CN108610424B

CN108610424B - 一种重组蛋白及其在制备猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用

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Publication number: CN108610424B
Application number: CN201810434893.9A
Authority: CN
Inventors: 沈克飞; 杨柳; 付利芝; 杨睿; 周雪; 张素辉
Original assignee: Chongqing Academy of Animal Sciences
Current assignee: Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-05-08
Also published as: CN108610424A

Abstract

本发明提供了一种含有猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明实现了该蛋白的可溶性高效表达，重组蛋白便于纯化，纯化的蛋白纯度高，能以更优的性能应用于疫苗中。

Description

一种重组蛋白及其在制备猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用

技术领域

本发明属于动物医学领域，涉及一种重组蛋白及其制备方法，尤其可用于制备猪圆环病毒和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗。

背景技术

猪圆环病毒(Porcinecirco virus，PCV)于1974年首次由德国学者Tischer I 等由多株连续传代的猪肾细胞系(PK15)中分离得到，1982年获得命名。PCV是迄今发现的最小的动物病毒之一，现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。猪圆环病毒2型对养猪业的危害日益被人们重视。

PCV2是引起仔猪断奶多系统衰竭综合征的主要病原，引起断奶仔猪发生进行性消瘦、咳嗽、呼吸困难等。目前PCV2已在世界各地广泛存在与流行，PCV2 感染可以破坏动物机体的免疫系统，造成严重的免疫抑制，容易诱发多种细菌及病毒的混合感染与继发感染，给疾病的诊断和治疗带来巨大的困难。迄今为止，欧美几家跨国公司已先后推出商品化的PCV2灭活疫苗、亚单位疫苗及嵌合病毒疫苗，国内也已研制出PCV2灭活疫苗。这些疫苗的推广应用虽然在防控猪圆环病上发挥了重要作用，但尚不能完全阻断PCV2传播，无法彻底清除体内感染的病毒。因此，开发高效、价廉的新型疫苗仍是研究的趋势和方向。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus，PRRSV)引起的一种高度接触性疾病，主要表现为母猪繁殖障碍及育肥猪和小猪呼吸困难。世界动物卫生组织将PRRS列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。商品化的PRRS疫苗目前主要有弱毒苗和灭活苗两种。灭活苗安全，免疫剂量大，不能刺激机体产生中和抗体，保护效果不理想。另外，PRRSV具有抗体依赖性病毒增强作用，即在低水平抗体下可介导和加强病毒的感染。弱毒疫苗免疫剂量小，免疫效果好。但弱毒疫苗存在散毒，同时PRRSV在体外易发生变异和重组而导致更严重的危害，弱毒疫苗的安全性及抗体依赖性病毒增强作用成为PRRS疫苗研发亟待解决的问题。

ORF1和ORF2是PCV2的两个主要阅读框，ORF1编码与病毒复制相关的蛋白(Rep)，ORF2编码病毒的主要结构蛋白(Cap)。近年来，针对PCV2基因功能的研究主要集中在ORF1和ORF2基因，其中Cap含有病毒主要抗原表位，是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。

PRRSV含有8个开放阅读框(ORFs)，ORF1编码非结构蛋白，ORF2～ORF7 编码结构蛋白。ORF2～5编码病毒4种囊膜相关蛋白GP2-5，ORF6编码非糖基化蛋白；ORF7编码核衣壳(N)蛋白。PRRSV ORF5编码的糖蛋白GP5为糖基化的囊膜(E)蛋白，分子量约为26ku～30ku，含4个糖基化位点和一段31个氨基酸的信号肽，该蛋白含有一段很大的内部疏水区。E蛋白与M蛋白在囊膜内由二硫键结合成异源二聚复合物，其内含有与病毒有关的免疫重要区。GP5有6个抗原决定簇，能诱导机体产生特异性中和抗体。

PRRSV ORF5编码的糖蛋白GP5既能诱导机体产生中和抗体，也是引起抗体依赖性病毒增强作用(ADE)的主要原因，引起ADE的区域位于GP5氨基端。因此，除去可引起ADE部分的ORF5其他部分可作为研究对抗PRRSV的基因工程疫苗的主要候选抗原。专利201210547915.5将PCV2ORF2和删去PRRSV ORF5ADE部分的抗原表位基因串联，插入到pGEX-4T-1中以在大肠杆菌中表达GST融合蛋白。以GST作为标签的重组蛋白需要可溶性表达才能顺利实现大量生产，但该专利诱导表达的重组蛋白主要以包涵体形式表达。另外，大肠杆菌表达系统虽是常用表达平台，但其内毒素在产品中很难去除，会影响产品质量。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是革兰氏阳性、无芽孢菌，在传统的食品发酵中已有悠久的历史，由美国食品和药物管理局(Food And drug administration， FDA)认定为公认安全级(generally recognized as safe，GRAS)微生物。自从 1873年JosephLister分离到乳酸菌以来(Teuber et al.，1995)，研究人员对这类细菌的生理生化以及遗传学特性进行了深入的研究，现在数据库中已经有50多种乳酸乳球菌菌株的遗传信息。这些研究的开展使乳酸乳球菌在基因工程得到了广泛的应用，包括作为黏膜免疫的活载体疫苗来递呈细菌和病毒抗原(Jounai et al.， 2015；Lei et al.，2015；Zhang et al.，2015)；表达特定过敏原的重组乳酸菌对I型变态反应进行调控(Kasarello et al.，2015)；表达细胞因子以及其他治疗性分子来治疗消化道或呼吸道疾病(Li et al.，2015；Wu etal.，2015；Xu et al.，2015)；作为细胞工厂来生产或试验性生产制药产品等(Mierau etal.，2005)。目前，在乳酸乳球菌所使用的载体有很多，但在异源蛋白的表达方面使用最多的是乳链菌肽控制基因表达(nisin-controlled gene expression system，NICE)系统，并且该系统也是在革兰氏阳性菌表达系统中使用最成熟、最广泛的表达系统。NICE系统是乳酸菌表达系统中表达效率最高的系统。NICE系统主要有三部分组成：宿主菌，诱导剂nisin或其类似物，含有启动子nisA和多克隆位点的质粒(deRuyter et a1.，1996)。但该系统提供的克隆宿主菌MC1061和表达宿主菌NZ9000的转化效率不高，缺少简便的重组质粒和重组宿主菌的鉴定方法，不含重组蛋白纯化和鉴定标签。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位的重组蛋白及其制备方法，实现了该蛋白的可溶性高效表达，重组蛋白便于纯化，纯化的蛋白纯度高，能以更优的性能应用于疫苗中。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种重组蛋白，蛋白质序列如SEQ ID NO.1。进一步的，所述重组蛋白包含 6×His。更进一步的，所述重组蛋白包括2段改造了的猪圆环病毒的抗原表位氨基酸序列PCV2ORF2序列(SEQ ID NO.2-1和SEQ ID NO.2-2)和一段猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原表位氨基酸序列PRRSV ORF5序列(SEQ ID NO.3)。

一种基因序列，用于编码上述重组蛋白。优选的，所述基因序列是按乳酸乳球菌密码子偏好性设计的，所述基因序列如SEQ ID NO.7所述，其中包括猪圆环病毒的抗原表位的核苷酸序列(SEQ ID NO.4-1、SEQ ID NO.4-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原表位的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)，通过linker(SEQ ID NO.6-1、SEQ ID NO.6-2、SEQ ID NO.6-3)连接，并在3’端引入6×His编码序列，得如SEQ ID NO.7所示的序列。

本发明提供上述的重组蛋白或基因在制备抗猪圆环病毒2型和/或抗猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。

本发明可以同时用于免疫猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒，且避免抗体依赖性病毒增强作用，有效刺激机体产生有益抗体。本发明删除了PCV2 ORF2非抗原表位区域，把GST标签替换成免疫原性弱的6×His，使用PCG作为linker，降低了重组蛋白中与有效抗原无关的成分，猪体免疫试验结果显示其抗原免疫效果并未因此削弱。更重要的是，相对于ZL201210547915.5所提供的重组蛋白，本发明显著提高了蛋白的可溶性表达水平，利用Ni-NTA亲和层析从可溶性蛋白中纯化得到高纯度的重组蛋白；Ni-NTA亲和层析利于实现重组蛋白的规模化生产。

本发明的另一目的在于提供制备上述重组蛋白的重组质粒和重组菌株的制备方法。此目的是通过以下措施实现的：

一种重组蛋白的制备方法，包括构建重组质粒、构建重组菌株，采用TOP10 感受态细胞制备重组质粒，重组菌株采用乳酸乳球菌。乳酸乳球菌是革兰氏阳性、无芽孢菌，在食品工业中应用广泛，被美国食品与药物管理局认定为公认为安全级微生物。本发明选用采用乳酸菌NICE表达系统，以nisin(乳酸菌素)作为诱导剂严格调控型革兰氏阳性菌表达系统，可高效表达外源基因，相对于大肠杆菌表达系统的最大有点是更安全、无内毒素，更适合作为疫苗的生产平台。为了更顺利地实现将目的基因与乳酸菌表达载体pNZ8148载体片段的连接产物转入克隆宿主菌，本发明采用将连接产物转入采用CaCl₂法制备的TOP10感受态细胞，相对于MC1061感受态细胞，TOP10转化效率提高了7倍，序列分析显示转化子中的目的基因未发生序列突变。

进一步地，乳酸乳球菌表达载体采用pNZ8148载体，宿主菌为NZ9000。

为了顺利将重组质粒电转化进表达宿主菌NZ9000，本发明对电转化条件进行了优化，电转参数设置为电压2000V、电容25μF、电阻500Ω、时间5ms，该条件的优化提高了转化效率。

具体的，一种重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

1)合成目的重组蛋白的基因序列：将改造了的猪圆环病毒2型的抗原表位的核苷酸序列SEQ ID NO.4和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原表位的核苷酸序列 SEQ ID NO.5通过linker连接，并在基因的3’端引入6×His编码序列，得如SEQ ID NO.7所示的序列；

2)构建重组质粒：通过限制性内切酶双酶切将步骤1)合成的基因序列克隆进pNZ8148载体，转化至大肠杆菌TOP10菌株，筛选阳性转化子，得重组载体，并提取重组质粒；

3)重组质粒的表达：将步骤2提取的重组质粒转化至宿主菌乳酸乳球菌NZ9000得重组菌株，再经诱导表达，得重组蛋白。

为了目的基因在乳酸乳球菌中高效表达，所述合成目的重组蛋白的基因序列是按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计基因序列。在合成目的重组蛋白的基因序列中引入6×His编码序列以便于采用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白。

作为一种优选，所述重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)将SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5通过linker PCG序列连接，并在羧基端引入6×His进行修饰，按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计基因序列，在基因的5’和3’端分别加入Nco I和HindIII限制性内切酶识别位点，得如SEQ ID NO.7所示的序列；

2)采用化学合成法合成基因，将其克隆至pUC57(pUC-PCV2-PRRSV)，在大肠杆菌TOP10菌株中保存；使用Nco I和HindIII酶切质粒pNZ8148和 pUC-PCV2-PRRSV，将目的基因及载体片段经DNA凝胶回收试剂盒回收后进行连接以构建重组质粒pNZ8148-PCV2-PRRSV，转化TOP10感受态细胞以构建重组菌株TOP-PCV2-PRRSV，采用PCR方法鉴定筛选阳性克隆；

3)将鉴定筛选出的阳性克隆，pNZ8148-PCV2-PRRSV电转化入乳酸乳球菌 NZ9000感受态细胞，以构建重组乳酸乳球菌菌株NZ8148-PCV2-PRRSV，采用 PCR方法鉴定阳性克隆；

4)诱导表达步骤3)得到的阳性重组乳酸乳球菌，得重组蛋白；

5)将步骤4)得到的重组蛋白采用Ni-NTA亲和层析从裂解上清中分离纯化得重组蛋白产品。

本发明还提供一种上述制备方法中得到的重组载体、重组菌株，包括上述重组蛋白，或上述核酸分子，或采用上述制备方法所得制品，如疫苗等。

本发明还提供一种上述重组质粒或重组菌株的鉴定方法和引物。正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。使用引物对重组质粒或重组菌株中的插入基因进行双向测序，将测得序列与SEQ ID NO.7所示的序列进行比对，比对无突变的为阳性重组质粒或重组菌株。本发明提供了重组质粒和或重组菌株的PCR鉴定方法，该鉴定方法结果准确，可用于构建基于pNZ8148质粒的重组质粒、重组菌株的PCR鉴定与测序，无需使用针对目的基因的特异引物。

本发明的目的还在于提供一种上述的重组蛋白制备的抗猪圆环病毒2型、抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗，所述疫苗包含SEQ ID NO.1所示的序列和药学上可接受的载体和/或助剂。本发明中术语“药学上可接受的载体和/或助剂”中载体通常选自包含代谢缓慢的大分子的组，例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物或脂质聚集体等；助剂的非限制性实例为水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物、防腐剂或稳定剂等。

本发明中术语“抗原表位”用于指被免疫系统的组分特异性识别或特异性结合的序列。

有益效果

1)本发明提供了目的基因与pNZ8148载体连接产物转化克隆宿主菌的高效方法，将连接产物转入采用CaCl₂法制备的TOP10感受态细胞，相对于MC1061感受态细胞，本发明的TOP10转化效率提高了7倍；同时结合对重组pNZ8148质粒电转化表达宿主菌NZ9000的参数进行筛选，提高了电转化效率。

2)本发明提供的鉴定方法结果准确，应用范围广，只要是基于pNZ8148质粒构建的重组质粒都可进行鉴定、测序，无需使用针对外源基因的特异引物，具有通用性。

3)本发明的重组蛋白通过对序列进行改造，删除了PCV2ORF2非抗原表位区域，使用PCG作为linker，只在羧基端添加了便于纯化重组蛋白的6×His，降低了重组蛋白中与有效抗原无关的成分，猪体免疫试验结果显示其抗原免疫效果并未因此削弱。

4)本发明提供了以pNZ8148为载体，在乳酸乳球菌中高效可溶性表达含有猪圆环病毒2型的抗原表位和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原表位的杂合重组蛋白及其制备方法，该蛋白能以更优异性能应用于抗猪圆环病毒、抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗中。本发明为进一步以此平台开展疫苗研究奠定了基础。

附图说明

图1为基于引物对PNZF/PNZR运用PCR扩增pNZ8148质粒的结果。M： MarkerDL2000；1：pNZ8148；2：含有pNZ8148的重组大肠杆菌TOP10培养物；3：含有pNZ8148的重组乳酸乳球菌NZ9000培养物；4：不含pNZ8148的大肠杆菌TOP10培养物；5：不含有pNZ8148的乳酸乳球菌NZ9000培养物。

图2为Nco I、Hind III双酶切重组质粒pUC-PCV2-PRRSV的结果。M：DNA MarkerDL2000；1：未酶切质粒；2：酶切质粒。

图3为Nco Ｉ、Hind III双酶切质粒pNZ8148的结果。M：DNA Marker DL2000； 1：酶切质粒；2：未酶切质粒。

图4为目的基因与pNZ8148载体片段连接产物转化TOP10的转化子PCR鉴定结果。M：DNA Marker DL2000；1-5：转化子。

图5为目的基因与pNZ8148载体片段连接产物转化MC1061的转化子PCR鉴定结果。M：DNA Marker DL2000；1-10：转化子。

图6为重组质粒pNZ8148-PCV2-PRRSV转化NZ9000的转化子PCR鉴定结果。 M：DNAMarker DL2000；1-2：转化子。

图7为重组乳酸乳球菌中PCV2-PRRSV表达产物的SDS-PAGE分析结果。M：蛋白质Marker；1：裂解物沉淀；3：裂解物上清；4：未诱导培养物。

图8为PCV2-PRRSV纯化分析。M：蛋白质Marker；1：PCV2-PRRSV。

图9为PCV2-PRRSV免疫仔猪抗体消长曲线。

图10为未删去非抗原表位的PCV2-PRRSV免疫仔猪抗体消长曲线。

图11为未免疫仔猪抗体消长曲线。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

主要试剂与材料：氯霉素购自索莱宝公司；Nco I和HindIII购自NEB公司；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；nisin购自Sigma公司；镍离子亲和层析柱购自GE公司；BCA试剂盒购自上海生工；乳酸菌表达质粒pNZ8148、乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9000、大肠杆菌MC1061购自荷兰 NIZO研究所；Ni-NTA亲和层析填料购自GE公司。大肠杆菌TOP10菌株由本实验室保存。

实施例

一、重组质粒pNZ8148中外源基因检测和测序的通用引物

1.重组质粒pNZ8148中外源基因检测和测序的通用引物设计

根据质粒pNZ8148的序列设计特异性引物对PNZF/PNZR，引物位于质粒多克隆位点两侧，扩增片段大小为556bp。质粒含有插入基因，扩增片段大小约为目的基因长度与556bp之和。引物信息见表1.

表1检测重组pNZ8148质粒插入基因的引物对PNZF/PNZR

2.DNA模板

含有pNZ8148的大肠杆菌MC1061、TOP10和乳酸乳球菌NZ9000。

3.PCR反应及序列分析

按表2加入PCR各反应体系，阴性对照为不含pNZ8148的大肠杆菌 MC1061。PCR反应参数按表3设置。反应结束后取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小，阳性条带采用引物PNZF/PNZR进行测序，将测得序列在 NCBI上进行BLAST以进行同源性分析。

表2 PNZF/PNZR PCR反应体系

表3 PNZF/PNZR PCR反应参数

试验结果如图1所示，采用引物对PNZF/PNZR从质粒pNZ8148、含有 pNZ8148的大肠杆菌MC1061和乳酸乳球菌NZ900014中通过PCR扩增出大符合预期的目的条带，而不含pNZ8148的阴性对照未扩增出条带。以PNZF/PNZR 为测序引物，对所扩增的条带进行序列测定，所得序列与pNZ8148的同源性为 100％。这表明对引物对PNZF/PNZR可从含有pNZ8148的模板中特异性扩增目的条带，且可用于所扩增条带的序列测定。

二、重组蛋白的基因序列的设计

根据GenBank公布的PCV2的ORF2及PRRSV的ORF5编码产物序列，分析其抗原表位，将抗原表位聚集区域串联，在羧基端引入6×His，各元件通过 Linker PCG连接。根据乳酸乳球菌密码子偏好性优化基因序列，在基因的5’和3’端分别加入Nco I和HindIII限制性内切酶识别位点。采用化学合成法合成基因，将其克隆至pUC57(pUC-PCV2-PRRSV)，在大肠杆菌TOP10菌株中保存。基因合成由上海生工生物工程有限公司完成。基因长度657bp，如SEQID NO.7 所示，重组蛋白的分子量约为25kD。

三、乳酸菌表达重组质粒pNZ8148转化克隆宿主菌

将制备好的质粒pNZ8148和含有目的基因的重组质粒pUC-PCV2-PRRSV 使用NcoＩ、HindIII进行酶切，双酶切检测结果见图2和图3。酶切体系如表4。混合各组分，37℃水浴2h，65℃灭活15min，琼脂糖凝胶电泳后切下含有pNZ8148 载体片段和目的基因的凝胶，回收DNA，作1％琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度深浅，调整目的基因与载体pNZ8148用量，使其摩尔浓度(pM级)之比在3～ 10∶1，连接反应体系为10μl，加入1μl T4DNA连接酶缓冲液及0.5μL T4DNA 连接酶，不足体积用去离子水补足，充分混匀各组分，16℃孵育8h。

表4双酶切体系

从-80℃冰箱取出MC1061、TOP10感受态细胞冰水浴至感受态细胞融化，取连接产物3μL分别加入两种感受态细胞中，搅动混匀，冰水浴30min，42℃热激90sec，冰水浴3min，加600μL LB培养基后置37℃90min，涂板，37℃培养48h。分别从MC1061平板、TOP10平板挑取单菌落接种含10μg/mL氯霉素的LB培养基，37℃空气浴振摇培养过夜。

取5μL培养物加入95μL无菌去离子水中，沸水浴10min。使用PNZF/PNZR PCR筛选阳性转化子。PCR体系按表2加入，PCR参数按表3设置。PCR反应后取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。提取阳性克隆培养物质粒，使用引物对PNZF/PNZR进行双向测序。

试验结果如图4、图5所示，连接产物转化TOP10后PNZF/PNZR PCR阳性率约为70％(22/30)，连接产物转化MC1061后PNZF/PNZR PCR阳性率约为10％ (3/30)。结果表明目的基因与pNZ8148载体片段连接产物转化TOP10的效率约为转化MC1061效率的7倍。序列测定和序列分析结果显示，重组质粒pNZ8148中的插入基因在TOP10中未发生突变，表明大肠杆菌TOP10菌株可作为构建重组质粒 pNZ8148的克隆宿主菌。TOP10菌株高效的转化效率为构建重组质粒pNZ8148提供了便利的操作平台。

四、乳酸菌表达重组质粒pNZ8148转化表达宿主菌

1、制备NZ9000感受态细胞

制备方法：(1)将NZ9000按1％接种于10mL GM17(M17+0.5％葡萄糖)培养基，30℃过夜培养后按1％接种于100mL GM17；(2)长至对数期的NZ9000置于于冰上预冷，4℃6000r/min离心5min收集菌体；(3)先后用预冷的60mL、 40mL、20mL含10％甘油的0.5M蔗糖溶液洗涤菌体，4℃6000r/min离心5min收集菌体；(4)用上述预冷的混合液10mL重悬菌体，并分装于1.5mL离心管，400 μL/管，冰浴操作。分装后于-70℃保存备用。

2、提取重组质粒

提取TOP10转化子培养物中的重组质粒pNZ8148-PCV2-PRRSV，电转化 NZ9000感受态细胞。

3、电转化

(1)电转杯清洗：取出酒精中保存的两支电转杯，置于紫外下照射15min，用无菌水充分清洗4-5次，再置于紫外下照射15min，然后用10％甘油充分清洗3-4 次，盖上盖子置于冰上。

(2)取出2管NZ9000感受态细胞冰水浴至融化，一管加入10μL质粒，搅动混匀，冰水浴15min后将混合物转入电转杯继续冰浴15min。另一管作为阴性对照；

(3)电转。设置5个电转条件，电转参数按表5设置。电转结束后立即冰水浴；

(4)取2个无菌EP管，每管装800μL GM17培养基(含20mM MgCl₂和2 mMCaCl₂)，取电转产物200μL加入其中，30℃培养2h；

(5)取100μL培养物涂布于GM17固体平板(含10μg/mL氯霉素)，30℃培养箱培养。

(6)待长出菌落，挑取单菌落接种含10μg/mL氯霉素的GM17培养基中培养过夜。

表5电转化参数设置

4、转化子鉴定

试验结果显示，电转参数影响电转化效率，电转参数设置为电压2000V、电容25uF、电阻500Ω、时间5ms，转化子涂板出现菌落，且经PNZF/PNZR PCR 鉴定为阳性克隆(见图6)；按其他电转参数进行的电转化未见菌落生长。序列测定和序列分析结果显示，重组质粒pNZ8148中的插入基因未发生。结果表明电压2000V、电容25μF、电阻500Ω、时间5ms的参数设置是乳酸乳球菌NZ9000 最佳电转参数。

5、诱导表达与纯化

将重组乳酸乳球菌接种于GM17液体培养基，30℃培养至D600＝0.5～0.6，加入终浓度为1ug/L的诱导剂nisin，30℃诱导3h。将诱导后的培养物4℃中6 000×g离心10min。收集菌体沉淀。用0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗涤菌体2次，用1/10发酵液体积的含20mg/L溶菌酶的缓冲液悬浮菌体，37℃温浴1 h 后离心，沉淀重悬于20mL 0.05mol/LTris-HCl(pH 8.0)缓冲液。冰浴条件下超声裂解细胞(300w，工作3s间歇6s，循环操作90次)。取裂解物样品，4℃下12000 ×g离心10mm，沉淀和上清分别进行12％SDS-PAGE。经过上样、洗杂蛋白和咪唑溶液洗脱，采用Ni-NTA亲和层析从裂解上清中分离纯化重组蛋白。采用SDS-PAGE分析重组蛋白纯化效果，用Image Lab3.0对目的条带进行灰度扫描以分析纯度，使用BCA试剂盒测定纯化蛋白的浓度。

SDS-PAGE结果显示，相对于未诱导的重组菌，重组菌经nisin诱导3h后在裂解物上清和沉淀中可见相对分子质量约25kD的目的条带，大小与预期相符，且可溶性表达水平高于包含体形式表达(图7)。

经Ni-NTA亲和层析从裂解上清中得到重组蛋白PCV2-PRRSV(图8)，蛋白纯度可达96％以上，BCA法测得蛋白的浓度约4mg/mL，每升重组菌株产量可达5mg。

6、免疫试验

选用15头PRRSV和PCV2抗原、抗体阴性的21日龄仔猪，非免疫对照组、删除非抗原表位的串联抗原和原串联抗原3组。试验组接种弗氏佐剂与重组蛋白的乳化物，接种剂量为80mg/头，间隔1周进行第2次接种。在首免后1周、2 周、3周、4周、5周7周进行前腔静脉穿刺采血，分离血清，采用重组蛋白ELISA 方法测定抗体水平。

试验结果显示，删除非抗原表位的串联抗原和原串联抗原免疫仔猪后的抗体水平没有明显差异，免疫组免疫后抗体水平逐渐上升，在首免后3周抗体水平达到最高峰，首免后4周开始逐渐下降。在测试的时间内，免疫组和非免疫组在首免后 3周抗体水平显著高于非免疫组。

序列表

<110> 重庆市畜牧科学院

<120>一种重组蛋白及其在制备猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用

<160> 13

<210> 1

<211> 220

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 1

pwmgifntrl srtfgytikr ttvktpswav dmmrfnindf lppgggsnpr svpfeyyrir 60

kvkpcgildd nfvtkatalt ydpyvnyssr htitqpfsyh sryftpkpvl dstidyfqpn 120

nkrnqlwlrl qtagnvdhvg lgtafensiy dqeynirvtm yvqfrefnlk dpplnppcga 180

nasndssshl qliynltlce lngtdwlank fpcghhhhhh 220

<210> 2-1

<211> 60

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> PCV2 ORF2-1

<400> 2-1

gifntrlsrt fgytikrttv ktpswavdmm rfnindflpp gggsnprsvp feyyrirkvk 60

<210> 2-2

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> PCV2 ORF2-2

<400> 2-2

ilddnfvtka taltydpyvn yssrhtitqp fsyhsryftp kpvldstidy fqpnnkrnql 60

wlrlqtagnv dhvglgtafe nsiydqeyni rvtmyvqfre fnlkdpplnp 110

<210> 3

<211>32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> PRRSV ORF5

<400> 3

anasndsssh lqliynltlc elngtdwlan kf 32

<210> 4-1

<211> 183

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PCV2 ORF2-1

<400> 4-1

atgggaattt ttaatacccg tctttctcgt acttttggtt atacaattaa acgtactacc 60

gttaaaaccc catcttgggc tgttgatatg atgagattta atattaatga ttttcttcca 120

ccaggtggag gttcaaatcc tcgttcagtt ccttttgaat attatagaat tcgtaaagtc 180

aaa 183

<210> 4-2

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PCV2 ORF2-1

<400> 4-2

attttagatg ataattttgt caccaaagcc acagctttaa catatgatcc ttatgttaat 60

tatagcagcc gtcatacaat tactcaacct ttttcttatc actcaagata ttttacccct 120

aaaccagttt tagattcaac tattgattat tttcaaccaa ataataaacg taatcaactt 180

tggcttcgtt tacaaacagc aggtaatgtt gatcatgttg gtttaggtac tgcttttgaa 240

aattcaattt atgatcaaga atataatatt cgtgtcacca tgtatgttca atttcgtgaa 300

tttaatctta aagatccacc attaaatcca 330

<210> 5

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PRRSV ORF5

<400> 5

gcaaatgcat caaatgattc atcttcacat cttcaactta tttataatct taccctttgt 60

gaacttaatg gaactgattg gttagcaaat aaattt 96

<210> 6-1

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> linker-1

<400> 6-1

ccatgtgga 9

<210> 6-2

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> linker-2

<400> 6-2

ccttgtggt 9

<210> 6-3

<211>

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> linker-3

<400> 6-3

ccatgtggt 9

<210> 7

<211> 657

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 重组蛋白的核苷酸序列

<400> 7

atgggaattt ttaatacccg tctttctcgt acttttggtt atacaattaa acgtactacc 60

gttaaaaccc catcttgggc tgttgatatg atgagattta atattaatga ttttcttcca 120

ccaggtggag gttcaaatcc tcgttcagtt ccttttgaat attatagaat tcgtaaagtc 180

aaaccatgtg gaattttaga tgataatttt gtcaccaaag ccacagcttt aacatatgat 240

ccttatgtta attatagcag ccgtcataca attactcaac ctttttctta tcactcaaga 300

tattttaccc ctaaaccagt tttagattca actattgatt attttcaacc aaataataaa 360

cgtaatcaac tttggcttcg tttacaaaca gcaggtaatg ttgatcatgt tggtttaggt 420

actgcttttg aaaattcaat ttatgatcaa gaatataata ttcgtgtcac catgtatgtt 480

caatttcgtg aatttaatct taaagatcca ccattaaatc caccttgtgg tgcaaatgca 540

tcaaatgatt catcttcaca tcttcaactt atttataatc ttaccctttg tgaacttaat 600

ggaactgatt ggttagcaaa taaatttcca tgtggtcatc atcatcatca ccattaa 657

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物

<400> 8

cataataaac ggctctg 17

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物

<400> 9

cctccaaccg aaatag 16

Claims

1. 含有猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 权利要求1所述的重组蛋白制备的抗猪圆环病毒2型、抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗，其特征在于：所述疫苗包含SEQ ID NO.1所示的序列和药学上可接受的载体和/或助剂。