CN111850002A

CN111850002A - 牛支原体分泌蛋白MbovP570的应用

Info

Publication number: CN111850002A
Application number: CN202010571850.2A
Authority: CN
Inventors: 郭爱珍; 赵刚; 伊赫萨努拉·希拉尼; 陈颖钰; 胡长敏; 陈曦; 陈建国
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-06-22
Also published as: CN111850002B

Abstract

本发明公开了牛支原体分泌蛋白MbovP570在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，属于动物传染病防治技术领域。所述牛支原体分泌蛋白MbovP570具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，试验证明，所述牛支原体分泌蛋白MbovP570具有抗原性，可以与牛支原体阳性血清反应而不与牛支原体阴性血清反应，而且该蛋白可以诱导牛巨噬细胞高表达IL‑8、IL‑12，而IL‑8可以激活中性粒细胞，IL‑12可以激活NK细胞和T细胞。因此认为MbovP570可以激活宿主免疫系统，在研发新药和疫苗方面具有重要潜力。

Description

牛支原体分泌蛋白MbovP570的应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体分泌蛋白MbovP570的应用，本发明首次鉴定出其为分泌蛋白，蛋白功能研究证明该蛋白能诱导牛巨噬细胞高表达IL-8、IL-12。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种能在体外复制的最小病原微生物。牛支原体能引起奶牛和肉牛的多种疾病，肉牛发病后临床症状主要表现为肺炎、关节炎，奶牛主要表现为乳房炎。牛支原体可以感染任何年龄的牛，2～6月龄的犊牛最易感(Stipkovits etal 2000)。牛支原体感染犊牛后往往难以治愈，与机体免疫系统对抗平衡后转成慢性病。目前牛支原体病在世界范围内广泛流行，该病临床治疗效果差，死亡率高，平均死亡率为10％，最高可达到60％(石磊等，2008)。当牛支原体病发生后，又会导致机体的免疫力下降，其他条件致病菌如A型多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、呼吸道合胞体病毒等会乘机感染宿主加重临床症状，协同导致牛呼吸疾病综合征(Bovine respiratory diseases,BRD)(Radellie et al 2008)。

牛支原体致病机制的不清楚及毒力因子的不明确是导致牛支原体难以防治的根本原因，细菌分泌蛋白是重要的毒力因子，常常被认为与细菌的致病力相关，如结核分枝杆菌的Rv1860蛋白、MTSA-10蛋白、ESAT-6蛋白等。分泌蛋白功能的鉴定可以为新诊断试剂的开发和疫苗的研发提供可选的分子靶标。目前为止，牛支原体分泌蛋白的研究刚刚起步，目前报道的有牛支原体MBOV_RS02825基因编码的分泌核酸酶。确定牛支原体的毒力相关因子和免疫原性蛋白是发现牛支原体特异性靶标的前提。分泌蛋白常与病原体毒力和免疫反应相关，因此是寻找特异性分子靶标的优先考虑对象。然而，由于牛支原体基因组中大部分基因为未知基因，且支原体分泌蛋白的研究刚起步，所以，相关研究进展缓慢。本申请人通过生物信息学预测及实验验证出MbovP570蛋白存在于牛支原体分泌蛋白组中，具有免疫原性。进一步证明该分泌蛋白可以诱导巨噬细胞高表达IL-8、IL-12。IL-8是巨噬细胞分泌的一种重要的趋化因子，可以激活中性粒细胞；IL-12作为一种分泌的趋化因子可以激活NK细胞和T细胞，对宿主抵抗病原感染具有重要作用。因此认为MbovP570蛋白是一种候选的免疫制剂分子靶标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体分泌蛋白MbovP570在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，该蛋白具有抗原性和激活宿主巨噬细胞高表达IL-8、IL-12的能力。

为了实现本发明的目的，申请人所在的农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体基因组中筛选出Mbov_0570基因，根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并克隆Mbov_0570基因，后续表达纯化出重组MbovP570蛋白。通过实验验证MbovP570蛋白可以在诱导牛巨噬细胞高表达IL-8、IL-12。而牛巨噬细胞作为宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，因此推测MbovP570蛋白是牛支原体的重要致病因子，是研发新药和疫苗的重要潜在靶点。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovisHB0801，基因组GenBank登录号为CP002058。以牛支原体Mbov_0570基因为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG，然后合成突变后的序列并进行双酶切和与载体质粒连接，构建重组质粒pET-30a-Mbov_0570并转化大肠杆菌DH5α后得到的重组蛋白，所述牛支原体Mbov_0570基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其长度为2265bp，其突变后的序列如SEQ ID NO:3所示。牛支原体MbovP570蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，共编码754个氨基酸。

所述的牛支原体rMbovP570蛋白可以与牛支原体阳性牛血清反应，而且不与牛支原体阴性牛血清反应。

进一步利用qRT-PCR技术检测rMbovP570蛋白刺激牛巨噬细胞6h、12h、24h后1L-8、1L-12、IFN-γ的表达量。实验结果显示rMbovP570可以诱导牛巨噬细胞高表达1L-8、IL-12。

本发明具有以下优点：

1、本发明的牛支原体rMbovP570蛋白可以与牛支原体阳性牛血清反应而且不与牛阴性血清反应。

2、本发明利用qRT-PCR技术验证出MbovP570蛋白可以诱导BoMac细胞高表达1L-8、IL-12。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：是纯化的牛支原体重组蛋白MbovP570的电泳图。

图2：是牛支原体重组蛋白MbovP570的分泌性验证的western blot图。附图标记说明：M：蛋白Marker；1：牛支原体HB0801株全菌蛋白；2：牛支原体HB0801株分泌蛋白组。

图3：是牛支原体重组蛋白MbovP570与人工感染牛支原体的牛血清反应的westernblot图。附图标记说明：M：蛋白Marker；1：rMbovP570蛋白与牛支原体阴性牛血清反应组；2：rMbovP570蛋白与牛支原体感染后的牛血清反应组。

图4：是牛支原体重组蛋白MbovP570刺激BoMac细胞表达IL-8、IL-12、IFN-γ试验结果。附图标记说明：*p<0.05、***p<0.005。

具体实施方式

实施例1：牛支原体MbovP570蛋白的表达

1.牛支原体Mbov_0570基因克隆表达

牛支原体HB0801(基因组GenBank登录号为CP002058)中的Mbov_0570基因的核苷酸序列见SEQ ID NO:1，序列大小为2265bp。以该原始序列为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG，突变后的序列见SEQ ID NO:3，序列大小为2265bp。将SEQ ID NO:3所示的序列送商业基因克隆公司进行合成。原基因序列和突变后的基因序列编码的蛋白质序列相同(序列见SEQ ID NO:2)，编码754个氨基酸。

将合成的Mbov_0570基因的扩增产物，用Xho I和BamHⅠ酶切，同时将pET-30a质粒(购自默克中国有限公司)用Xho I和BamHⅠ进行双酶切。将酶切后的Mbov_0570基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4DNA ligase(购自NEB公司))进行连接，得到重组质粒pET-30a-Mbov_0570。用该重组质粒pET-30a-Mbov_0570转化大肠杆菌DH5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒，用通用载体T7经过测序，确定插入序列正确后转化大肠杆菌BL21。将所得的重组大肠杆菌BL21在LB液体培养基中培养至OD＝0.6时，取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，在37℃摇床上诱导表达3小时。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清，加入1mL磷酸盐缓冲液即PBS(配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30uL的PBS和30uL上样缓冲液(1M Tris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水)重悬。在100℃沸水中煮沸10min。用12％SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。rMbovP570蛋白大小为86kDa。

2.牛支原体rMbovP570的纯化

将重组的大肠杆菌BL21用0.8mMIPTG按上述步骤1的方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL的PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自上海罗氏制药有限公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定rMbovP570大部分表达于上清中。

rMbovP570蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的binding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mL binding buffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mL washing buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mL elute buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置12％SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120V)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

纯化后的rMbovP570蛋白大小为86kDa，且条带单一(图1)。

实施例2：牛支原体MbovP570分泌性验证

使用PPPLO培养基培养牛支原体HB0801株至对数期，在140000g离心20分钟，并使用0.22μm的滤器过滤上清。向上清中加入TCA试剂至终浓度为10％，置于4℃孵育过夜。65000g离心20分钟，去上清后使用预冷的丙酮洗涤沉淀。清洗后的沉淀使用裂解缓冲液(8Murea,4％CHAPS,2M thiourea,60mM DTT,2％Amidosulfobetaine-14(ASB-14),40mM Tris-HCl pH 8.8)溶解，即为分泌蛋白组提取物，使用2D Quant Kit测量蛋白质的浓度，向蛋白组中加入PMSF防止蛋白降解，-80℃保存。

同时，按以下方法提取全菌蛋白：取生长至对数期的牛支原体10ml，12000r/min离心10min，使用10ml PBS洗涤沉淀1次，然后再使用500uL PBS重悬沉淀一次，利用超声破碎仪破碎牛支原体(200W，5min)，破碎后的样品使用BCA试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)测量蛋白浓度，存于-20℃备用。

将全菌蛋白上样量1μg，分泌蛋白组上样量是50μg中加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，总量均8μl，沸水加热5分钟，使蛋白充分变性。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到12％SDS-PAGE胶加样孔。上层胶电泳电压为80V，下层胶电泳电压为120V。电泳完成后，采用湿转法使用硝酸纤维素膜转印蛋白，电压为100V，转膜时间为1小时。转膜完毕后，使用5％脱脂牛奶封闭膜，置于4℃封闭过夜。使用TBST(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，Tween-20(0.05％(v/v))，pH 7.4)洗膜三次，每次间隔5分钟，然后与使用TBST稀释的抗rMbovP570蛋白的小鼠抗血清(体积比为1:500)于室温孵育3小时。使用TBST洗膜五次，每次间隔5分钟，然后与使用TBST稀释的抗小鼠IgG抗体(Southern Biotech)(体积比为1:5000)于室温孵育1小时。孵育完成后，用TBST洗膜五次，每次间隔5分钟，并使用化学发光显色和图像获取。结果表明，MbovP570蛋白存在于分泌蛋白组中，验证了该蛋白为牛支原体分泌蛋白，分子量为86kDa(图2)。

实施例3：牛支原体MbovP570天然抗原性验证

纯化的rMbovP570蛋白，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液处理，煮沸5分钟。冷却至室温后，将蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔。上层胶电泳电压为80V，下层胶电泳电压为120V。电泳完成后，使用硝酸纤维素膜转印蛋白，本实施例采用湿转法，电压为100V，转膜时间为1小时。转膜完毕后，使用5％脱脂牛奶封闭膜，置于4℃封闭过夜。使用TBST洗膜三次，每次间隔5分钟，然后与使用TBST稀释的牛支原体HB0801人工感染试验中5头牛的混合血清(实验室留存)(体积比为1:500)于室温孵育3小时。未感染的牛血清(实验室留存)(体积比为1:500)被用作阴性对照。使用TBST洗膜五次，每次间隔5分钟，然后与使用TBST稀释的抗牛IgG抗体(Southern Biotech)(体积比为1:5000)于室温孵育1小时。孵育完成后，用TBST洗膜五次，每次间隔5分钟，并使用化学发光显色和图像获取。试验结果表明：rMbovP570蛋白可以与人工感染牛支原体的牛阳性血清反应，而且不与阴性血清反应，证明MbovP570蛋白在牛支原体人工感染中能诱导免疫反应，具有抗原性(图3)。

实施例4：牛支原体MbovP570诱导巨噬细胞表达IL-8、IL-12

将BoMac按照2×10⁶每孔的细胞密度接种到6孔细胞板中，37℃，5％CO2培养至贴壁，按照每孔0.375μM的量加入纯化的rMbovP570蛋白，同时设置细胞完全培养基为阴性对照组。每组各3孔重复。37℃，5％CO2分别孵育6h、12h、24h后收集细胞。

提取RNA

(1)加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温孵育2-3min，12000g 4℃离心15min；

(2)转移水层到新的RNase-free EP管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温孵育10min，12000g 4℃离心10min，弃上清，管底部可见到胶状的RNA沉淀；

(3)加入1mL 75％乙醇，轻轻混匀，7500g 4℃离心10min，弃上清；

(4)空气干燥RNA 5-10min，但勿使RNA完全干燥。再用50μL DEPC水溶解，混匀，60℃水浴10min；

(5)紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，-80℃保存，备用。

反转录

按照

II qRT SuperMix反转录试剂盒(购自南京诺维赞生物科技有限公司)说明书进行操作。首先，去除基因组DNA，反应体系如下：4×gDNA wiper Mix(购自南京诺维赞生物科技有限公司)2μL，模板RNA 500ng，RNase free去离子水(购自碧云天生物科技有限公司)To final 8μL，将各个试剂加到RNase free PCR管中，轻轻混匀，42℃作用2min。然后，进行逆转录：上述反应液8μL，

II qRT SuperMixII(购自南京诺维赞生物科技有限公司)2μL，混匀后按5℃10min，42℃30min，85℃5min的程序反应，将产物收于﹣20℃冰箱保存。

实时荧光定量PCR

用SYBR qPCR Mix(购自南京诺维赞生物科技有限公司)进行相对实时定量PCR反应，以β-actin为内参基因，检测各个基因mRNA的相对表达情况。每个样品均设置内参基因与目的基因进行扩增，每个反应均设置3个重复。反应体系见表1，而反应程序为：50℃2min，预变性95℃10min；变性95℃15s，复性60℃30s，延伸72℃30s，循环40。引物如表2所示。

表1荧光定量PCR反应体系

表2荧光定量扩增引物

实验结果显示，rMbovP570刺激BoMac细胞表达IL-8的能力从刺激6h后就高于对照组(p<0.005)；而刺激BoMac细胞表达IL-12的能力在刺激24h时高于对照组(p<0.05)(图4)。

附录：说明书中名词术语说明：

牛支原体MbovP570重组蛋白以rMbovP570表示；

牛支原体MbovP570蛋白的编码基因以Mbov_0570表示；

牛支原体本地分离株以牛支原体HB0801表示。

<110> 华中农业大学

<120> 牛支原体分泌蛋白MbovP570的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2265

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 1

atgaaatcta gaaaaataaa agcattattt atttcacaag caattggctt tagtgcatta 60

attccagttt tatctgcaag atgtaatgat cctaaaaata attctgaagt tatcatatat 120

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ctaatgaata aatcactaaa agaattacca gtgtatttaa acaacatatc aatgctaagc 2160

aaggaacaat ctaaaggtta tgcagatcct aatcttgttt ataaattaag agattcaaaa 2220

acatttgctt ttggtataga agatttattt gaacttaata aataa 2265

<210> 2

<211> 754

<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 2

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Asn Asn Ser Glu Val Ile Ile Tyr Gln Arg Asn Ala Asn Ser Asp Lys

35 40 45

Thr Asn Glu Gln Phe Glu Lys Tyr Asn Gln Val Asn Leu Leu Ser Asn

50 55 60

Ile Lys Asp Tyr Phe Asp Lys His Glu His Leu Asp Leu Ile Lys Phe

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100 105 110

Ala Ile Val Lys Lys Glu Leu Lys Leu Ser Asp Lys Leu Leu Ser Arg

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130 135 140

Asn Tyr Asp Val Leu Phe Lys Val Lys Val Gly Leu Pro Leu Glu Ser

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Asn Asp Lys Ser Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Ile

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Asp Phe Arg Ile Lys Asn Val Lys Val Lys Asp Asn Glu Lys Pro Phe

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Ala Asp Ala Leu Lys Pro Tyr Asp Gln Lys Ile Gln Ala Leu Thr Ser

195 200 205

Gln Asp Phe Glu Val Lys Leu Glu Asn Ile Asp Asp Glu Leu Lys Gln

210 215 220

Ala Ile Thr Lys Tyr Gly Ile His Gln Leu Ser Ser Lys Gln Tyr Glu

225 230 235 240

Lys Leu Leu Lys Phe Ser Ser Ala Lys Leu Asp Glu Ile Phe Lys Asp

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Asn Asp Lys Lys Ile Glu Ile Pro Val Gly Ser Lys Lys Glu Lys Tyr

260 265 270

Thr Leu Lys Phe Asn Lys Phe Ile Glu Asp Val Val Leu Asn Asp Gly

275 280 285

Thr Leu Ser Ser Ala Lys Ala Lys Ile Arg Ile Ala Thr Ser Leu Phe

290 295 300

Asp Asp Lys Arg Lys Ser Thr Val Trp Glu Ser Gly Lys Thr Val Tyr

305 310 315 320

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Ser Asp Leu Ser Thr Leu Thr Lys Gly Asn Leu Phe Ile Asn Val Lys

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Val Val Ala Thr Gly Val Gly Thr Val Val Val Ile Lys Ile Pro Val

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Gly Glu Asn Arg Thr Ile Lys Val Ala Pro Thr Val Ser Ala Asp Thr

580 585 590

Pro Thr Glu Val Lys Lys Gly Gln Ile Ile Gly Phe Leu Gly Thr Gln

595 600 605

Asp Thr Asn Gly Gly Trp Met Ala His Ala His Val Asn Leu Tyr Thr

610 615 620

Asn Arg Asn Phe Trp Leu Ser Pro Asn His Phe Asn Lys Glu Ser Lys

625 630 635 640

Gln Ser Asn Ile Asp Lys Arg Val Lys Asp Tyr Lys Lys Thr Asn Lys

645 650 655

Gly Lys Ile Lys Tyr Thr Gln Val Gly Asn Ile Gly Val Glu Gly Val

660 665 670

Thr Asp Lys Arg Val Val Glu Val Asp Pro Lys Thr Gly Glu Ala Ile

675 680 685

Lys Thr Lys Val Lys Thr Asn Asn Gly Lys Glu Lys Leu Met Asn Lys

690 695 700

Ser Leu Lys Glu Leu Pro Val Tyr Leu Asn Asn Ile Ser Met Leu Ser

705 710 715 720

Lys Glu Gln Ser Lys Gly Tyr Ala Asp Pro Asn Leu Val Tyr Lys Leu

725 730 735

Arg Asp Ser Lys Thr Phe Ala Phe Gly Ile Glu Asp Leu Phe Glu Leu

740 745 750

Asn Lys

<210> 3

<211> 2265

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 3

atgaagagcc gcaaaattaa agcactgttt attagccagg caattggttt tagcgcactg 60

attccggttc tgagcgcacg ttgtaacgac ccgaaaaaca acagcgaagt tattatttac 120

cagagaaatg caaactcaga taaaaccaac gaacaatttg aaaagtacaa ccaggtcaac 180

ttactgagca acataaaaga ctactttgat aaacacgagc acctggatct gatcaaattt 240

aaagggggtg gcaaaccgga aacagtagaa tacagcctga tgatgcaaaa taattacatg 300

agcaaataca tcaacttcga taccgaagca tttaaagcaa ttgttaaaaa ggagctgaag 360

ctgagcgata aactgctgag cagactgaaa tttagctatg actacaacaa cgtcacccgc 420

gacccgggaa acaattatga cgtactgttt aaagttaagg tgggcctgcc gctggaatct 480

aacgataaaa gcaaatatga aagcggactg tattctcagc agattattga tttcagaatc 540

aaaaacgtga aggttaaaga taacgaaaag ccgtttgcag atgccctgaa accgtacgac 600

cagaaaattc aggccctgac ctctcaagat tttgaagtaa aactggaaaa catcgacgac 660

gaactgaaac aagcaataac caaatacggt attcaccagc tgagcagcaa acagtatgaa 720

aaattattaa agttcagtag tgcaaagctg gatgaaatct ttaaagataa cgataagaag 780

atcgagatcc cggttggcag caaaaaggaa aaatataccc tgaaattcaa caagttcatc 840

gaagatgtgg ttctgaatga tggtactctg agcagcgcaa aagcaaaaat aagaatagca 900

acgagcttat tcgatgataa acggaaaagc accgtttggg aaagcggcaa gaccgtttat 960

ggtctgttta ccgtgccgaa agaacaaaaa ctgatcaata atctgcagct ggccgaactg 1020

attgatgtgc ataccattgg gaatatcgaa cataatagcg atttaagcac cctgaccaaa 1080

ggtaatctgt ttataaacgt gaaagacgca aatatcgaaa aagttgaaat cgataagatc 1140

accaccagcg aacaggattt ccgcaatgca acagttaccc tgaatgttaa actgaaaaat 1200

agccaagaac tggttaaagt agaaaaacat ctgggagtgg gtagatacag cctgttattt 1260

gacaaacagt ttacaaaaca gaacatcaaa gcaccggcat tcgcgacaga aggaatcaca 1320

acaaaaaatc tgccgagcat tgataaaacc ttttttggtc attataatag ccagctgttt 1380

agcggtggtt atgcaagcgc acgtgcattt tatgcagata atgttgttgt tccgcgtttt 1440

gttcatattg gtgaagatta tattgcaccg gattttcagc cggttctggc accgtatgat 1500

ggtcagattg ttgcagcata tgaactgacc accaaagttg ttgcaaccgg tgttggtacc 1560

gttgttgtta ttaaaattcc ggttgcaaat ctggattgga gcccgaaaga aaaagaaatt 1620

tatctgaatg ataatgataa acatatttat atgagctttc tgcatctgga tgcaggtaaa 1680

accctgaata ataccagcct gggttggcag agcgaaaccg ttaccctggg tgaaaatcgt 1740

accattaaag ttgcaccgac cgttagcgca gataccccga ccgaagttaa aaaaggtcag 1800

attattggtt ttctgggtac ccaggatacc aatggtggtt ggatggcaca tgcacatgtt 1860

aatctgtata ccaatcgtaa tttttggctg agcccgaatc attttaataa agaaagcaaa 1920

cagagcaata ttgataaacg tgttaaagat tataaaaaaa ccaataaagg taaaattaaa 1980

tatacccagg ttggtaatat tggtgttgaa ggtgttaccg ataaacgtgt tgttgaagtt 2040

gatccgaaaa ccggtgaagc aattaaaacc aaagttaaaa ccaataatgg taaagaaaaa 2100

ctgatgaata aaagcctgaa agaactgccg gtttatctga ataatattag catgctgagc 2160

aaagaacaga gcaaaggtta tgcagatccg aatctggttt ataaactgcg tgatagcaaa 2220

acctttgcat ttggtattga agatctgttt gaactgaata aataa 2265

Claims

1.牛支原体分泌蛋白MbovP570在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，所述牛支原体分泌蛋白MbovP570具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牛支原体分泌蛋白MbovP570是以牛支原体Mbov_0570基因为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG，然后合成突变后的序列并进行双酶切和与载体质粒连接，构建重组质粒并转化大肠杆菌后得到的重组蛋白，其中，所述牛支原体Mbov_0570基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其突变后的序列如SEQ ID NO:3所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牛支原体分泌蛋白MbovP570具有抗原性，可以与牛支原体阳性血清反应而不与牛支原体阴性血清反应，而且该蛋白能诱导牛巨噬细胞高表达IL-8、IL-12。