CN116903711B - 幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1及其制备方法和用途 - Google Patents

幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种幽门螺杆菌重组蛋白CagA1及其制备方法和用途。目前Hp疫苗的研究主要集中在尿素酶UreA、UreB或空泡毒素VacA等毒力因子上，还未见有对CagA1蛋白是否能作为疫苗抗原成分的研究，本发明提供了一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了该幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的编码核苷酸，以及制备方法和用途。该蛋白具有易纯化、纯度高、制备方法简便等优点，具有显著的经济效益，且动物实验证明其有效刺激机体产生免疫应答并具备良好的免疫保护作用，可作为预防幽门螺杆菌感染的疫苗抗原候选成分。

Description

幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及幽门螺杆菌重组蛋白CagA1及其制备方法和用途。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是微需氧螺旋形革兰氏阴性菌，已被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌物，是多种消化道疾病的危险因素，也是引起胃、十二指肠溃疡及胃癌等疾病的常见病菌。目前通过质子泵抑制剂(PPI)和胃黏膜保护剂，并结合三联或四联疗法进行临床治疗，但随着细菌耐药问题的日益加剧，目前的临床治疗手段疗效受限，急需研制有效的疫苗进行预防和治疗。
细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A，CagA)属于外膜蛋白，为Hp主要的毒力因子之一。蛋白CagA由细胞毒素相关基因致病岛编码的Ⅳ型分泌系统(TypeⅣsecretion systems，T4SS)转运到胃黏膜上皮细胞，通过侵入上皮细胞基质，使细胞形态发生改变，影响其增殖和凋亡过程，进而引起炎症反应。不同Hp菌株的CagA基因长度不等，约3444～5925bp，通常可分为N末端保守区(约占70％)和C末端可变区(约占30％)，可变区存在数目不等的重复序列。西方国家的Hp菌株CagA基因携带率为60～70％，而亚太地区国家Hp菌株CagA基因携带率通常高达90％以上。
目前还未有研究报道Hp菌株的CagA1蛋白是否可以作为特异性抗原引起机体免疫反应。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：目前Hp疫苗的研究主要集中在尿素酶UreA、UreB或空泡毒素VacA等毒力因子上，还未见有对CagA1蛋白是否能作为疫苗抗原成分的研究。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1。所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1抗原CagA1的氨基酸序列
MGTNETIDQQPQTEAAFNPQQFISYDPDQKPIVDKNDRDNRQAFDGISQLREEYSNKAIKNPTKKNQYFSDFINKSNDLINKDALIDVESSTKSFQKFGDQRYQIFTSWVSHQNDPSKINTRSIRNFMEHTIQPPIPDDKEKAEFLKSAKQSFAGIIIGNQIRTDQKFMGVFDESLKERQEAEKNGGSTGGDWLDIFLSFIFDKKQSSDVKEAINQEPVPHIQPDIATSTTHIQGLPPESRDLLDERGNFSKFTLGDMEMLDVEGVADMDPNYKFNQLLIHNNTLSSVLIGSHDGIEPEKVSLLYAGNGGFGDKHDWNATVGYKDQQGNNVATIINVHMKNGSGLVIAGGEKGINNPSFYLYKEDQLTGSQRALSQEEILNKIDFMEFLAQNNAKLDNLSEKEKEKFQNEIKDFQKDSKPYLDALGNDRIAFVSKKDPKHSALSNFKYTNASKSPNKGVGVTNGVSHLEAGFSKVAVFNLPNLNNLAITSVVRRLE。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1中，编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2抗原CagA1的编码核苷酸序列
CCATGGGCACCAATGAAACCATCGACCAGCAACCTCAGACGGAAGCAGCTTTCAATCCGCAACAGTTTATTTCTTATGATCCCGACCAAAAGCCAATTGTAGATAAGAACGATCGTGATAATCGTCAGGCTTTCGACGGAATTTCGCAACTTCGCGAGGAGTACTCGAATAAAGCAATCAAGAATCCCACGAAGAAGAACCAGTATTTCAGTGATTTTATCAATAAATCGAACGACCTTATTAATAAAGACGCCCTTATCGACGTTGAGTCTTCGACCAAGTCATTTCAGAAGTTCGGAGATCAGCGCTATCAAATCTTTACCTCCTGGGTATCACACCAGAACGACCCTAGTAAAATCAACACGCGTAGCATCCGCAATTTTATGGAACATACGATCCAGCCGCCCATTCCAGACGATAAGGAGAAAGCGGAGTTCCTGAAAAGCGCGAAGCAATCTTTTGCGGGGATTATCATTGGAAACCAGATCCGTACGGATCAAAAGTTCATGGGCGTATTTGACGAAAGTCTGAAAGAGCGCCAGGAAGCGGAGAAGAACGGTGGATCTACGGGTGGAGATTGGCTGGACATTTTCCTGTCCTTCATCTTCGACAAGAAACAATCGAGCGATGTAAAGGAAGCCATTAATCAGGAACCTGTACCCCATATTCAACCTGATATTGCCACGAGCACCACGCACATTCAAGGATTGCCGCCCGAGTCGCGCGACCTTCTTGATGAGCGCGGGAATTTCTCTAAGTTCACGCTTGGGGACATGGAGATGTTGGACGTGGAGGGCGTTGCCGACATGGACCCCAATTACAAGTTTAACCAATTGTTAATTCATAACAACACACTTTCATCCGTTCTTATTGGATCGCACGACGGGATCGAACCCGAAAAGGTCTCGTTGTTGTATGCAGGAAATGGAGGTTTTGGTGATAAGCACGATTGGAACGCTACGGTCGGGTATAAAGACCAACAAGGAAACAACGTCGCCACGATCATCAATGTCCACATGAAGAATGGTAGTGGTCTTGTCATTGCAGGCGGCGAGAAGGGGATTAATAACCCGTCATTTTACTTATATAAAGAGGACCAATTAACTGGTTCGCAACGTGCACTGTCTCAGGAAGAGATCCTTAACAAGATTGACTTTATGGAGTTTCTGGCTCAGAACAATGCTAAACTTGACAACCTTTCGGAGAAAGAAAAGGAGAAGTTCCAAAATGAGATTAAGGACTTCCAAAAGGATTCGAAGCCCTATTTAGACGCTCTTGGGAATGATCGTATCGCTTTTGTTAGTAAGAAAGACCCTAAGCACTCCGCACTTTCTAACTTCAAGTATACAAATGCATCGAAATCTCCCAACAAAGGTGTGGGTGTCACAAATGGCGTTTCTCATCTGGAGGCTGGGTTTTCAAAAGTGGCGGTATTTAATCTGCCAAATTTAAATAACCTTGCCATTACATCAGTCGTACGCCGCCTCGAG。
本发明还提供了一种上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法，包括以下步骤：
a、质粒构建，原核表达
将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因连接在表达载体质粒中，构建质粒并转入宿主菌中进行诱导表达；
b、破菌、离心
收集表达后的菌体用破菌液重悬混匀，高压均质破菌，低速离心，收集包涵体沉淀；
c、包涵体洗涤及溶解
将步骤b收集的沉淀使用包涵体洗涤液及破菌液进行离心，并使用A液进行重悬清洗，2～8℃溶解过夜；
d、Ni柱亲和纯化
A液重悬后获得的上清液，使用A液平衡层析柱，使用B液梯度洗脱，进行纯化；
e、凝胶过滤层析
经步骤d纯化的目的蛋白，使用C液平衡凝胶过滤层析柱，C液复性并洗脱，得到幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法中，步骤a所述的表达载体为pET28a；宿主菌为E.coli BL21(DE3)；表达条件为16～37℃，120～220rpm；诱导浓度为0.1～0.5mM IPTG。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法中，步骤b所述的破菌液为pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～0.5M NaCl；破菌条件为外循环温度-4～0℃、压力600～850bar、功率20～30％、4～6个循环；离心条件为2000～5000g，10～30min。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法中，步骤c所述的包涵体洗涤液组成为：pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～1％Triton X～100，1～5mM EDTA，0.1～0.5M NaCl。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法中，步骤c所述的离心条件为12000～17000rpm，15～30min。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法中，步骤d所述的Ni亲和填料为Ni Sepharose High Performance(cytiva，货号：17526802)；所述的A液组成为：pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～0.5M NaCl和10～50mM咪唑，6～8M尿素；B液组成为pH6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～0.5M NaCl和0.5～1M咪唑，6～8M尿素。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法中，步骤d所述的凝胶过滤层析柱填料为Sephadex G-25Medium(cytiva，货号：17003301)；所述C液组成为：pH6.0～8.0的10～30mM PB，100～150mM NaCl，0.1～0.6％精氨酸。
本发明还提供了一种上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染药物中的用途。
进一步的，所述的药物为疫苗。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过分析Hp全基因组中与CagA相关序列，并截取其N端包含功能结构域的基因序列进行表达纯化，获得可引起胃上皮细胞功能紊乱与病变的蛋白CagA1的氨基酸序列，并对编码该氨基酸的核苷酸序列进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，将其导入载体重组表达后，得到大肠杆菌表达的基因工引起程重组幽门螺杆菌抗原蛋白CagA1。
进一步的，本发明采用特别的蛋白纯化方法，从表达的重组单位基因工程蛋白CagA1的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于95％，通过氨基酸序列预测本发明构建获得的蛋白CagA1分子质量约为56.5kD，等电点在5.7左右。并验证发现该重组蛋白能够有效刺激体液免疫应答，血清抗体IgG显著提高，也能有效刺激黏膜免疫应答，产生较高的抗体sIgA，并经免疫保护力评价实验证实具有良好的保护效果，可以作为预防幽门螺杆菌感染的抗原成分使用，后续用来制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗。
附图说明
图1所示为重组质粒：CagA 1/pET28a双酶切鉴定结果；M：Takara DL5000 DNAMarker；1：质粒CagA1/pET28a；2：CagA 1/pET28a双酶切；鉴定结果显示分离片段约为5300bp和1500bp。
图2所示为CagA1蛋白诱导鉴定结果；1：全菌液；2：破菌上清；3：破菌沉淀；M：Thermo Scientific Protein Ruler；鉴定结果显示CagA 1蛋白约为56.5kD，沉淀表达。
图3所示为NI亲和层析电泳结果；1：上样；2：流穿；M：Vazyme protein markerMP102；3：5％B-2；4：5％B-3；5：10％B；6：5％B-1。
图4所示为凝胶过滤层析电泳结果；1：C～1；2：C～2；3：C～3；4：C～4；5：D～1；6：D～2；7：D～3；M：Vazyme protein marker MP102。
图5所示为制备的LTs63k SDS～PAGE电泳结果；1：上样，2：流穿，3～5：目的蛋白洗脱，M：Vazyme protein marker MP102。
图6所示为血清特异性抗体IgG Elisa检测情况，***P<0.001。
图7所示为阴道灌洗液特异性抗体sIgA Elisa检测情况，**P<0.05。
具体实施方式
蛋白CagA是Hp菌株定植于胃黏膜层后，通过其Ⅳ型分泌系统进入宿主细胞质，通过依赖或独立于磷酸化等相关机制干扰宿主细胞信号传导产生病变，导致胃溃疡或胃癌发生与发展。但全长CagA蛋白分子量较大，约130～145kD，不符合疫苗抗原分子特性。本发明通过比较分析数据库中Hp菌株CagA相关的序列，利用生物信息技术与“反向疫苗学”理论截取其包含有功能结构域N端序列，从而获得了具有免疫原性的CagA1蛋白，氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
同时，本发明还对表达该蛋白的密码子进行了优化，获得了核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的编码基因。本发明的编码基因是根据宿主菌株BL21(DE3)的常用密码子把编码氨基酸的核苷酸序列进行优化，使得基因序列更容易在我们选择的宿主菌中表达。因此，本发明的重组载体在转化工程菌后可以进行大规模表达，经过纯化后获得重组蛋白，可用于制备基因工程亚单位疫苗。该重组蛋白具有制备工艺简单、成本低、可操作性强等优点，有望成为Hp基因工程疫苗候选抗原之一。
本发明成功构建了包含CagA1蛋白的重组载体，并进行了高效的表达，表达的蛋白正确折叠且稳定，又通过采用Ni柱层析和凝胶过滤层析结合的纯化方式，获得了纯度很高的目的蛋白。
本发明的CagA1蛋白为包涵体表达，本发明通过离心来获取重组蛋白，此时沉淀还包含了破碎的细菌菌体残留的一些成分包括膜蛋白，脂类，核酸等，为了去除杂质，本发明特别的筛选得到适宜纯化包涵体的包涵体洗涤液，组成为：pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1～1％Triton X-100，1～5mM EDTA，0.1～0.5M NaCl。同时，采用包涵体洗涤液和破菌液交替清洗的方式，能让由于离心聚集在一起的包涵体被清洗干净，纯化效果更好。本发明纯化过程工艺简单，成本低，纯化后的蛋白状态稳定，并且还能在动物实验中激起免疫反应，产生免疫保护作用，为幽门螺杆菌疫苗的开发提供了很好的理论支持。
特别的，根据本发明特定序列的重组蛋白，本发明根据蛋白的等电点不同、分子量大小，重组表达蛋白是否可溶还是包涵体等因素，调整了纯化参数，以适应本发明的重组蛋白获得更好的纯化效果。
最终，本发明制备重组蛋白的纯化方法中，从表达的重组亚单位基因工程蛋白CagA1的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于95％，通过氨基酸序列预测本发明构建获得的蛋白CagA1分子质量约为56.5kD。
本发明所述的纯化方法主要有Ni亲和纯化、凝胶过滤层析，通过上述方法纯化的蛋白用15％SDS-PAGE检测，呈单一目标蛋白条带，分子质量约为56.5D。蛋白纯度为95％。纯化后的CagA1与氢氧化铝佐剂共同注射免疫Balb/c小鼠，结果发现免疫组血清中IgG水平显著高于对照组；CagA1与LTs63k佐剂滴鼻免疫Balb/c小鼠后可显著提高抗体sIgA效价，诱导产生黏膜免疫应答。这证明使用本发明纯化方法获得的抗原CagA1可有效刺激机体产生较高的免疫应答，并经免疫保护力评价实验证实具有良好的保护效果。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中所使用幽门螺杆菌菌株Helicobacter pylori ATCC700824购自美国菌种保藏中心；质粒pET28a购自Thermo Fisher公司，申请人保存；大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自上海超研生物科技有限公司，申请人保存；DNA Marker、限制性内切酶Nco I和Xho I、T4DNA Ligase、蛋白Marker为Thermo Fisher产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒及超薄回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。
实施例1CagA1基因的重组质粒pET28a/CagA1的构建及鉴定
具体的操作步骤如下：
(1)首先通过比较数据库中Hp菌株CagA相关序列，对CagA全序列结构及空间定位进行分析，并利用生物信息技术与反向疫苗学理论截取其包含有功能结构域的N端序列，从而获得CagA1氨基酸序列。
(2)根据CagA1的氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，序列为SEQ ID NO:2(下划线示酶切位点碱基序列)。
(3)对目的基因进行合成，通过Nco I和Xho I酶切位点，插入表达质粒pET28a中(武汉金开瑞生物工程有限公司完成)，质粒测序结果与提交合成的序列信息比对，核苷酸序列完全相同。
(4)将合成质粒用40μL无菌水溶解，取2μL转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min，42℃热休克90sec，迅速冰浴3min。加入1mL SOC培养基，混匀，置37℃摇床中220rpm振荡45min。
(5)取100μL菌液涂布于Kana抗性LB平板，置37℃培养箱中培养16h。
(6)pET28a/CagA 1/BL21(DE3)阳性重组质粒的筛选、鉴定；
a、挑取转化平板上分隔良好的单个菌落，接种于Kana抗性LB培养基中，37℃振
荡培养过夜；
b、质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
c、质粒DNA进行Nco I和Xho I双酶切，双酶切反应体系如下表1，37℃酶切2h；
d、1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图1所示，表明基因重组质粒构建成功。
表1双酶切反应体系
试剂 体积μL
10×K Buffer 1
0.1％BSA 1
Xho I 0.4
Nco I 0.4
质粒 2
ddH2O Up to 10
实施例2重组蛋白CagA 1在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定
具体的操作步骤如下：
(1)取过夜培养的pET28a/CagA 1/BL21(DE3)菌液100μL加入10mL卡那霉素+抗性的LB培养基中，220rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液200μL加入20mL卡那霉素+抗性的LB培养基中，220rpm 37℃培养2h，二次活化至OD600为0.8时，加入IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷10μL，使其终浓度为0.5mM，再置于摇床220rpm 37℃诱导表达4h。
(2)将诱导表达后的菌液取出，以8000g离心15min，弃去上清，加入3mL破菌液(50mM磷酸盐缓冲液(PB)，0.1M NaCl，pH 7.0)混匀，冰浴超声裂解10min(超声5s停止6s)，再4℃12000g离心30min，分离上清及沉淀。
(3)处理样品
在沉淀中加入3mL破菌液重悬，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μL加入10μL 5X蛋白上样缓冲液(生工，货号：C508320-0010)，100℃10min，12000g离心3min。
(4)SDS-PAGE电泳
将处理好的裂菌液、上清和沉淀分别取10μL上样，进行15％的SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，再置于脱色液中脱色，凝胶扫描成像系统(ChemiDoc MP，Bio-Rad)扫描。结果表明，pET28a/CagA1/BL21(DE3)目的蛋白大小正确，为沉淀包涵体表达(如图2所示)。
实施例3CagA1抗原的制备
(1)放大培养获取蛋白
取过夜培养的pET28a/CagA 1/BL21(DE3)菌液30mL加入3L Kana+抗性的TB培养基中，220rpm 37℃培养3h，培养至OD600为0.8～1.0时，加入1M IPTG 1.5mL，使其终浓度为0.5mM，220rpm 37℃诱导表达4h。将诱导后的菌液，8000g离心15min收集菌体，再加入160mL破菌液(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行高压均质破碎：外循环温度-4℃、压力650bar、功率25％、6个循环。12000g离心30min后取其沉淀。
(2)重组蛋白CagA1纯化
a、包涵体的洗涤及溶解
取上述沉淀，加入200mL包涵体洗涤液(50mM PB，1％Triton X-100，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH 7.0)洗涤1次，洗涤条件为：振荡、彻底分散重悬，12000g离心15min，弃上清，再向沉淀中加入200ml破菌液洗涤液洗涤1次，洗涤条件为：振荡、彻底分散重悬，12000g离心15min，弃上清；
重复此步骤3次，洗涤完成后向沉淀中加入200mL A液(50mM PB，0.5M NaCl，8M尿素，10mM咪唑，pH 7.0)室温搅拌溶解1h，4℃放置溶解过夜。
b、Ni柱亲和层析
取上述溶解液上清，12000g离心15min，取上清，过0.45μm滤膜备用。使用A液平衡Ni柱亲和层析柱，取过滤后上清液上样，再使用5％B液(50mM PB，0.5M NaCl，8M尿素，1M咪唑，pH 7.0)+95％A液洗脱目的蛋白。电泳结果如图3所示。
c、凝胶过滤层析
使用C液(20mM PB，110mM NaCl，0.6％精氨酸，pH 7.0)平衡层析柱，取b中洗脱的蛋白40mL上样，C液冲洗平衡并收集蛋白洗脱峰，D液(20mM PB，1M NaCl，pH 7.0)洗脱杂质，目的蛋白保存4℃备用。电泳结果如图4所示，获得了纯度大于95％的目的蛋白。
实施例4动物免疫
(1)抗原CagA1与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠
Balb/c小鼠，雌性，7～8周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，动物分组如下表2所示：
表2CagA1与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠分组
a、首次免疫，50μg抗原和氢氧化铝佐剂混合后，4℃吸附30min，小鼠双侧大腿肌肉注射(100μL/鼠)；
b、第二次免疫，第14天进行二次免疫，注射剂量与免疫方式同上；
c、第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上；
d、第四次免疫，在第28天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上。
(2)抗原CagA1与LTs63k佐剂联合滴鼻免疫小鼠
Balb/c小鼠，雌性，8～10周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，LTs63k自制(制备方法如文献：冯强.重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究.[D].重庆大学.2003)，制备结果如图5所示，动物分组如下表3所示。
表3CagA1与LTs63k佐剂联合免疫小鼠分组
a、首次免疫，50μg抗原和LTs63k佐剂混合后，混匀仪4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中免疫备用，吸取已配制的免疫原，缓慢滴于小鼠鼻腔小鼠：10μL/侧，共20μL/鼠；
b、第二次免疫，第14天进行二次免疫，免疫剂量与免疫方式同上；
c、第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，免疫剂量与免疫方式同上；
d、第四次免疫，在第28天进行第三次免疫，免疫剂量与免疫方式同上。
实施例5血清特异性抗体IgG与阴道灌洗液sIgA检测
(1)抗原CagA1与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠后血清特异性抗体IgG Elisa检测
第四次免疫后5天，采集Balb/c小鼠眼眶静脉血，4℃静置3h后3000rpm离心5min分离血清，用Elisa检测CagA1特异性IgG水平变化。
a、抗原包被：取包被液将CagA1纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。
b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用。
c、标本稀释：将血清从1:8000开始进行系列倍比稀释至1:256000。
d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(生工，货号：
D110087-0100)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
g、结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，a中包被液为0.05mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)。b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween～20。e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween～20+0.5％BSA。f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na2HPO4 100mM。f中终止液为2M H2SO4。
结果显示：检测CagA1蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:256000；CagA1免疫小鼠对重组蛋白CagA1的抗体IgG几何平均滴度为1:97087.6；免疫后抗体阳性率达到100％，如表4和图6所示，说明CagA1重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体IgG。
表4重组蛋白CagA1免疫血清抗体IgG几何平均滴度
(2)抗原CagA1与LTs63k佐剂联合滴鼻免疫小鼠后阴道灌洗液特异性抗体sIgAElisa检测
第四次免疫后5天，用PBST(含0.05％吐温20的PBS)采集Balb/c小鼠阴道灌洗液，75μL/次，灌洗4次，300μL/鼠。采集后涡旋1min，然后12000g离心3min取上清液用于Elisa检测CagA1特异性sIgA水平变化。
a、抗原包被：取包被液将CagA1纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。
b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用。
c、标本稀释：将灌洗液样本从1:8开始进行系列倍比稀释至1:256。
d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释灌洗液样本，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgA(Abcam，货号：Ab97235)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
g、结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，a中包被液为0.05mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)。b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween～20。e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween～20+0.5％BSA。f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na2HPO4 100mM。f中终止液为2M H2SO4。
结果显示：检测CagA1重组蛋白抗原免疫小鼠产生的sIgA抗体效价达到1:256；免疫小鼠对重组CagA1的几何平均滴度为1:68.6；免疫后抗体阳性率达到100％，如表5和图7所示，表明CagA1重组蛋白可诱导小鼠产生黏膜免疫应答。
表5CagA1免疫后小鼠阴道灌洗液抗体sIgA几何平均滴度
实施例6CagA1重组蛋白免疫后攻毒保护力评价
具体的操作如下：
(1)小鼠灌胃：在末次滴鼻免疫后10天进行口服灌胃H.pylori ATCC700824进行攻毒实验，灌胃前24h断食，17h断水，每只小鼠感染剂量为2.0×107CFU，灌胃后2h恢复水食。
(2)平板培养：灌胃后一周宰杀小鼠取其胃组织剪碎后放入PBS缓冲液中，涡旋3min，然后将其洗涤原液与10倍稀释液涂布于含有5％脱纤维绵羊血(南京茂捷生物)与0.5％复合抗生素(万古霉素1.67mg/mL、多粘菌素0.0694mg/mL、甲氧苄啶0.5mg/mL、两性霉素B0.2mg/mL)的Skirrow平板上(月示蛋白胨15g/L(海博生物)、胰蛋白胨2.5g/L(Oxoid)、酵母浸粉5g/L(Oxoid)、氯化钠5g/L(科隆试剂)、pH7.4)，37℃微需氧(5％O2、10％CO2、85％N2)培养3～4d后观察。
(3)结合Hp菌落特征，快速尿素酶试剂以及镜检等方式来检测平板上是否存在Hp，以此来确定小鼠是否成功感染Hp，统计Hp感染阳性率与其保护率。其中，疫苗保护率＝(对照组感染阳性率～免疫组感染阳性率)/对照组感染阳性率×100％。
结果显示：对照组与实验组各20只小鼠平板培养情况统计如下表6所示，对照组20只小鼠平板培养检测均为阳性，感染率为95％，实验组小鼠20只小鼠中有13只小鼠平板培养阳性，感染率为65％，那么本疫苗的保护效率为31.6％。
因此，本发明制备的CagA1抗原具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生较强的免疫应答，并且能一定程度抑制小鼠胃内的幽门螺杆菌定植。
表6小鼠免疫后攻毒Hp感染阳性率统计
小鼠编号 对照组 实验组 小鼠编号 对照组 实验组
1 + － 11 + +
2 + － 12 + +
3 + + 13 + +
4 + － 14 － +
5 + + 15 + －
6 + + 16 + +
7 + + 17 + －
8 + + 18 + －
9 + + 19 + +
10 + + 20 + －
注:“+”表示为快速尿素酶试剂与镜检均为阳性，“－”表示为快速尿素酶试剂与镜检为阴性。

Claims (10)

1.幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种编码权利要求1所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的核苷酸，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、质粒构建，原核表达
将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因连接在表达载体中，构建质粒并转入宿主菌中进行诱导表达；
b、破菌、离心
收集表达后的菌体用破菌液重悬混匀，高压均质破菌，低速离心，收集包涵体沉淀；
c、包涵体洗涤及溶解
将步骤b收集的沉淀使用包涵体洗涤液及破菌液进行离心，并进行重悬清洗，使用A液重悬洗涤后的包涵体，2～8℃溶解过夜；A液组成为：pH 6.0～8.0的20～50 mM PB，0.1～0.5 M NaCl和10～50mM咪唑，6～8 M尿素；
d、Ni柱亲和纯化
经过步骤c溶解后获得的上清液，使用上述A液平衡层析柱，使用B液梯度洗脱；B液组成为pH 6.0～8.0的20～50 mM PB，0.1～0.5 M NaCl和0.5～1M咪唑，6～8 M尿素；
e、凝胶过滤层析
经步骤d纯化的目的蛋白，使用C液平衡凝胶过滤层析柱，C液复性并洗脱，得到幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1；C液组成为：pH 6.0～8.0的10～30 mM PB，100～150 mMNaCl，0.1%～0.6%精氨酸。
4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法，其特征在于：步骤a所述的表达载体为pET28a；宿主菌为E. coli BL21(DE3)；表达条件为16～37℃，120～220rpm；诱导浓度为0.1～0.5mM IPTG。
5.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法，其特征在于：步骤b所述的破菌液为pH 6.0～8.0的20～50 mM PB，0.1～0.5 M NaCl；破菌条件为外循环温度-4～0℃、压力600～850 bar、功率20%～30%、4～6个循环；离心条件为2000～5000g，10～30min。
6.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法，其特征在于：步骤c所述的包涵体洗涤液组成为：pH 6.0～8.0的20～50mM PB，0.1%～1% Triton X-100，1～5mM EDTA，0.1～0.5M NaCl。
7.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法，其特征在于：步骤c所述的离心条件为12000～17000 rpm，15～30min。
8.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法，其特征在于：步骤d所述的Ni柱填料为Ni Sepharose High Performance。
9.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1的制备方法，其特征在于：步骤e所述的凝胶过滤层析柱填料为Sephadex G-25 Medium。
10.权利要求1所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原CagA1在用于制备预防幽门螺杆菌感染疫苗中的用途。
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