CN111647609A - 一种优化的PCV2d ORF2基因及病毒样颗粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种优化的PCV2d ORF2基因及其病毒样颗粒的制备方法。本发明对编码猪圆环病毒2d亚型Cap蛋白的编码基因序列优化后，构建表达工程菌表达系统进行Cap蛋白的表达。在适合的表达条件下，该表达菌可大量表达可溶且具有活性的猪圆环病毒2d亚型Cap蛋白，利用单克隆抗体柱对表达蛋白进行纯化，得到高纯度高浓度的Cap蛋白，且该蛋白可形成病毒样颗粒。本发明实现了猪圆环病毒2d亚型全长Cap蛋白在原核表达系统中的高效可溶表达，操作简单，成本低廉，制备的单克隆抗体柱能反复使用，纯化得到的Cap蛋白具有高浓度和高纯度，且能自发形成病毒样颗粒，免疫原性好，适合工业化应用。

Description

一种优化的PCV2d ORF2基因及病毒样颗粒的制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及利用优化的PCV2d ORF2基因和单克隆抗体柱纯化得到可溶性PCV2d Cap蛋白及病毒样颗粒的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、增生性坏死肺炎等猪圆环病毒相关疾病的主要病原。目前，PCV2在中国乃至世界猪群中普遍存在，给养猪业造成严重经济损失。猪一旦感染圆环病毒病，无有效药物治疗，因此疫苗免疫是预防本病的主要途径。PCV2共有11个开放阅读框(ORF)，其中ORF1和ORF2是最主要的两个阅读框。研究表明ORF2为编码病毒的主要结构蛋白和衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白上的抗原表位具有免疫原性，是疫苗研制的基础。

目前市场上的PCV2疫苗主要为灭活疫苗和亚单位疫苗。其中，灭活疫苗免疫效果差，需多次加强免疫才能达到预防效果，且灭活疫苗可因灭活过程不完全而导致安全性问题。亚单位疫苗均采用真核表达系统生产，然而由于ORF2编码的Cap蛋白在真核表达系统中的表达量极低，即使利用高表达的杆状病毒-昆虫细胞表达系统，表达量通常也很难超过50-100mg/L(Pumpens P,Grens E.HBV core particles as a carrier for B cell/Tcell epitopes.Intervirology,2001,44:98–114.)，因此产量低、成本高，造成养殖场难以在生产中使用这类疫苗。

为了提高产量，利用大肠杆菌表达系统进行Cap蛋白的表达，但是通常只能得到不可溶形式的变性包涵体蛋白，需要通过蛋白复性才能得到可溶性蛋白，这种先变性再复性的方法对蛋白产量以及蛋白活性均具有一定损失(李中圣，王凤求，伍建敏，等.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒：中国，CN201710439243.9[P]，2017.10.13.)。

PCV2可分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d以及PCV2e等多个亚型。2004年前PCV2的流行毒株以PCV2a亚型为主，2004年后流行趋势逐渐转变为PCV2b亚型，且不断有PCV2d 和PCV2e两种新亚型的出现。2014年后，PCV2d亚型逐渐替代PCV2b亚型成为主导血清型 (徐妮.山东省猪圆环病毒病的血清学调查及PCV2分离株的遗传变异分析[D].泰安,山东农业大学,2014；Xiao CT,Halbur PG,Opriessnig T.Global molecular genetic analysis ofporcine circovirus type 2(PCV2)sequences confirms the presence of four mainPCV2genotypes and reveals a rapid increase of PCV2d[J].J Gen Virol, 2015,96:1830-1841)。目前的商品化疫苗，例如法国梅里亚公司的

美国勃林格公司的

CIRCOFLX^TM以及青岛易邦生物工程有限公司的“易圆净”等都是基于PCV2a或PCV2b亚型，尚未有基于PCV2d亚型的疫苗上市。鉴于目前我国由PCV2b亚型向PCV2d亚型转变的流行态势，开展基于PCV2d亚型疫苗的研究具有重要的意义。

病毒样颗粒(Virus Like Particles，VLPs)是具有与天然病毒相似的空间结构和免疫原性的蛋白质多聚复合物，能够被宿主细胞的TLRs和PRRs识别，从而激活先天性免疫机制，且由于其规则的表面结构，可诱导强烈的B细胞反应；并且利于抗原递呈细胞的抗原递呈作用，因此具有很强的免疫原性。但是VLPs不含有病毒遗传物质，因此无感染性，稳定性好，不易失活，可诱导体液、细胞和粘膜免疫。基于VLPs的上述优点，VLPs能增强疫苗的免疫效果，减少免疫次数，降低成本，提高生产性能，具有广阔的发展前景。然而，利用大肠杆菌或酵母表达系统表达得到的Cap蛋白经常无法自发组装形成VLPs(Masuda A1,Lee JM1,Miyata T，Purification and characterization of immunogenic recombinant virus-like particles of porcine circovirus type 2expressed in silkworm pupae，J GenVirol.，2018 May 31)，因此，对表达条件和基因序列的优化尤为重要。

综上所述，防控圆环病毒病主要靠疫苗免疫，新流行基因型PCV2d亚型需要新型疫苗进行防控。目前真核表达系统得到的Cap蛋白产量低、成本高；大肠杆菌表达系统虽然操作简单、表达量高、成本低，但得到的Cap蛋白通常可溶性差、纯化难度大、VLPs形成率低。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是获的可溶性的Cap蛋白编码基因。

本发明要解决的第二个技术问题是制备高表达、可溶性的PCV2d Cap蛋白。

本发明要解决的第三个技术问题是获得纯度高、活性佳、并能形成大小均一的Cap蛋白的VLPs。

目前，商品化PCV2疫苗存在的问题主要为：现有疫苗所能防控的基因型未覆盖目前流行的PCV2d基因型；真核表达的商品化亚单位疫苗产量低、成本高；大肠杆菌表达系统获得的Cap蛋白通常可溶性差、纯化难度大、VLPs形成率低。为了克服上述不足，本发明根据目前流行的PCV2d基因型，获得易于可溶性表达的编码Cap蛋白的优化ORF2基因，并利用优化的ORF2基因和大肠杆菌表达系统制备高表达、可溶性的PCV2d Cap蛋白；利用单克隆抗体柱纯化得到的Cap蛋白纯度高、活性佳，并能形成大小均一的VLPs。

本发明的第一方面，提供了一种优化的PCV2d ORF2基因，利用该优化基因构建的表达工程菌，在合适的诱导、表达条件下能可溶性表达PCV2d Cap蛋白，且所述Cap蛋白可形成病毒样颗粒(VLPs)。

本发明的第二方面，提供了一种可溶性PCV2dCap蛋白，该可溶性Cap蛋白由本发明第一方面所述的表达工程菌表达。

本发明的第三方面，提供了一种具有活性的PCV2dCap蛋白，琼扩效价可达1:64，该活性Cap蛋白由本发明所述的表达工程菌表达。

本发明的第四方面，提供了一种PCV2d Cap蛋白的单克隆抗体，利用该单克隆抗体制备的抗体柱纯化得到的Cap蛋白纯度可达90％以上。

本发明的第五方面，提供了一种病毒样颗粒(VLPs)，所述VLPs由本发明第一方面所述的表达工程菌表达。

本发明提供了一种DNA，它编码猪圆环病毒2d亚型Cap蛋白，并与SEQ ID NO 2的序列具有80％以上的相似度。

较好的，所述的DNA的序列如SEQ ID NO 2所示。

PCV2d毒株基因组中ORF2基因(序列如SEQ ID NO.1)，并依据大肠杆菌密码子偏好性进行优化得到优化序列(序列如SEQ ID NO.2。由于密码子的简并性，即使与SEQ ID NO 1或者SEQ ID NO 2具有80％的同源度的DNA序列也可能获得相同的蛋白。

本发明提供了一种质粒，该质粒是含有上述DNA的表达载体。

本发明还提供了相应的蛋白，该蛋白的核酸编码序列与SEQ ID NO 2的序列具有80％以上的相似度。

本发明还提供了含有上述DNA的细胞。

本发明还提供了一种单克隆抗体，它能够特异性结合上述DNA编码的蛋白。例如，可以通过使用上述的蛋白免疫动物，制备杂交瘤并单克隆培养，获得抗体。

相应的，本发明提供了一种单克隆抗体柱，它偶联上述的单克隆抗体，可以用于纯化上述蛋白。

在另一优选例中，所述ORF2序列为全长序列。

在另一优选例中，所述ORF2序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化。

在另一优选例中，所述的表达盒包括5'至3'可操作地连接的以下元件：起始密码子、所述优化的ORF2序列和终止密码子。

在另一优选例中，所述PCV2d ORF2优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示(含起始密码子和终止密码子)。

在另一优选例中，所述表达载体以pET30a载体为骨架。

在另一优选例中，所述表达工程菌为大肠杆菌，优选为Rosetta(DE3)。

在另一优选例中，所述病毒样颗粒为PCV2d ORF2基因所表达的Cap蛋白形成的病毒样颗粒。

本发明提供了一种Cap蛋白的制备方法，将序列为SEQ ID NO 2的DNA与表达载体连接，表达蛋白。

本发明中，可以通过大肠杆菌表达系统制备病毒样颗粒，制备步骤如下：

将与SEQ ID NO 1序列有80％同源度的DNA插入大肠杆菌表达载体，形成重组表达载体后，转化入大肠杆菌表达宿主菌，构建表达工程菌；

重组大肠杆菌表达工程菌分泌表达，得到可溶性Cap蛋白；

利用单克隆抗体柱对所表达Cap蛋白进行纯化，所得纯化蛋白能形成病毒样颗粒。

本发明中，所述的大肠杆菌表达载体可以为pET28a(+)、pET30a(+)或者pET32a(+)。

本发明中，所述的大肠杆菌表达宿主细胞可以为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLySs或者E.coli Rosetta(DE3)。

本发明中，所述的重组大肠杆菌表达工程菌分泌表达是指，取过夜培养的表达工程菌，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6～0.8；加入终浓度为0.0001-0.0005mol/L的IPTG，37℃诱导培养5h-7h。

具体而言，本发明包括以下技术方案：

目的基因的合成和重组表达质粒的构建：根据PCV2d毒株基因组中ORF2基因(序列如 SEQ ID NO.1)，并依据大肠杆菌密码子偏好性进行优化得到优化序列(序列如 SEQ IDNO.2)，引入酶切位点后克隆至表达载体pET28a(+)、pET30a(+)、pET32a(+)，优选为pET30a(+)，获得携带PCV2d ORF2的重组表达质粒。

重组表达菌的构建：将该重组表达质粒转化入大肠杆菌表达宿主菌E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLySs、E.coli Rosetta(DE3)，优选为E.coli Rosetta(DE3)，获得表达工程菌。

Cap蛋白的原核表达：取过夜培养的表达工程菌，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6～0.8；加入终浓度为0.0001-0.0005mol/L的IPTG， 37℃诱导培养5h-7h。

重组表达菌的超声裂解：收集菌体后，PBS洗涤一次，再次收集菌体后，以PBS悬浮细菌，在冰水浴中进行超声波裂解，收集上清液即为可溶性的PCV 2d-Cap蛋白。

Cap蛋白的粗纯化：向粗蛋白液中加入饱和硫酸铵溶液，4℃静置后离心收集上清，重复上述操作，离心后收集沉淀，并用PBS重悬；利用非连续性蔗糖密度梯度离心法得到PCV2d-Cap粗纯蛋白。

Cap蛋白单克隆抗体的制备和纯化：该步骤中包含动物免疫、杂交瘤细胞株的建立和克隆化以及腹水的制备和纯化。

动物免疫：将与佐剂混合并充分乳化的Cap蛋白作为免疫原免疫小鼠，三免后取血清抗体效价达1:104以上的小鼠用于细胞融合。融合前3天腹腔接种Cap蛋白进行超强免疫；

杂交瘤细胞株的建立和克隆化：加强免疫3天后,无菌取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0)融合培养,通过IFA筛选阳性并克隆培养至抗体分泌阳性率大于95％后扩大培养；

腹水制备和纯化：对脱敏处理后的小鼠腹腔接种上述杂交瘤细胞，采集腹水，纯化后的腹水上清即为单克隆抗体。

单克隆抗体特异性分析：利用间接ELISA和Western-Blot鉴定所制备单克隆抗体的特异性。

单克隆抗体柱的制备：将上述单克隆抗体置换液和介质充分混合后，加入适量封闭液封闭，最后用清洗液和PBS洗涤，即获得单克隆抗体柱。

Cap蛋白的精纯化：将单克隆抗体柱置于结合缓冲液中，以5倍体积的结合缓冲液平衡柱子后，将Cap粗蛋白加载于单克隆抗体柱，洗脱获得Cap精蛋白并透析脱盐。

病毒样颗粒的检测：取微量上述纯化的Cap蛋白滴于铜网上，染色、干燥后在透射电镜下观察病毒样颗粒的形成情况。

本发明后续实施例中可以看出，本发明至少有以下优点：

大肠杆菌表达系统操作简单、周期短、技术成熟。从构建工程菌到通过大肠杆菌表达系统来原核表达PCV2d Cap蛋白只需1周时间；而真核表达从构建载体到表达蛋白通常需要4-6周时间。因此利用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达极大的简化了实验步骤、缩短了实验周期。

利用大肠杆菌表达系统进行PCV2dCap蛋白的分泌表达，成本低。整个蛋白表达过程无需大规模培养昆虫细胞，只需进行大肠杆菌的培养，极大的降低了生产成本。

表达量高。原核表达的蛋白产量高于真核表达的产量，并且由于生产周期短，在单位时间内的产量大大高于真核表达。在后续实施例中，原核表达得到的PCV2dCap蛋白的表达量可达150mg/L培养液以上，若工业化生产成熟后，该产量会继续提升。

获得具有活性的可溶性蛋白。本发明生产的蛋白为可溶性蛋白，无需复性，降低了复性过程中蛋白量的损失；具有良好的蛋白活性，能达到较高的琼扩效价。

利用单克隆抗体柱纯化得到的PCV2d Cap蛋白纯度高，可达90％以上。

该纯化后的可溶性蛋白能自发形成VLPs。VLPs具有良好的免疫原性，因此能形成VLPs的 Cap蛋白能增强疫苗的免疫效果，减少免疫次数，从而降低生产成本，提高生产性能。

附图说明

图1：PCV2d Cap蛋白的诱导表达及可溶性分析SDS-PAGE电泳图。

其中：M：蛋白质分子量标准；1：未诱导的Cap蛋白上清；2：未诱导的Cap蛋白沉淀；3：诱导的空质粒上清；4：诱导的空质粒沉淀；5：诱导的Cap蛋白上清；6：诱导的Cap蛋白沉淀。

图2：PCV2d Cap蛋白的纯化图。

其中，M：蛋白分子量标准；1：纯化前Cap粗蛋白；2：单克隆抗体柱纯化后Cap蛋白。

图3：PCV2d Cap蛋白形成的病毒样颗粒电镜图。

其中，VLPs的电镜观察(67000×)。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，该实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，应按照常规实验方法进行。

实施例1

根据PCV2d HB-MC1毒株基因组中ORF2基因，并根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化，在其5’端引入NdeI酶切位点，3’端引入终止密码子和Hind III酶切位点，基因合成后经双酶切克隆至pET30a(+)表达载体，获得携带目的片段的重组表达质粒。原始序列的 CAI(Codon Adaptation Index)仅为0.63，优化后提升至0.85，大大提高了表达量和可溶表达的概率。

实施例2

将阳性重组表达质粒pET30a-ORF2转化入E.coli Rosetta(DE3)宿主表达菌，在含有卡那霉素抗性的LB平板上挑取阳性菌落进行测序鉴定，获得序列未发生突变和移码的阳性重组表达菌Rosetta-pET30a-ORF2。

实施例3

挑取阳性重组单菌落，在37℃条件下200r/min的振摇速度于含20μg/mL卡纳霉素的 LB培养基中振摇扩大培养12h后，将过夜培养物以1:100的比例重新接种于新鲜的含 20μg/mL卡纳霉素的LB培养基中，37℃200r/min振摇培养至OD₆₀₀约0.7后，分别用不同的诱导条件进行目的蛋白的诱导表达。

取27℃、32℃、37℃和42℃4个诱导温度分别对工程菌进行相同时间的诱导表达，在37℃的诱导温度获得了最大量的可溶性目的蛋白。

1.在37℃的诱导温度下分别对工程菌进行1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h的诱导表达，在6h的诱导时间后获得了最大量的可溶性目的蛋白。

2.在37℃的诱导温度下，分别加入终浓度为0.00005mol/L、0.0001mol/L、0.00015mol/L、0.0002mol/L、0.00025mol/L和0.0003mol/L的IPTG对工程菌进行6h的诱导表达，在0.0002mol/L IPTG的诱导下获得了最大量的可溶性目的蛋白。

在37℃条件下加入终浓度为0.0002mol/L的IPTG，200r/min摇速诱导表达6h后，于4℃条件下10000r/min离心5min收集菌体，用0.05mol/L PBS洗涤菌体，再次4℃10000 r/min离心5min收集菌体后加入初始培养基体积1/5的0.05mol/L PBS悬浮细菌，在冰水浴中进行超声波裂解。

3.待菌体裂解完全后，4℃条件下10000r/min离心10min分离上清和沉淀，其中用与上清等体积的细菌裂解液混悬沉淀。分别取上清和沉淀进行12％SDS-PAGE分析，检测目的蛋白表达情况。

实施例4

取上清目的蛋白进行Western Blot分析：SDS-PAGE电泳后，将蛋白转膜至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2h，PCV2阳性血清4℃孵育过夜，HRP标记的羊抗猪IgG二抗37℃孵育1h后显色，检测目的蛋白能否被抗体特异性识别。

实施例5

目的蛋白的粗纯化：取目的蛋白上清液，加入终浓度为10％的饱和硫酸铵溶液，4℃放置30min后12000r/min离心15min收集上清；再向上清中加入终浓度为50％的饱和硫酸铵溶液，4℃放置30min后12000r/min离心15min，弃上清收集沉淀，加入原体积1％的0.05mol/L PBS重悬，利用非连续性蔗糖密度梯度离心纯化目的蛋白。蔗糖密度梯度依次为10％、15％、20％、25％、30％、35％以及40％，超速(25000～30000r/min)离心分离1h后，吸取各梯度分离液进行12％SDS-PAGE分析后，将纯度较高的小管汇总到一起。

实施例6

Cap蛋白单克隆抗体的制备：将上述纯化蛋白免疫小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，构建杂交瘤细胞株并进行筛选、克隆化和腹水收集；利用饱和硫酸铵和亲和层析柱对收集的腹水进行纯化。

实施例7

杂交瘤细胞株的建立、筛选：将上述纯化蛋白与弗氏完全佐剂混合并充分乳化后，皮下多点免疫6-8周龄的BALB/c雌性小鼠，初免剂量约75ug。随后每隔2周取等量抗原与等体积的氟氏不完全佐剂混勾乳化，进行二免和三免。三免后第3天断尾采血，ELISA测定血清抗体效价达1:10⁴以上小鼠用于细胞融合。融合前3天经腹腔接种不加佐剂的抗原蛋白进行超强免疫。无菌条件下取小鼠脾细胞与事先培养的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合, 用含1％HAT和20％FCS的RPMI 1640培养,5天后半量换液，10天后改用含1％HT的RPMI 1640培养。待细胞克隆布满1/5-1/2培养孔时，吸取上清，通过IFA筛选阳性孔，筛选出的特异性阳性孔采用有限稀释法进行3次克隆,选择抗体效价高、呈单个克隆生长、形态良好的细胞株继续克隆培养，直至抗体分泌阳性率大于95％，即可扩大培养。

实施例8

单克隆抗体的制备和纯化：将上述杂交瘤细胞腹腔注射预处理的Balb/c小鼠，0.5ml/ 只。观察7～14日，小鼠出现明显腹部胀大时无菌收集腹水。间接ELISA检测腹水效价。饱和硫酸铵纯化：将腹水以3000r/min离心10分钟，收集上清，加入等体积的灭菌生理盐水稀释，混合均匀。加入等体积的饱和硫酸铵溶液，以磁力搅拌器4℃作用过夜；12000r/min离心10min，弃上清，将沉淀按1:10(w/v)的比例用灭菌生理盐水复溶，每12ml液体滴加8ml饱和硫酸铵，混合均匀，2～8℃作用1小时；以12000r/min离心10min，弃上清，按1:10(w/v)比例用灭菌生理盐水复溶，每13.3ml液体滴加6.6ml饱和硫酸铵，2～8℃作用1小时；以12000r/min离心10min，弃上清，沉淀称重，按1:10(w/v)比例用灭菌生理盐水复溶，PBS中2～8℃透析过夜；以12000r/min离心10min，收集上清经0.22μm 孔径滤膜过滤。亲和层析柱纯化：用20mmol/L Na₂HPO₄(pH7.0)平衡Protein G Bestarose 4FF亲和柱至基线平稳，以1ml/min的速度上样，用5～10倍柱体积的结合缓冲液洗脱杂蛋白，至基线平稳。用5倍体积的0.1mol/LGly-HCl(pH2.7)溶液洗脱目的蛋白，收集洗脱产物，边洗脱边用1mol/LTris-HCl(pH9.0)调节洗脱蛋白的pH值至中性；PBS中2～8℃透析24～48小时，以12000r/min离心10min，收集上清经0.22μm孔径滤膜过滤。

单克隆抗体特异性分析：利用间接ELISA和Western-Blot鉴定所制备单克隆抗体的特异性。

实施例9

间接ELISA:将纯化蛋白按20ug/ml的浓度包被于96孔酶标板,每孔加入100uL,37℃孵育2h后4℃过夜；弃去包被液,PBST洗涤3次，每次3min；加入200uL封闭液，37℃封闭2h；洗涤3次后加入单抗的上清100uL，37℃作用2h；洗涤5次，加入HRP标记的SPA，37℃作用1h；洗涤5次，加入新配置的DAB底物缓冲液100uL，室温作用3min；加入50uL 2M 硫酸，终止反应，测定OD₄₅₀。

实施例10

Western-Blot：将Cap蛋白进行SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜上，37℃封闭2h后，用纯化的单克隆抗体作为一抗37℃孵育1h，PBST洗涤5次；

HRP标记的抗鼠IgG作为二抗37℃孵育1h，PBST洗涤5次后，进行显色。

实施例11

制备单克隆抗体柱：取5mL NHS-activated Bestarose TM 4FF介质，加入预冷的异丙醇，待介质沉降彻底后，将异丙醇排出；取20倍柱体体积的偶联溶液A(1mmol/L HCl)洗涤柱体30分钟；利用超滤管离心将Cap粗蛋白溶液置换为偶联溶液B(0.1MNaHCO3、0.5MNaClPH8.3)；将置换后的Cap粗蛋白与介质1:1混合，4℃轻摇过夜后，加入封闭液(0.1MTris-HClPH8.5)室温放置2-4小时；用3倍柱体体积的清洗液(0.1mol/L Tris-HClpH8.5，0.2mol/L醋酸)洗涤3-6次，最后用PBS清洗柱体，获得单克隆抗体柱。

实施例12

利用该单克隆抗体柱对Cap粗蛋白进行精纯化：用PBS清洗单克隆抗体柱后，再用0.1 mol/L Gly-HCl(pH 2.7)洗涤柱子去除杂质，最后用3-5个柱体积的20mmol/L Na₂HPO₄洗涤柱子至平衡状态；将粗蛋白样品经0.45um滤膜过滤后上柱，流速约1mL/min，上样完成后用20mmol/L Na₂HPO₄洗柱，直至OD₂₈₀检测无蛋白流出，则完成蛋白吸附；最后，用0.1mol/LGly-HCl洗脱样品，并用NaOH调节洗脱蛋白的pH值7.4左右。利用SDS-PAGE检测蛋白的纯化效果。

实施例13

对纯化后的Cap蛋白进行琼脂凝胶免疫扩散试验：在琼扩板的中心孔加入猪抗PCV2 阳性血清，周围孔依次加入不同稀释度的上述可溶性目的蛋白。37℃温箱中反应过夜，观察沉淀线。

实施例14

病毒样颗粒的电镜检测：取微量纯化的目的蛋白滴于铜网上，液体被充分吸收后用2％的醋酸双氧铀染色1min，待完全干燥后置透射电镜下观察VLPs形成情况。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明所涉及的主要序列如下：

原始PCV2d ORF2序列，SEQ ID NO.1

ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTCCGCAGACGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGC CCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGGATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACC ATCGGTTATACTGTCAAGAAAACCACAGTCAGAACGCCCTCCTGGAATGTGGACATGATGAGATTTAATATTAATGAT TTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCTCACTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAGGTTAAGGTTGAA TTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTA ACAAAGGCCAATGCCCTAACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTAC CACTCCCGGTACTTTACCCCGAAACCTGTCCTTGATAGGACAATCGATTACTTCCAACCCAATAACAAAAGAAATCAA CTCTGGCTGAGACTACAAACTACTGGAAATGTAGACCATGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATCTACGAC CAGGACTACAATATCCGTATAACCATGTATGTACAATTCAGGGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTAAG TGA。

密码子优化的PCV2d ORF2序列，SEQ ID NO.2

ATGACCTATCCGCGCCGTCGCTTTCGTCGTCGTCGCCATCGCCCGCGCTCTCATCTGGGCCAGATTCTGCGTCGTCGC CCGTGGTTAGTGCATCCGCGTCATCGTTATCGCTGGCGTAGAAAGAATGGCATTTTTAATACCCGCCTGTCTCGCACC ATTGGCTATACCGTGAAAAAGACCACCGTGCGTACCCCGAGTTGGAATGTGGATATGATGCGCTTTAATATTAATGAT TTTCTGCCGCCGGGCGGCGGCTCTAATCCGCTGACCGTTCCGTTTGAATATTATCGCATTCGTAAAGTTAAAGTGGAA TTTTGGCCGTGTAGTCCGATTACCCAGGGCGATCGCGGTGTTGGTTCAACCGCAGTGATTCTGGATGATAATTTTGTG ACCAAAGCAAATGCCCTGACCTATGATCCGTATGTGAATTATAGCTCACGTCATACCATTACCCAGCCGTTTAGCTAT CATTCACGCTATTTTACCCCGAAACCGGTGTTAGATCGCACCATTGATTATTTTCAGCCGAACAATAAGCGCAATCAG CTGTGGTTACGCTTACAGACCACCGGCAATGTGGATCATGTTGGCTTAGGCACCGCCTTTGAAAATAGTATATATGAT CAGGATTATAATATTCGTATTACCATGTATGTGCAGTTTCGCGAGTTCAATCTGAAAGATCCGCCGTTAAATCCGAAA TAA。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种优化的PCV2d ORF2基因及病毒样颗粒的制备方法

<130> 20181210

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atgacgtatc caaggaggcg tttccgcaga cgaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120

aaaaatggga tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccatcg gttatactgt caagaaaacc 180

acagtcagaa cgccctcctg gaatgtggac atgatgagat ttaatattaa tgattttctt 240

cccccaggag ggggctcaaa ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataaggaag 300

gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360

actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca atgccctaac ctatgacccc 420

tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccggtac 480

tttaccccga aacctgtcct tgataggaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga 540

aatcaactct ggctgagact acaaactact ggaaatgtag accatgtagg cctcggcact 600

gcgttcgaaa acagtatcta cgaccaggac tacaatatcc gtataaccat gtatgtacaa 660

ttcagggaat ttaatcttaa agacccccca cttaacccta agtga 705

<210> 2

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

atgacctatc cgcgccgtcg ctttcgtcgt cgtcgccatc gcccgcgctc tcatctgggc 60

cagattctgc gtcgtcgccc gtggttagtg catccgcgtc atcgttatcg ctggcgtaga 120

aagaatggca tttttaatac ccgcctgtct cgcaccattg gctataccgt gaaaaagacc 180

accgtgcgta ccccgagttg gaatgtggat atgatgcgct ttaatattaa tgattttctg 240

ccgccgggcg gcggctctaa tccgctgacc gttccgtttg aatattatcg cattcgtaaa 300

gttaaagtgg aattttggcc gtgtagtccg attacccagg gcgatcgcgg tgttggttca 360

accgcagtga ttctggatga taattttgtg accaaagcaa atgccctgac ctatgatccg 420

tatgtgaatt atagctcacg tcataccatt acccagccgt ttagctatca ttcacgctat 480

tttaccccga aaccggtgtt agatcgcacc attgattatt ttcagccgaa caataagcgc 540

aatcagctgt ggttacgctt acagaccacc ggcaatgtgg atcatgttgg cttaggcacc 600

gcctttgaaa atagtatata tgatcaggat tataatattc gtattaccat gtatgtgcag 660

tttcgcgagt tcaatctgaa agatccgccg ttaaatccga aataa 705

Claims (13)

1.一种DNA，其特征在于，它编码猪圆环病毒2d亚型Cap蛋白，并与SEQ ID NO 2的序列具有80％以上的相似度。

2.如权利要求1所述的DNA，其特征在于，所述的DNA的序列如SEQ ID NO 2所示。

3.一种质粒，其特征在于，该质粒是含有权利要求1所述DNA的表达载体。

4.一种蛋白，其特征在于，该蛋白的核酸编码序列与SEQ ID NO 2的序列具有80％以上的相似度。

5.一种细胞，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

6.一种单克隆抗体，其特征在于，它能够特异性结合权利要求4所述的蛋白。

7.如权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，它通过使用权利要求4所述的蛋白免疫动物，制备杂交瘤并单克隆培养，获得抗体。

8.一种单克隆抗体柱，其特征在于，它偶联权利要求6所述的单克隆抗体。

9.一种Cap蛋白的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的DNA与表达载体连接，表达蛋白。

10.权利要求1所述DNA的应用，其特征在于，通过大肠杆菌表达系统制备病毒样颗粒，制备步骤如下：

(1)将权利要求1所述DNA插入大肠杆菌表达载体，形成重组表达载体后，转化入大肠杆菌表达宿主菌，构建表达工程菌；

(2)重组大肠杆菌表达工程菌分泌表达，得到可溶性Cap蛋白；

(3)利用单克隆抗体柱对所表达Cap蛋白进行纯化，所得纯化蛋白能形成病毒样颗粒。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的大肠杆菌表达载体为pET28a(+)、pET30a(+)或者pET32a(+)。

12.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的大肠杆菌表达宿主细胞为E.coliBL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLySs或者E.coli Rosetta(DE3)。

13.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的重组大肠杆菌表达工程菌分泌表达是指，取过夜培养的表达工程菌，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6～0.8；加入终浓度为0.0001-0.0005mol/L的IPTG，37℃诱导培养5h-7h。

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