CN116286757A - 幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s及其制备方法和应用 - Google Patents

幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种幽门螺杆菌重组蛋白抗原UreB‑s及其制备方法和应用。现有基因工程疫苗制备中，抗原的选择非常重要，筛选存在问题，直接使用幽门螺杆菌原始蛋白往往会造成无法顺利重组表达，或者难以纯化或纯度较低，都会出现免疫效果不好，保护力较差等问题。针对上述问题，本发明提供了一种幽门螺杆菌重组蛋白抗原UreB‑s及其制备方法，通过大肠杆菌基因工程表达获得。该抗原UreB‑s具有亲水性强、可溶性表达、易纯化、纯度高、制备方法简便等优点，具有显著的经济效益，且动物实验证明其有效刺激机体产生免疫应答并具备良好的免疫保护作用，可作为预防幽门螺杆菌感染的疫苗候选成分。

Description

幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s及其制备方法和应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter prlor，HP)是一种革兰氏阴性菌，存在于人类胃及十二指肠黏膜中，是危害人类健康最常见的细菌病原体之一。世界卫生组织早在1994年就将其归为Ⅰ类致癌物，这种细菌能够导致很多不同的胃肠道疾病，包括：胃炎、十二指肠炎、胃溃疡、黏膜相关组织淋巴瘤，胃癌等。
目前对于HP感染的治疗常采用质子泵抑制剂和抗生素联合治疗的方式，但这种治疗方式常有一些缺陷，如再次感染、世界范围内的抗生素耐药性越来越强、副作用、患者依从性和成本过高等。因此，研发出针对HP的疫苗是控制HP感染、阻断传播的可靠方法。
由于HP在生物体中的感染和发病机制一般与各种毒力因子有关，其中尿素酶就是HP在胃环境长期生存的主要毒力因子，在HP生长过程中会产生大量的尿素酶，占整个产生蛋白质重量的10％-15％，用以调节周边环境PH值，使其能够适应酸性环境，抵抗胃酸造成的损伤。而这种尿素酶是一种多聚酶，分子量为550KDa，由A亚基(29.5KDa)和B亚基(66KDa)组成。其中B亚基包含了该酶的活性位点，参与尿素酶活性、诱导Th17细胞反应、诱导NF-κB和白细胞介素-8的产生等，如果能够让机体产生针对抗体破坏其功能，就可以阻断脲酶的活性，大大降低HP的定植能力。
本发明拟通过对尿素酶B亚基的部分蛋白片段进行重组，制备基因工程重组蛋白，为幽门螺杆菌疫苗提供一种新的抗原。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有基因工程疫苗制备中，抗原的选择非常重要，筛选存在问题或者直接使用幽门螺杆菌原始蛋白往往会造成无法顺利重组表达，或者难以纯化或纯度较低，出现免疫效果不好，保护力较差等问题，所以在幽门螺杆菌疫苗研发中亟待开发出性能稳定、产量高、保护效果好的疫苗成分。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s。所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1抗原UreB-s的氨基酸序列
NPTIPFTVNTEAEHMDMLMVCHHLDKSIKEDVQFADSRIRPQTIAAEDTLHDMGIFSITSSDSQAMGRVGEVITRTWQTADKNKKEFGRLKEEKGDNDNF。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s中，编码核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明还提供了一种上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s的制备方法，包括以下步骤：
a、质粒构建，原核表达
将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因链接在表达载体质粒中，构建质粒并转入宿主菌中进行诱导表达；
b、破菌、离心
收集表达后的菌体用pH为6.0-8.0的破菌液重悬混匀，高压均质破菌，高速离心，收集上清；
c、Ni柱亲和纯化
Ni亲和填料进行初步纯化，使用A液平衡层析柱，使用B液梯度洗脱；
d、Q柱阴离子交换层析
经步骤c纯化的目的蛋白，使用C液平衡Q层析柱，D液洗脱，得到幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s中，步骤a所述的SEQ ID NO:2为优化后编码抗原UreB-s的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2编码抗原UreB-s的核苷酸序列
ATGAACCCAACCATCCCATTTACCGTTAACACCGAAGCTGAACACATGGACATGCTGATGGTATGCCACCACCTGGACAAGAGCATCAAAGAAGATGTCCAGTTCGCAGATTCCCGTATTCGTCCACAAACCATTGCAGCAGAGGATACCCTGCATGACATGGGTATCTTTAGCATCACCAGCTCCGACTCTCAGGCAATGGGCCGTGTTGGTGAAGTAATTACCCGTACTTGGCAGACCGCGGACAAAAACAAAAAAGAATTTGGTCGCCTGAAAGAAGAAAAAGGTGACAACGACAACTTTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s中，步骤a所述的表达载体为pET22b。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s中，步骤a所述的宿主菌为E.coliBL21DE3。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s中，步骤a所述的诱导表达条件为温度16-37℃，转速180-220rpm，诱导表达采用浓度为0.1-0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s中，步骤b所述的破菌液为pH6.0-8.0的20-50mM PB，0.1-0.5M NaCl和10-50mM咪唑；破菌条件为外循环温度-4-0℃、压力600-850bar、功率20-30％、4-6个循环；离心条件为12000-15000rpm，15-30min。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s中，步骤c所述的Ni亲和填料为NiSepharose High Performance(cytiva，货号：17526802)；所述的A液组成为：pH 6.0-8.0的20-50mM PB，0.1-0.5M NaCl和10-50mM咪唑；B液组成为pH 6.0-8.0的20-50mM PB，0.1-0.5M NaCl和0.5-1M咪唑。
其中，上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s中，步骤d所述的Q柱阴离子交换层析柱填料为Q Sepharose High performance(cytiva，货号：17101401)；所述C液组成为：pH 6.0-8.0的10-30mM PB；所述D液组成为pH 6.0-8.0的10-30mM PB和0.5-1M NaCl。
本发明还提供了一种上述幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s在预防或治疗幽门螺杆菌感染药物中的用途。
进一步的，所述的药物为疫苗。
本发明的有益效果为：
本发明通过对HP尿素酶进行了空间及结构定位分析，结合抗原表位分析预测，筛选出了其中特异性高、抗原性好、亲水性高的部分蛋白结构，命名为UreB-s蛋白，并根据UreB-s的氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，将其导入载体重组表达后，得到大肠杆菌表达的基因工程重组幽门螺杆菌抗原蛋白。
进一步的，本发明采用特别的蛋白纯化方法，能够纯化得到纯度在99.6％以上的重组蛋白，并验证发现该重组蛋白能够有效刺激体液免疫应答，血清IgG显著提高，也能有效刺激黏膜免疫应答，产生较高的sIgA，并经免疫保护力评价实验证实具有良好的保护效果，可以作为预防幽门螺杆菌感染的抗原成分使用，后续用来制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗。
附图说明
图1所示为重组质粒UreB-s双酶切鉴定结果；M：Takara DL5000 DNAMarker；泳道1：质粒UreB-s-pET28a；泳道2：双酶切UreB-s-pET28a；鉴定结果显示分离片段约为5270bp和303bp；3：质粒UreB-s-pET20b+；泳道4：双酶切UreB-s-pET20b+；鉴定结果显示分离片段约为2970bp和303bp；5：质粒UreB-s-pET22b；泳道6：双酶切UreB-s-pET22b；鉴定结果显示分离片段约为5300bp和303bp。
图2所示为UreB-s蛋白诱导鉴定结果；泳道1：UreB-s-pET20b+全菌液；泳道2：UreB-s-pET20b+破菌上清；泳道3：UreB-s-pET20b+破菌沉淀；泳道4：UreB-s-pET22b全菌液；泳道5：UreB-s-pET22b破菌上清；泳道6：UreB-s-pET22b破菌沉淀；M：ThermoScientificProtein Ruler；7：UreB-s-pET28a破菌沉淀；泳道8：UreB-s-pET28a破菌上清；泳道9：UreB-s-pET28a全菌液；鉴定结果显示UreB-s蛋白约为12.57KD，UreB-s-pET22b及UreB-s-pET28a可溶表达。
图3所示为UreB-s1蛋白诱导鉴定结果；泳道1：UreB-s1-pET20b+全菌液；泳道2：UreB-s-pET20b+破菌上清；泳道3：UreB-s-pET20b+破菌沉淀；M：Thermo ScientificProteinRuler；泳道4：UreB-s-pET22b全菌液；泳道5：UreB-s-pET22b破菌上清；泳道6：UreB-s-pET22b破菌沉淀；M：Thermo Scientific Protein Ruler；7：UreB-s-pET28a全菌液；泳道8：UreB-s-pET28a破菌上清；泳道9：UreB-s-pET28a破菌沉淀；M：ThermoScientific Protein Ruler；鉴定结果显示UreB-s1蛋白约为15KD，UreB-s-pET20b+及UreB-s-pET28a包涵体表达。
图4所示为Ni亲和层析电泳结果；1：上样；2：流穿；3：5％B；4：20％B；5：100％B；M：Thermo Scientific Protein Ruler；
图5所示为Q柱离子层析电泳结果；1：上样；2：流穿；M：Thermo ScientificProtein Ruler；3：5％-1D；4：5％-2D；5：20％D；6：40％-1D；7：40％-2D；8：100％D；
图6所示为血清特异性抗体IgG效价统计结果。
图7所示为LTs63K电泳图；1：上样；2：流穿；3：洗脱1；4：洗脱2；M：ThermoScientificProtein Ruler。
图8所示为阴道灌洗液特异性抗体sIgA效价统计结果。
具体实施方式
本发明通过对尿素酶结构及空间定位分析，结合“反向疫苗学”技术，筛选出了其中位于尿素酶分子表面、特异性、高抗原性好和亲水性高的部分蛋白片段命名为UreB-s蛋白，序列如SEQ ID NO:1所示，将其编码基因SEQ ID NO:2克隆至表达载体，转化工程菌进行大规模表达，经过纯化后获得重组蛋白，可用于制备基因工程亚单位疫苗。该重组蛋白具有制备工艺简单、成本低、可操作性强等优点，有望成为HP基因工程疫苗候选抗原之一。
本发明成功构建了包含UreB-s蛋白的重组载体，并进行了高效的表达，表达的蛋白正确折叠且稳定，又通过采用Ni柱层析和Q柱层析结合的纯化方式，获得了纯度很高的目的蛋白。本发明纯化过程工艺简单，成本低，纯化后的蛋白状态稳定，并且还能在动物实验中激起免疫反应，产生免疫保护作用，为幽门螺杆菌疫苗的开发提供了很好的理论支持。
本发明制备重组蛋白的纯化方法中，从表达的重组亚单位基因工程蛋白UreB-s的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于99％，通过氨基酸序列预测本发明构建获得的蛋白UreB-s分子质量约为12.57KD，等电点在5.73左右。
本发明所述的纯化方法主要有Ni亲和纯化、Q柱阴离子交换层析，通过上述方法纯化的蛋白用15％SDS-PAGE检测，呈单一目标蛋白条带，分子质量约为12.57KD。蛋白纯度为99.6％。纯化后的UreB-s与佐剂氢氧化铝共同注射免疫BalB/C小鼠，结果发现UreB-s加免疫佐剂组血清中IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)P<0.01；UreB-s与LTs63K佐剂滴鼻免疫Balb/c小鼠后可显著提高抗体sIgA效价，诱导产生黏膜免疫应答。这证明使用本发明纯化方法获得的抗原UreB-s可有效刺激机体产生较高的免疫应答，并经免疫保护力评价实验证实具有良好的保护效果。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例所用的幽门螺杆菌购自美国ATCC(J99/Helicobacter pylori(
Figure BDA0004117618390000051
700824))；质粒pET-22b购自Thermo Fisher；大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自上海超研生物科技有限公司，申请人自己保存；DNAMarker、限制性内切酶Nco I和Xho I、T4 DNA连接酶、蛋白Marker为Thermo Fisher产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒及超薄回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；
其余试剂和设备为普通市售产品。
实施例1构建UreB-s基因的重组质粒
具体的操作步骤如下：
(1)首先通过生物信息学技术采用“反向疫苗学”对HP尿素酶进行了空间及结构定位分析，筛选出了其中特异性高，抗原性好，亲水性高的部分蛋白结构命名为UreB-s蛋白(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)，同时筛选得到的还有UreB-s1等其他蛋白，所述UreB-s1氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:3UreB-s1的氨基酸序列
GPATEALAGEGLIVTAGGIDTHIHFISPQQIPTAFASGVTTMIGGGTGPADGTNATTITPGRRNLKWMLRAAEEYSMNLGFLAKGNTSNDASLADQIEAGAIGFKIHEDWGTTPSAINHALDVADKYDVQVAIHTDTLNEAGCVEDTMAAIA。
(2)根据UreB-s、UreB-s1的氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，序列为SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4。
SEQ ID NO:4UreB-s1的编码核苷酸序列
GGTCCGGCAACTGAAGCACTGGCTGGTGAGGGTCTGATCGTCACTGCGGGTGGCATCGATACCCACATTCACTTCATCTCTCCTCAGCAGATTCCGACCGCATTCGCTTCTGGCGTCACCACTATGATCGGTGGTGGTACCGGCCCTGCTGATGGTACCAACGCTACCACTATCACTCCGGGTCGTCGTAATCTGAAATGGATGCTGCGTGCGGCAGAAGAATACAGCATGAACCTGGGCTTCCTGGCCAAAGGTAACGCATCTAACGACGCTTCCCTGGCGGACCAAATCGAAGCTGGCGCAATTGGCTTCAAAATCCATGAAGACTGGGGTACCACTCCTTCCGCGATTAACCACGCGCTGGATGTTGCAGATAAGTACGACGTGCAGGTCGCCATCCATACCGATACGCTGAACGAAGCGGGCTGCGTTGAGGACACGATGGCGGCAATTGCG。
(3)对目的基因进行合成，通过Nde I和Xho I酶切位点，插入表达质粒pET22b、pET20b+、pET28a等表达载体中(武汉金开瑞生物工程有限公司完成)，质粒测序结果与提交合成的序列信息比对，核苷酸序列完全相同。
(4)将合成质粒用40μl无菌水溶解，取2μl转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min，42℃热休克90sec，迅速冰浴3min。加入1ml SOC培养基，混匀，置37℃摇床中220rpm振荡40min。
(5)取100μl菌液涂布于Amp抗性LB平板，置37℃培养箱中培养16h。
实施例2 pET22b、pET20b+、pET28a/UreB-s/BL21(DE3)阳性重组质粒的筛选、鉴定
具体的操作步骤如下：
(1)挑取转化平板上分隔良好的单个菌落，接种于相应的Amp及kana抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
(2)质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
(3)质粒DNA进行Nde I和Xho I双酶切；37℃酶切2h；
(4)1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图1所示，表明基因重组质粒构建成功。
双酶切反应体系如表1所示：
表1双酶切反应体系
试剂 体积μl
CutSmart Buffer 2
Nde I 0.2
Nco I 0.2
质粒 6
Water,nuclease-free Up to 20
实施例3重组蛋白UreB-s在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、表达形式的鉴定
具体的操作步骤如下：
(1)取过夜培养的pET22b、pET20b+、pET28a/UreB-s/BL21(DE3)菌液100μl加入10mL Amp/kana抗性的LB培养基中，220rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μl加入20mL Amp/kana抗性的LB培养基中，220rpm 37℃培养2h，二次活化至OD600为0.8时，加入IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷10μl，使其终浓度为0.5mM，再置于摇床220rpm37℃诱导表达4h。
(2)将诱导表达后的菌液取出，以8000g离心15min，弃去上清，加入3ml破菌液(50mM PB，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)混匀，冰浴超声裂解10min(超声5s停止6s)，再4℃12000g离心30min，分离上清及沉淀。
(3)在沉淀中加入3ml破菌液重悬，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μl加入10μl5X蛋白上样缓冲液(生工，货号：C508320-0010)，100℃10min，12000g离心3min。
(4)SDS-PAGE电泳
将处理好的裂菌液、上清和沉淀分别取10μl上样，电泳结果如图2所示。电泳结果显示UreB-s-pET20b+未表达，UreB-s-pET22b、UreB-s-pET28a正常表达，呈单一目标蛋白条带，分子质量约为12.57KD，其中UreB-s-pET22b可溶表达较多，表达效果最好。
UreB-s1的鉴定结果如图3所示，显示UreB-s1-pET22b未表达，UreB-s1-pET20b+、UreB-s1-pET28a呈单一目标蛋白条带，分子质量约为15KD，但是均为包涵体方式表达，对后期纯化及应用影响较多，因此筛选到本申请的UreB-s蛋白规模化生产更好。
实施例4 UreB-s抗原的制备
1、放大培养获取蛋白
取过夜培养的pET22b/UreB-s/BL21(DE3)菌液30mL加入3LAmp+抗性的TB培养基中，220rpm 37℃培养2-3h，培养至OD600为0.8-1时，加入1M IPTG 1.5ml，使其终浓度为0.5mM，220rpm 37℃诱导表达4h。将诱导后的菌液，8000g离心15min收集菌体，再加入200ml破菌液(同实施例3)重悬菌体后，将菌液进行高压均质破碎：外循环温度-4℃、压力650bar、功率25％、6个循环。12000g离心30min，取上清。
2、UreB-s纯化
(1)Ni柱亲和层析
取破菌液上清液，过0.45μm滤膜备用。使用A液(50mM PB，0.15M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)平衡Ni柱亲和层析柱，取过滤后上清液上样，再使用5％B液(50mM PB，0.15M NaCl，1M咪唑，pH 7.4)+95％A液洗脱杂质，20％B液+80％A液洗脱目的蛋白，电泳结果如图4所示。
(2)Q柱阴离子交换层析
取(1)中洗脱的蛋白14ml加入C液(20mM PB，pH 7.4)稀释至140ml备用。用C液平衡Q层析柱，取样品上样，C液冲洗平衡，再使用D液(20mM PB，0.5M NaCl，pH 7.4)洗脱，收集洗脱下来的目的蛋白保存4℃备用。电泳结果如图5所示，获得了纯度大于99％的目的蛋白。
实施例5 UreB-s抗原与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠
Balb/C小鼠，雌性，8-10周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。分为免疫组(UreB-s抗原+氢氧化铝佐剂)、阴性对照组(PBS+氢氧化铝佐剂)和空白对照组(PBS)，每组20只。
(1)首次免疫，免疫组注射50μg UreB-s抗原和氢氧化铝佐剂体积比1：1混合，阴性对照组注射50μg PBS和氢氧化铝佐剂体积比1：1混合，空白对照组注射PBS，双侧大腿肌肉注射(100μl/鼠)。
(2)第二次免疫，第14天进行二次免疫，注射量与免疫方式同上；
(3)第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，注射量与免疫方式同上；
(4)第四次免疫，在第28天进行第三次免疫，注射量与免疫方式同上。
实施例6抗原UreB-s与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠后血清特异性抗体IgG Elisa检测
第四次免疫后5天，采集Balb/C小鼠眼眶静脉血，4℃静置3h后3000rpm离心5min分离血清，用Elisa检测UreB-s特异性IgG水平变化。
检测的具体操作步骤如下：
(1)抗原包被：取包被液将UreB-s纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。
(2)封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用。
(3)标本稀释：将血清从1:4096开始进行系列倍比稀释至1:65536。
(4)加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
(5)加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(生工，货号：D110087-0100)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
(6)显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
(7)结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，(1)中包被液为50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)。(2)中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。(4)中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20。(5)中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20+0.5％BSA。(6)中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mLTMB溶于DMSO；底物缓冲液(pH5.0)为0.1M柠檬酸、0.2MNa2HPO4。(6)中终止液为2M H2SO4。
结果如表2和图6所示。结果显示：检测UreB-s蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体IgG最高效价达到1:65536；UreB-s免疫小鼠对重组UreB-s的几何平均滴度为1:31651.8，免疫后抗体阳性率达到100％，说明UreB-s重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生其特异性抗体。
表2 IgG几何平均滴度
Figure BDA0004117618390000091
实施例7抗原UreB-s与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠
Balb/C小鼠，雌性，8-10周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，LTs63K自制，制备方法参考“冯强.重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究.[D].重庆大学.2003”，制备结果如图7所示，动物分组如下表3所示：
表3 UreB-s与LTs63K佐剂联合免疫小鼠分组
Figure BDA0004117618390000092
(1)首次免疫，免疫组采用50μg UreB-s抗原和10ug LTs63K佐剂混合后，混匀仪4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中免疫备用，吸取已配制的免疫原，缓慢滴于小鼠鼻腔：10μL/侧，共20μL/鼠；对照组将UreB-s抗原替换为等量的PBS，操作相同；
(2)第二次免疫，第14天进行二次免疫，注射剂量与免疫方式同上；
(3)第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上；
(4)第四次免疫，在第28天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上。
实施例8抗原UreB-s与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠后阴道灌洗液特异性抗体sIgAElisa检测
第四次免疫后5天，用PBST(含0.05％吐温20的PBS)采集Balb/C小鼠阴道灌洗液，75μL/次，灌洗4次，300μL/鼠。采集后涡旋1min，然后12000g离心3min取上清液用于Elisa检测UreB-s特异性sIgA水平变化。
(1)抗原包被：取包被液将UreB-s纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。
(2)封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用。
(3)标本稀释：将阴道灌洗液从1:8开始进行系列倍比稀释至1:128。
(4)加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
(5)加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgA(Abcam，货号：Ab97235)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
(6)显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
(7)结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，(1)中包被液为50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)。(2)中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。(4)中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20。(5)中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20+0.5％BSA。(6)中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mLTMB溶于DMSO；底物缓冲液(pH5.0)为0.1M柠檬酸、0.2MNa2HPO4。(6))中终止液为2M H2SO4。
结果如表4和图8所示。结果显示：检测UreB-s蛋白抗原免疫小鼠产生的sIgA抗体效价达到1:128；UreB-s免疫小鼠对重组UreB-s的几何平均滴度为1:68.6；免疫后抗体阳性率达到100％，说明UreB-s重组蛋白能够刺激小鼠产生黏膜免疫应答。
表4 UreB-s免疫后小鼠阴道灌洗液sIgA几何平均滴度
Figure BDA0004117618390000101
实施例9 UreB-s重组蛋白免疫后攻毒保护力评价
具体的操作步骤如下：
(1)灌胃：在末次滴鼻免疫后10天进行口服灌胃幽门螺杆菌J99活菌进行攻毒实验，灌胃前24h断食，17h断水，每只小鼠感染剂量为2.0×107CFU，灌胃后2h恢复水食。
(2)平板培养：灌胃后一周宰杀小鼠取其胃组织剪碎后放入PBS缓冲液中，涡旋3min，然后将其洗涤原液与10倍稀释液涂布于含有5％脱纤维绵羊血(南京茂捷生物)与0.5％复合抗生素(万古霉素1.67mg/mL、多粘菌素0.0694mg/mL、甲氧苄啶0.5mg/mL、两性霉素B0.2mg/m)Skirrow平板上(月示蛋白胨15g/L(海博生物)、胰蛋白胨2.5g/L(Oxoid)、酵母浸粉5g/L(Oxoid)、氯化钠5g/L(科隆试剂)、pH7.4)，37℃微需氧(5％O2、10％CO2、85％N2)培养2-3d后观察。
(3)结合HP菌落特征，快速尿素酶试剂以及镜检等方式来检测平板上是否存在HP，以此来确定小鼠是否成功感染HP。其中，疫苗保护率＝(对照组感染阳性率-免疫组感染阳性率)/对照组感染阳性率*100％。
结果如下所示，对照组与实验组各20只小鼠平板培养情况统计如下表5，对照组20只小鼠中有18只平板培养检测均为阳性，感染率为90％，实验组小鼠20只小鼠中有11只小鼠平板培养阳性，感染率为55％，疫苗的保护效率为38.9％。
表5小鼠免疫后攻毒HP感染阳性率统计
小鼠编号 对照组 实验组 小鼠编号 对照组 实验组
1 + + 11 + -
2 + - 12 + +
3 + - 13 + +
4 + - 14 - +
5 + + 15 + -
6 + + 16 + +
7 + - 17 + +
8 + + 18 + -
9 - + 19 + -
10 + - 20 + +
注:“+”表示为快速尿素酶试剂与镜检均为阳性，“-”表示为快速尿素酶试剂与镜检阴性。
由此可见，本发明制备的重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生较强的免疫应答，并且能有效抑制小鼠胃内的幽门螺杆菌定植。本发明提供的制备UreB-s重组蛋白的方法，能够快速获得纯度高的目的蛋白，同时能够刺激机体产生免疫应答反应，有望作为疫苗成分，用于幽门螺杆菌的预防和治疗上。

Claims (10)

1.一种幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s，其特征在于：编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1或2所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、质粒构建，原核表达
将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因链接在表达载体质粒中，构建质粒并转入宿主菌中进行诱导表达；
b、破菌、离心
收集表达后的菌体用pH为6.0-8.0的破菌液重悬混匀，高压均质破菌，高速离心，收集上清；
c、Ni柱亲和纯化
Ni亲和填料进行初步纯化，使用A液平衡层析柱，使用B液梯度洗脱；
d、Q柱阴离子交换层析
经步骤c纯化的目的蛋白，使用C液平衡Q层析柱，D液洗脱，得到幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s。
4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s的制备方法，其特征在于：步骤a所述的表达载体为pET22b。
5.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s的制备方法，其特征在于：步骤a所述的宿主菌为E.coliBL21DE3。
6.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s的制备方法，其特征在于：步骤a所述的诱导表达条件为温度16-37℃，转速180-220rpm，诱导表达采用浓度为0.1-0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷。
7.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s的制备方法，其特征在于：步骤b所述的破菌液为pH6.0-8.0的20-50mMPB，0.1-0.5MNaCl和10-50mM咪唑；破菌条件为外循环温度-4-0℃、压力600-850bar、功率20-30％、4-6个循环；离心条件为12000-15000rpm，15-30min。
8.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s的制备方法，其特征在于：步骤c所述的Ni亲和填料为NiSepharoseHighPerformance；所述的A液组成为：pH6.0-8.0的20-50mMPB，0.1-0.5MNaCl和10-50mM咪唑；B液组成为pH6.0-8.0的20-50mMPB，0.1-0.5MNaCl和0.5-1M咪唑。
9.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s的制备方法，其特征在于：步骤d所述的Q阴离子交换层析柱填料为QSepharoseHighperformance；所述C液组成为：pH6.0-8.0的10-30mMPB；所述D液组成为pH6.0-8.0的10-30mMPB和0.5-1MNaCl。
10.权利要求1或2所述的任一项所述的幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原UreB-s在预防或治疗幽门螺杆菌感染药物中的用途。
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