F1-61。
(2)F1-61外植体的获取与处理：选取月季F1-61半木质化带腋芽的茎段作为接种外植体，剪去外植体叶片和皮刺；剪成4～5cm的小段后将其用稀释过的洗洁剂浸泡10min，期间不断震荡；流水冲洗60min，然后将外植体放置于消毒处理后的培养皿中；最后在超净工作台上进行消毒处理：先用75％酒精浸泡30s，然后用灭菌水清洗3次，取出再用0.1％升汞浸泡10min，期间每隔2min振荡一次，然后用灭菌水清洗3次，以上每次无菌水清洗均为2min。
(3)初代培养：将消毒处理后茎段切除上下两端1～2cm的小段，按形态学上下端放入培养基中保证其存活率，每瓶接种3个茎段，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d，期间注意其生长及污染情况，及时挽救处理或更换培养基。
(4)继代培养：切取步骤(3)培养4周后诱导出的芽，去除掉老化组织，接种到继代培养基中；每瓶接种3个芽，每4周继代1次，期间注意其生长及污染情况，及时挽救处理或更换培养基。培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d。
(5)胚性愈伤组织诱导培养：选取步骤(4)继代培养较好的幼苗切取茎段置于含有细胞分裂素(TDZ)的胚性愈伤组织培养基中：MS+2mg/L TDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0，培养温度为23℃，黑暗培养4周，期间注意其生长情况。而顶芽保留放入继代培养基中继续增殖培养以供二次取材。
(6)胚性愈伤组织增殖培养：将步骤(5)诱导出有光泽的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中：MS+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0,培养温度23℃，黑暗培养4周。
(7)胚性愈伤组织分化培养：将步骤(6)增殖的胚性愈伤组织转入分化培养基中：MS+0.5mg/L ZT+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0,培养温度23℃，黑暗培养4周。
(8)不定芽成苗培养：将步骤(7)诱导出的不定芽转至不定芽成苗培养基中：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0，增殖分化形成幼苗，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d。
(9)生根培养：将步骤(8)不定芽成苗培养的幼苗分装于生根培养基中，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d。
进一步地，在步骤(1)中，本发明在F1-23、F1-46、F1-61三个基因型中获得诱导效果最好的基因型为F1-61。
在步骤(2)中，消毒处理时，先用75％酒精浸泡30s，然后用灭菌水清洗3次，取出再用0.1％升汞浸泡10min，期间每隔2min振荡一次，然后用灭菌水清洗3次，以上每次无菌水清洗均为2min。
更进一步地，在步骤(3)中，初代培养基：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
在步骤(4)中，继代培养基：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
进一步地，在步骤(5)中，诱导胚性愈伤组织培养基：MS+2.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0。
在步骤(6)中，胚性愈伤组织增殖培养基：MS+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0。
进一步地，在步骤(7)中，胚性愈伤组织分化培养基：MS+0.5mg/L ZT+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0。
在步骤(8)不定芽成苗培养基：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
进一步地，在步骤(9)中，幼苗分装于生根培养基：MS+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
有益效果：本发明所筛选的基因型F1-61和采用的外植体不受季节限制，可周期性进行月季胚性愈伤组织诱导，并且具有较高的再生效率。本发明离体培养下的月季F1-61胚性愈伤组织还可通过次生组织不断增殖，具有良好的增殖效果。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明选择从二倍体月季群体中筛选胚性愈伤诱导和再生效率较高的基因型，二倍体相较四倍体在基因功能验证中具有更多优势，如遗传复杂性较低。
(2)本发明选择的基因型其双亲的高质量组装和注释基因组已被发布，更便于后续的基因功能验证研究。
(3)成功实现以茎段为外植体建立了高效的月季F1-61胚性愈伤组织的再生方法，并通过胚性愈伤组织获得再生植株，为目的基因的遗传转化打下了良好的基础。
月季遗传转化效率低和高度杂合的复杂遗传背景是目前制约月季基因功能验证的两大难题。因此，建立选择一个遗传背景相对清楚和具有高效再生能力的基因型对月季目的基因的功能验证具有重要意义。
附图说明
图1为本发明的方法流程图。
图2为本发明实施例1获取月季F1-61的外植体图。
图3为本发明试验例2细胞分裂素TDZ下诱导月季F1-61茎段胚性愈伤组织的生长状态图。
图4为本发明试验例3细胞分裂素TDZ下的胚性愈伤增殖的生长状态图。
图5为本发明试验例3细胞分裂素ZT下的胚性愈伤分化的生长状态图。
图6为本发明实施例1中月季F1-61不定芽成苗的生长情况图。
图7为本发明实施例1中月季F1-61幼苗生根培养的生长情况图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明提出了一种以茎段为外植体建立月季F1-61胚性愈伤再生体系的方法，以茎段为外植体在细胞分裂素TDZ下直接诱导胚性愈伤组织建立再生体系(如图1所示)，为目的基因转化提供转化受体材料，并为遗传转化打下良好的基础。
1、培养基设计
表1列出了本发明中各种培养基的成分及其用量。月季F1-61获取的茎段、不定芽成苗培养、生根培养在以下培养基中生长情况均较好(如图2，6，7所示)。月季F1-61的初代培养、继代培养、不定芽成苗培养、生根培养及其离体培养等培养基的实验设计如表1所示：
表1本发明培养基的成分及其用量
Figure BDA0003817847160000061
注：MS培养基的配制参见Murashige and Skoog 1962。
表1中的TDZ(噻苯隆，thidiazuron)，ZT(玉米素，Zeatin)均采用0.22μm过滤灭菌器灭菌，培养基高温灭菌后冷却至50℃以下加入。其他激素如6-BA(6-苄氨基腺嘌呤，6-benzylaminopurine)、NAA(a-萘乙酸，α-Naphthalene acetic acid)等直接加入培养基经过121℃灭菌25min。
2、建立月季F1-61间接再生的过程：
(1)外植体的获取与处理：选取月季F1-61半木质化带腋芽的茎段作为接种外植体，剪去外植体叶片和皮刺；剪成4～5cm的小段后将其用稀释过的洗洁剂浸泡10min，期间不断震荡；流水冲洗60min，然后将外植体放置于消毒处理后的培养皿中；最后在超净工作台上进行消毒处理：先用75％酒精浸泡30s，然后用灭菌水清洗3次，取出再用0.1％升汞浸泡10min，期间每隔2min振荡一次，然后用灭菌水清洗3次，以上每次无菌水清洗均为2min。
(2)初代培养：将消毒处理后茎段切除上下两端1～2cm的小段，按形态学上下端放入培养基中保证其存活率，每瓶接种3个茎段，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d，期间注意其生长及污染情况，及时挽救处理或更换培养基。
(3)继代培养：切取步骤(2)培养4周后诱导出的芽，去除掉老化组织，接种到继代培养基中；每瓶接种3个芽，每4周继代1次，期间注意其生长及污染情况，及时挽救处理或更换培养基。培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d。
(4)胚性愈伤组织诱导培养：选取步骤(3)继代培养较好的幼苗切取茎段置于含有细胞分裂素(TDZ)的胚性愈伤组织培养基中：MS+2mg/L TDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0，培养温度为23℃，黑暗培养4周，期间注意其生长情况。而顶芽保留放入继代培养基中继续增殖培养以供二次取材。
(5)胚性愈伤组织增殖培养：将步骤(4)诱导出有光泽的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中：MS+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0,培养温度23℃，黑暗培养4周。
(6)胚性愈伤组织分化培养：将步骤(5)增殖的胚性愈伤组织转入分化培养基中：MS+0.5mg/L ZT+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0,培养温度23℃，黑暗培养4周。
(7)不定芽成苗培养：将步骤(6)诱导出的不定芽转至不定芽成苗培养基中：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0，增殖分化形成幼苗，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d。
(8)生根培养：将步骤(7)不定芽成苗培养的幼苗分装于生根培养基中，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d。
3、实验结果
本发明以茎段为外植体建立月季F1-61间接再生的方法，从外植体到胚性愈伤组织的分化(即不定芽的发生)均通过黑暗培养完成，实验过程中单一添加某一激素即可获得再生植株，可用作遗传转化的材料，为目的基因的遗传转化打下良好的基础。
试验例1
胚性愈伤发生率较高的基因型的筛选
本发明在OW-BT群体(Rosa chinensis‘Old Blush’×Rosa wichuraiana‘Basye’sThornless’)中首先选择一次开花和皮刺性状稳定的基因型F1-23、F1-46、F1-61然后以三个基因型的叶片为外植体分别在含有(1mg/L)2,4-D或TDZ的MS培养基下进行初步筛选，结果发现F1-61的诱导效果最好(见表2，3)。并且在多步试验中发现F1-61不管是在含1.0～4.0mg/L 2,4-D还是TDZ的MS培养基上均能诱导再生植株的发生(此处部分试验结果未显示)。其它两个基因型诱导效果较差，其中F1-46在两种培养基下均能诱导胚性愈伤但发生频率较低且生长情况较差，而F1-23在含2,4-D的MS培养基上只诱导愈伤组织并不断增殖直至褐化死亡，在含TDZ的MS培养基上可直接诱导绿色有光泽的胚性愈伤组织的发生，继而诱导较低频率的再生植株。最终以诱导效果最好的基因型F1-61为试验材料进行后续的分化成苗和配方优化实验。
表2植物激素2,4-D对四个基因型的影响
Figure BDA0003817847160000081
表3植物激素TDZ对四个基因型的影响
Figure BDA0003817847160000082
注：愈伤诱导率＝愈伤组织数/接种的外植体数×100％；胚性愈伤诱导率＝胚性愈伤组织数/接种的外植体数×100％。
表2，3中的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-dichlorophenoxyaceticacid)直接加入培养基经过121℃灭菌25min，而激素TDZ同表1即可。
试验例2
不同浓度的TDZ对月季F1-61不同外植体诱导的愈伤组织及胚性愈伤组织发生的影响
不同浓度的TDZ对月季F1-61不同外植体诱导的愈伤组织及胚性愈伤组织发生的影响实验结果如表4和表5所示：
以顶端复叶三小叶为外植体时，不添加TDZ的培养条件下有极少量愈伤组织的发生，无胚性愈伤发生，继续培养愈伤组织逐渐褐化死亡。TDZ 1～4mg/L时，复叶顶端三小叶交叉叶柄处先膨大，继续培养偶有分化能力极强的绿色胚性愈伤发生。其中，复叶顶端三小叶在4mg/L时愈伤组织诱导率最高，为32.27％，在2mg/L时胚性愈伤组织诱导率最高，为6.96％。
表4不同浓度的TDZ对月季F1-61叶片愈伤组织及胚性愈伤组织发生的影响
Figure BDA0003817847160000091
注：愈伤诱导率＝愈伤组织数/接种的外植体数×100％；胚性愈伤诱导率＝胚性愈伤组织数/接种的外植体数×100％。
以茎段为外植体时，不添加TDZ浓度的培养条件下也有极少量愈伤组织的发生，无胚性愈伤发生，继续培养愈伤组织逐渐褐化死亡，部分在茎段腋芽处直接长出芽，部分茎段逐渐褐化死亡。TDZ 1～4mg/L时，茎段先肿大然后逐渐形成绿色有光泽的愈伤组织，继续培养部分可形成胚性愈伤并形成不定芽，其中茎段在2mg/L时愈伤组织诱导率最高，可达88.44％，胚性愈伤组织诱导率也最高，为86.00％。
综上所述，月季F1-61的茎段诱导比叶片诱导更佳，而TDZ浓度为2mg/L时，是茎段诱导胚性愈伤组织的最佳激素浓度。
表5不同浓度的TDZ对月季F1-61茎段愈伤组织及胚性愈伤组织发生的影响
Figure BDA0003817847160000101
注：愈伤诱导率＝愈伤组织数/接种的外植体数×100％；胚性愈伤诱导率＝胚性愈伤组织数/接种的外植体数×100％。
试验例3
两个较低浓度(0.1mg/L和0.5mg/L)的TDZ和ZT对月季F1-61胚性愈伤组织增殖与分化的影响
将试验例中的胚性愈伤组织接种到含有较低浓度(0.1mg/L和0.5mg/L)的TDZ或ZT的MS培养基中，蔗糖浓度为30g/L，植物凝胶为2g/L。置于黑暗条件下培养，4周后比较两种外源激素对胚性愈伤组织生长状态的影响。本发明发现0.1mg/L和0.5mg/L浓度的TDZ和ZT均能诱导不同胚性愈伤组织的增殖与分化(表6)。其中，0.5mg/L的TDZ诱导胚性愈伤组织增殖效果较佳(图4)，继续培养会伴随着少量的不同类型的胚状体发生。0.5mg/L的ZT诱导胚性愈伤组织分化的效果较佳，同时也伴随着较低概率的增殖效果(图5)。因此，0.5mg/L的TDZ适合月季F1-61胚性愈伤组织的维持，而0.5mg/L的ZT适合诱导F1-61胚性愈伤组织的分化。
表6较低浓度的TDZ和ZT对月季F1-61胚性愈伤组织增殖与分化的影响
Figure BDA0003817847160000111
注：胚性愈伤增殖率＝增殖的胚性愈伤组织数/接种的胚性愈伤组织数×100％；胚性愈伤分化率＝已分化的胚性愈伤组织数/接种的胚性愈伤组织数×100％；
以上不同的表所述层意为：
表1所述：本发明最终各种培养基的成分及其用量。
表2，3所述：三个基因型在含有生长素2,4-D或细胞分裂素TDZ的培养基中诱导愈伤组织的情况，其中诱导效果最好的基因型F1-61是试验最佳材料。
表4，5所述：细胞分裂素TDZ浓度在0～4mg/L时，复叶顶端三小叶和茎段两种外植体的诱导情况。其中，以茎段为外植体优于复叶顶端三小叶，而2mg/LTDZ是茎段诱导胚性愈伤组织的最佳激素浓度。
表6所述：试用两个较低浓度(0.1mg/L和0.5mg/L)的TDZ和ZT对月季F1-61胚性愈伤组织增殖与分化的影响时，发现0.5mg/L的TDZ适合月季F1-61胚性愈伤组织的维持，0.5mg/L的ZT适合诱导F1-61胚性愈伤组织的分化。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (6)

1.以茎段为外植体建立月季F1-61再生植株的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)基因型预筛选：首先在OW-BT群体中选择一次开花和皮刺性状稳定且在主枝和花枝上分布均匀的基因型F1-23、F1-46、F1-61，然后以三个基因型的叶片为外植体分别在含有1mg/L的2,4-D或TDZ的MS培养基下进行初步筛选，获得了综合诱导效果最好的基因型为F1-61；
(2)F1-61外植体的获取与处理：选取月季F1-61半木质化带腋芽的茎段作为接种外植体，剪去外植体叶片和皮刺；剪成4～5cm的小段后将其用稀释过的洗洁剂浸泡10min，期间不断震荡；流水冲洗60min，然后将外植体放置于消毒处理后的培养皿中；最后在超净工作台上进行消毒处理：先用75％酒精浸泡30s，然后用灭菌水清洗3次，取出再用0.1％升汞浸泡10min，期间每隔2min振荡一次，然后用灭菌水清洗3次，以上每次无菌水清洗均为2min；
(3)初代培养：将消毒处理后茎段切除上下两端1～2cm的小段，按形态学上下端放入培养基中保证其存活率，每瓶接种3个茎段，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d，期间注意其生长及污染情况，及时挽救处理或更换培养基；
(4)继代培养：切取步骤(3)培养4周后诱导出的芽，去除掉老化组织，接种到继代培养基中；每瓶接种3个芽，每4周继代1次，期间注意其生长及污染情况，及时挽救处理或更换培养基，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d；
(5)胚性愈伤组织诱导培养：选取步骤(4)继代培养较好的幼苗切取茎段置于含有细胞分裂素(TDZ)的胚性愈伤组织培养基中：MS+2mg/LTDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0，培养温度为23℃，黑暗培养4周，期间注意其生长情况，而顶芽保留放入继代培养基中继续增殖培养以供二次取材；
(6)胚性愈伤组织增殖培养：将步骤(5)诱导出有光泽的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中：MS+0.5mg/LTDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0,培养温度23℃，黑暗培养4周；
(7)胚性愈伤组织分化培养：将步骤(6)增殖的胚性愈伤组织转入分化培养基中：MS+0.5mg/LZT+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0,培养温度23℃，黑暗培养4周；
(8)不定芽成苗培养：将步骤(7)诱导出的不定芽转至不定芽成苗培养基中：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0，增殖分化形成幼苗，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d；
(9)生根培养：将步骤(8)不定芽成苗培养的幼苗分装于生根培养基中，培养温度为23℃，光照强度为2000Lux，光照时间为12h/d。
2.根据权利要求1所述的以茎段为外植体诱导的月季F1-61植株的再生方法，其特征在于：
在OW-BT群体中选择了适用于多个重要性状(如皮刺、连续开花、花瓣数、花色、花香、抗病等)的候选基因转基因验证研究的基因型F1-23、F1-46、F1-61，然后以其叶片为外植体分别在含有(1mg/L)2,4-D或TDZ的MS培养基下进行初步筛选，结果获得诱导效果最好的基因型F1-61。
3.根据权利要求2所述的以茎段为外植体诱导的月季F1-61植株的再生方法，其特征在于：在步骤(2)中，消毒处理时，先用75％酒精浸泡30s，然后用灭菌水清洗3次，取出再用0.1％升汞浸泡10min，期间每隔2min振荡一次，然后用灭菌水清洗3次，以上每次无菌水清洗均为2min；
在步骤(3)中，初代培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
4.根据权利要求3所述的以茎段为外植体诱导的月季F1-61植株的再生方法，其特征在于：在步骤(4)中，继代培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0；
在步骤(5)中，诱导胚性愈伤组织培养基：MS+2.0mg/LTDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0。
5.根据权利要求4所述的以茎段为外植体诱导的月季F1-61植株的再生方法，其特征在于：在步骤(6)中，胚性愈伤组织增殖培养基：MS+0.5mg/LTDZ+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0；
在步骤(7)中，胚性愈伤组织分化培养基：MS+0.5mg/LZT+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0。
6.根据权利要求5所述的以茎段为外植体诱导的月季F1-61植株的再生方法，其特征在于：在步骤(8)中，不定芽成苗培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0；
在步骤(9)中，幼苗分装于生根培养基中：MS+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
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