CN116178507B - 突变型gp5蛋白及其编码基因、表达载体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种突变型GP5蛋白及其编码基因、表达载体和应用。所述突变型GP5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明将天然GP5蛋白的第26‑30位的氨基酸“A(V)LVN”突变为“S(V)GSG”，且将第51位氨基酸“N”突变为“A”，得到突变型GP5蛋白，可使得成熟蛋白缺失ALVN表位和糖基化残基，显著增强GP5蛋白的免疫原性和抗原递呈作用，以其作为免疫原可改善细胞免疫反应和免疫应答水平，产生更高浓度的中和抗体，显著提高中和抗体滴度和效价，进而提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对中和抗体的敏感性，为开发商品化的检测试剂盒提供了优良的中和抗体材料。

Description

突变型GP5蛋白及其编码基因、表达载体和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种突变型GP5蛋白及其编码基因、表达载体和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的病毒性传染病，又称“猪蓝耳病”。感染该病毒的猪只会出现食欲废绝、体温升高、孕后期出现莫名的流产、出生仔猪为死胎和木乃伊胎等问题，日龄较小的仔猪则表现为明显的呼吸系统症状，并且会使感染PRRSV的动物继发感染其他疾病尤其是细菌性疾病。该病于1987年在美国首次被报道，并迅速蔓延到世界各地，给生猪养殖业造成了严峻的打击。迄今还未能找到有效预防PRRSV病毒的方法，因此，开发用于诊断或检测的试剂盒尤为重要。
PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属囊膜病毒，核衣壳呈现立体对称的二十面体，核酸不分节段，为单股正链RNA，大小约为15kb，包括8个开放阅读框架，共编码RNA聚合酶(非结构蛋白)、GP2囊膜蛋白、GP3囊膜蛋白、GP4囊膜蛋白、GP5囊膜蛋白、膜基质蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)等7种蛋白，其主要结构蛋白包括囊膜蛋白中的GP5、膜基质蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)，分别由病毒基因序列开放阅读框ORF5、ORF6和ORF7编码，在病毒的感染和增殖等过程中发挥重要的作用。有研究证明，GP5(又称E蛋白)具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生中和抗体，其糖基化与体内的病毒增殖相关，可能引起病毒的免疫逃逸，降低机体免疫力和抗体产生的能力，被作为构建PRRSV诊断或检测试剂盒的靶标之一。目前有通过编码GP5的基因免疫动物产生一定水平的中和抗体以制备酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒，但检测结果并不能很好地反应猪群的免疫保护水平和感染的病毒含量，另有学者采用纯化的GP5蛋白免疫动物获取抗体，但是产生的抗体滴度较低，难以用于开发商品化的ELISA检测试剂盒。
发明内容
针对现有技术存在的利用GP5编码基因或GP5蛋白作为免疫原免疫动物存在的免疫原性弱、产生的抗体滴度不高的问题，本发明提供了一种突变型GP5蛋白及其编码基因，并提供了用于表达该突变型GP5蛋白的表达载体，进一步提供了编码基因或者表达载体在制备GP5重组蛋白或特异性结合GP5蛋白的抗体中的应用。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面提供了一种突变型GP5蛋白，所述突变型GP5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二方面提供了一种编码基因，用于编码如上所述的突变型GP5蛋白。
进一步地，编码所述突变型GP5蛋白的基因如SEQ ID NO：2所示。
本发明的第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括编码如上所述的突变型GP5蛋白的基因。
进一步地，所述表达载体还包括编码谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签的基因，编码所述谷胱甘肽巯基转移酶标签的基因位于编码所述突变型GP5蛋白的基因的上游。
进一步地，所述表达载体还包括编码组氨酸标签的基因，编码所述组氨酸标签的基因位于编码所述突变型GP5蛋白的基因的下游。
进一步地，构建所述表达载体所用的出发载体为pGEX-4T-1。
本发明第四方面提供了一种如上所述的编码基因或者表达载体在制备GP5重组蛋白或特异性结合GP5蛋白的抗体中的应用。
本发明第五方面提供了一种GP5重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1、将如上所述的表达载体导入大肠杆菌中，培养转化后的所述大肠杆菌；
S2、收集转化后的所述大肠杆菌，进行纯化，得到GP5重组蛋白。
本发明第五方面提供了一种特异性结合GP5蛋白的抗体的制备方法，以如上所述的突变型GP5蛋白或如上所述制备得到的所述GP5重组蛋白为免疫原，免疫动物，收集动物血清，纯化得到抗体。
本发明的优点及积极效果为：
本发明以天然GP5蛋白(Uniprot编号：Q8B908)为基础，将天然GP5蛋白的第26-30位的氨基酸“A(V)LVN”突变为“S(V)GSG”，以废除诱饵ALVN表位，且将第51位氨基酸“N”突变为“A”，以废除N51糖基化位点，得到如SEQ ID NO：1所示的突变型GP5蛋白，可使得成熟蛋白缺失ALVN表位和糖基化残基，显著增强GP5蛋白的免疫原性和抗原递呈作用，以其作为免疫原免疫动物，可改善细胞免疫反应和免疫应答水平，产生更高浓度的中和抗体，显著提高中和抗体滴度和效价，进而提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对中和抗体的敏感性，为开发商品化的检测试剂盒提供了优良的中和抗体材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例的构建质粒1时PCR扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳结果图；
图2为本发明实施例的构建质粒1时菌落PCR鉴定阳性克隆的琼脂糖凝胶电泳结果图；
图3为本发明实施例的构建质粒2时PCR反向扩增目的基因时的琼脂糖凝胶电泳结果图；
图4为本发明实施例质粒1诱导表达GP5重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图5为本发明实施例质粒2诱导表达GP5重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图6为本发明实施例质粒1诱导表达的破细胞上清和包涵体的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图7为本发明实施例质粒2诱导表达的破细胞上清和包涵体的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图8为本发明实施例质粒2诱导表达的破细胞上清亲和纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图9为本发明实施例采用GP5重组蛋白作为免疫原产生的血清中和抗体效价测定结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种突变型GP5蛋白，所述突变型GP5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明以天然GP5蛋白(蛋白数据库Uniprot的ID编号：Q8B908)为基础，将天然GP5蛋白的第26-30位的氨基酸“A(V)LVN”突变为“S(V)GSG”，(V)表示该位点氨基酸未发生改变，且将第51位氨基酸“天冬酰胺(N)”突变为“丙氨酸(A)”，得到如SEQ ID NO：1所示的突变型GP5蛋白，其中第一个突变位点旨在废除诱饵ALVN表位，第二个突变位点旨在废除N51糖基化位点。相对于大多数报道的改造GP5蛋白，例如，截去了“TFVIFPVLTHIVSYGALTTSHFL”、“YVLSSIYAVCALAALICFVI”等片段，或将氨基酸片段中的“VVLDGS”突变为“EELDGS”、将氨基酸片段的“EKGGKV”突变为“EKEEKV”，本发明通过废除诱饵表位和糖基化位点，可使得成熟蛋白缺失ALVN表位和糖基化残基，显著增强GP5蛋白的免疫原性和抗原递呈作用，以其作为免疫原免疫动物，可改善细胞免疫反应和免疫应答水平，产生更高浓度的中和抗体，显著提高中和抗体滴度和效价，进而提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对中和抗体的敏感性，为开发商品化的检测试剂盒提供了优良的中和抗体材料。
本发明另一实施例提供了一种编码基因，所述编码基因用于编码如上所述的突变型GP5蛋白。
编码基因包括DNA分子(例如基因组DNA或cDNA)和/或RNA分子(例如mRNA)，分子可以是单链或双链的。
示例性地，所述编码基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
需要注意的是，所述编码基因的序列依据氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。本领域技术应当理解，由于遗传密码的简并性，不同于本发明所示例的编码基因的DNA序列同样可以编码得到本发明的突变型GP5蛋白，因此，本发明提供的用于编码如上所述的突变型GP5蛋白的DNA序列不作为对本发明保护范围的限定。
本发明再一实施例提供了一种表达载体，所述表达载体包括如上所述的编码所述突变型GP5蛋白的基因，用于可溶性表达突变型GP5蛋白。
所述表达载体相对于现有技术的优势与如上所述的突变型GP5蛋白相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
囊膜蛋白GP5具有两个跨膜区，跨膜区一般疏水性强，定位于细胞膜上，对于任何的表达系统来说跨膜对于体外重组表达影响都是巨大的，将导致不能采用原核表达系统获得有效表达或者产生大量的包涵体使得蛋白没有活性。因此，在一些优选地实施方式中，本发明的表达载体还包括编码谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签的基因，编码所述GST标签的基因位于编码所述突变型GP5蛋白的基因的上游。GST标签蛋白高度可溶，并可在大肠杆菌中大量表达，以GST标签来增强蛋白的可溶性及表达量，利于蛋白的分离纯化。
通过本发明所提供的突变序列及表达载体构建方式，解决了GP5蛋白疏水性强、富含跨膜区导致蛋白结构变化继而所产生的活性低的问题，将本实施例的表达载体导入原核表达系统，以融合蛋白的形式对GP5编码基因进行原核表达，可以有效获取可溶性GP5重组蛋白，对可溶性GP5重组蛋白的免疫反应性进行分析，该蛋白具有良好的免疫原性，得到的血清中和抗体滴度高，能够特异性识别GP5蛋白。
上述所述的原核表达系统为大肠杆菌表达系统，通过本发明提供的表达纯化方式可以有效解决GP5蛋白来源问题，且由于采用大肠杆菌表达系统其操作简便，周期短，成本低，且容易进行扩大生产规模，继而可以有效解决原来来源稀缺，产品稳定性问题。
为了便于蛋白的分离纯化，可选地，所述表达载体还包括编码组氨酸标签的基因，如8×His标签，编码所述组氨酸标签的基因位于编码所述突变型GP5蛋白的基因的下游。
具体地，构建所述表达载体所用的出发载体为pGEX-4T-1。通过将编码突变型GP5蛋白的基因序列与编码GST标签的基因序列和/或编码组氨酸标签的基因序列连接到出发载体pGEX-4T-1的多克隆位点内，获得本发明如上所述的表达载体，表达得到的融合蛋白从N端到C端依次为：GST标签、突变型GP5蛋白和组氨酸标签。
本发明还提供了如上所述的编码基因或者表达载体在制备GP5重组蛋白或特异性结合GP5蛋白的抗体中的应用，并提供了相关的制备方法。
具体而言，一种GP5重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1、将如上所述的表达载体导入大肠杆菌中，培养转化后的所述大肠杆菌；
S2、收集转化后的所述大肠杆菌，进行纯化，得到所述GP5重组蛋白。
步骤S1中，构建所述表达载体包括以下步骤：通过全基因合成或者PCR扩增合成编码突变型GP5蛋白的基因序列(例如SEQ ID NO：2所示)，将编码突变型GP5蛋白的基因序列与编码组氨酸标签的基因序列连接到出发载体的多克隆位点，构建得到所述表达载体。
其中，PCR扩增合成编码突变型GP5蛋白的基因序列包括以下步骤：以GP5蛋白的编码基因为模板，采用如SEQ ID NO：9-12所示的扩增引物对进行扩增反应。
步骤S2中，所述纯化方法为亲和纯化，包括细胞破碎和镍柱纯化步骤。其中，细胞破碎所用的破菌液包括50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM AEBSF、1mM EDTA、1％Triton X-100和0.1％CHAPS；采用超声破碎。
具体而言，一种特异性结合GP5蛋白的抗体的制备方法，以突变型GP5蛋白或上述纯化所得的GP5重组蛋白免疫动物，收集动物血清，纯化得到所述抗体。
本发明的克隆表达方法，可以得到高浓度、高活性的融合蛋白形式的GP5重组蛋白，为开发特异性抗体提供了保证，通过该蛋白作为免疫原，成功开发出多克隆抗体，为建立特异性PRRSV检测方法奠定了基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。
一、表达载体构建
本实施例构建如下表达载体：
编号 基因名 标签
质粒1 天然GP5蛋白(Q8B908，见SEQ ID NO：3) GST标签、组氨酸标签
质粒2 突变型GP5蛋白(见SEQ ID NO：1) GST标签、组氨酸标签
以上所涉及的序列信息如下：
突变型GP5蛋白的氨基酸序列如下所示：
(见SEQ ID NO：1)，其中灰色所示区域为突变位点，下划线位置的氨基酸残基未进行改造。
突变型GP5蛋白的基因序列如下所示：
(见SEQ ID NO：2)，其中灰色所示区域为突变位点，下划线位置的碱基未进行改造。
Q8B908的氨基酸序列如下所示：
(见SEQ ID NO：3)。
Q8B908的基因序列所示：
ATGCTGGGTAAATGCCTGACTGCTGGCTGCTGTTCTCGTCTGCTGTCTCTGTGGTGCATCGTTCCTTTCTACCTGGCTGTGCTGGTAAACGCTAGCAACAACTCTTCCAGCCATATCCAGCTGATCTACAACCTGACCCTGTGTGAGCTGAACGGTACCGACTGGCTGGCTAAAAACTTCAACCGTGCGGTAGAAACCTTCGTCATCTTCCCGGTACTGACCCATATCGTTTCTTACGGTGCGCTGACTACCTCTCATTTCCTGGACACTGTTGGCCTGGTTACTGTGAGCACCGCTGGCTACTACCATCGTCGTTACGTTCTGAGCTCCATCTACGCAGTTTGTGCTCTGGCAGCACTGATCTGCTTCGTCATTCGTCTGGCGAAGAATTGCATGTCTTGGCGCTATTCTTGTACCCGTTATACCAATTTCCTGCTGGATACCAAAGGTAAACTGTATCGCTGGCGTTCTCCTGTAATCGTCGAAAAAGGTGGCAAAGTGGAAGTGGAGGGTCATCTGATCGATCTGAAACGTGTCGTACTGGACGGCTCCGTAGCAACCCCTCTGACCCGTGTATCTGCGGAACAGTGGGGTCGTCTGTAA(见SEQ ID NO：4)。
1.1、质粒1构建
采用全基因合成的方式将天然GP5蛋白构建到克隆载体PUC57上，命名为pUC57-GP5，以此为模板、利用下述的质粒1-F和质粒1-R引物进行PCR扩增，将扩增的目的片段构建到pGEX-4T-1(购自灵淼质粒平台，货号：P0001)中，在该目的片段C端添加8×His标签，改造后载体命名为质粒1(pGEX-4T-AB1)。
质粒1-F：ACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGCTGGGTAAATGCCTGA(见SEQ ID NO：5)；
质粒1-R：CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACAGACGACCCCACTGTTCCGCA(SEQ ID NO：6)。
PCR扩增体系(50μL)包括Gloria Nova HS 2X HF Master Mix(武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：RK20715)25μL、pUC57-GP5模板2μL、上/下游引物1+1μL、、ddH2O21μL。PCR扩增反应程序设置：98℃变性(高温破碎菌液)5min，(98℃变性解链20s、60℃退火引物和模板结合30s、72℃延伸，延伸速率2kb/1min)×30cycLe，72℃延伸10min。
PCR反应完成后，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证，可以看到600bp的单一条带(见图1)，说明得到了纯的目的基因，之后采用爱博泰克琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：RK30100)回收目的条带，得到纯的目的基因。
将上述纯化的目的基因采用同源重组的方式与GST标签的出发载体pGEX-4T-1进行连接转化，连接体系为：目的基因2μL、pGEX-4T-1载体3μL、2×MultiF SeamlessAssembly Mix(购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：RK21020)5μL。
取连接产物10μL全部转入DH5α感受态细胞，经过冰浴、热激、复苏及过夜培养后采用通用引物pGEX-5′和pGEX-3′进行菌落PCR鉴定，验证结果如图2所示。从图2中挑选正确的阳性克隆采用载体通用引物进行测序验证，将测序正确后的质粒1用于后续的蛋白表达。
pGEX-5′：GCAAGCCACGTTTGGTG(见SEQ ID NO：7)；
pGEX-3′：GAGCTGCATGTGTCAGAGG(见SEQ ID NO：8)。
1.2、质粒2构建
采用质粒1为模板、利用下述扩增引物对进行PCR反向扩增，第一个突变位点将“GCTGTGCTGGTAAAC”序列替代为“TCTGTGGGGTCTGGC”：以废除诱饵ALVN表位，第二个突变位点将AAC三联体替换为GCC三联体以废除N51糖基化位点，其中灰色所示区域为突变位点。
突变位点1-F： (见SEQ ID NO：9)；
突变位点1-R： (见SEQ ID NO：10)；
突变位点2-F：(见SEQ ID NO：11)；
突变位点2-R：(见SEQ ID NO：12)。
PCR反向扩增体系：Max DNA Polymerase(购自Takara，货号：R045B(A×4))25μL、上/下游引物1+1μL、质粒1 1μL、ddH2O 22μL。PCR反向扩增反应程序设置：98℃变性(高温破碎菌液)4min，(94℃变性解链40s、58℃退火引物和模板结合30s、72℃延伸1min)×35cycLe，72℃延伸10min。
PCR反向扩增反应完成后，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证，可以看到约5000bp的单一条带(结果见图3)，说明得到了纯的目的基因，之后回收目的条带，得到纯的目的基因。
将上述目的基因用DpnI酶(购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：RK21109)进行消化，酶切体系为：10×Buffer CutS 5μL、目的基因1μg、DpnI 0.5-1μL、ddH2O补足至50μL。在37℃孵育5-15min，得到酶切产物。之后将酶切产物转化到DH5α感受态细胞，经过冰浴、热激、复苏及过夜培养后，进行阳性克隆筛选，以此阳性克隆为模板再次反向扩增全长，将得到的PCR产物再次用DpnI进行消化、转化后进行筛选并测序，将最终测序正确的突变质粒命名为质粒2，进行后续的蛋白表达。
二、小量表达
(1)培养基分装：从冰箱中取出已经添加相应抗生素的液体培养基，将培养基分装到灭菌的10mL EP管中，每管3mL，每个质粒分四管，一管用于测OD值，三管用于诱导表达；
(2)挑取单菌落：使用10μL枪头挑取平板上的单菌落接种入相应装有培养基的10mL EP管中，尽量保证挑取的单菌落形态大小均一；
(3)菌液保存和诱导：将接种后的培养基放入摇床中37℃、220rpm培养2-3h后，每个质粒分别取一管测量OD600的值(如太过澄清则继续培养)，当OD600达到0.5-0.55左右时，分别用0.8mM IPTG诱导4h，培养条件37℃、220rpm；或者用0.8mM IPTG诱导16h，培养条件16℃、180rpm。诱导前每管取100μL菌液保菌；
(4)收集菌体：将诱导完成的菌液收集到2mL EP管中，用高速离心机12000rpm、4℃离心5min，弃去上清，得到菌体；
(5)超声破碎：在2ml EP管中取1mL的菌液重悬菌体。选择2mm变幅杆、功率150W、破菌时间3s、间隔时间3s，总时长3min。完成后12000rpm离心8min得到上清液和包涵体。包涵体使用200μL纯水润洗掉包涵体上残留的上清液，弃掉润洗液之后使用150μL 8M尿素将包涵体吹打混匀使之溶解，无需离心；
(6)制样：上清液与6×Loading Buffer 5：1混合制样(50μL：10μL)，包涵体与2×Loading Buffer 1：1混合制样(20μL：20μL)；
(7)SDS-PAGE凝胶电泳：将制好的样品与牛血清白蛋白(BSA)、Maeker、阳性对照、阴性对照一起进行SDS-PAGE凝胶电泳，质粒1-2的电泳结果分别如图4-5所示。
由图中可知，质粒1表达的蛋白大小为44KDa，37℃小试表达时目的蛋白条带集中表达在包涵体中，16℃小试表达上清液、包涵体有较浅目的蛋白条带表达，因此选取16℃进行后续的扩大培养。质粒2蛋白大小约44KDa，37℃与16℃小试上清液和包涵体中均有明显目的蛋白条带表达，选取16℃进行扩大培养。
三、大量表达与纯化
由于GP5蛋白是一种约25kDa的糖基化包膜蛋白，且两次跨膜区域疏水性较高，在普通的缓冲液中很难保持正确的构象，可以通过添加去垢剂解决该问题，去垢剂广泛应用于膜蛋白的提取、增溶、纯化、理化性质及结构研究。本实施例中选取以下去垢剂促进对GP5蛋白的增溶、纯化。CHAPS是一种用于膜生物化学的非变性两性离子洗涤剂，可用于溶解膜蛋白以及打断蛋白-蛋白相互作用，可通过透析从样品中除去，它也适合在等电聚焦和二维电泳中用于溶解蛋白质。Triton X-100是一种比较温和的去垢剂、表面活性剂或称界面活性剂，常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。Triton X-100与CHAPS去垢剂一起使用来纯化膜蛋白，更有利于使膜蛋白保持其天然构象。
3.1、阳性菌株扩大培养与诱导
取出小摇测试表达正确的菌液按1％接种量接种于1mL LB培养液中过夜活化，之后取活化的菌液20μL接种于300mL LB培养液中扩大培养，LB培养液中加入有300μL相应的抗生素，37℃、220rpm培养3-4h，至菌液OD600在0.45-0.55之间，加入对应体积的诱导剂IPTG，并记下加入诱导剂的时间，诱导3-4h，诱导温度和时间、OD600、IPTG浓度可根据第一次的表达结果合理调整诱导条件，从而获得较高质量的蛋白。将诱导完成的菌液转移至干燥的500mL离心瓶中，3900rpm离心10min，弃上清，菌体-20℃冰柜保存。
3.2、超声破菌
质粒1破碎方法：
取30mL His标签蛋白破菌液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl(等渗体系)和1mM AEBSF(蛋白酶抑制剂))悬浮菌体，之后超声破碎细胞。
第一次破碎：将悬浮完成的菌液转移至50mL圆底离心管，放入冰盒中，用冰固定，选择6号变幅杆、功率350W、破菌时间3s、间隔时间3s，计时5min，之后置于冰水混合物中冷却5min，再重复上述步骤破菌15min。完成后分装到两支离心管中于9000rpm离心10min得到上清1和沉淀。
第二次破碎：取30mL破菌液(50mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)、0.1mmol/L EDTA、5％甘油、0.1mmol/L DTT、0.1mol/L氯化钠和2M尿素)倒入沉淀中，吹匀沉淀，转移至50mL的圆底离心管中，功率350W、破菌时间3s、间隔时间3s，计时5min(菌液置于冰块中)，9000rpm离心10min得到上清2和包涵体。
包涵体处理：加入6mL纯水悬浮包涵体，分装到4个2mL的离心管中，12000rpm离心2min，弃上清。选取其中一管加入1.5mL 8M的尿素-PBS缓冲液，用巴氏吸管吹打均匀后，在小型振荡器上振荡30min，促其溶解，12000rpm离心1min，上清转移至新的2mL EP管中。
将上述得到的上清1和上清2用Loading Buffer做2倍稀释，包涵体做2倍、5倍和10倍稀释，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，质粒1的电泳结果见图6。
由图可知，质粒1表达之后的蛋白大小为44KDa，上清中无明显目的蛋白条带表达，主要集中在包涵体中，故不再继续后续实验。
质粒2破碎方法：
取30mL蛋白破菌液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl(等渗体系)、1mM AEBSF(蛋白酶抑制剂)、1mM EDTA(变性剂和稳定剂)、1％ Triton X-100(破坏细胞)和0.1％CHAPS(蛋白洗涤剂))悬浮菌体，之后超声破碎细胞。
第一次破碎：将悬浮完成的菌液转移至50mL圆底离心管，放入冰盒中，用冰固定，选择6号变幅杆、功率350W、破菌时间3s、间隔时间3s，计时3min，之后置于冰水混合物中冷却3min，再重复上述步骤破菌15min。完成后分装到两支离心管中于9000rpm离心10min得到上清1和沉淀。
第二次破碎：取30mL破菌液(50mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)、0.1mmol/L EDTA、5％甘油、0.1mmol/L DTT、0.1mol/L氯化钠和2M尿素)倒入沉淀中，吹匀沉淀，转移至50mL的圆底离心管中，功率350W、破菌时间3s、间隔时间3s，计时5min(菌液置于冰块中)，9000rpm离心10min得到上清2和包涵体。
包涵体处理：加入6mL纯水悬浮包涵体，分装到4个2mL的离心管中，12000rpm离心2min，弃上清。选取其中一管加入1.5mL 8M的尿素-PBS缓冲液，用巴氏吸管吹打均匀后，在小型振荡器上振荡30min，促其溶解，12000rpm离心1min，上清转移至新的2mL EP管中。
将上述得到的上清1和上清2用Loading Buffer做2倍稀释，包涵体做2倍、5倍和10倍稀释，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，质粒1的电泳结果见图7。
质粒2表达之后的蛋白大小为44KDa，上清1中有明显目的蛋白条带表达，对比质粒1，质粒2的上清表达量明显高于质粒1，之后进行质粒2上清1纯化。
3.3、质粒2上清蛋白纯化
采用Ni-IDA亲和纯化基质预装柱(购自蓝晓，货号：A4023205)纯化，操作流程如下：
(1)用30mL纯水洗去Ni-IDA亲和纯化基质(预装柱2mL)中的乙醇(商品化填料用20％乙醇保存)，用30mL结合缓冲液(Binding Buffer)平衡基质，控制流速为2mL/min，流出液体；
(2)将破菌离心后的上清1(低温4℃保存)与基质在50mL离心管中混合，4℃条件下，在混合培养器上结合45min，将结合后的液体加入到预装柱中，用Washing Buffer洗脱，控制流速为2mL/min，流出液体，收集流穿液；
(3)用20mL洗脱缓冲液(Elution Buffer A)洗脱目的蛋白，控制流速为0.5mL/min，取10mL离心管收集洗脱液15-20mL，取Branford工作液285μL于1.5mL EP管中，加入15μL收集的洗脱液，若液体由褐色变为蓝色，说明有结合的目的蛋白未被洗脱完全，可用更高咪唑浓度(500mM)的Elution Buffer B洗脱目的蛋白；
(4)清洗回收基质，将收集的流穿液及洗脱下来的目的蛋白(各洗脱缓冲液)进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图8所示。
上述提及的缓冲液(Binding Buffer)的配方具体如下：
由图8可知，质粒2表达之后的蛋白大小为44KDa，上清纯化后，收集ElutionBuffer B(500mM咪唑)，通过BCA定量测定蛋白浓度为0.6mg/ml，蛋白纯度为90％；这证明本发明有效获取了可溶性GP5重组蛋白(包括突变型GP5蛋白、GST标签和组氨酸标签)，以该GP5重组蛋白作为免疫原，为下一步GP5蛋白特异性抗体的制备奠定了物质基础。
四、GP5重组蛋白免疫兔源多克隆抗体制备和抗体效价测定
以上述纯化所得的GP5重组蛋白作为免疫原，按照下表所示方式免疫大白兔。
日期 免疫事件
第1天 第一次免疫：多点皮内注射(S.Q.)，按照240μg免疫原/只的剂量免疫动物
第7天 第二次免疫：多点皮内注射(S.Q.)，按照240μg免疫原/只的剂量免疫动物
第14天 第三次免疫：多点皮内注射(S.Q)，按照240μg免疫原/只的剂量免疫动物
第28天 第四次免疫：多点皮内注射(S.Q)，按照240μg免疫原/只的剂量免疫动物
第42天 收集4ml第四次免疫后的血液
在每次加强免疫前采集兔血液，并在第42天时收集第四次免疫的兔血液，分离血清，作为GP5蛋白多抗血清，此外，首次免疫前采集兔血液分离血清，作为后期试验阴性血清对照。
为了验证以上质粒2表达的GP5重组蛋白对抗体的亲和力差异，采用ELISA法检测血清中中和抗体效价，通过在酶标板上包被GP5重组蛋白，并选用此蛋白免疫动物产生的血清作为一抗，选用HRP Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(购自Jackson ImmunoResearch，货号：111-035-045)作为二抗进行ELISA检测分析；
(1)蛋白包被：将质粒2表达的GP5重组蛋白调整至浓度为1μg/mL后，按25μL/well的量包被酶标板，4℃过夜，同时以蛋白稀释液(PBS)做一组空白对照，每孔加100μL样，完成后，盖上铝箔纸，37℃烘箱中温育2h；
(2)洗板：取出已包被好抗原的酶标板，去除孔内液体，向每孔中加入200μL TBST(购自Monad，货号：CR10701S)至其装满但不溢出，整板加完静置3min后，将TBST甩出，再置于干净的吸水毛巾上排干，每板拍6次至无明显液体残留。重复此组操作4次；
(3)封闭：以TBST为缓冲体系，配制质量体积比为3％的脱脂牛奶作为封闭液及一抗稀释液，向每孔加入200μL已配置好的封闭液，盖上铝箔纸，37℃温箱静置1h；
(4)抗体孵育：向每孔中加入等量的一抗(用TBST按1:1000为起始浓度，之后3倍稀释，8个梯度，室温孵育1h)，加好一抗后，37℃温箱静置孵育2h或4℃过夜，之后洗板(同操作(2))，将二抗用TBST按1：5000稀释，然后每孔加100μL，37℃温箱静置孵育1h，之后洗板(同操作(2))；
(5)显色与终止：向酶标板每孔加入底物显色液(购自湖州英创生物科技)100μL，加盖，静置反应5min，显色5min后，每孔中加入终止液(700mM草酸溶液)100μL用于终止反应。
在上述反应终止后，拍照记录ELISA酶标板颜色结果，然后将酶标板板放入酶标仪中，测定OD值，结果如图9所示，其中横坐标表示血清稀释倍数，纵坐标表示OD450，图注prebleed表示免疫前血清，bleed I至bleed IV表示第一次至第四次免疫后的血清，NC表示空白对照。
从图中可以看出，本发明提供的GP5重组蛋白的免疫原性好，通过免疫，兔血清中产生了中和抗体，且随着免疫次数增加，中和抗体滴度越高。以多克隆抗体的最高稀释度为多克隆抗体的效价，纯化后的GP5重组蛋白的多克隆抗体效价可达1：243000。本发明的实施为PRRSV病毒的GP5蛋白作为免疫原的研究提供了借鉴。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种突变型GP5蛋白，其特征在于，所述突变型GP5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种编码基因，其特征在于，用于编码如权利要求1所述的突变型GP5蛋白。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，编码所述突变型GP5蛋白的基因如SEQID NO：2所示。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括编码如权利要求1所述的突变型GP5蛋白的基因。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括编码谷胱甘肽巯基转移酶标签的基因，编码所述谷胱甘肽巯基转移酶标签的基因位于编码所述突变型GP5蛋白的基因的上游。
6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括编码组氨酸标签的基因，编码所述组氨酸标签的基因位于编码所述突变型GP5蛋白的基因的下游。
7.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，构建所述表达载体所用的出发载体为pGEX-4T-1。
8.如权利要求2-3任一项所述的编码基因或者如权利要求4-7任一项所述的表达载体在制备GP5重组蛋白或特异性结合GP5蛋白的抗体中的应用。
9.一种GP5重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将如权利要求4-7任一项所述的表达载体导入大肠杆菌中，培养转化后的所述大肠杆菌；
S2、收集转化后的所述大肠杆菌，进行纯化，得到GP5重组蛋白。
10.一种特异性结合GP5蛋白的抗体的制备方法，其特征在于，以如权利要求1所述的突变型GP5蛋白或如权利要求9制备得到的所述GP5重组蛋白为免疫原，免疫动物，收集动物血清，纯化得到抗体。
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