CN115820704B

CN115820704B - 表达蛋白l的重组质粒及其应用与重组蛋白l的表达方法

Info

Publication number: CN115820704B
Application number: CN202211655778.7A
Authority: CN
Inventors: 余乐; 盛鑫龙; 程威; 程索; 郭年华; 李嘉琪
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Priority date: 2022-12-22
Filing date: 2022-12-22
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-12-22
Also published as: CN115820704A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种表达蛋白L的重组质粒及其应用与重组蛋白L的表达方法。所述表达蛋白L的重组质粒包括表达质粒和用于编码重组蛋白L的基因序列，所述重组蛋白L包括从N端到C端依次连接的组氨酸标签、生物素标签、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸。本发明通过选取蛋白L的120‑470aa，在其C端添加半胱氨酸使得表达之后的重组蛋白L的分子间可形成二硫键，有助于形成二聚体结构，进而提高重组蛋白L与免疫球蛋白结合力，对于免疫球蛋白具有更高的亲和力和更广的亚型结合范围，而且通过添加组氨酸标签和生物素标签有利于实现蛋白L的高表达和亲和纯化，重组蛋白L表达量高和亲和力得到了显著提高。

Description

表达蛋白L的重组质粒及其应用与重组蛋白L的表达方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种表达蛋白L的重组质粒及其应用与重组蛋白L的表达方法。

背景技术

蛋白L（Protein L）或蛋白质L是是从马格努斯消化链球菌分离出来的能和免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）特异性结合的蛋白，分子量约36kDa，与Protein A和Protein G结合到免疫球蛋白的可结晶片段（fragment crystallizable，Fc段）不同的是，Protein L是通过与免疫球蛋白的kappa（k）轻链相互作用结合到免疫球蛋白上，其结合免疫球蛋白后，不影响免疫球蛋白与抗原结合。因为重链的任何部分都不会参与结合相互作用，相对于Protein A 和Protein G等其它抗体结合蛋白，Protein L具有更广的免疫球蛋白和免疫球蛋白亚型结合范围，能与更广泛的含有kappa轻链的免疫球蛋白类结合，不仅可以结合所有的Ig（包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD），也可以结合单链抗体、抗原结合片段（Fabs）、单链可变片段（scFv）和结构域抗体（Dabs）。因此，蛋白L被广泛应用于免疫球蛋白的纯化领域，是亲和层析和抗体固定化的有利工具。

目前，有一些研究报道了蛋白L相关蛋白质序列，但如何设计更为有效的表达区域以提高蛋白L的表达量的研究较少。且市场上销售蛋白L的厂家少，主要有金斯瑞的ProteinL Resin，Biovision的Recombinant Protein L，但这些试剂的蛋白L的来源不稳定，与免疫球蛋白的亲和力不强，且制备成本费用较高。因此，优化蛋白L的表达方法，提高其表达量甚至提高其与下游蛋白如免疫球蛋白的结合能力是当前急需解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种表达蛋白L的重组质粒及其应用，并提供了利用该表达蛋白L的重组质粒进行重组蛋白L的表达方法，以解决现有技术中蛋白L表达量低和/或与免疫球蛋白亲和力低的技术问题。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的第一方面提供了一种表达蛋白L的重组质粒，包括表达质粒和插入到所述表达质粒中用于编码重组蛋白L的基因序列，所述重组蛋白L包括从N端到C端依次连接的组氨酸标签、生物素标签、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸，其中，所述重组蛋白L的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，编码所述重组蛋白L的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，所述重组蛋白L包括从N端到C端依次连接的组氨酸标签、生物素标签、半胱氨酸、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸。

进一步地，所述表达载体包括pET-28a或pET-21a。

本发明的第二方面提供了如上所述的表达蛋白L的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

S1、将编码组氨酸标签、生物素标签、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸的基因序列连接，得到编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的目的基因；

S2、将所述目的基因插入到表达载体的多克隆位点，构建所述蛋白L的C端含有一个半胱氨酸的重组质粒。

进一步地，步骤S1包括：人工合成编码组氨酸标签、生物素标签、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸的基因序列，将合成的所述基因序列克隆至pUC57载体上，以插入有所述基因序列的所述pUC57载体为模板，利用如SEQ ID NO：4-5所示引物或者SEQ ID NO：6-7所示引物进行扩增，得到编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的所述目的基因，所述目的基因的基因序列如SEQ ID NO：2所示；当所述表达载体为pET-21a时，采用如SEQ ID NO：4-5所示引物，当所述表达载体为pET-28a时，采用如SEQ ID NO：6-7所示引物。

进一步地，步骤S2包括：将所述表达载体采用限制性核酸内切酶进行双酶切，得到线性化的所述表达质粒，之后将线性化的所述表达质粒与所述目的基因连接，构建所述蛋白L的C端含有一个半胱氨酸的重组质粒。

进一步地，在步骤S2之后还包括步骤S3，具体操作如下：

S3、以步骤S2得到的所述蛋白L的C端含有一个半胱氨酸的重组质粒作为模板，利用如SEQ ID NO：10-11所示引物进行扩增，之后采用限制性内酶切进行单酶切，酶切之后自连，得到所述蛋白L的N端和C端均含有一个半胱氨酸的重组质粒。

本发明的第三方面提供了如上所述的表达蛋白L的重组质粒在制备重组蛋白L中的应用。

本发明的第四方面提供了一种重组蛋白L的表达方法，包括以下步骤：

利用如上所述的表达蛋白L的重组质粒转染宿主细胞，培养转染后的所述宿主细胞，收集菌体，破碎细胞之后纯化得到重组蛋白L。

进一步地，所述宿主细胞包括大肠杆菌。

本发明的优点及积极效果为：

本发明选取了蛋白L的特定序列（120-470aa），通过在其C端添加半胱氨酸使得表达之后的重组蛋白L的分子间可形成二硫键，有助于形成二聚体结构，二聚体结构更有利于重组蛋白L与免疫球蛋白结合，对于免疫球蛋白具有更高的亲和力和更广的亚型结合范围，而且通过添加组氨酸标签和生物素标签有利于实现蛋白L的高表达和亲和纯化。通过本发明的技术，得到了高效表达的重组蛋白L，其表达量高和亲和力得到了显著提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1构建质粒1时的目的基因扩增结果图；

图2为本发明实施例1构建质粒2时的目的基因扩增结果图；

图3为本发明实施例1构建质粒1时的菌落验证阳性克隆的电泳图；

图4为本发明实施例1构建质粒2时的菌落验证阳性克隆的电泳图；

图5为本发明实施例1质粒1诱导表达重组蛋白表达的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图6为本发明实施例1质粒2诱导表达重组蛋白表达的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图7为本发明实施例1质粒3诱导表达重组蛋白表达的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图8为本发明实施例1质粒4诱导表达重组蛋白表达的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图9为本发明实施例1质粒1（左图）和质粒2（右图）诱导表达的破细胞上清和包涵体的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图10为本发明实施例1质粒1（左图）和质粒2（右图）诱导表达的破细胞上清纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图11为本发明实施例2构建质粒5时的目的基因扩增结果图；

图12为本发明实施例2质粒5诱导表达重组蛋白表达的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图13为本发明实施例2质粒5诱导表达的破细胞上清纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图14为本发明实施例3采用ELISA法检测重组蛋白L的抗体亲和力结果图。

实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

本发明实施例提供了一种表达蛋白L的重组质粒，包括表达质粒和插入到所述表达质粒中用于编码重组蛋白L的基因序列，所述重组蛋白L包括从N端到C端依次连接的组氨酸标签、生物素标签、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸，其中，所述重组蛋白L的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明中，根据分析蛋白L氨基酸性质及蛋白L二级和三级结构，选择最适合用于表达的氨基酸区域，具体为蛋白L第120至470（含）氨基酸，为描述方便以下简称蛋白L（120-470aa），并在其N端依次添加组氨酸标签（6×His标签）和生物素标签（AVI标签）、在C端添加一个半胱氨酸构建重组蛋白L表达盒，即重组质粒的插入片段按5’端向3’端，依次连接编码组氨酸的基因序列、编码生物素标签的基因序列、编码蛋白L（120-470aa）的基因序列和编码半胱氨酸的基因序列，重组质粒表达之后，得到的重组蛋白L按N端向C端为依次连接的组氨酸标签、生物素标签和蛋白L（120-470aa）和半胱氨酸，其中，6×His标签用于蛋白L的分离纯化，有利于得到高纯度的蛋白L，紧接着的AVI标签可用于蛋白L的生物素化，适用于进行化学发光检测，最后为蛋白L的蛋白序列和一个半胱氨酸，半胱氨酸有利于在蛋白L之间形成二硫键，进而形成蛋白L二聚体结构，提高其与免疫球蛋白结合能力，对于免疫球蛋白具有更高的亲和力和更广的亚型结合范围，更有利于进行蛋白标记并应用到不同的场景。本发明的实施为得到高表达量和高亲和力的蛋白L提供了参考依据。

可选地，上述所述的编码所述重组蛋白L的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

为了更好地形成二聚体甚至多聚体结构，优选地，所述重组蛋白L包括从N端到C端依次连接的组氨酸标签（6×His标签）、生物素标签（AVI标签）、半胱氨酸、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸。此时重组蛋白L的氨基酸序列为在SEQ ID NO：1所示序列的基础上，在AVI标签和蛋白L（120-470aa）之间添加一个半光氨酸（简称C）；同理，编码重组蛋白L的基因序列为在SEQ ID NO：2所示序列的基础上，在编码AVI标签的基因序列和编码蛋白L（120-470aa）的基因序列之间添加一个编码半光氨酸的密码子序列，具体为TGT，在此不再重复展示前述相关序列。

可选地，所述表达载体包括pET-28a或pET-21a。

基于相同的发明构思，本发明另一实施例提供了如上所述的表达蛋白L的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

所述表达蛋白L的重组质粒的构建方法相对于现有技术的优势与如上所述的表达蛋白L的重组质粒相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

可选地，步骤S1包括：人工合成编码组氨酸标签、生物素标签、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸的基因序列，将合成的所述基因序列克隆至pUC57载体上，以插入有所述基因序列的所述pUC57载体为模板，利用如SEQ ID NO：4-5所示引物或者SEQ ID NO：6-7所示引物进行扩增，得到编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的所述目的基因，所述目的基因序列如SEQ ID NO：2所示。具体而言，当表达载体为pET-21a时，采用SEQ ID NO：4-5所示引物，当表达载体为pET-28a时，采用SEQ ID NO：6-7所示引物。

可选地，步骤S2包括：将所述表达载体采用限制性核酸内切酶进行双酶切，得到线性化的所述表达质粒，之后将线性化的所述表达质粒与所述目的基因连接，构建所述蛋白L的C端含有一个半胱氨酸的重组质粒。

在步骤S2之后还包括步骤S3，具体操作如下：

基于相同的发明构思，本发明又一实施例提供了如上所述的表达蛋白L的重组质粒在制备重组蛋白L中的应用。具体的，一种重组蛋白L的表达方法，包括以下步骤：

利用上述所述的重组质粒转染宿主细胞，培养转染后的所述宿主细胞，收集菌体，破碎细胞之后纯化得到重组蛋白L。

在本实施例中，将上述所述的重组质粒转染宿主细胞后，通过本领域的常规方法培养上述的宿主细胞和破碎宿主细胞，可分离纯化得到高纯度、高浓度的重组蛋白L。

需要注意的是，重组蛋白L从N端到C端，其结构式为：组氨酸标签-生物素标签-蛋白L（120-470aa）-半胱氨酸，或者为：半胱氨酸-组氨酸标签-生物素标签-蛋白L（120-470aa）-半胱氨酸。需要说明的是，由于添加了半胱氨酸促进分子间二硫键的形成，分离得到的蛋白L不仅包括单聚体的形式（分子量为38KDa）也包括二聚体（分子量约为66KDa）的形式。所述重组蛋白L的表达方法相对于现有技术的优势与如上所述的表达蛋白L的重组质粒相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

具体地，所述宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

具体地，所述纯化方法为亲和纯化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。

蛋白L全长氨基酸序列见SEQ ID NO：3，截取其中第120位（含）至470位（含）氨基酸共351个氨基酸作为表达区域，并在其N端组氨酸标签（6×His标签）、生物素标签（AVI标签），在C端添加一个半胱氨酸（简称C），全基因合成后克隆到pUC57载体上，命名为pUC57-protein L，以此为模板进行PCR扩增，得到编码重组蛋白L的目的基因，之后将目的基因分别构建到表达载体pET-21a和pET-28a上，得到质粒1和质粒2。同时，以pUC57-protein L质粒为模板进行PCR扩增，分别构建C端不带半胱氨酸的目的基因到pET-21a和pET-28a载体上，得到质粒3和质粒4。

其中，编码重组蛋白L的目的基因的氨基酸和核酸序列如下：

需要注意的是，C端不带半胱氨酸的目的基因与上述SEQ ID NO：1-2所示序列的区别仅在于相应位置缺失半胱氨酸或编码半胱氨酸的基因序列（上述序列阴影部分指示区域），因此，不再重复展示相关序列。

质粒1-4的具体构建过程如下：

使用Primer 5进行引物设计，引物序列为：

以上述引物、采用RK20705试剂盒（购自ABclonal）分别进行PCR扩增，PCR体系（总计50μL）：Gloria High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 25μL、ddH₂O 17μL、pUC57-protein L模板1.5μL、上/下游引物2.5+2.5μL、二甲基亚砜（DMSO） 1.5μL。PCR扩增反应程序设置：98℃变性5min，（98℃解链20s、60℃退火30s、72℃延伸1min，延伸速率2kb/1min）×30cycLe，72℃延伸10min。

PCR反应完成后，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证（见图1-2），可以看到质粒1-2具有1122bp的单一条带，质粒3-4具有1119bp的单一条带，说明前述步骤得到了纯的目的基因，之后采用康为世纪琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（货号：CW2302）回收目的条带，分别得到质粒1、质粒2、质粒3和质粒4的目的片段。

将上述纯化的目的基因采用同源重组的方式与酶切后的表达载体进行连接。

pET-21a载体的酶切体系（总计50 μL）：pET-21a载体20μL、ddH₂O 20μL、10×Buffer（B） 5μL、BamHI内切酶（购自ABclonal、货号：RK21101） 2.5μL、HindIII内切酶（购自ABclonal，货号：RK21108） 2.5μL。

pET-28a载体的酶切体系（总计50 μL）：pET-28a载体20μL、ddH₂O 20μL、10×Buffer（B） 5μL、NcoI内切酶（购自ABclonal，货号：RK21115） 2.5μL、BamHI内切酶（购自ABclonal，货号：RK21101） 2.5μL。分别在37℃反应3h，得到酶切后的表达载体。

质粒1和质粒3连接体系（总计10μL）：质粒1/质粒3目的片段2μL、酶切后pET-21a载体3μL、2× MultiF Seamless Assembly Mix（购自ABclonal，货号：RK21020） 5μL。

质粒2和质粒4连接体系（总计10μL）：质粒2/质粒4目的片段2μL、酶切后pET-28a载体3μL、2× MultiF Seamless Assembly Mix（购自ABclonal，货号：RK21020） 5μL。

在连接过程中，目的片段与载体比例根据回收后的浓度决定，摩尔比范围为3-10:1。

将各连接产物10μL全部转入DH5α感受态细胞，经过冰浴、热激、复苏及过夜培养后采用通用引物T7进行菌落PCR鉴定，结果见图3-4，可见看到质粒1-4均成功转入大肠杆菌。

取菌落PCR鉴定中的阳性克隆采用载体通用引物进行测序验证（测序公司：武汉金开瑞生物科技有限公司），测序正确后的重组质粒用于后续的蛋白表达。

（1）培养基分装：从冰箱中取出已经添加相应抗生素的液体培养基，将培养基分装到灭菌的10mL EP管中，每管3mL，每个质粒分四管，一管用于测OD值，三管用于诱导表达；

（2）挑取单菌落：使用10μL枪头挑取平板上的单菌落接种入相应装有培养基的10mL EP管中，尽量保证挑取的单菌落形态大小均一；

（3）菌液保存和诱导：将接种后的培养基放入摇床中37℃、220rpm培养2-3h后，每个质粒分别取一管测量OD₆₀₀的值（如太过澄清则继续培养），当OD₆₀₀达到0.5-0.55左右时，分别用0.8mM IPTG诱导4h，培养条件37℃、220rpm；或者用0.8mM IPTG诱导16h，培养条件16℃、180rpm。诱导前每管取100μL菌液保菌；

（4）收集菌体：将诱导完成的菌液收集到2mL EP管中，用高速离心机12000 rpm 4℃离心5min，弃去上清，得到菌体；

（5）超声破碎：在2ml EP管中取1mL的菌液重悬菌体。选择2mm变幅杆、功率150W、破菌时间3s、间隔时间3s，总时长3min。完成后12000rpm离心8min得到上清液和包涵体。包涵体使用200µL纯水润洗掉包涵体上残留的上清液，弃掉润洗液之后使用150µL 8M尿素将包涵体吹打混匀使之溶解，无需离心；

（6）制样：上清液与6× Loading Buffer 5：1混合制样（50µL：10µL），包涵体与2×Loading Buffer 1：1混合制样（20µL：20µL）；

（7）SDS-PAGE凝胶电泳：将制好的样品与牛血清白蛋白（BSA）、Maeker、阳性对照、阴性对照一起进行SDS-PAGE凝胶电泳，质粒1-4的电泳结果分别如图5-8所示。

由图可知，PET-21a-Protein L（120-470）C端带半胱氨酸（质粒1）蛋白大小38KDa，37℃小试表达目的蛋白条带较弱，16℃小试表达上清、包涵体均有明显目的蛋白条带表达，选取16℃进行扩大培养。而PET-21a-Protein L（120-470）C端不带半胱氨酸（质粒3）蛋白大小38KDa，37℃与16℃小试均无明显目的蛋白条带表达，不做扩大培养。PET-28a-Protein L（120-470）C端带半胱氨酸（质粒2）蛋白大小38KDa，37℃小试包涵体中有明显目的蛋白条带表达、16℃上清和包涵体中均有明显目的蛋白条带表达，选取16℃进行扩大培养。PET-28a-Protein L（120-470）C端不带半胱氨酸（质粒4）蛋白大小38KDa，37℃与16℃小试均无明显目的蛋白条带表达，不做扩大培养。

取出小摇测试表达正确的菌液按1%接种量接种于1mL LB培养液中过夜活化，之后取活化的菌液20µL接种于300mL LB培养液中扩大培养，LB培养液中加入有300µL相应的抗生素，37℃、220rpm培养3-4h，至菌液OD₆₀₀在0.45-0.55之间，加入对应体积的诱导剂IPTG，并记下加入诱导剂的时间，诱导3-4h，诱导温度和时间、OD₆₀₀、IPTG浓度可根据第一次的表达结果合理调整诱导条件，从而获得较高质量的蛋白。将诱导完成的菌液转移至干燥的500mL离心瓶中，3900rpm离心10min，弃上清，菌体-20℃冰柜保存。

取30mL HIS标签蛋白破菌液悬浮菌体，之后超声破碎细胞。

第一次破碎：将悬浮完成的菌液转移至50mL圆底离心管，放入冰盒中，用冰固定，选择6号变幅杆、功率350W、破菌时间3s、间隔时间3s，计时5min，之后置于冰水混合物中冷却5min，再重复上述步骤破菌5min。完成后分装到两支离心管中于9000rpm离心10min得到上清1和沉淀。

第二次破碎：取30mL破菌液（含2M尿素）倒入沉淀中，吹匀沉淀，转移至50mL的圆底离心管中，功率350W、破菌时间3s、间隔时间3s，计时5min（菌液置于冰块中），9000rpm离心10min得到上清2和包涵体。

包涵体处理：加入6mL纯水悬浮包涵体，分装到4个2mL的离心管中，12000rpm离心2min，弃上清。选取其中一管加入1.5mL 8M的尿素-PBS缓冲液，用巴氏吸管吹打均匀后，在小型振荡器上振荡30min，促其溶解，12000rpm离心1min，上清转移至新的2mL EP管中。

将上述得到的上清1和上清2用Loading Buffer做2倍稀释，包涵体做2倍、5倍和10倍稀释，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，质粒1-2的电泳结果分别见图9中的左图和右图。

由图可知，质粒1表达之后的蛋白大小为38KDa，上清中有明显目的蛋白条带表达，聚体带表现不明显，后续尝试做上清1纯化。质粒2表达之后的蛋白大小为38KDa，上清中有明显目的蛋白条带表达且有明显聚体带，后续尝试做上清1纯化。

采用Ni-IDA亲和纯化基质预装柱（购自蓝晓，货号：A4023205）纯化，操作流程如下：

（1）用30mL纯水洗去Ni-IDA亲和纯化基质（预装柱2mL）中的乙醇（商品化填料用20%乙醇保存），向基质中加入10mL 0.2M硫酸镍溶液，用巴氏吸管温和混匀后静置10min，控制流速为2mL/min，流出液体，之后用30mL纯水洗去残留的硫酸镍，用30mL结合缓冲液（Binding Buffer）平衡基质，控制流速为2mL/min，流出液体；

（2）将破菌离心后的上清（低温4℃保存）与基质在50mL离心管中混合，4℃条件下，在混合培养器上结合45min，将结合后的液体加入到预装柱中，用Washing Buffer洗脱，控制流速为2mL/min，流出液体，收集流穿液；

（3）用20mL洗脱缓冲液（Elution Buffer A）洗脱目的蛋白，控制流速为0.5mL/min，取10mL离心管收集洗脱液15-20mL，取Branford工作液285μL于1.5ML EP管中，加入15μL收集的洗脱液，若液体由褐色变为蓝色，说明有结合的目的蛋白未被洗脱完全，可用更高咪唑浓度（500mM）的Elution Buffer B洗脱目的蛋白；

（4）清洗回收基质，将收集的流穿液及洗脱下来的目的蛋白进行透析换液，之后进行SDS-PAGE凝胶电泳，质粒1-2的电泳结果分别见图10中的左图和右图。

上述提及的缓冲液（Binding Buffer）的配方具体如下：

将BSA、Marker、纯化后的上清以及纯化还原后的上清（还原剂为DTT）进行电泳，判断洗脱液中蛋白的量。

由图10可知，质粒1表达之后得到了大量的Protein L蛋白，其表达量高，且上清纯化中有二聚体条带，经检测蛋白浓度为1mg/mL，纯度高达85%。质粒2上清纯化纯度高且有明显聚体表现，经检测蛋白浓度为0.2mg/mL，纯度高达95%。

综上，本发明选取了Protein L蛋白的特定序列（120-470aa），并通过在其C端添加半胱氨酸使得分子间形成了二硫键，得到了二聚体的结构，二聚体的结构更有利与免疫球蛋白的结合，而且通过添加组氨酸标签和生物素标签有利于实现Protein L蛋白的高表达和亲和纯化。

以实施例1中的质粒2为模板利用下述引物反向扩增全长，以在蛋白L（120-470aa）的N端增加一个半胱氨酸C，得到质粒5。需要注意的是，N端带半胱氨酸的氨基酸序列和基因序列与上述SEQ ID NO：1-2所示序列的区别仅在于相应位置增加半胱氨酸或编码半胱氨酸的基因序列，因此，不再重复展示相关序列。引物序列（阴影部分指示半胱氨酸编码基因）为：

以上述引物进行PCR扩增，PCR体系（总计50μL）：PrimeSTAR® Max DNAPolymerase（购自Takara，货号：R045B（A×4）） 25μL、ddH₂O 22μL、质粒1模板1μL、上/下游引物1+1μL。PCR扩增反应程序设置：98℃变性4min，（94℃解链40s、58℃退火30s、72℃延伸1min，延伸速率2kb/1min）×35cycLe，72℃延伸10min。

PCR反应完成后，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证（见图11），可以看到扩增得到大于5000bp的单一条带，说明前述步骤得到了纯的线性化质粒，将得到的PCR产物用DpnI（购自ABclonal，货号：RK21109）进行消化，50μL体系如下：DpnI内切酶0.5-1μL、PCR产物1μg、10×Buffer CutS 5μL、ddH₂O补足至50μL。37℃孵育5-15min后转化到DH5α感受态细胞进行阳性克隆筛选，并用通用引物T7ter进行测序，经过冰浴、热激、复苏及过夜培养后采用通用引物T7进行测序验证（测序公司：武汉金开瑞生物科技有限公司），测序正确后的重组质粒5用于后续的蛋白表达。

取质粒5表达正确的菌液按1%接种量接种于2mL LB培养液中过夜活化，之后取活化的菌液20µL接种于300mL LB培养液中扩大培养，LB培养液中加入有300µL相应的抗生素（kan：0.05mg/mL，Chl：0.034mg/mL），37℃、220rpm培养3-4h，至菌液OD600在0.45-0.55之间，加入0.8mM诱导剂IPTG，16℃、220rpm培养16h。将诱导完成的菌液收集到500mL离心瓶中，4000rpm离心10min，弃上清，得到菌体。之后超声破碎细胞。

包涵体处理：添加8M的尿素-PBS缓冲液，用巴氏吸管吹打均匀后，在小型振荡器上振荡30min，促其溶解，12000rpm离心1min，上清转移至新的2mL EP管中。

将上述得到的上清1、上清2和包涵体分别制样后进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图12所示。

由图中可知，质粒5表达的蛋白大小为38KDa，主要表达在上清中且有明显的二聚体条带，其相比于质粒2的表达结果，二聚体结构形式更为显著，这说明通过在Protein L蛋白上添加半胱氨酸能显著增加二聚体的形成，且在其序列N端与C端分别添加半胱氨酸的效果要好于仅在C端添加半胱氨酸。

采用与实施例1相同的方法（参见3.3、蛋白纯化）对上清1进行纯化，纯化后产物进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如13所示。质粒5表达的蛋白浓度约为0.8mg/mL，纯度为95%，且能形成二聚体，相比于仅在C端添加半胱氨酸情况下，N端与C端分别添加半胱氨酸不仅使得蛋白L表达量提高，且增加了二聚体量。

为了验证以上三种不同的质粒2、质粒4和质粒5表达的重组蛋白L对抗体的亲和力差异，通过在酶标板上包被不同浓度的Protein L，并选用重组表达抗体（购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号：68045-R118）作为一抗，选用Peroxidase AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG（H+L）（购自jacksonimmuno，货号：111-035-045）作为二抗进行ELISA检测实验分析；

（1）蛋白包被：将以上三种质粒表达纯化的蛋白至1μg/mL后，依次做1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64梯度的稀释液，将梯度稀释的三种蛋白按浓度大小从左向右加入ELISA酶标板孔底部，同时以蛋白稀释液（PBS）做一组空白对照，每孔加100μL样，完成后，盖上铝箔纸，37℃烘箱中温育2h；

（2）洗板：取出已包被好抗原的酶标板，去除孔内液体，向每孔中加入200μL TBST（购自Monad，货号：CR10701S）至其装满但不溢出，整板加完静置3min后，将TBST甩出，再置于干净的吸水毛巾上排干，每板拍6次至无明显液体残留。重复此组操作4次；

（3）封闭：以TBST为缓冲体系，配制质量体积比为3%的脱脂牛奶作为封闭液及一抗稀释液，向每孔加入200μL已配置好的封闭液，盖上铝箔纸，37℃温箱静置1h；

（4）抗体孵育：向每孔中加入等量的一抗，加好一抗后，37℃温箱静置孵育2h或4℃过夜，之后洗板（同操作（2）），将二抗用TBST按1:5000稀释，然后每孔加100μL，37℃温箱静置孵育1h，之后洗板（同操作（2））；

（5）显色与终止：向酶标板每孔加入底物显色液（湖州英创生物科技）100μL，加盖，静置反应5min，显色5min后，每孔中加入终止液（700mM草酸溶液）100μL用于终止反应。

在上述反应终止后，拍照记录ELISA酶标板颜色结果，然后将酶标板板放入酶标仪中，测定OD值，结果如图14所示。

由图14可知，质粒2和质粒5所表达的蛋白L（120-470aa）的吸光度（OD_450-620）高于质粒4，表明在蛋白L的序列末端添加半胱氨酸可以促进其与免疫球蛋白IgG的结合力度，且N端与C端均添加半胱氨酸相较于C端添加能显著提高蛋白L间形成二聚体的能力从而增加其对抗体的结合力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种表达蛋白L的重组质粒，其特征在于，包括表达质粒和插入到所述表达质粒中用于编码重组蛋白L的基因序列，所述重组蛋白L包括从N端到C端依次连接的组氨酸标签、生物素标签、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸，其中，所述重组蛋白L的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2. 根据权利要求1所述的表达蛋白L的重组质粒，其特征在于，编码所述重组蛋白L的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的表达蛋白L的重组质粒，其特征在于，所述表达载体包括pET-28a或pET-21a。

4. 一种表达蛋白L的重组质粒，其特征在于，包括表达质粒和插入到所述表达质粒中用于编码重组蛋白L的基因序列，所述重组蛋白L包括从N端到C端依次连接的组氨酸标签、生物素标签、半胱氨酸、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸，其中，所述重组蛋白L的氨基酸序列由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在第22位和第23位氨基酸之间添加C形成。

5.根据权利要求4所述的表达蛋白L的重组质粒，其特征在于，所述表达载体包括pET-28a或pET-21a。

6.一种表达蛋白L的重组质粒的构建方法，其特征在于，用于构建如权利要求1-3任一项所述的表达蛋白L的重组质粒，包括以下步骤：

7. 根据权利要求6所述的表达蛋白L的重组质粒的构建方法，其特征在于，步骤S1包括：人工合成编码组氨酸标签、生物素标签、蛋白L第120至470氨基酸和半胱氨酸的基因序列，将合成的所述基因序列克隆至pUC57载体上，以插入有所述基因序列的所述pUC57载体为模板，利用如SEQ ID NO：4-5所示引物或者SEQ ID NO：6-7所示引物进行扩增，得到编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的所述目的基因，所述目的基因的基因序列如SEQ ID NO：2所示；

当所述表达载体为pET-21a时，采用如SEQ ID NO：4-5所示引物，当所述表达载体为pET-28a时，采用如SEQ ID NO：6-7所示引物。

8.根据权利要求6所述的表达蛋白L的重组质粒的构建方法，其特征在于，步骤S2包括：将所述表达载体采用限制性核酸内切酶进行双酶切，得到线性化的所述表达质粒，之后将线性化的所述表达质粒与所述目的基因连接，构建所述蛋白L的C端含有一个半胱氨酸的重组质粒。

9.一种表达蛋白L的重组质粒的构建方法，其特征在于，用于构建如权利要求4-5任一项所述的表达蛋白L的重组质粒，包括以下步骤：

S2、将所述目的基因插入到表达载体的多克隆位点，构建所述蛋白L的C端含有一个半胱氨酸的重组质粒；

10.如权利要求1-5任一项所述的表达蛋白L的重组质粒在制备重组蛋白L中的应用。

11.一种重组蛋白L的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用如权利要求1-5任一项所述的表达蛋白L的重组质粒转染宿主细胞，培养转染后的所述宿主细胞，收集菌体，破碎细胞之后纯化得到重组蛋白L。