CN112011556A - 一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗及其制备和应用。本发明对猪圆环病毒2b和2d的衣壳蛋白基因进行了突变改造和优化，大大提高了猪圆环病毒2b和2d衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达水平和组装成病毒样颗粒的产量，病毒样颗粒的纯化工艺较简单，易于大规模生产，成本较低。本发明提供的猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的免疫保护效果均优于猪圆环病毒2b的单价病毒样颗粒疫苗和猪圆环病毒2d的单价病毒样颗粒疫苗，且安全、有效、质量可控、成本较低，对于猪圆环病毒2型引起的相关疾病的防控提供了方便且更为有效的技术手段。

Description

一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及一种在大肠杆菌中高效表达的经过突变改造和优化的PCV2b型和2d型的Cap蛋白基因，及该基因高效表达自组装为病毒样颗粒(Virus like particles,VLP)和病毒样颗粒的纯化方法，以及由该方法制备的猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗和应用。本发明属于生物技术与动物病毒学技术领域。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒，现已知PCV有三个血清型：即PCV1、PCV2及PCV3。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒，PCV3为近几年刚刚被发现但临床致病性尚存在争议的病毒。PCV2引起的猪圆环病毒病最早发现于加拿大(1991)，很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，除PMWS外，PDNS(猪皮炎与肾病综合征)、PNP(增生性坏死性肺炎)、PRDC(猪呼吸道疾病综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联，现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。由PCV2感染引起的PMWS于2001年开始在我国各地呈暴发流行，是危害我国养猪业的重要疫病之一。PCV2可分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d四个亚型，其中PCV2d、PCV2d两个亚型是目前我国临床上主要的流行毒株。
PCV2含有2个主要的开放阅读框(ORF)，其中ORF2基因编码病毒的衣壳蛋白(Cap)是主要结构蛋白，也是主要免疫原性蛋白，是发展新型疫苗的良好靶基因。国内已经有PCV2全病毒及杆状病毒载体灭活疫苗和基因工程疫苗上市，全病毒灭活疫苗中有效抗原含量占比较低，目前根据相关企业的宣传报道，其疫苗产品病毒颗粒含量和纯度已经达到国内同类产品顶尖水平，病毒颗粒含量可达3μg/mL，纯度可达4％。由此可见，即便是做得很好的国产圆环病毒灭活疫苗杂蛋白含量也高达96％左右，不可避免会导致免疫猪的机体免疫资源浪费和较高比例的临床副反应；经过纯化的PCV2基因工程亚单位疫苗中有效抗原含量高，杂蛋白少，免疫效果好并且临床副反应很小。PCV2基因工程亚单位疫苗必将是今后防治PCV2引起的猪圆环病毒病的主流疫苗产品。
目前我国已经上市的PCV2基因工程亚单位疫苗有2014年青岛易邦生物工程有限公司研制的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗(大肠杆菌源)和2017年普莱柯生物工程股份有限公司研制的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗(大肠杆菌源)，以上两家公司均为采用大肠杆菌表达重组的PCV2 Cap蛋白，其有效抗原成分就是重组Cap蛋白形成的病毒样颗粒(Virus-Like-Particles,VLP)，以上两个基因工程亚单位疫苗均为PCV2b病毒样颗粒的单价疫苗。
我们的研究发现，PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗对于PCV2d攻击的保护效果不如PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗，PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗对于PCV2b攻击的保护效果不如PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗，而PCV2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的免疫保护效果均优于PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗和PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗，因此，PCV2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的研制具有重要的经济价值。PCV2基因工程亚单位疫苗中VLP含量对疫苗的效果起着决定性的作用；采用大肠杆菌表达重组的PCV2 Cap蛋白时，纯化的VLP中内毒素残留的多少也是影响疫苗品质的重要因素，为了进一步提高PCV2基因工程亚单位疫苗的产品质量标准和质控标准，提高该疫苗在临床上的使用效果，研制新的安全有效的PCV2b、PCV2d型二价病毒样颗粒疫苗具有重要的价值和意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因，该基因能够在大肠杆菌中高效表达PCV 2b型和2d型的衣壳蛋白；
本发明的另一目的是提供由上述经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白自组装成的病毒样颗粒(Virus like particles,VLP)及其制备方法；
本发明的再一目的是提供一种安全有效的猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗，该疫苗包含上述经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白自组装成的病毒样颗粒，并对该二价疫苗在本动物(猪)上进行安全和效力评价。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的前期研究结果表明，直接克隆PCV2b和PCV2d的原始完整衣壳基因到大肠杆菌表达载体中，经过数套方案均未获得明显的目的蛋白表达。因此，本发明最开始设计了5套PCV2b衣壳重组蛋白的密码子优化和基因突变改造优化方案，包括1套PCV2b衣壳蛋白原始全长基因的密码子优化和4套PCV2b衣壳蛋白基因的突变改造优化。具体而言，方案1：在考虑到密码子偏爱性和GC含量等因素的基础上对PCV2b衣壳蛋白基因进行不改变氨基酸序列的部分密码子优化；方案2：在方案2的基础上，对N端再进行三个氨基酸突变，方案3：在方案2的基础上，对N端再进行四个氨基酸突变；方案4：在方案3的基础上，对N端再进行三个氨基酸突变；方案5：在方案4的基础上，对N端再进行两个氨基酸突变；以上5套不同优化表达方案的结果是：方案1、2、3的表达量极低；方案5的表达量稍高，但也未达到期望的高效表达水平；方案4的表达量在5套方案最高，基本达到了期望的高效表达水平；但是进一步的可溶性表达分析发现，方案4的PCV2b衣壳的可溶性重组蛋白未达到高效表达水平。
根据方案4的结果，本发明随后设计了3套PCV2b衣壳重组蛋白的基因突变改造优化方案。具体而言，方案6：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变；方案7：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变；方案8：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了15个氨基酸突变；以上3套不同优化表达方案的结果是：方案6、7的表达量较高，基本达到了期望的高效表达水平，可溶性重组蛋白也达到了较高效表达水平；方案8的表达量在3套方案最高，可溶性PCV2b Cap重组蛋白的表达水平在3套方案中也是最高的。
根据方案4的结果，本发明随后设计了3套PCV2d衣壳重组蛋白的基因突变改造优化方案。具体而言，方案9：对PCV2d衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变；方案10：对PCV2d衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变；方案11：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了15个氨基酸突变；以上3套不同优化表达方案的结果是：方案9、10的表达量较高，基本达到了期望的高效表达水平，可溶性重组蛋白也达到了较高效表达水平；方案11的表达量在3套方案最高，可溶性PCV2d衣壳重组蛋白的表达水平在3套方案中也是最高的。
将方案6、方案7、方案8的可溶性PCV2b衣壳重组蛋白和方案9、方案10、方案11的可溶性PCV2d衣壳重组蛋白进行纯化，所纯化的PCV2b重组衣壳蛋白和PCV2d重组衣壳蛋白在电子显微镜均可以看到典型的病毒样颗粒，方案8和方案11获得的病毒样颗粒最多。综上可见，方案8和方案11是我们设计的11套方案中的最优方案。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因，其中，经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示，经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示；优选的，经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
含有所述的经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
进一步的，本发明还提出了所述的经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因、所述的表达载体或所述的宿主细胞在制备猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒中的应用。
再进一步的，本发明还提出了一种制备猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒的方法，包括以下步骤：
1)合成本发明所述的经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因连接至pET30a载体，产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap或pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为2g/L的α乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵进行初步纯化后，再经两步层析精细纯化，包括第一步阴离子交换层析和第二步凝胶过滤层析，得到猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒。
其中，优选的，步骤5)中以饱和硫酸铵进行初步纯化的具体操作如下：
用pH6.5的20mM PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换柱，随后将以饱和硫酸铵进行初步纯化的上清缓慢载入平衡后的柱子，选用pH6.5的含有0.3M NaCl的20mM PB缓冲液对杂蛋白进行洗脱，选用pH6.5的含有1M NaCl的20mM PB缓冲液对目的蛋白进行洗脱，得到初步纯化的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液；
步骤5)中两步层析精细纯化的具体操作如下：利用孔径为300kD的切向流膜过滤系统分别对经离子交换层析的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液进行5到10倍超滤浓缩；选用pH6.5的含有0.2M NaCl的20mM PB缓冲液平衡琼脂糖6FF凝胶过滤层析柱，5％柱体积分别载入初步纯化后经过超滤浓缩的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液，收集在OD 280nm监测下第一个可吸收峰洗脱的样品，即精细纯化后的重组2b型或2d型Cap蛋白，并自组装成典型的猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒，分别命名为PCV2b-VLP和PCV2d-VLP。
按照所述的方法制备得到的猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒也在本发明的保护范围之内。
更进一步的，本发明还提出了一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗，其包含猪圆环病毒2b型和2d型病毒样颗粒，所述的猪圆环病毒2b型病毒样颗粒是由经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白自组装而成，所述的猪圆环病毒2d型病毒样颗粒是由经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白自组装而成，其中编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示，编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示，优选的，编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
其中，优选的，所述的猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒按照前述方法制备得到，优选的，所述猪圆环病毒2b型和2d型病毒样颗粒的质量比为1：1。
其中，优选的，所述的疫苗中还包含兽医学可接受的佐剂，优选的，所述佐剂为水佐剂、凝胶系列佐剂、蜂胶佐剂、细胞因子佐剂、免疫刺激复合物佐剂中的任意一种或多种，更优选的，所述的佐剂为603佐剂。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明对PCV2b和PCV2d的衣壳蛋白基因进行了突变改造和优化，大大提高了PCV2b和PCV2d衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达水平和组装成病毒样颗粒的产量；
2、本发明的病毒样颗粒的纯化工艺较简单，易于大规模生产，成本较低。
3、本发明提供了一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗，实验证明，该疫苗的免疫保护效果均优于PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗和PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗，本发明的提出对于猪圆环病毒2型引起的相关疾病的防控提供了更为有效的技术手段。
4、本发明的一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗安全、有效、质量可控，且制备成本较低，适合大规模工业生产。
附图说明
图1为大肠杆菌表达的本发明猪圆环病毒2b型重组衣壳蛋白的SDS-PAGE结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.1所示序列表达结果；2为SEQ ID NO.2所示序列表达结果；3为SEQ ID NO.3所示序列表达结果；4为SEQ ID NO.4所示序列表达结果；5为SEQ ID NO.5所示序列表达结果。
图2为SEQ ID NO.4所示序列表达重组蛋白的可溶性分析SDS-PAGE结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.4所示序列重组菌表达的总蛋白；2为SEQ ID NO.4所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；3为SEQ ID NO.4所示序列重组菌表达的可溶性蛋白。
图3为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示序列表达重组蛋白的可溶性分析SDS-PAGE结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.6所示序列重组菌表达的总蛋白；2为SEQ ID NO.6所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；3为SEQ ID NO.6所示序列重组菌表达的可溶性蛋白；4为SEQ ID NO.7所示序列重组菌表达的总蛋白；5为SEQ ID NO.7所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；6为SEQ ID NO.7所示序列重组菌表达的可溶性蛋白；7为SEQID NO.8所示序列重组菌表达的总蛋白；8为SEQ ID NO.8所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；9为SEQ ID NO.8所示序列重组菌表达的可溶性蛋白。
图4为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白的可溶性分析SDS-PAGE结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.9所示序列重组菌表达的总蛋白；2为SEQ ID NO.9所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；3为SEQ ID NO.9所示序列重组菌表达的可溶性蛋白；4为SEQ ID NO.10所示序列重组菌表达的总蛋白；5为SEQ ID NO.10所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；6为SEQ ID NO.10所示序列重组菌表达的可溶性蛋白；7为SEQ ID NO.11所示序列重组菌表达的总蛋白；8为SEQ ID NO.11所示序列重组菌表达的不可溶性蛋白；9为SEQ ID NO.11所示序列重组菌表达的可溶性蛋白。
图5为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示序列表达重组蛋白初步纯化产物形成病毒样颗粒的电镜结果；
其中：A为SEQ ID NO.6所示序列表达重组蛋白初步纯化产物；B为SEQ ID NO.7所示序列表达重组蛋白初步纯化产物；C为SEQ ID NO.8所示序列表达重组蛋白初步纯化产物。
图6为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白初步纯化产物形成病毒样颗粒的电镜结果；
其中：A为SEQ ID NO.9所示序列表达重组蛋白初步纯化产物；B为SEQ ID NO.10所示序列表达重组蛋白初步纯化产物；C为SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白初步纯化产物。
图7为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白在第一步离子交换层析纯化结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.8所示序列表达的重组衣壳蛋白；2为SEQ ID NO.11所示序列表达的重组衣壳蛋白。
图8为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白在第二步凝胶过滤层析纯化结果；
其中：M为预染蛋白Marker；1为SEQ ID NO.8所示序列表达的重组衣壳蛋白；2为SEQ ID NO.11所示序列表达的重组衣壳蛋白。
图9为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白精细纯化产物形成病毒样颗粒的电镜结果；
其中：A为SEQ ID NO.8所示序列表达重组蛋白精细纯化产物；B为SEQ ID NO.11所示序列表达重组蛋白精细纯化产物。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所设定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
实施例1、经过密码子优化和基因突变改造优化的PCV2b和PCV2d衣壳蛋白基因的合成
本发明开始设计了5套PCV2b衣壳蛋白的密码子优化和基因突变改造优化方案，包括1套PCV2b衣壳蛋白原始全长基因的密码子优化和4套PCV2b衣壳蛋白基因的突变改造优化。具体而言，方案1：在考虑到密码子偏爱性和GC含量等因素的基础上对PCV2b衣壳蛋白基因进行部分密码子优化，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；方案2：在方案1的基础上，对N端进行三个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；方案3：在方案2的基础上，对N端进行其它四个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；方案4：在方案3的基础上，对N端进行其它两个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；方案5：在方案4的基础上，对N端进行其它两个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
根据方案4的结果，本发明随后设计了3套PCV2b衣壳重组蛋白的基因突变改造优化方案。具体而言，方案6：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；方案7：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；方案8：对PCV2b衣壳蛋白N端重新设计了15个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
根据方案4的结果，本发明随后设计了3套PCV2d衣壳重组蛋白的基因突变改造优化方案。具体而言，方案9：对PCV2d衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；方案10：对PCV2d衣壳蛋白N端重新设计了9个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；方案11：对PCV2d衣壳蛋白N端重新设计了15个氨基酸突变，优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
实施例2、对比各种优化及突变改造的PCV2b和PCV2d衣壳蛋白(Cap)基因的重组蛋白表达水平及是否形成病毒样颗粒
1)Cap蛋白表达载体的构建
分别将人工合成的优化后的Cap蛋白基因(SEQ ID NO.1-11所示)与pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点连接并在16℃过夜。之后将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，涂至含卡那霉素的LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上的单菌落，进行菌液PCR鉴定并测序。鉴定正确后抽提重组质粒。
2)重组Cap蛋白的诱导表达
将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，以1：100的比例接入含卡那霉素的TB培养基中37℃，220rpm过夜培养。将活化的菌液以1:50比例接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，25℃，220rpm进行诱导表达10h。随后离心收集菌液，按照100ml菌体加入10ml缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0)重悬菌体。对重悬的菌体进行超声破碎，冰上操作。工作3s，停顿6s，Amp设置为39％，重复300个循环。随后将破碎完成的菌液离心，12000rpm，30min，4℃，收集上清。
样品处理过后进行SDS-PAGE分析，结果如图1，图2，图3以及图4所示，目的蛋白大小约28Kd。对比多套方案的表达水平，在突变改造和优化的PCV2b衣壳蛋白基因中，SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8基因的可溶性重组蛋白的表达水平远高于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。PCV2d衣壳蛋白基因突变改造和优化的SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11基因直接借鉴于PCV2b衣壳蛋白基因优化的方案6、方案7和方案8，表达结果表明，SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11基因均获得了高效可溶性重组蛋白的表达。因此选取SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11进行后续电镜观察，判断是否形成猪圆环病毒2b和2d型病毒样颗粒。
3)电镜观察
分别将2)中获得的高效表达的重组蛋白送至透射电镜观察。SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示序列方案都可以观察到明显的圆形空心颗粒，结果如图5所示，直径大约为17-20nm，说明此三套方案均成功形成了猪圆环病毒2b型病毒样颗粒。SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示序列方案也都可以观察到明显的圆形空心颗粒，结果如图6所示，直径大约为17-20nm，说明此三套方案均成功形成了猪圆环病毒2d型病毒样颗粒。在SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示序列方案中，SEQ ID NO.8的病毒样颗粒量最高。在SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示序列方案中，SEQ ID NO.11的病毒样颗粒量最高。所以最终确定SEQ ID NO.8所示的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ IDNO.11所示的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因为制备病毒样颗粒的最佳目的基因。
实施例3、猪圆环病毒2b和2d型衣壳蛋白的表达、纯化以及猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的制备
1)合成SEQ ID NO.8所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因和SEQ ID NO.11所示的突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因分别连接至pET30a载体的NdeI和XhoI酶切位点，产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为2g/L的α-乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵进行初步纯化后，再经两步层析纯化，包括第一步阴离子交换层析，利用切向流膜过滤系统对离子交换层析产物进行超滤浓缩，和第二步凝胶过滤层析，得到猪圆环病毒2b型和2d型病毒样颗粒。具体操作如下：
PCV2b型和2d型重组Cap蛋白的初步纯化：用缓冲液(20mM PB缓冲液,PH6.5)平衡DEAE阴离子交换柱，随后将以饱和硫酸铵进行初步纯化的上清缓慢载入平衡后的柱子。选用含有一定盐浓度的缓冲液(含有0.3M NaCl的20mM PB缓冲液，pH6.5)对杂蛋白进行洗脱，选用含有一定盐浓度的缓冲液(含有1M NaCl的20mM PB缓冲液，pH6.5)对目的蛋白进行洗脱，可得一定纯度的重组2b型和2d型Cap蛋白，即为初步纯化的重组2b型和2d型Cap蛋白，结果如图7所示。
重组2b型和2d型Cap蛋白的精细纯化：利用孔径为300kD的切向流膜过滤系统分别对经离子交换层析的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液进行5到10倍超滤浓缩；选用含有一定盐浓度的缓冲液(含有0.2M NaCl的20mM PB缓冲液，pH6.5)平衡琼脂糖6FF凝胶过滤层析柱，5％柱体积分别载入初步纯化后经过超滤浓缩的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液。收集在OD280nm监测下第一个可吸收峰洗脱的样品，即精细纯化的目的蛋白，结果如图8所示。可以看到经过第二步纯化后，目的蛋白的纯度可以达到极高的水平，在电镜下可以看到典型的猪圆环病毒2b和2d型病毒样颗粒，分别命名为PCV2b-VLP和PCV2d-VLP，结果如图9所示。
猪圆环病毒2b和2d型二价病毒样颗粒疫苗的制备：将纯化并经终浓度为0.05％的β-丙内酯灭活的PCV2b-VLP蛋白液和PCV2d-VLP蛋白液等比例混合均匀，经过无菌过滤后，与纳米603佐剂(购自北京生泰尔科技股份有限公司)按照质量比为2:1乳化制备成二价病毒样颗粒疫苗，使得每毫升疫苗中PCV2b-VLP和PCV2d-VLP的蛋白浓度均为50微克，放置4℃存储。
猪圆环病毒2b或2d型单价病毒样颗粒疫苗的制备：将纯化并经终浓度为0.05％的β-丙内酯灭活的PCV2b-VLP蛋白液或PCV2d-VLP蛋白液，经过无菌过滤后，与纳米603佐剂(购自北京生泰尔科技股份有限公司)按照质量比为2:1乳化制备成单价病毒样颗粒疫苗，使得每毫升疫苗中PCV2b-VLP或PCV2d-VLP的蛋白浓度为50微克，放置4℃存储。
实施例4、猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗接种仔猪的安全性评价
1材料
1.1疫苗
猪圆环病毒2b、2d二价病毒样颗粒疫苗，共三批号为2017001、2017002及2017003，均按照实施例3的方法制备。
1.2试验动物
21-28日龄健康仔猪(PCV2、PRRSV抗原抗体阴性)，购自哈尔滨市道里区立新养殖场。
2方法
取21-28日龄仔猪20头，分为4组，每组5头，3组为试验组，1组为对照组。每个批次疫苗免疫一组猪，每头猪耳后肌肉注射2mL，对照组以相同方式和剂量注射生理盐水。观察14日，观察各组猪体温、采食、饮水、精神是否正常，有无不良临床反应，有无发病及死亡。
3结果
结果显示见表1，整个试验观察期14天内，免疫三批疫苗的15头仔猪的体温、精神状态和食欲均正常，没有出现任何临床异常现象，试验结束后，20头仔猪均健活。空白对照组的5头仔猪也无任何不良反应。这说明，猪圆环病毒2b、2d二价病毒样颗粒疫苗对仔猪是安全的。
表1猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗接种仔猪的安全性评价
Figure BDA0002620103130000121
实施例5、猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗接种仔猪的效力评价
1材料
1.1疫苗
猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗，按照实施例3的方法制备。
猪圆环病毒2b或2d型单价病毒样颗粒疫苗，按照实施例3的方法制备。
1.2试验动物
21～28日龄健康仔猪(PCV2抗原抗体阴性猪)，购自哈尔滨市道里区立新养殖场。
1.3效检用毒
猪圆环病毒2b(YW株)和2d(DF株)冻干毒，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备、鉴定、保存及供应。
2方法
2.1动物试验设计
取21～28日龄健康仔猪45头，分为9组，每组5头，其中2组为攻毒对照组，1组为空白对照组，2组为猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗免疫组，2组为猪圆环病毒2b型病毒样颗粒疫苗免疫组，2组为猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗免疫组，试验设计见表2。按照1ml/头接种，14天后加强免疫一次，空白对照组不免疫不攻毒。二次免疫后14日，使用PCV2b(YW株)或PCV2d(DF株)按照表2方案接种攻毒。PCV2的攻毒接种途径为YW株F7代，DF株F8代，每头猪均滴鼻2ml，肌肉注射2ml(含105TCID50/ml)。免疫前3天和免疫后1-7天，攻毒后1-21天，每天测定各组试验猪体温，观察各组猪采食、饮水、精神是否正常，有无不良临床反应，有无发病及死亡。攻毒当日对每头试验仔猪的体重进行称量并记录，攻毒后28日再对每头试验仔猪的体重进行称量并记录。攻毒后28天，前腔静脉采血，采用PCR的方法检测PCV2的核酸；攻毒后28天，安乐死所有试验猪，采集腹股沟淋巴结采用免疫组织化学(IHC)的方法检测PCV2。
3 PCV2发病判定标准
3.1血清中PCV2病毒核酸检测
攻毒后21日，前腔静脉采血，分离血清，按PCV2病毒检测法检测PCV2病毒核酸，在PCR 30个循环时出现特异性条带，判为PCV2病毒血症阳性。
3.2体重标准
相对增重率应不低于5％，非攻毒仔猪的平均日增重应大于攻毒仔猪的平均日增重；攻毒当日对每头试验仔猪的体重进行称量并记录，攻毒后28日再对每头试验仔猪的体重进行称量并记录；相对增重率的计算按照下列公式进行：相对增重率＝{非攻毒对照组仔猪平均日增重-攻毒组仔猪平均日增重}/
3.3淋巴结中PCV2免疫组化检测(IHC)
攻毒后28日，对所有仔猪实施安乐死，取腹股沟淋巴结，按淋巴结中PCV2抗原免疫组化检测法进行IHC检测，出现阳性信号。
以上3项出现任意2项，即判为发病。
4、结果
猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的效力评价及和猪圆环病毒2b型病毒样颗粒疫苗、猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗的效力对比评价见表2。效力评价结果表明，二价病毒样颗粒疫苗和2b型病毒样颗粒疫苗、2d型病毒样颗粒疫苗均具有免疫保护效果。进一步分析发现，PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗对于PCV2d攻击的保护效果不如PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗，PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗对于PCV2b攻击的保护效果不如PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗，而PCV2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗的免疫保护效果均优于PCV2b的单价病毒样颗粒疫苗和PCV2d的单价病毒样颗粒疫苗
表2猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗接种仔猪的效力评价
Figure BDA0002620103130000141
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
哈尔滨维科生物技术有限公司
<120> 一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 1
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<213> Porcine circovirus
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<210> 8
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<212> DNA
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<400> 8
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<211> 705
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 9
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Claims (10)

1.一种经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因，其特征在于，经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示，经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示；优选的，经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因。
3.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。
4.权利要求1所述的经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因、权利要求2所述的表达载体或权利要求3所述的宿主细胞在制备猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒中的应用。
5.一种制备猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成权利要求1所述的经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型或2d型衣壳蛋白基因；
2)将合成的基因连接至pET30a载体，产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒分别命名为pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap；
3)将pET30a-2b-rCap和pET30a-2d-rCap质粒分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养后，得到分别含有pET30a-2b-rCap或pET30a-2d-rCap质粒的大肠杆菌菌液；
4)将含有pET30a-2b-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃，220rpm进行诱导表达10h，随后离心收集菌液；将含有pET30a-2d-rCap质粒的菌液接种到含卡那霉素的液体TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养2h。然后加入终浓度为2g/L的α乳糖，25℃，220rpm进行诱导表达20h，随后离心收集菌液；
5)破碎步骤4)中收集的菌液上清，以饱和硫酸铵进行初步纯化后，再经两步层析精细纯化，包括第一步阴离子交换层析和第二步凝胶过滤层析，得到猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5)中以饱和硫酸铵进行初步纯化的具体操作如下：
用pH6.5的20mM PB缓冲液平衡DEAE阴离子交换柱，随后将以饱和硫酸铵进行初步纯化的上清缓慢载入平衡后的柱子，选用pH6.5的含有0.3M NaCl的20mM PB缓冲液对杂蛋白进行洗脱，选用pH6.5的含有1M NaCl的20mM PB缓冲液对目的蛋白进行洗脱，得到初步纯化的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液；
步骤5)中两步层析精细纯化的具体操作如下：利用孔径为300kD的切向流膜过滤系统分别对经离子交换层析的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液进行5到10倍超滤浓缩；选用pH6.5的含有0.2M NaCl的20mM PB缓冲液平衡琼脂糖6FF凝胶过滤层析柱，5％柱体积分别载入初步纯化后经过超滤浓缩的重组2b型和2d型Cap蛋白溶液，收集在OD 280nm监测下第一个可吸收峰洗脱的样品，即精细纯化后的重组2b型或2d型Cap蛋白，并自组装成典型的猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒，分别命名为PCV2b-VLP和PCV2d-VLP。
7.按照权利要求5或6所述的方法制备得到的猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒。
8.一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗，其特征在于，包含猪圆环病毒2b型和2d型病毒样颗粒，所述的猪圆环病毒2b型病毒样颗粒是由经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白自组装而成，所述的猪圆环病毒2d型病毒样颗粒是由经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白自组装而成，其中编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示，编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示，优选的，编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2b型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码经突变改造优化后的猪圆环病毒2d型衣壳蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
9.根据权利要求8所述的猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述的猪圆环病毒2b型或2d型病毒样颗粒按照权利要求5或6所述的方法制备得到，优选的，所述猪圆环病毒2b型和2d型病毒样颗粒的质量比为1：1。
10.根据权利要求7所述的猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述的疫苗中还包含兽医学可接受的佐剂，优选的，所述佐剂为水佐剂、凝胶系列佐剂、蜂胶佐剂、细胞因子佐剂、免疫刺激复合物佐剂中的任意一种或多种，更优选的，所述的佐剂为603佐剂。
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