CN104818283B

CN104818283B - 一种优化的猪干扰素‑α8基因及其表达方法

Info

Publication number: CN104818283B
Application number: CN201510244475.XA
Authority: CN
Inventors: 缪德年; 王秀花; 郭佳宏
Original assignee: Nantong Haikang Biotechnology Co ltd; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2018-02-27
Anticipated expiration: 2035-05-14
Also published as: CN104818283A

Abstract

本发明涉及一种优化的猪干扰素‑α8基因及其表达方法，表达方法包括以下步骤：（1）将所述的猪干扰素‑α8基因克隆入冷应激表达载体pCold II，构建表达载体pCold II‑PoIFN‑α8,转化到宿主细胞中；（2）从所述宿主细胞中筛选含有所述pCold II‑PoIFN‑α8载体的重组细胞；（3）培养所述重组细胞，表达得到猪干扰素‑α8蛋白。本发明首次高效地表达了可溶性的猪干扰素‑α8蛋白，生产工序少、生产效率和产量都得到显著提高，且本发明的猪干扰素‑α8蛋白的抗病毒活性效果非常优秀。

Description

一种优化的猪干扰素-α8基因及其表达方法

技术领域：

本发明属于生物技术高科技研究领域，涉及一种优化的猪干扰素-α8基因及其表达方法。

背景技术：

目前, 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)和口蹄疫病毒(FMDV)等病毒性疫病已成为阻碍养猪业持续健康发展的重大问题。每年因病毒感染而造成的经济损失无法估量。对这些常见的病毒病，虽然有些可用疫苗作常规免疫，但由于免疫程序、疫苗本身和动物个体等原因，使其在实际应用中的效果并不十分理想。干扰素(interferon, INF)是由细胞产生的一类诱生性蛋白质,具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞分裂活性和免疫调节活性,是目前应用前景较为广阔的生物制剂之一。干扰素可分为α、β和γ三大类型。其中α干扰素的抗病毒作用最广、效果最显著。研究表明, 猪干扰素-α对猪痘病毒(SPV)、猪瘟病毒(CSFV), 猪流感病毒(SIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和口蹄疫病毒(FMDV)都具有较好的抗病毒作用。更重要的是，猪干扰素-α对口蹄疫病毒等病毒的感染具有防治作用，有望开发成新型的抗病毒制剂。猪干扰素-α是一个多基因家族，包括17个干扰素-α亚型，其中, 猪干扰素-α1是研究得最清楚的干扰素。研究表明，不同猪干扰素及其亚型在不同组织细胞中的表达谱不同。猪干扰素-α1、猪干扰素-α8和猪干扰素-α12几乎在所有的组织中均有表达，提示其在机体正常防御中的重要地位，从而有望开发成最有效的抗病毒制剂（Sang, Y., et al., Differential expression and activity of theporcine type I interferon family. Physiol Genomics, 2010. 42(2): p. 248-58.）。目前尚未有成功利用基因工程技术手段生产出有活性的猪干扰素-α8的报道，也无商品化猪干扰素-α8报道。由于猪干扰素-α8在组织中的广泛分布性和高抗病毒活性，其市场前景非常广阔。

大肠杆菌表达系统由于生长快、成本低、表达水平高而成为应用最为广泛的表达系统，但外源蛋白由于不正确的折叠通常在大肠杆菌中以包涵体的形式表达。应用大肠杆菌表达系统制备猪干扰素-α也面临同样的问题。如陈涛等构建的pGEX-IFN/大肠杆菌表达系统（Chen, T., et al., [Site-directed mutation of PoIFN-alpha and itsexpression in Escherichia coli]. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2002. 18(3): p.339-42.）、曹瑞兵等构建的pRLC-α1/大肠杆菌表达系统（Cao, R.B., et al., [Genemodification and high prokaryotic expression of porcine interferon alpha-1].Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2004. 20(2): p. 291-4.）、夏青等构建的pQE30-αac/大肠杆菌表达系统所表达的猪干扰素-α均以包涵体形式存在（Xia, C., et al., Cloningand expression of interferon-alpha/gamma from a domestic porcine breed andits effect on classical swine fever virus. Vet Immunol Immunopathol, 2005.104(1-2): p. 81-9.）。猪干扰素-α在大肠杆菌中以包涵体形式表达，需要经变性、复性、纯化等才能获得具有抗病毒活性的干扰素-α，不仅费时费力，而且得率较低，成为规模化生产中面临的技术瓶颈。2003年青岛宝依特生物技术研究所公布了“猪α-干扰素的基因合成、表达载体构建及产物的制法”（专利申请号为200310109820.6），将猪α-干扰素的基因克隆入pRLC表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。2007年中国科学院微生物研究所公布了 “一种改良重组猪α干扰素蛋白及其编码基因与应用”（专利号为200710176867.2），将猪α-干扰素的基因克隆入pBV220表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。黑龙江省农业科学院畜牧研究中心和东北农业大学公布了“野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法”（专利号为200710144345.4），将野猪α-干扰素的基因克隆入pWL表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。2010年山东罗朗科技有限公司公布了“编码猪α-干扰素的DNA分子和重组大肠杆菌及其应用” （专利号为201010295921.7），将猪α-干扰素的基因克隆入pQE30表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。2011年上海交通大学和上海市浦东新区动物疫病预防控制中心公布了“一种提高原核表达猪干扰素抗病毒活性的方法”（专利申请号为201110237881.5），将猪α和γ-干扰素的基因克隆入pET30a表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。上述专利均未能有效解决猪干扰素在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达问题。

发明内容：

本发明的保护范围只由权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。

本发明的目的在于提供一种优化的猪干扰素-α8基因，具有序列表中序列1的核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种表达上述猪干扰素-α8基因的方法，包括以下步骤：

（1）将所述的猪干扰素-α8基因克隆入冷应激表达载体pCold II，构建表达载体pCold II-PoIFN-α8,转化到宿主细胞中；

（2）从所述宿主细胞中筛选含有所述pCold II-PoIFN-α8载体的重组细胞；

（3）培养所述重组细胞，表达得到猪干扰素-α8蛋白；

所述方法中使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）；

所述方法中的表达条件为16℃，0.02 mM 异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导24h。

所述方法还包括在非变性条件下，使用Ni²⁺-柱对所述猪干扰素-α8蛋白进行纯化的步骤。

本发明首次在大肠杆菌系统中表达出有活性的猪干扰素-α8蛋白，具有以下优点：

A. 本发明人工设计合成的猪干扰素-α8基因选用大肠杆菌偏爱密码子，有利于密码子在大肠杆菌中的识别和表达，从而可达到高效表达的目的；

B.本发明的表达系统有利于重组蛋白的正确折叠，促进了猪干扰素-α8以可溶性形式表达，该蛋白在非变性条件下经一步纯化即可获得高纯度产品，工序少，生产效率高；

C.本发明获得的可溶性表达的猪干扰素-α8表达量高，能达到100mg/L,为后续规模化生产打下了良好的基础；

D.上述猪干扰素-α8蛋白实现良好的抗病毒活性，在PK-15细胞上的抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性可达1.0×10⁹ U/mg，具有良好的产业应用前景。

附图说明：

图1是在诱导剂异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷不同浓度对所得菌体的上清和沉淀进行SDS-PAGE实验的结果；

图2是在不同诱导时间对所得菌体的上清和沉淀进行SDS-PAGE实验的结果；

图3是经纯化后的猪干扰素-α8蛋白SDS-PAGE实验的结果；

图4是经纯化后的猪干扰素-α8蛋白Western Blot（WB）实验的结果。

具体实施方式：

下面结合具体实施例详细阐述本发明，但并不将本发明限制在所述的具体实施方式的范围中。如无特别说明，本发明各个实施例所用方法均为相关商品化试剂的说明书所列方法、实验材料均为常规实验材料。

实施例1 猪干扰素-α8基因的优化设计与合成

根据GenBank上poIFN-α8的氨基酸序列(登录号：ABI26100.1，氨基酸序列如序列表中序列2所示）和猪干扰素-α8 天然基因序列（登录号：DQ872661.1，DNA序列如序列表中序列3所示）,本发明对天然基因序列的密码子进行了优化、设计出编码poIFN-α8成熟蛋白的基因。

密码子没有优化前，猪干扰素-α8 天然基因在大肠杆菌中密码子适应指数（CAI）为0.60，通过密码子优化后，使得本发明的猪干扰素-α8基因在大肠杆菌中CAI 指数为0.80，CAI 指数升高表明经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高猪干扰素-α8基因在大肠杆菌中的表达水平。

密码子没有优化前，猪干扰素-α8 天然基因在大肠杆菌中的低利用率密码子出现百分比为13%，而本发明的猪干扰素-α8基因在大肠杆菌中低利用率密码子的出现百分比为3%，显著提高了翻译的效率。

密码子没有优化前，猪干扰素-α8 天然基因的GC 碱基平均含量为60.37%，而本发明的猪干扰素-α8基因GC 碱基平均含量为57.19%。GC 碱基过高时容易发生错误配对，影响基因的表达，将GC含量优化后更利于目的基因的表达，提高其表达水平。

该poIFN-α成熟蛋白编码基因全长498 bp, 在其5′端添加起始密码子ATG、在3′端添加了终止密码子TGA, 并分别在两端设计了NdeI和HindIII酶切位点，得到了本发明的猪干扰素-α8基因，其完整的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

实施例2 猪干扰素-α8基因表达载体构建

将实施例1获得的优化的猪干扰素-α8基因，亚克隆到pColdII载体（购自宝生物工程(大连)有限公司），转化Top10感受态菌株（购自上海捷瑞生物工程有限公司），挑取单克隆，应用快速质粒小提试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）提取质粒，NdeI/HindIII（购自宝生物工程(大连)有限公司）双酶切和测序鉴定，阳性载体命名为pColdII-PoIFN-α8。

实施例3 猪干扰素-α8基因的表达

将鉴定阳性的质粒pColdII-PoIFN-α8转化BL21(DE3) 感受态菌株（购自宝生物工程(大连)有限公司），阳性工程菌接种于LB培养液37℃过夜培养，次日按1%接种量接种于含10 mL新鲜LB培养基的100 mL 锥形瓶中，37℃振荡培养，当菌液OD600值达0.6-0.8时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（购自天根生化科技（北京）有限公司），加入浓度0.01 mM -0.64mM，16℃诱导12-48 h。

实施例4 猪干扰素-α8基因表达的诱导条件优化

为了获得最佳表达水平，本发明对诱导剂浓度、诱导时间分别进行了优化。

诱导剂浓度优化

采用同实施例3相同的实验步骤，当重组菌OD600值达0.6-0.8时，分别加入0、0.01mM、0.02 mM、0.04 mM、0.08 mM、0.16 mM、0.32 mM和0.64 mM 异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷，16℃诱导24 h。将诱导表达的菌液于4℃，12000 r•min^-1离心10min，将沉淀悬浮于结合缓冲液(0.5 M NaCl, 5% (v/v) 丙三醇, 20 mM Tris-HCl, 1mM 苯甲基磺酰氟, 5 mM咪唑, pH 7.9)中，混匀，置冰浴进行超声波破碎（超声功率为400w，工作5s，间隔5s，共计10min）。裂解菌液于4 ℃，12 000 r•min^-1离心30 min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果如附图1所示。

图中M为蛋白质Marker, 1、3、5、7、9、11、13、15泳道分别为0, 0.01, 0.02, 0.04,0.08, 0.16, 0.32, 0.64 mM异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导的上清，2、4、6、8、10、12、14、16泳道分别为0, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64 mM异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导的沉淀。

结果表明，表达液上清和沉淀中在约20.0 ku处均有一特异性目的条带，随着IPTG浓度的增加，沉淀中目标蛋白的浓度不断增加，而上清中可溶性目标蛋白的浓度变化不明显。当用0.02 mM 异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导时，目标蛋白主要以可溶性形式存在于上清中。

诱导时间优化

采用同实施例3相同的实验步骤，当重组菌OD600值达0.6-0.8时，加入0.02mM 异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷，16℃诱导，分别于诱导后12、24、36、48h取样，所取样品于 4℃，12000 r•min^-1离心10min，将沉淀悬浮于结合缓冲液(0.5 M NaCl, 5% (v/v) 丙三醇,20 mM Tris-HCl, 1mM 苯甲基磺酰氟, 5 mM 咪唑, pH 7.9)中，混匀，置冰浴进行超声波破碎（超声功率为400w，工作5s，间隔5s，共计10min）。裂解菌液于4 ℃，12 000 r•min^-1离心30 min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果如附图2所示，图中M为蛋白质Marker,1、3、5、7泳道分别为0.02 mM 异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后12、24、36、48h取样的上清，2、4、6、8泳道分别为0.02 mM 异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后12、24、36、48h取样的沉淀。结果表明，诱导24h后，上清中的目标蛋白浓度达到高峰，而随着诱导时间的延长，沉淀中的目标蛋白浓度不断增加。

实施例5 猪干扰素-α8蛋白的分离纯化及鉴定

采用同实施例3相同的实验步骤，在重组菌中加入0.02 mM 异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷，16℃诱导24 h。

将诱导表达的菌液于4℃，12000 r•min^-1离心10min，将沉淀悬浮于结合缓冲液(0.5 M NaCl, 5% (v/v) 丙三醇, 20 mM Tris-HCl, 1mM 苯甲基磺酰氟, 5 mM 咪唑, pH7.9)中，混匀，置冰浴进行超声波破碎（超声功率为400w，工作5s，间隔5s，共计10min）。裂解菌液于4 ℃，12 000 r•min^-1离心30 min，取上清，利用Ni²⁺柱（His•Bind® Kits蛋白质纯化试剂盒）进行纯化（购自Novagen公司），收集洗脱下来的目的蛋白，PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)透析脱盐，收集蛋白液，应用Bradford 蛋白质定量试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）测定蛋白浓度，测得蛋白浓度为2mg/mL, 1升培养液可收集洗脱蛋白液50mL，则从1升培养液中可纯化获得100mg 猪干扰素-α8蛋白。纯化蛋白过滤除菌，分装，零下20℃保存备用。经SDS-PAGE电泳，结果见附图3 。图中M为蛋白质Marker, 1为表达产物经超声波破碎离心后的上清，2为上清过柱后的溶液，3为表达上清洗脱的目标蛋白。结果显示目的蛋白可被Ni²⁺-柱高效吸附，洗脱后呈单一条带，分离效果较好，经BandScan软件分析，纯度超过了95％。将表达的蛋白样品经SDS-PAGE 电泳后，用半干转印法转印到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶封闭过夜，磷酸盐缓冲液 (含0.05%吐温)洗涤3次，加入1:5000稀释的PoIFN-α单克隆抗体（购自PBL Interferon Source公司），4℃孵育2 h，磷酸盐缓冲液 (含0.05%吐温)洗涤后加入1:5000稀释的羊抗鼠HRP标记二抗（购自PBL Interferon Source公司），室温孵育2 h，磷酸盐缓冲液 (含0.05%吐温)洗涤后，使用DAB二氨基联苯显色液（购自天根生化科技（北京）有限公司）显色。Westernblot结果见附图4。图中M为蛋白质Marker, 泳道1为2μg纯化的猪干扰素-α8，泳道2为1μg 纯化的猪干扰素-α8，泳道3为0.5μg纯化的猪干扰素-α8。

结果表明，猪干扰素-α8蛋白能与抗poIFN-α的单克隆抗体在目的带20.0 ku处发生特异性显色反应。

实施例6 猪干扰素-α8蛋白的抗病毒活性

采用PK-15细胞-VSV（水泡性口炎病毒）（购自中国兽药监察所）系统微量细胞病变抑制法。将PK-15细胞（购自中国科学院细胞库）接种于96孔培养板，置37℃ 5%CO₂温箱中培养至单层。去除营养液，依次加入系列稀释的本发明制备的猪干扰素-α8，每个稀释度各加8孔，同设人干扰素α2b（购自北京凯因科技股份有限公司，300万IU/支）标准对照、细胞对照和病毒对照。37℃ 5%CO2温箱中培养24h。去除干扰素溶液，用100TCID50的VSV攻击，细胞对照加不含病毒的营养液。48h后在倒置显微镜下观察结果，将抑制细胞病变减少50%的干扰素的最高稀释度的定为一个干扰素单位。结果测得本发明制备的猪干扰素-α8抗病毒活性为1x10⁹U/mg（1x10⁹ IU/mg），与接毒对照和空白对照相比，10U猪干扰素-α8可完全抑制细胞病变的形成。

表1 本发明猪干扰素-α8蛋白与现有技术生产的猪干扰素-α蛋白对比

蛋白	表达形式	抗病毒活性
			本发明猪干扰素-α8蛋白	可溶蛋白	1x10⁹U/mg
1）猪干扰素-α1	包涵体	1x10⁶U/mg
			2）猪干扰素-α	包涵体	6.4x10⁶U/mg
3）猪干扰素-α	包涵体	1.6x10⁷U/mg
			4）猪干扰素-α	包涵体	4.45x10⁶U/mg

上表中，1）猪干扰素-α1是曹瑞兵等构建的pRLC-α1/大肠杆菌表达系统（Cao,R.B., et al., [Gene modification and high prokaryotic expression of porcineinterferon alpha-1]. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2004. 20(2): p. 291-4.）表达的猪干扰素-α1。2）是2003年青岛宝依特生物技术研究所公布了“猪α-干扰素的基因合成、表达载体构建及产物的制法”（专利申请号为200310109820.6）表达的猪干扰素-α。3）是2007年中国科学院微生物研究所公布了 “一种改良重组猪α干扰素蛋白及其编码基因与应用”（专利号为200710176867.2）表达的猪干扰素-α。4）是黑龙江省农业科学院畜牧研究中心和东北农业大学公布了“野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法”（专利号为200710144345.4）表达的猪干扰素-α。

与现有技术相比，一方面，本发明高效地表达了可溶性的猪干扰素-α8蛋白，生产工序少、生产效率和产量都得到显著提高；另一方面，本发明的猪干扰素-α8蛋白的抗病毒活性效果非常优秀，可达现有技术获得的猪干扰素-α的10-1000倍以上，上述特征使得本发明的优化的猪干扰素-α8基因及其表达方法具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 南通海康生物科技有限公司

上海市农业科学院

<120> 一种优化的猪干扰素-α8基因及其表达方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtgcgacc tgcctcagac ccactctctg gctcacaccc gcgctctgcg tctgctggcg 60

cagatgcgtc gtatttctcc gttttcttgc ctggatcatc gtcgtgactt cggtttcccg 120

caagaggcgc tgggcggtaa ccaggttcag aaagcgcagg cgatggcgct cgttcacgaa 180

atgctgcaac aaactttcca actgttctcc actgagggtt ctgcggctgc ttgggacgag 240

tctctgctgc accaattttg caccggtctg gaccagcagc tccgtgatct cgaagcgtgc 300

gttatgcagg aagcgggcct ggaaggtacc ccgctgctcg aagaggacag catcctggcg 360

gtgcgcaaat acttccaccg tctcaccctg tacctccagg aaaaatctta cagcccgtgc 420

gcgtgggaaa ttgttcgtgc ggaagtcatg cgtgcatttt cttcctctac caacctgcaa 480

gaccgtctgc gtaagaaaga atga 504

<210> 2

<211> 189

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 2

Met Ala Pro Thr Ser Ala Phe Leu Thr Ala Leu Val Leu Leu Ser Cys

1 5 10 15

Asn Ala Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu

20 25 30

Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser

35 40 45

Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu

50 55 60

Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val

65 70 75 80

His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser

85 90 95

Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu

100 105 110

Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly

115 120 125

Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

130 135 140

Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser

145 150 155 160

Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser

165 170 175

Ser Ser Thr Asn Leu Gln Asp Arg Leu Arg Lys Lys Glu

180 185

<210> 3

<211> 570

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 3

atggccccaa cctcagcctt cctcacggcc ctggtgctgc tcagctgcaa tgccatctgc 60

tctctgggct gcgacctgcc tcagacccac agcctggctc acaccagggc cctgaggctc 120

ctggcacaaa tgaggagaat ctcccccttc tcctgcctgg accacagaag ggactttgga 180

ttcccccaag aggccttggg gggcaaccag gtccagaagg ctcaagccat ggctctggtg 240

catgagatgc tccagcagac cttccagctc ttcagcacag agggctcggc tgctgcctgg 300

gatgagagcc tcctgcacca gttctgcact ggactggatc agcagctcag ggacctggaa 360

gcctgtgtca tgcaggaggc ggggctggaa gggacccccc tgctggagga ggactccatc 420

ctggctgtga ggaaatactt ccacagactc accctctatc tgcaagagaa gagctacagc 480

ccctgtgcct gggagatcgt cagggcagaa gtcatgagag ccttctcttc ctccacaaac 540

ctgcaagaca gactcaggaa gaaggagtga 570

Claims

1.一种猪干扰素-α8基因，其特征在于，所述猪干扰素-α8基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2.一种猪干扰素-α8基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

3.一种表达猪干扰素-α8基因的方法，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述的猪干扰素-α8基因克隆入冷应激表达载体pCold II，构建表达载体pCold II-PoIFN-α8,转化到宿主细胞中；

（2）从所述宿主细胞中筛选含有所述pCold II-PoIFN-α8载体的重组细胞;

（3）培养所述重组细胞，表达得到猪干扰素-α8蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）的表达条件为16℃，0.02 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导24 h。

6.根据权利要求3～5任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用Ni²⁺-柱对所述猪干扰素-α8蛋白进行纯化的步骤。