CN115724922B - 一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了一种核酸，编码幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB。该核酸序列如SEQID NO:2所示。本发明提供的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB可溶性表达、易纯化、纯度高等，具有显著的经济效益，且动物实验证明其有效刺激机体产生免疫应答并具备良好的免疫保护作用，可作为预防幽门螺杆菌感染的疫苗候选成分。

Description

一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及幽门螺杆菌(Helicobacter prlor，HP)重组蛋白TonB的制备及应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter prlor，HP)是一种革兰氏阴性菌，世界卫生组织早在1994年就公布为Ⅰ类致癌物，很多研究表明在包括十二指肠、胃溃疡，粘膜相关组织淋巴瘤和胃腺癌的形成中都起到重要作用。此外，大量的研究也证实，HP感染也与其他一些非消化系统疾病的发生有密切关系。而胃癌作为全球三大常见癌症，其中50％以上来自中国、日本及韩国，预后很差，只有1/5的患者在诊断后存活超过5年。2007年在《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》中被明确指出根治Hp是感染预防胃癌的重要手段之一，也是最为有效的一级预防措施，能显著降低胃癌的发生率和病死率。

目前，通过免疫接种的方式来有效预防感染，对HP的传播途径进行阻断，能够极大降低相关疾病的发生。然而，众所周知，当致病菌入侵宿主时，其为了生存繁殖，需要获取到大量自身必需的营养物质，而往往宿主体内的这些物质都是不能被致病菌直接利用到的。比如对于包括致病菌在内几乎所有生命都必需的铁离子，一般宿主体内铁源主要存在于血红素结合蛋白和铁离子结合蛋白。都是无法被致病菌直接利用的，需要一个复杂的过程将铁运输到胞内直接使用，或者将血红素转运至胞内降解释放铁离子后再利用。为了适应宿主体内的这种限制，大部分革兰氏阴性菌包括HP都具有一个TonB系统，利用这个系统致病菌可以转运宿主体内的铁离子、维生素B12、碳水化合物等等自身必需的营养物质用以生存繁殖。其中，TonB蛋白就是这个系统的重要组成部分，这也导致其在HP中广泛存在且高度保守。

如何获取适用于作为幽门螺杆菌疫苗的高纯度的蛋白抗原TonB，是目前幽门螺杆菌研究领域面临的难题之一。

发明内容

针对HP感染目前只能采用抗生素联用的方式治疗，存在费用昂贵，复发率高，多因素导致无法正常用药等不足，本发明目的旨在提供一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB及其制备方法，能够有效刺激机体产生免疫应答并具备良好的免疫保护作用。

本发明提供了一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种核酸，编码上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB。在优选实现方式中，核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB的制备方法，包括步骤：

1)质粒构建，原核表达

将上述重组蛋白抗原TonB核酸连接在表达载体质粒中，将该连接好的质粒转入宿主菌中进行诱导表达；

2)破菌、离心：

收集表达后的菌液用pH为7.5-8.5的破菌液重悬混匀，然后在给定压力下进行均质破菌，之后经离心，收集上清液；

3)分别使用Ni亲和层析柱和SP层析柱对上清液依次进行纯化，即得到重组蛋白抗原TonB。

上述步骤1)中，所述重组蛋白抗原TonB核苷酸序列通过反向疫苗学筛选出；使用的表达载体为pET28a、pET22b或pET30a等；宿主菌为E.coli BL21(DE3)、AD494(DE3)或Origami B(DE3)等；诱导表达条件为于16～37℃、150～220rpm条件下诱导表达过夜；诱导表达使用的是0.1～0.5mM的IPTG。

上述步骤2)中，破菌液为pH7.5～8.5的20～50mM Tris-HCl，0.15～0.5M NaCl，0～25M咪唑；破菌参数为外循环温度-4～-2℃、压力600～700bar、功率20～30％、6～7个循环；离心条件为12000～17000g、30～40min。

上述步骤3)中，Ni亲和层析柱亲和纯化操作为：首先使用A液平衡Ni亲和层析柱，然后取过滤后上清液上样，再使用不同比例的A液和B液的混合液进行梯度洗脱；Ni亲和层析柱使用填料为Ni Sepharose High Performance(cytiva，货号：17526802)；A液为：pH8.3的50mM Tris-HCl，0.15M NaCl，25mM咪唑；B液为pH8.3的50mM Tris-HCl，0.15M NaCl，0.5M咪唑。

SP层析柱亲和层析操作为：经Ni亲和层析柱纯化后得到的目的蛋白，首先使用C液平衡SP层析柱，然后D液进行洗脱即可；SP层析柱使用填料为SP Sepharose Highperformance(cytiva，货号：17108701)；C液为：pH 8.3的20mM Tris-HCl；D液为pH8.3的20mM Tris-HCl，1M NaCl。

本发明所述制备方法所得到的重组蛋白抗原TonB纯度大于95％，通过氨基酸序列预测重组蛋白抗原TonB分子质量约为21.7KD，等电点在9.37左右(经氨基酸序列预测得到)。

本发明进一步提供了上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB在制备幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗中的应用。本发明所述的纯化方法主要有Ni亲和纯化、SP亲和层析，通过上述方法纯化的重组蛋白抗原TonB用15％SDS-PAGE检测，呈单一目标蛋白条带，分子质量约为21.7KD，蛋白纯度为99.32％。纯化后的TonB与氢氧化铝佐剂共同注射免疫BalB/C小鼠，结果发现重组蛋白抗原TonB免疫小鼠产生的血清抗体IgG效价可达1:256000；重组蛋白抗原TonB与LTs63K佐剂滴鼻免疫Balb/c小鼠后可显著提高抗体sIgA效价，诱导产生黏膜免疫应答。这证明使用本发明纯化方法获得的重组蛋白抗原TonB可有效刺激机体产生较高的免疫应答。并经免疫保护力评价实验证实具有良好的保护效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB，通过大肠杆菌基因工程表达获得，动物实验表明其能够有效刺激机体产生免疫应答并具备良好的免疫保护作用；可作为预防幽门螺杆菌感染的疫苗候选成分；

2、本发明提供的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB制备方法工艺简单、成本低、可操作性强等优点，所获目的蛋白抗原可溶性表达、易纯化、纯度高等，具有显著的经济效益。

附图说明

图1为重组质粒TonB-Pet28a双酶切鉴定结果；泳道1：TonB/28a质粒；泳道2：TonB/28a双酶切；M：Takara DNA DL5000；鉴定结果显示分离片段约为5300bp和550bp。

图2为TonB蛋白诱导鉴定结果；泳道1：全菌液；泳道2：破菌上清；泳道3：破菌沉淀；鉴定结果显示TONB蛋白约为21.7KD，可溶表达。

图3为NI亲和层析分析结果；(a)为Bio-Rad，NGC QUEST 100PLUS原始纯化数据图；(b)为电泳结果；泳道1：样品；泳道2：流穿；泳道3：5％B液洗脱蛋白；泳道4：10％B液洗脱蛋白；M：Marker。

图4为SP层析分析结果；(a)为Bio-Rad，NGC QUEST 100PLUS原始纯化数据图；(b)为电泳结果；泳道1：流穿；泳道2：样品；泳道3：25％D液洗脱蛋白-1；泳道4：25％D液洗脱蛋白-2；泳道5：25％D液洗脱蛋白-3；M：Marker。

图5为LTs63K电泳鉴定结果；1：上样；2：流穿；3：洗脱1；4：洗脱2；5：洗脱3；M：Marker。

图6为重组蛋白抗原TonB免疫小鼠IgG几何平均滴度(对应抗体滴度1:256000)；

图7为重组蛋白抗原TonB免疫后小鼠阴道灌洗液sIgA几何平均滴度(对应抗体滴度1:128)。

具体实施方式

以将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。

以下实施例所使用的菌株及试剂如下：

(1)幽门螺杆菌菌株：

幽门螺杆菌购自美国ATCC(J99/Helicobacter pylori(700824))；

(2)试剂：

1)质粒pET-28a购自GE Healthcare Life Sciences公司；

2)大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自上海超研生物科技有限公司；

3)DNA Marker、限制性内切酶Nco I和Xho I、T4 DNA Ligase、蛋白Marker为Thermo Fisher产品；

4)质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒及超薄回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。

实施例1：TonB基因的重组质粒pET28a/TonB的构建及鉴定

首先根据幽门螺杆菌全基因组序列，应用反向疫苗学理论使用生物信息学技术筛选出了候选抗原TonB(参见WP_001945492.1energy transducer TonB[Helicobacterpylori])，抗原TonB的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示。

根据抗原TonB的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化(参见Villalobos A,Ness JE,Gustafsson C,Minshull J,Govindarajan S.Gene Designer:asynthetic biology tool for constructing artificial DNA segments.BMCBioinformatics.2006)，获得目的核酸序列，序列为SEQ ID NO:3(最前面的CCATGG和最后的CTCGAG表示酶切位点碱基序列)。

对目的核酸序列进行合成：通过Nco I和Xho I酶切位点，将目的基因片段插入表达质粒pET28a中，质粒测序结果与提交合成的序列信息比对，核酸序列(SEQ ID NO:2)完全相同。

将合成质粒用40μl无菌水溶解，取2μl转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min，42℃热休克90s，迅速冰浴3min。加入1ml SOC培养基，混匀，置37℃摇床中220rpm振荡45min。

取100μl菌液涂布于Kana抗性LB平板，置37℃培养箱中培养16h。

然后进行pET28a/TonB/BL21(DE3)阳性重组质粒的筛选、鉴定，包括以下步骤：

(1)挑取转化平板上分隔良好的单个菌落，接种于Kana抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

(2)参照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取；

(3)将提取的质粒DNA在37℃进行Nco I和Xho I双酶切，酶切时间为2h；双酶切反应体系如表1所示；

(4)使用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶(1.5g琼脂糖溶解于100ml TAE缓冲液中得到)电泳检测双酶切结果，结果如图1，表明基因重组质粒构建成功。

表1双酶切反应体系

试剂	体积μl
		10×K Buffer	1
0.1％BSA	1
		Xho I	0.4
Nco I	0.4
		质粒	2
Water,nuclease-free	Up to 10

实施例2：重组蛋白TonB在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定

取过夜培养的pET28a/TonB/BL21(DE3)菌液100μl加入10mL卡那霉素+抗性的LB培养基中，在37℃、于220rpm振荡过夜培养；分别取过夜培养的菌液200μl加入20mL卡那霉素+抗性的LB培养基中，在37℃、于220rpm培养2h，二次活化至OD600为0.8时，加入IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷10μl，使其终浓度为0.5mM，再置于摇床在37℃、于220rpm诱导表达4h。

将诱导表达后的菌液取出，以8000g离心15min，弃去上清，加入3ml破菌液(50mMTris-HCl，0.5M NaCl，25mM咪唑，pH 8.3)混匀，冰浴超声裂解10min(超声5s停止6s)，再在4℃、12000g离心30min，分离上清及沉淀。

处理样品：在沉淀中加入3ml破菌液重悬，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μl加入10μl 5X蛋白上样缓冲液(生工，货号：C508320-0010)，于金属浴100℃静置10min，之后于12000g离心3min。

SDS-PAGE电泳：将处理好的裂菌液、上清和沉淀分别取10μl上样，进行浓度为15％的SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，再置于脱色液(5％冰醋酸及10％无水乙醇水溶液)中脱色，采用凝胶扫描成像系统(ChemiDoc MP，Bio-Rad)扫描，扫描结果如图2所示。结果表明，pET28a/TonB/BL21(DE3)目的蛋白大小正确，为可溶性表达。

实施例3：重组蛋白抗原TonB的制备

放大培养获取重组蛋白TonB：取过夜培养的pET28a/TonB/BL21(DE3)菌液30mL加入3L Kana+抗性的TB培养基中，在37℃、于220rpm培养3h，培养至OD600为1时，加入1M IPTG1.5ml，使其终浓度为0.5mM，在37℃、于220rpm诱导表达4h。将诱导后的菌液，8000g离心15min收集菌体，再加入160ml破菌液(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行高压均质破碎(外循环温度-4℃、压力650bar、功率25％、6个循环)。之后，12000g离心30min，取上清液。

重组蛋白TonB纯化，包括以下步骤：

(1)Ni柱亲和层析：取破菌液上清液，过0.45μm滤膜备用。使用A液(50mM Tris-HCl，0.15M NaCl，25mM咪唑，pH 8.3)平衡Ni柱亲和层析柱，取过滤后上清液上样，再使用5％B液(50mM Tris-HCl，0.15M NaCl，0.5M咪唑，pH 8.3)+95％A液洗脱杂质，10％B液+90％A液洗脱目的蛋白。Ni柱亲和层析柱的层析图如图3(a)所示，Ni柱亲和层析柱后经SDS-PAGE的电泳结果如图3(b)所示。

(2)SP柱层析

取(1)中洗脱的蛋白10ml加入C液(20mM Tris-HCl，pH 8.3)稀释至100ml备用。用C液平衡SP层析柱，取样品上样，C液冲洗平衡，再使用75％C液+25％D液(20mM Tris-HCl，1MNaCl，pH 8.3)洗脱，收集洗脱下来的目的蛋白(即蛋白抗原TonB)保存4℃备用。SP柱层析的层析图如图4(a)所示，SP柱层析后经SDS-PAGE的电泳结果如图4(b)所示，获得了纯度为99.32％的目的蛋白。

实施例4：动物的免疫及血清特异性抗体IgG检测

(1)重组蛋白抗原TonB与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠后血清特异性抗体IgGElisa检测

Balb/C小鼠，雌性，8-10周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。分为免疫组(重组蛋白抗原TonB+氢氧化铝佐剂)、阴性对照组(氢氧化铝佐剂)和空白对照组，每组20只。

重组蛋白抗原TonB与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠过程包括以下步骤：

1)首次免疫，50μg重组蛋白抗原TonB和氢氧化铝佐剂体积比1：1混合，双侧大腿肌肉注射(100μl/鼠)。

2)第二次免疫，第14天进行二次免疫，注射量与免疫方式同上；

3)第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，注射量与免疫方式同上；

4)第四次免疫，在第28天进行第三次免疫，注射量与免疫方式同上。

第四次免疫后5天，采集Balb/C小鼠眼眶静脉血，于4℃静置3h，之后3000rpm离心5min分离血清，用Elisa检测TonB特异性IgG水平变化，包括以下步骤：

1)抗原包被：取包被液将前面实施例3制备的TonB纯化蛋白稀释至4μg/mL，然后按照100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；包被液为20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH 8.3。

2)封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后，于4℃保存备用；封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。

3)标本稀释：将血清从1:8000开始进行系列倍比稀释至1:256000。

4)加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做两个重复，37℃孵育1h，之后PBST洗涤4次；PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20。

5)加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(生工，货号：D110087-0100)，100μL/孔，37℃孵育30min，之后PBST洗涤4次；抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20+0.5％BSA。

6)显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；显色液为TMB储存液：底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na₂HPO4 100mM；中终止液为2M H₂SO4。

7)结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。

结果：如表2及图6所示，检测重组蛋白抗原TonB免疫小鼠产生的抗体IgG效价达到1：256000；TonB免疫小鼠对重组TonB的几何平均滴度为1:137588.4，免疫后抗体阳性率达到100％，说明重组蛋白抗原TonB能够使免疫小鼠体内产生抗体。

表2 IgG几何平均滴度

(2)重组蛋白抗原TonB与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠阴道灌洗液特异性抗体sIgA Elisa检测

Balb/C小鼠，雌性，8-10周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，LTs63K自制(制备方法如文献：冯强.重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究.[D].重庆大学.2003)，制备结果如图5所示，动物分组如下表3所示：

表3 TonB与LTs63K佐剂联合免疫小鼠分组

重组蛋白抗原TonB与LTs63K佐剂联合免疫小鼠过程包括以下步骤：

1)首次免疫，50μg重组蛋白抗原TonB和10μg LTs63K佐剂混合后，混匀仪4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中免疫备用，吸取已配制的免疫原，缓慢滴于小鼠鼻腔小鼠：7μL/侧，共14μL/鼠；

2)第二次免疫，在第14天进行二次免疫，注射剂量与免疫方式同上；

3)第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上；

4)第四次免疫，在第28天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上。

第四次免疫后5天，用PBST(含0.05％吐温20的PBS)采集Balb/C小鼠阴道灌洗液，75μL/次，灌洗4次，300μL/鼠。采集后涡旋1min，然后12000g离心3min取上清液用于Elisa检测TONB特异性sIgA水平变化。

1)抗原包被：取包被液将实施例3制备的TonB纯化蛋白稀释至4μg/mL，然后按照100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；包被液为20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH 8.3。

2)封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后，于4℃保存备用；封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。

3)标本稀释：将血清从1:16开始进行系列倍比稀释至1:256。

4)加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做两个重复，37℃孵育1h，之后PBST洗涤4次；PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20。

5)加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgA(Abcam，货号：Ab97235)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20+0.5％BSA；

6)显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na₂HPO4 100mM；中终止液为2M H₂SO₄。

7)结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。

结果：如表4及图7所示，检测重组蛋白抗原TonB免疫小鼠产生的sIgA抗体效价达到1:128；TonB免疫小鼠对重组蛋白抗原TonB的几何平均滴度为1:84.4；免疫后抗体阳性率达到100％，说明重组蛋白抗原TonB能够刺激小鼠产生黏膜免疫应答。

表4 TonB免疫后小鼠阴道灌洗液sIgA几何平均滴度

实施例5：重组蛋白抗原TonB免疫后攻毒保护力评价

对末次滴鼻免疫后10天的小鼠按照以下步骤进行重组蛋白抗原TonB免疫后攻毒保护力评价：

(1)灌胃：在末次滴鼻免疫后10天进行口服灌胃幽门螺杆菌J99活菌进行攻毒实验，灌胃前24h断食，17h断水，每只小鼠感染剂量为2.0×10⁷CFU，灌胃后2h恢复水食。

(2)平板培养：灌胃后一周宰杀小鼠取其胃组织剪碎后放入PBS缓冲液中，涡旋3min，然后将其洗涤原液与10倍稀释液涂布于含有5％脱纤维绵羊血(南京茂捷生物)与0.5％复合抗生素(万古霉素1.67mg/mL、多粘菌素0.0694mg/mL、甲氧苄啶0.5mg/mL、两性霉素B 0.2mg/mL)Skirrow平板上(月示蛋白胨15g/L(海博生物)、胰蛋白胨2.5g/L(Oxoid)、酵母浸粉5g/L(Oxoid)、氯化钠5g/L(科隆试剂)、pH7.4)，37℃微需氧(5％O₂、10％CO₂、85％N₂)培养3d后观察。

(3)结合Hp菌落特征，快速尿素酶试剂以及镜检等方式来检测平板上是否存在Hp，以此来确定小鼠是否成功感染Hp；其中，疫苗保护率＝(对照组感染阳性率-免疫组感染阳性率)/对照组感染阳性率*100％。

结果：对照组与实验组各20只小鼠平板培养情况统计如下表，对照组20只小鼠平板培养检测均为阳性，感染率为100％，实验组小鼠20只小鼠中有9只小鼠平板培养阳性，感染率为45％，那么本疫苗的保护效率为55％。

因此，本发明制备的重组蛋白抗原TonB具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生较强的免疫应答，并且能有效抑制小鼠胃内的幽门螺杆菌定植。

表5小鼠免疫后攻毒Hp感染阳性率统计

小鼠编号	对照组	实验组	小鼠编号	对照组	实验组
						1	+	-	11	+	-
2	+	-	12	+	+
						3	+	+	13	+	-
4	+	+	14	+	+
						5	+	-	15	+	+
6	+	-	16	+	-
						7	+	-	17	+	+
8	+	+	18	+	-
						9	+	-	19	+	+
10	+	+	20	+	-

注:“+”表示为快速尿素酶试剂与镜检均为阳性，“-”表示为快速尿素酶试剂与镜检阴性

综上所述，本发明通过生物信息学技术采用“反向疫苗学”锚定了TonB蛋白的部分相关结构，同时满足了抗原性强、易于表达且高度保守，为幽门螺杆菌疫苗的研发提供了一个重要的抗原成分。本发明将选定的基因克隆至的蛋白表达载体，重组在工程菌内进行大规模表达，经过纯化后制备成为基因工程亚单位疫苗。该疫苗具有工艺简单、成本低、可操作性强等优点，而作为HP膜转运蛋白中的重要组成TonB蛋白，也将是Hp基因工程疫苗最有希望的候选抗原之一。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种权利要求1所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1)质粒构建，原核表达

将权利要求2或3所述的重组蛋白抗原TonB核酸连接在表达载体质粒中，将该连接好的质粒转入宿主菌中进行诱导表达；

2)破菌、离心：

收集表达后的菌液用pH为7.5-8.5的破菌液重悬混匀，然后在给定压力下进行均质破菌，之后经离心，收集上清液；

3)分别使用Ni亲和层析柱和SP层析柱对上清液依次进行纯化，即得到重组蛋白抗原TonB。

5.权利要求1所述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原TonB在制备幽门螺杆菌重组亚单位基因工程候选疫苗中的应用。