CN108355131A - 猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗及其制备方法。本发明通过对我国PCV2d毒株流行病学的分析，通过对所收集大量的毒株氨基酸序列信息比对和系统进化树分析，选取了一株我国当前流行的PCV2d毒株的Cap基因，通过密码子序列优化，采用大肠杆菌原核表达系统高效表达了PCV2d Cap蛋白，经纯化及体外组装透析缓冲液中进行组装，成功的制备了PCV2d病毒样颗粒，该病毒样颗粒在本发明的保存缓冲液中于4℃和‑20℃放置6个月不影响病毒样颗粒的形态、大小及浓度；制备好的PCV2d病毒样颗粒疫苗免疫21日的仔猪，经PCV2d病毒攻毒测试，证明该疫苗能对仔猪起到很好的保护作用。

Description

猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗及其制备方法
技术领域
本专项发明内容包括猪圆环病毒2d型(PCV2d)病毒样颗粒(virus likeparticles，VLPs) 的制备方法、成功透析组装成VLPs的体外组装缓冲液(buffer)、VLPs长期保存buffer的试 剂配方及PCV2d VLPs组装效率的评价体系，制备的病毒样颗粒疫苗用于预防猪圆环病毒2d 型疾病的感染，属于兽用生物制品领域。
背景技术
1991年猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV 2)首次在加拿大的猪群中分离得 到，目前PCV2的基因型分为：PCV 2a、PCV 2b、PCV 2c、PCV 2d(mPCV 2b)，PCV2c目 前仅在丹麦报道。最初PCV2a是流行的主要基因型，直到2003年，PCV2的主要流行毒株的基因型发生了由PCV 2a向PCV 2b的转变。2010年国内首次报道发现了变异的PCV 2毒株，命名为突变的PCV 2b毒株(mutant PCV 2b，mPCV 2b)，之后研究者根据遗传进化树分析遗传距离超过0.035，而被命名划分为PCV2d，与PCV2b的毒株同源性极高，由于ORF2 第1033-1035核苷酸的突变，导致编码的病毒衣壳蛋白(Cap)C端多出一个带正电荷的赖氨酸。之后国内外陆续报道PCV 2d的流行病学情况，现在PCV 2d已经逐渐成为流行的主导毒株。
研究发现，广泛的疫苗接种能够改变PCV 2的进化模式，从而可能导致出现具有逃避疫 苗免疫能力的PCV 2变异株。PCV 2具有迫于疫苗而进化以及疫苗诱导的病原替换的能力。 2003年主要流行毒株的基因型由PCV 2a向PCV 2b的转变，以及2010年新基因型PCV2d 的出现并迅速流行的一个重要的原因是疫苗免疫诱导的选择压力。由于PCV 2d在C端延伸 一个带正电荷的赖氨酸，改变了原有的构象型表位，而导致目前疫苗产生的抗体无法识别， 进一步造成免疫逃避，2012年美国首次报道了在免疫失败的猪场分离得到PCV 2d，为了控 制猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)，2014年韩国报道了在两个分别免疫了商业化的PCV2疫 苗的猪场分离到PCV 2d，不能有效的防控PCV 2d的流行。
目前PCV 2d已经成为主要的流行毒株，PCV 2d的出现及迅速流行可能将对我国猪场疫 病防控产生强烈的影响。由于PCV 2各个基因型之间存在交叉免疫保护性，有相关研究报道 现有的PCV 2a/PCV 2b疫苗对新的变异毒株(PCV 2d)具有一定的保护效果，
发明内容
但由于现有猪圆环病毒疫苗与流行的新变异毒株不是最佳的匹配，保护效果不是十分理 想，PCV 2的遗传变异多样性及其快速的进化速率提示我们现有的疫苗已需要进行更新升级。 为此本发明的目的在于研发出以PCV2d新变异毒株为基础的新型疫苗，将有利于更好地防控 目前流行的PCV 2d毒株。
本发明的技术方案
1.一种猪圆环病毒2d型(PCV2d)病毒样颗粒疫苗，其特征在于该疫苗的主要成分是 由含有猪圆环病毒2d型毒株Cap全长基因(命名为PCV2d-SS-Cap-Pro基因)重组表达质粒 (命名为pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro)的大肠杆菌表达的蛋白经组装而成的病毒样颗粒(VLPs)、保存缓冲液(buffer)和兽用疫苗佐剂；该表达蛋白的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)被命名为大肠埃希氏菌pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro株，该株菌已于2017年12月28 日送交中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏号CGMCC No.15135。
2.本发明所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于其中组装而成的病 毒样颗粒是经本发明建立的猪圆环病毒2d型分子筛验证体系的动态光散射组合验证和 PCV2d VLPs组装效率的评价体系评价了VLPs的大小及组装效率。
3.本发明所述一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于其中pET100-PCV2d -SS-Cap-Pro基因含有序列1所示的核苷酸序列。
4.本发明所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于含有pET100-PCV2d -SS-Cap-Pro基因的重组表达质粒的大肠杆菌表达的蛋白的氨基酸序列为序列2。
5.本发明所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于其疫苗中含有
PCV2d病毒样颗粒疫苗保存缓冲液的成分为：300mM NaCl，0.5％Nonidet P 40，10％海 藻糖，2％甘油
6.本发明所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于含有pET100-PCV2d -SS-Cap-Pro基因的重组表达质粒的大肠杆菌的构建步骤为：(1)我国典型PCV2d毒株Cap 基因的筛选；(2)PCV2d cap基因的优化合成和重组表达质粒的构建，获得重组表达质粒(命 名为：pET100-PCV 2d-SS-Cap-Pro)；(3)将pET100-PCV 2d-SS-Cap-Pro重组表达质粒转化 至大肠杆菌感受态细胞。
7.本发明所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗的配制方法，其特征在于将制备 好的PCV2d病毒样颗粒与法国赛比克Gel 01ST水性佐剂按照(W/V)1:9混合而成。
8.本发明所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于构建过程所涉及的 试剂及组分为：裂解缓冲液：NaCl 500mM，Na2HPO4 100mM，Imidazole 30mM，KH2PO4100mM，Triton X-100 1％(现加)，pH 8.0；低浓度咪唑洗涤液：NaCl 500mM，Na2HPO4 100mM，Imidazole 50mM，pH 8.0；高浓度咪唑洗涤液：NaCl 500mM，Na2HPO4 100mM，Imidazole500mM，pH8.0；组装透析液：Ammonium citrate 200mM，Na3PO4 100mM，Tris 20mM， Arginine20mM，pH7.0。
本发明具体实施方式
本发明通过对我国PCV2d毒株流行病学的分析，收集大量的毒株的序列信息，通过氨基 酸序列信息比对，系统进化树分析，选取了一株我国当前流行的典型的PCV2d毒株的Cap 基因，通过密码子序列优化，采用大肠杆菌原核表达系统，高效表达了PCV2d Cap蛋白，将 纯化后的Cap蛋白在本发明的体外组装透析缓冲液中进行组装，成功的制备了PCV2d病毒样 颗粒，在本发明的保存buffer中，病毒样颗粒在4℃和-20℃长期放置6个月不影响病毒样颗 粒的形态、大小及浓度，本发明的保存buffer可用于PCV2d病毒样颗粒疫苗的长期保存。另 将制备好的PCV2d病毒样颗粒免疫21日的仔猪，并接种PCV2d病毒，能对仔猪起到很好的 保护作用。
实施步骤：
1.我国典型PCV2d毒株Cap基因的筛选：
利用PCV 2d Cap蛋白氨基酸序列比对及遗传进化树分析的方法，将NCBI数据库收集的 PCV 2cap蛋白氨基酸的序列，利用在线氨基酸序列比对服务器，比对结果PCV 2d cap蛋白 氨基酸序列与其他毒株的Cap蛋白同源性高达95％以上，同时进行PCV2毒株遗传进化树分 析PCV 2d毒株遗传进化关系，收集大量PCV2毒株的全长基因的序列，利用PCV 2全长核 苷酸序列进行系统遗传进化树的制作，分析PCV 2d毒株遗传进化关系，结果显示所选取的 PCV 2d毒株为我国当前流行的典型毒株。
2.PCV 2d Cap蛋白单体及VLPs 3D结构模拟
(1)利用PDB蛋白数据库中PCV 2的晶体结构(PDB登录号：3R0R)为模板，利用Modeller蛋白同源建模软件对选取的PCV 2d毒株的Cap蛋白进行3D结构模拟。
(2)再将模拟的Cap蛋白单体利用VMD建模软件对其VLPs的结构进行模拟，利用PyMol蛋白3D软件进行展示和标记(见附图1)。
模拟的结果用PyMol进行展示和标记(surface模式)，模拟结果显示不影响单体及VLPs 的结构。
3.PCV2d cap基因的优化合成和重组表达质粒的构建
PCV2d全长Cap基因前41位氨基酸含有大量编码精氨酸的稀有密码子，根据大肠杆菌 密码子的偏好性，将选取的PCV 2d毒株的Cap基因进行密码子优化合成全长基因(命名为： PCV 2d-SS-Cap-Pro)序列1。
序列1：PCV 2d-SS-Cap-Pro基因(705bp)核苷酸序列
将优化合成的PCV 2d-SS-Cap-Pro基因通过两端的酶切位点(NdeⅠ和BamHⅠ)连接到 高效原核表达载体pET100_D/TOPO(Invitrogen)，构建重组表达质粒(命名为：pET100-PCV 2d-SS-Cap-Pro),重组质粒图谱(见附图2)。
4.将pET100-PCV 2d-SS-Cap-Pro重组表达质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，该大肠杆 菌(E.coli)被命名为重组大肠杆菌猪圆环病毒2d型Cap基因(pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro) 菌株，菌株已于2017年12月28日送交中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.15135。
5.PCV2d Cap蛋白(病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)的制备
(1)PCV 2d Cap蛋白的表达
1)将pET100-PCV 2d-SS-Cap-Pro重组表达质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌(北京全 式金公司)感受态细胞，涂布在浓度为100μg/mL的氨苄抗生素素的LB培养基平板，37℃倒置培养12～14h。
2)分别随机挑取一个单克隆菌落至10mL含有100μg/mL的氨苄抗生素的LB培养基，37℃220r/min振荡培养12h。
3)按照(V/V)1:100的比例，将10mL菌液加至1L已高压灭菌处理的含有100μg/mL的氨苄抗生素的α乳糖发酵培养基(0.01mol/L)，37℃180r/min振荡培养3h至OD600达到0.8～1.0，温度降至25℃，180r/min振荡培养12h后，4℃8,000g离心10min，弃掉上清液，大肠 杆菌沉淀置于-80℃保存用于蛋白纯化。
(2)亲和层析方法纯化PCV 2d Cap蛋白
1)大肠杆菌沉淀置于冰浴上，取100mL PBS裂解缓冲液(Lysis buffer，其配方为：裂 解缓冲液：NaCl 500mM，Na2HPO4 100mM，Imidazole 30mM，KH2PO4 100mM，Triton X-1001％(现加)，pH 8.0)裂解1L培养液离心的沉淀(按1:10倍体积比浓缩)，充分悬浮细菌沉淀。
2)将悬浮的样品利用低温超高压连续流细胞破碎机进行破碎沉淀，1300bar压力，反复 破碎6～8遍，破碎产物利用革兰氏染色方法，显微镜下观察大肠杆菌95％以上全部破碎，破 碎后样品于4℃16,000g离心20min，离心后收集上清。
3)纯化前先用3～5倍柱子体积蒸馏水清洗Ni-NTA填料，然后再用3～5倍柱体积的PBS 缓冲液进行平衡，再将离心收集的上清液与4mL Ni-NTA填料于室温摇床轻微振荡结合1h。
4)将结合上清的填料转移至柱子里面，让上清液自然流出柱子收集，为流穿液(Flow through)，放置4℃保存用于后期样品分析。
5)用3倍柱子体积的低浓度咪唑的洗涤液(wash buffer：NaCl 500mM，Na2HPO4100mM， Imidazole 50mM，pH 8.0)将与填料结合的杂蛋白洗脱掉，在洗脱的最后一个柱体积时收集 1mL洗脱样品进行分析。
6)先用1个柱子体积的高浓度咪唑洗涤液(Elution buffer：NaCl 500mM，Na2HPO4100 mM，Imidazole 500mM，pH8.0)将与填料结合的目的蛋白进行洗脱，用1.5mL离心管进行收集，洗脱的蛋白样品放置4℃保存。
7)接着再用2-3个柱子体积的Elution buffer清洗填料，将与填料结合的蛋白洗脱干净， 便于填料的可回收重新利用。
8)最后先用5倍柱体积的蒸馏水清洗填料，然后再用3-4倍柱体积20％的酒精清洗填料， 最后填料保存至20％酒精中。
9)所有收集的样品加入(5×SDS-PAGE sample buffer：Tris-Hcl 225mM，甘油50％，SDS 5％，溴酚蓝0.05％)，100℃煮沸10min，进行SDS-PAGE分析。
按照亲和层析的纯化方法，SDS-PAGE分析成功纯化了PCV2d cap蛋白(详细过程见实 施例2)，纯化蛋白大小与预期蛋白分子量大小一致，结果(见图3，其氨基酸序列见序列2)。
序列2：PCV2d-SS-Cap蛋白(234aa，28KD，等电点：10.8)氨基酸序列
(3)PCV 2d Cap病毒样颗粒的组装
将上述亲和层析纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析后，选择高浓度及高纯度的蛋白放置 7000D大小透析袋中置于4℃冰柜在本发明的组装缓冲液(Ammonium citrate 200mM，Na3PO4 100mM，Tris 20mM，Arginine 20mM，pH7.0)中透析48h，透析后收集的样品用1％磷钨酸进行负染，在透射电镜下观察病毒样颗粒。
(4)PCV2d病毒样颗粒的组装鉴定及稳定性测试
1)间接免疫荧光技术鉴定入侵细胞效率
将PCV2d VLPs取1μg侵染猪肾上皮细胞(PK15)，侵染30min，用免疫的兔血清孵育1h，再用FITC绿色荧光素标记的羊抗兔抗体孵育1h，荧光显微镜下观察入侵细胞效率。
将制备的PCV 2d病毒样颗粒入侵PK15细胞，间接免疫荧光实验结果能在PK15细胞核 周围有大量的绿色荧光，表明制备的PCV 2d病毒样颗粒具有与野生型病毒一样入侵PK15细 胞的特性，结果(见图5)。
2)分子筛验证VLPs的组装效率
建立分子筛验证体系，用BSA(68KD)作为标准样品，分子筛验证BSA样品在70mL体积被洗脱下来，观察制备的VLPs被洗脱的体积大小及紫外吸收峰情况。
分子筛实验显示PCV2d病毒样颗粒在体积约为42mL左右被洗脱下来，且只出现单一的 紫外吸收峰，结果显示所制备的PCV2d病毒样颗粒组装效率很高，病毒样颗粒纯度很高，分 子筛结果(见图6)。
3)动态光散射验证VLPs的大小及组装效率
将制备的VLPs取1mL用动态光散射仪测量VLPs的直径大小及验证组装效率，测量三 次取其平均值。
动态光散射实验结果显示测量的颗粒大小为17.4nm，颗粒数量所占比例为100％，结果 表明制备的PCV2d病毒样颗粒组装效率极高，且直径大小与PCV2d病毒颗粒大小一致，结 果(见图7)。
4)PCV2d病毒样颗粒疫苗保存缓冲液(buffer)稳定性
将体外透析组装制备好的VLPs加入本发明的保存buffer试剂(300mM NaCl，0.5％Nonidet P 40，10％海藻糖，2％甘油)测试病毒样颗粒的稳定性，分别放置4℃和-20℃保存6个月，再将保存的病毒样颗粒进行电镜观察，其结果为：体外透析组装制备好的VLPs加入保存buffer的病毒样颗粒分别在4℃和-20℃放置6个月后，病毒样颗粒的形态、大小及浓度基本一致(见图4B、C)，表明本发明的保存buffer能长期保持病毒样颗粒的稳定性。
疫苗配制
将制备好保存在本发明的保存buffer中的PCV2d病毒样颗粒与法国赛比克Gel01ST水 性佐剂(按照体积比9:1)混合后制备成疫苗。
4.仔猪免疫保护试验
选取21日龄ELISA血清学检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病 毒均为阴性的仔猪25头，随机分为5组(5头猪/组)。将制备好的PCV 2d病毒样颗粒疫苗与法国赛比克Gel 01ST水性佐剂按照9:1比例混合，配成50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL， 第1组免疫50μg，第2组免疫100μg，第3组免疫200μg，第4组为PBS攻毒对照组，第 5组为空白对照组，每组分别于颈部肌肉免疫1次，免疫后28天对1-4组分别接种4mL 5×105.5TCID50PCV2d病毒(肌肉注射2mL，滴鼻接种2mL)，第5组空白对照进行隔离单独饲养。 攻毒后第4、7天在两腋下及两臀部四点注射2mg弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔蓝蛋白 (0.5mg/mL，4mL)，于第4、7、11、19天腹腔注射10mL巯基乙酸培养基。所有组别的猪 在免疫后第14、21、28天采血分离血清检测ELISA抗体水平及中和抗体水平，所有的猪攻 毒后28天全部剖检采取淋巴结等组织，进行免疫组化检测抗原。
(1)ELISA抗体水平与中和抗体水平免疫两周后血清中和抗体水平达1:80-1:90之间， 且随着时间增加中和抗体水平逐渐升高，免疫后28天中和抗体水平达1:240，而PBS对照组 和空白组无中和抗体(图8B)。
(2)个体相对日增重、免疫组化及体温变化攻毒后连续14天测量猪的体温变化，结果PBS攻毒对照组5头猪体温均连续3天超过40℃，而疫苗免疫组及空白对照组体温均为正常。免疫组化检测淋巴结PCV 2d病原，疫苗免疫组与空白对照组淋巴结PCV 2d抗原检测均为阴性，而攻毒保护组4头为PCV 2d阳性。个体相对日增重，疫苗免疫组与空白对照组无 显著差异，攻毒对照组个体相对日增重显著低于疫苗免疫组及空白对照组，疫苗免疫的三个组5头均能起到保护作用，而攻毒对照组5头均判定为发病(见实施例5表1)。
附图说明
图1PCV2d cap蛋白亚基3D结构模拟图
图2pET100-PCV 2d-SS-Cap-Pro重组质粒图谱
图3PCV 2d Cap蛋白纯化结果
图4PCV 2d病毒样颗粒电镜结果
图5PCV 2d病毒样颗粒间接免疫实验结果
图6PCV 2d病毒样颗粒分子筛鉴定结果图
图7PCV 2d病毒样颗粒动态光实验结果图
图8PCV 2d ELISA抗体水平检测及中和抗体水平
本发明所涉及微生物资源信息
本发明涉及的高效表达了PCV2d Cap蛋白的大肠杆菌(E.coli)被命名为重组大肠杆菌 猪圆环病毒2d型Cap基因(pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro)菌株，该菌株已于2017年12月28 日送交中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏号CGMCC No.15135。
本发明积极意义
本发明涉及猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗及其制备方法。本发明通过对我国PCV2d 毒株流行病学的分析，通过对所收集大量的毒株氨基酸序列信息比对和系统进化树分析，选 取了一株我国当前流行的PCV2d毒株的Cap基因，通过密码子序列优化，采用大肠杆菌原核 表达系统高效表达了PCV2d Cap蛋白，经纯化及体外组装透析缓冲液中进行组装，成功的制 备了PCV2d病毒样颗粒，该病毒样颗粒在本发明的保存缓冲液中于4℃和-20℃放置6个月 不影响病毒样颗粒的形态、大小及浓度；制备好的PCV2d病毒样颗粒疫苗免疫21日的仔猪， 经PCV2d病毒攻毒测试，证明该疫苗能对仔猪起到很好的保护作用。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明的技术方案，不对本发明的技术方案构成限制。
实施例1
——PCV2d Cap蛋白的表达
1)将pET100-PCV 2d-SS-Cap-Pro重组表达质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌(北京全 式金公司)感受态细胞，涂布在浓度为100μg/mL的氨苄抗生素素的LB培养基平板，37℃倒置培养12～14h。
2)分别随机挑取一个单克隆菌落至10mL含有100μg/mL的氨苄抗生素的LB培养基，37℃220r/min振荡培养12h。
3)按照(V/V)1:100的比例，将10mL菌液加至1L已高压灭菌处理的含有100μg/mL的氨苄抗生素的α乳糖发酵培养基(0.01mol/L)，37℃180r/min振荡培养3h至OD600达到0.8～1.0，温度降至25℃，180r/min振荡培养12h后，4℃8,000g离心10min，弃掉上清液，大肠 杆菌沉淀置于-80℃保存用于蛋白纯化。
实施例2
——亲和层析方法纯化PCV 2d Cap蛋白
1)大肠杆菌沉淀置于冰浴上，取100mL PBS裂解缓冲液(Lysis buffer，其配方为：裂 解缓冲液：NaCl 500mM，Na2HPO4 100mM，Imidazole 30mM，KH2PO4 100mM，Triton X-1001％(现加)，pH 8.0)裂解1L培养液离心的沉淀(按1:10倍体积比浓缩)，充分悬浮细菌沉淀。
2)将悬浮的样品利用低温超高压连续流细胞破碎机进行破碎沉淀，1300bar压力，反复 破碎6～8遍，破碎产物利用革兰氏染色方法，显微镜下观察大肠杆菌95％以上全部破碎，破 碎后样品于4℃16,000g离心20min，离心后收集上清。
3)纯化前先用3～5倍柱子体积蒸馏水清洗Ni-NTA填料，然后再用3～5倍柱体积的PBS 缓冲液进行平衡，再将离心收集的上清液与4mL Ni-NTA填料于室温摇床轻微振荡结合1h。
4)将结合上清的填料转移至柱子里面，让上清液自然流出柱子收集，为流穿液(Flow through)，放置4℃保存用于后期样品分析。
5)用3倍柱子体积的低浓度咪唑的洗涤液(wash buffer：NaCl 500mM，Na2HPO4100mM， Imidazole 50mM，pH 8.0)将与填料结合的杂蛋白洗脱掉，在洗脱的最后一个柱体积时收集 1mL洗脱样品进行分析。
6)先用1个柱子体积的高浓度咪唑洗涤液(Elution buffe：NaCl 500mM，Na2HPO4100mM， Imidazole 500mM，pH8.0)将与填料结合的目的蛋白进行洗脱，用1.5mL离心管进行收集， 洗脱的蛋白样品放置4℃保存。
7)接着再用2-3个柱子体积的Elution buffer清洗填料，将与填料结合的蛋白洗脱干净， 便于填料的可回收重新利用。
8)最后先用5倍柱体积的蒸馏水清洗填料，然后再用3-4倍柱体积20％的酒精清洗填料， 最后填料保存至20％酒精中。
9)所有收集的样品加入(5×SDS-PAGE sample buffer：Tris-Hcl 225mM，甘油50％， SDS 5％，溴酚蓝0.05％)，100℃煮沸10min，进行SDS-PAGE分析。
按照亲和层析的纯化方法，SDS-PAGE分析成功纯化了PCV2d cap蛋白，纯化蛋白大小 与预期蛋白分子量大小一致，结果(见图3，其氨基酸序列见序列2)。
实施例3
——PCV 2d病毒样颗粒的组装
将实施例2所制备的经亲和层析纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析后，选择高浓度及高纯 度的蛋白放置7000D大小透析袋中置于4℃冰柜在本发明的组装缓冲液(Ammoniumcitrate 200mM，Na3PO4 100mM，Tris 20mM，Arginine 20mM，pH7.0)中透析48h，透析后收集的样品用1％磷钨酸进行负染，在透射电镜下观察病毒样颗粒。
实施例4
——疫苗配制
将制备好保存在本发明的保存buffer中的PCV2d病毒样颗粒与法国赛比克Gel01ST水 性佐剂(按照体积比9:1)混合后制备成疫苗。
实施例5
——仔猪免疫保护试验
选取21日龄ELISA血清学检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病 毒均为阴性的仔猪25头，随机分为5组(5头猪/组)。将制备好的PCV 2d病毒样颗粒疫苗与法国赛比克Gel 01ST水性佐剂按照9:1比例混合，配成50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL， 第1组免疫50μg，第2组免疫100μg，第3组免疫200μg，第4组为PBS攻毒对照组，第 5组为空白对照组，每组分别于颈部肌肉免疫1次，免疫后28天对1-4组分别接种4mL 5×105.5TCID50PCV2d病毒(肌肉注射2mL，滴鼻接种2mL)，第5组空白对照进行隔离单独饲养。 攻毒后第4、7天在两腋下及两臀部四点注射2mg弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔蓝蛋白 (0.5mg/mL，4mL)，于第4、7、11、19天腹腔注射10mL巯基乙酸培养基。所有组别的猪 在免疫后第14、21、28天采血分离血清检测ELISA抗体水平及中和抗体水平，所有的猪攻 毒后28天全部剖检采取淋巴结等组织，进行免疫组化检测抗原。
(1)ELISA抗体水平与中和抗体水平将PCV2d VLPs包被至ELISA板(每孔1μg)， 血清1:100倍稀释检测，免疫两周后抗体水平明显升高，随着时间增加抗体水平逐渐升高，PBS组与空白对照组均为阴性(图8A)。将血清两倍逐一稀释，中和200TCID50PCV2d病毒， 免疫两周后血清中和抗体水平达1:80-1:90之间，且随着时间增加中和抗体水平逐渐升高，免疫后28天中和抗体水平达1:240，而PBS对照组和空白组无中和抗体(图8B)。
(2)个体相对日增重、免疫组化及体温变化攻毒后连续14天测量猪的体温变化，结果PBS攻毒对照组5头猪体温均连续3天超过40℃，而疫苗免疫组及空白对照组体温均为正常。免疫组化检测淋巴结PCV 2d病原，疫苗免疫组与空白对照组淋巴结PCV 2d抗原检测均为阴性，而攻毒保护组4头为PCV 2d阳性。个体相对日增重，疫苗免疫组与空白对照组无 显著差异，攻毒对照组个体相对日增重显著低于疫苗免疫组及空白对照组，疫苗免疫的三个组5头均能起到保护作用，而攻毒对照组5头均判定为发病(表1)。
表1个体相对日增重、免疫组化及体温变化
组别(动物数) 平均个体相对日增重(Kg) 免疫组化 体温变化
50μg(5头) 0.033 5头淋巴结PCV2d阴性 正常
100μg(5头) 0.0302 5头淋巴结PCV2d阴性 正常
200μg(5头) 0.0325 5头淋巴结PCV2d阴性 正常
PBS攻毒对照组(5头) 0.0271 4头淋巴结PCV2d阳性 5头升高
空白对照(5头) 0.03065 5头淋巴结PCV2d阴性 正常
注：发病的判定标准
试验结果符合以下任意两项标准即判定为发病：
(1)体温变化：攻毒后仔猪体温连续3天超过40℃；
(2)个体相对日增重：攻毒对照组个体相对日增重显著低于疫苗免疫组判定为发病，疫 苗免疫组的个体相对日增重与空白对照组无显著差异判定为保护
个体相对日增重＝(攻毒后第28日体重－攻毒当日体重)÷28÷攻毒当日体重；
(3)免疫组化检测淋巴结应检测到PCV 2d病毒抗原。
序列表
<110> 江苏南农高科技股份有限公司
<120> 猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗及其制备方法
<130> 18020
<140> 中国
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 705
<212> DNA
<213> PCV 2d-SS-Cap-Pro基因核苷酸序列()
<400> 1
atgacctacc cgcgtcgtcg ctatcgtcgt cgtcgccatc gcccgcgttc ccatctgggt 60
cagatcctgc gtcgccgtcc gtggctggtt catccgcgcc accgttaccg ttggcgccgt 120
aaaaacggta tttttaatac ccgtctgagc cgcaccatcg gctatacggt taaggcaacc 180
acggtccgta ccccgtcttg gaacgttgat atgatgcgct ttaacattaa tgacttcctg 240
ccgccgggcg gtggcagcaa tccgctgacc gtcccgtttg aatattaccg tattcgcaaa 300
gtgaaggttg aattctggcc gtgctcaccg atcacccaag gtgatcgtgg tgtgggctcg 360
acggctgtta ttctggatga caacttcgtc accaaagcga atgccctgac gtatgacccg 420
tacgtgaact atagctctcg ccataccatc acgcagccgt ttagttacca ctcccgttat 480
ttcaccccga aaccggttct ggatcgcacg attgactatt ttcaaccgaa caataagcgt 540
aaccagctgt ggctgcgcct gcaaaccacg ggcaatgtcg atcacgtggg tctgggcacc 600
gccttcgaaa acagtatcta cgatcaggac tacaacatcc gtatcacgat gtatgtccag 660
ttccgcgaat ttaatctgaa agacccgccg ctgaatccga aataa 705
<210> 2
<211> 234
<212> PRT
<213> PCV2d-SS-Cap蛋白氨基酸序列()
<400> 2
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys
225 230

Claims (8)

1.一种猪圆环病毒2d型(PCV2d)病毒样颗粒疫苗，其特征在于该疫苗的主要成分是由猪圆环病毒2d型毒株病毒样颗粒(VLPs)、保存缓冲液(buffer)和兽用疫苗佐剂组成；该病毒样颗粒由PCV2d的Cap蛋白质，在体外特定的缓冲液中高效地组装而成，并在保存缓冲液中长期稳定存在；该Cap蛋白质是由我们人工优化合成的PCV2d cap基因(命名为PCV2d-SS-Cap-Pro基因)克隆到重组表达质粒(命名为pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro)后，经大肠杆菌表达，通过亲和纯化大量获得；该表达蛋白的大肠埃希氏菌被命名为重组大肠埃希氏菌(Escherichia Coli)pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro株，该株菌已于2017年12月28日送交中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCCNo.15135。
2.权利要求1所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于，在本发明中，该病毒样颗粒是经本发明建立的猪圆环病毒2d型分子筛验证体系的动态光散射组合验证和PCV2d VLPs组装效率的评价体系评价了VLPs的大小及组装效率。
3.权利要求1所述一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于其中pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro基因含有序列1所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于含有pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro基因的重组表达质粒的BL21(DE3)大肠杆菌表达的蛋白的氨基酸序列为序列2。
5.权利要求1所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于其疫苗中含有的PCV2d病毒样颗粒疫苗保存缓冲液的成分为：300mM NaCl，0.5％Nonidet P 40，10％海藻糖，2％甘油,200mM Ammonium citrate，100mM Na3PO4，20mM Tris，20mM Arginine。
6.权利要求1所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于含有pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro基因的重组表达质粒的大肠杆菌的构建步骤为：(1)我国典型PCV2d毒株cap基因的筛选；(2)PCV2d cap基因的优化合成和重组表达质粒的构建，获得重组表达质粒(命名为：pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro)；(3)将pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro重组表达质粒转化至大肠杆菌感受态细胞(CGMCC No.15135)。
7.权利要求1所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗的配制方法，其特征在于将制备好的PCV2d病毒样颗粒与法国赛比克Gel 01ST水性佐剂按照(W/V)1:9混合而成。
8.权利要求1、6所述的一种猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗，其特征在于构建过程所涉及的试剂及组分为：裂解缓冲液：NaCl 500mM，Na2HPO4 100mM，Imidazole 30mM，KH2PO4100mM，Triton X-100 1％(现加)，pH 8.0；低浓度咪唑洗涤液：NaCl 500mM，Na2HPO4 100mM，Imidazole 50mM，pH 8.0；高浓度咪唑洗涤液：NaCl 500mM，Na2HPO4 100mM，Imidazole500mM，pH8.0；组装透析液：Ammonium citrate 200mM，Na3PO4 100mM，Tris 20mM，Arginine20mM，pH7.0。
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