KR20190110050A - 신규한 바이러스 유사입자, 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 백신 조성물, 및 이의 제조 방법 - Google Patents

신규한 바이러스 유사입자, 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 백신 조성물, 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 바이러스 입자, 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 백신 조성물, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PCV3 ORF2를 이용하는 경우 곤충 또는 대장균 세포에서 바이러스 유사 입자를 효과적으로 생산할 수 있고, 상기 바이러스 유사 입자는 돼지 써코바이러스 3에 대한 항체가를 증가시키는 효과를 가지는바, 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환 예방 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.

Description

신규한 바이러스 유사입자, 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 백신 조성물, 및 이의 제조 방법{Novel Virus Like Particle, Vaccine Composition for Preventing Porcine Circovirus 3 Comprising the Same, and Method for Manufacturing Thereof}
본 발명은 신규한 바이러스 입자, 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 백신 조성물, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
PCV(porcine circovirus)는 써코바이러스과(Circoviridae) 써코바이러스속( circovirus)에 속하며 원형의 단일 가닥 DNA 유전체를 함유하는 작은 바이러스이다. PCV는 PCV1 그리고 PCV2로 분리하였는데, 2015년 Kansas State University researchers에 의해 새로 PCV3가 추가되었다. 1974년 발견된 PCV1은 돼지 신장세포에서 비-병리학적으로 분리하였고, PCV2는 이유 후 전신성 소모성 증후군(PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome)등의 증상과 PRRS, 가성 광견병 (Pseudorabies) 등 다른 감염을 동반한다고 1997년 알려졌다. PCV의 임상적 증상을 북미에서는 PCVAD(porcine Circovirus associate disease), 유럽에서는 PCVD(porcine Circovirus disease)라 명하였다. PCV2에 감염된 돼지의 사망률은 80%에 이르며, PCV1 과 PCV2는 대략 80%의 상동 염기서열을 보이고 있다.
2015년 미국의 노스캐롤라이나에서 PCVAD/PCVD의 증상인 PDNS (porcine dermatitis and nephropathy syndrome), 만성적 생식장애 그리고 불임을 일으키며 태아와 모돈의 사망이 발생하였다. 해당 질병이 PCV2 진단에서 음성을 나타내면서 이 질병에 대한 연구가 시작 되었다. 이 질병을 야기하는 바이러스를 Kansas State University 연구자들이 처음으로 PCV3(porcine circovirus type 3)라고 명명하였다. PDNS의 대표적인 증상으로 피부에 멍이 든 것처럼 검고 붉은 반점이 보이며, 신장을 비대해지는 특성이 있다. 또한 섬유성 사구체염, 간질성신염과 함께 혈관염 및 전신괴사를 유발한다. 전신성 혈관염과 섬유성 사구체신염은 PCV2가 아닌 PRRSV(procine reproductive and respiratory virus) 및 TTC(tissue homogenate containing torque teno virus)에 의한 면역복합체의 원인으로 생각된다고 알려져 있다. PDNS 증상을 나타내는 돼지 중 태어난 지 3개월 된 돼지에게선 100%, 그리고 어린 돼지에게서는 50% 정도의 사망률을 나타낸다고 한다. 현재 미국 이외에도 브라질, 영국, 이탈리아, 폴란드, 중국, 태국 및 한국에서도 PCV3의 존재가 확인되고 있으며, 이에 대한 연구가 진행 되고 있다.
PCV3에 대한 연구는 계속적으로 진행되고 있으며 아직 정확한 진단방법은 알려지지 않았다. 현재 사용하고 있는 방법은 자체 분리 바이러스의 정보를 이용해 단백질을 발현시킨 후 ELISA 키트를 제조 하거나 특정 부위의 프라이머를 제조하여 qPCR 및 real-time RPA(Recombinase polymerase amplification)를 이용해 질병을 진단하고 있다.
바이러스 유사 입자(virus like particle, VLP)를 기반으로 한 PCV2 백신은 농장에서 효과적으로 질병의 발생을 제어하고 있다. 하지만 현재 상용화 되어 있는 PCV2 백신을 이용해 약 35% 캡시드 단백질만을 공유하는 PCV3를 방어하기는 많은 어려움이 있을 것으로 예상된다. 따라서 ELISA 키트 개발을 통해 농장내 PCV3의 감염 여부를 신속하게 진단하고, 국내 분포하고 있는 PCV3에 대한 효율적인 백신 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 돼지 써코바이러스 3을 효과적으로 예방하기 위하여, 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자를 이용하여 PCV3 바이러스 유사 입자를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 돼지 써코바이러스 3(porcine circovirus 3)의 ORF2(open reading frame 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 세포에 의하여 생산되는 바이러스 유사입자(virus like particle, VLP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이러스 유사 입자를 유효성분으로 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환의 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 상기 바이러스 유사입자를 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 면역반응을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 돼지 써코바이러스 3(porcine circovirus 3)의 ORF2(open reading frame 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 세포에 의하여 생산되는 바이러스 유사입자(virus like particle, VLP)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바이러스 유사 입자를 유효성분으로 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환의 예방 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바이러스 유사입자를 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 PCV3 ORF2를 이용하는 경우 곤충 세포에서 바이러스 유사 입자를 효과적으로 생산할 수 있고, 상기 바이러스 유사 입자는 돼지 써코바이러스 3에 대한 항체가를 증가시키는 효과를 가지는바, 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환 예방 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1은 국내 및 해외에 분포하고 있는 PCV3 및 PCV2의 ORF2 유전자의 염기서열을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 코돈 최적화된 PCV3 국내 분리주의 ORF2 유전자와 PCV3 국내 분리주의 ORF2 유전자의 염기서열을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2의 발현을 위한 셔틀 벡터의 개열 지도를 나타낸 도이다.
도 4는 전기영동을 통해 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2의 발현을 위한 셔틀 벡터를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 전자 현미경을 이용하여 곤충세포가 재조합 바이러스 rAc-PCV3에 감염되었는지를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 재조합 바이러스 rAc-PCV3에 감염된 곤충세포로부터 수득한 바이러스 유사 입자를 전자 현미경으로 확인한 도이다.
도 7은 돼지 써코바이러스 3 바이러스 유사입자로 면역된 미니돼지의 항체가를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자를 발현하는 재조합 벡터의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 9는 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자를 발현하는 재조합 벡터가 형질주입된 대장균의 플라스미드 DNA의 전기영동 및 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 통해, 대장균에서 PCV3 ORF2 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 FPLC를 이용하여 PCV3 ORF2 단백질을 정제(A) 한 후, 정제된 PCV3 ORF2 단백질을 SDS-PAGE(B) 및 웨스턴 블롯팅(C)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 PCV3 ORF2에 대한 항체를 제조하기 위한 PCV3 ORF2의 에피토프 대상 부위를 나타낸 도이다.
도 13은 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자를 이용한 곤충세포에서 PCV3 ORF2 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 돼지 써코바이러스 3 ORF2를 이용한 돼지 써코바이러스3 감염 의심 돼지의 항체가 분석 및 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 돼지 써코바이러스 3(porcine circovirus 3)의 ORF2(open reading frame 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, “돼지 써코바이러스 3(porcine circovirus 3)”은 써코바이러스과(Circoviridae) 써코바이러스속(circovirus)에 속하며 원형의 단일 가닥 DNA 유전체를 함유하는 작은 바이러스를 의미하며, 종래 돼지 써코바이러스의 혈청형은 PCV1 및 PCV2로 분리되었는데, 최근 PCV3이 새롭게 분리되었다.
본 발명에 있어서, “ORF(open reading frame)”는 아미노산 배열로서, 번역되는 DNA 염기 서열을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 돼지 써코바이러스 3의 ORF2는 돼지 써코바이러스3 국내 분리주의 ORF2 서열 및 항원인식부위를 곤충 세포에 맞도록 코돈최적화 시킨 것이다.
본 발명에 있어서, “코돈 최적화(codon optimization)"란 특정 유전자를 다른 개체에서 발현시키는 경우, 유전자가 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현할 수 있도록 유전자의 염기서열을 변환시키는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 돼지 써코바이러스 3의 ORF2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명에 있어서, “형질전환 세포”는 분자유전학적 방법을 사용하여 외부의 유전자 (transgene)를 삽입하여 제조된 세포를 의미한다. 형질전환 세포의 예로는 대장균과 같은 세균; 및 Sf9, Sf21, High five 세포 또는 Tn5 등의 일반적인 곤충 세포; 등이 있으며, 형질전환을 통해 목적 단백질을 생산할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.본 발명에 따른 형질전환 세포는 코돈 최적화의 목적상 곤충세포인 것이 바람직하며, 그 종류에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 세포에 의해 생산되는 바이러스 유사입자(virus like particle, VLP)를 제공한다.
본 발명에 있어서, "바이러스 유사 입자"는 바이러스 외피를 구성하도록 조립된 단백질 코트 또는 캡시드를 포함하는 것으로, 상기 바이러스 유사 입자는 바이러스의 외피(capsid) 형태를 유지하여 살아있는 바이러스와 유사한 효과를 가진다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 세포에 의해 생산되는 바이러스 유사 입자를 유효성분으로 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “백신”은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신으로, PCV3에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다.
본 발명의 실시예에서는 코돈 최적화된 PCV3 ORF2를 이용하여 제조된 바이러스 유사입자를 이용하여 복합 백신 조성물을 제조하였으며, 상기 백신 조성물은 항체 생성능이 우수한바, PCV3에 의한 질환의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 유효 성분인 돼지 써코바이러스 3 바이러스 유사 입자 이외에도 백신 조성물을 구성하는 데 적절한 하나 이상의 면역 증강제 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전 일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판(Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체예에서, 상기 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환은 이유자돈 전신성 소모성 증후군(PMWS; postweaning multisystemic wasting syndrome), 돼지 피부염 신부전 증후군(PDNS; porcine dermatitis and nephropathy syndrome), 복합 돼지 호흡기 질병(PRDC; porcine respiratory disease complex) 및 모돈유산폐사 증후군(SAMS; sow abortion and mortality syndrome)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 세포에 의해 생산되는 바이러스 유사입자를 포함하는 백신 조성물을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환의 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 포유동물은 개, 고양이, 소, 돼지, 염소, 양, 말, 토끼 및 쥐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명에서 포유동물에 백신 조성물을 투여하는 방법은 일반적인 백신 투여 방법에 의할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 장내 또는 비경구 경로, 경구, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 피내 또는 다른 적절한 경로를 통한 투여를 수행할 수 있고, 바람직하게는 근육 내, 피내, 피하에 투여된다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여는 면역학적 유효량으로 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 PCV3과 관련된 질병의 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 바이러스 유사입자를 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 포유동물은 돼지로 한정되지 않으며, 개, 고양이, 소, 돼지, 염소, 양, 말, 토끼 및 쥐로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 포유동물일 수 있다.
본 발명에 따른 면역반응을 유도하는 방법은 생체 내 면역 반응을 증가시키는 것이 바람직하며, 보다 상세하게는 항체가, 면역반응 관련 인자의 발현을 조절하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 돼지 써코바이러스2 ( PCV2 ) 및 돼지 써코바이러스3(PCV3)의 ORF2 (open reading frame 2) 유전자의 상동성 분석
돼지 써코바이러스 감염증의 주요 병원체인 돼지 써코바이러스2(PCV2) 및 돼지 써코바이러스3(PCV3)의 ORF2 유전자의 상동성을 분석하였다. 구체적으로, PCV2 및 PCV3의 유전적 상동성을 파악하기 위하여, PCV2 및 PCV3 유전자 21개의 ORF2 유전자를 CLC 프로그램을 이용하여 비교분석하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 유전자 단편(partial)을 제외한 PCV3의 ORF2 유전자 간에는 약 95.38 내지 100% 일치한 반면, PCV3 ORF2 유전자와 PCV2의 ORF2 유전자는 약 43% 일치한다는 것을 알 수 있다. 이는 PCV2에 대한 백신으로 PCV3을 효과적으로 예방할 수 없음을 의미한다.
실시예 2. PCV3의 ORF2 유전자 코돈 최적화
곤충 세포에서 PCV3 ORF2 유전자의 발현 효율을 높이기 위하여 PCV3 국내 분리주로부터 얻은 PCV3 ORF2 유전자(NCBI 등록번호 KY996337)를 곤충세포에 대하여 코돈 최적화하였다. 본 발명의 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자가 곤충세포에서 발현되는 경우 원래 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 코돈 최적화된 PCV3 국내 분리주의 ORF2 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 표시되며, 상기 코돈 최적화된 PCV3 국내 분리주의 ORF2 유전자(서열번호 1)와 PCV3 국내 분리주의 ORF2 유전자의 염기서열을 비교한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에서 나타낸 바와 같이, 코돈 최적화된 PCV3 국내 분리주의 ORF2 유전자와 PCV3 국내 분리주의 ORF2 유전자는 645개의 염기 중 92개가 차이나는 것을 확인하였다. 서열번호 1의 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자를 이후 실험에 사용하였다.
실시예 3. 곤충세포에서 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2의 발현을 위한 셔틀 벡터 및 재조합 바이러스 rAc-PCV3 제조
상기 실시예 2에서 얻은 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자를 pFastBac™Dual 벡터(ThermoFisher SCIENTIFIC, Cat. No. 10359-016)에 삽입하여 셔틀 벡터 pFastBac™Dual PCV3를 제작하였다. 제작된 셔틀 벡터(bacmid)의 개열 지도는 도 3에 나타내었다.
제작된 셔틀 벡터를 확인하기 위하여, 정방향 프라이머(5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG 3’, 5’ CCT ATA AAT ATT CCG GAT TAT TCA TAC CG-3’) 및 역방향 프라이머(5’-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG 3’, 5’ TGT GGT ATG GCT GAT ATA GA-3’)를 사용하여, 하기 표 1의 조건으로 PCR을 수행한 후 전기영동을 통해 셔틀 벡터를 확인하였다. 셔틀 벡터를 확인한 결과는 도 4에 나타내었다.
온도 시간 사이클
93 C° 3 분

30사이클
94 C° 45 초
55 C° 45 초
72 C° 5 분
72 C° 7 분
도 4에 나타낸 바와 같이, 전기영동을 통해 셔틀 벡터가 정상적으로 제작된 것을 알 수 있다.
제작된 셔틀 벡터를 100μl의 Sf-900™III SFM (ThermoFisher SCIENTIFIC, Cat. No. 12658019) 배지에 혼합하고, 셀펙틴 II(Cellfectin II, Invitrogen) 5μl를 100μl의 Sf-900™III SFM 배지에 혼합한 후 각각을 15분 동안 27℃에서 반응시켰다. 그 후 두 혼합액을 섞어주고 다시 15분 동안 27℃에서 반응시켰다. 밤나방과 세포주인 Sf9(Spodoptera frugiperda 9)(ThermoFisher SCIENTIFIC, Cat. No. B82501)를 T25 배양 플라스크에 1.0ⅹ106개의 세포로 분주하고, 상기 혼합액을 세포에 접종하였다. 접종 약 14일 후 세포변성을 확인함으로서 재조합 바이러스 rAc-PCV3의 감염을 확인하였다. 세포변성 확인 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 재조합 바이러스 rAc-PCV3에 감염된 세포는 정상 세포와 달리 세포의 크기가 커지고, 불규칙한 형태를 나타내는 것을 알 수 있다.
제작된 재조합 바이러스 rAc-PCV3은 T25 플라스크에 계대배양 하였으며, 순수 분리된 바이러스는 T-75 플라스크(Corning Inc.)에 재접종하여 대량으로 바이러스를 수득하였다. 수득한 바이러스는 BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit(Takara)를 이용하여 정량한 후 실험에 사용하였다.
실시예 4. 재조합 바이러스 rAc - PCV3를 이용한 바이러스 유사 입자 제조
상기 실시예 3에서 제조한 재조합 바이러스 rAc-PCV3를 곤충 세포에 접종하여 바이러스 유사 입자(VLP)를 제조하였다. 구체적으로, 밤나방과 세포주인 Sf9 세포주를 T-75 배양 플라스크에 5x106개의 세포의 양으로 넣어주고, Sf-900III SFM(Gibco-BRL, USA)을 10ml 첨가하여 27 ℃에서 최소 1시간 이상 배양함으로써 세포를 플라스크에 부착시켰다. 그 후 부착된 세포에 재조합 바이러스 rAc-PCV3를 접종하였고, 세포 및 배양액을 수거하여 이로부터 바이러스 유사 입자를 얻었다. 상기 바이러스 유사 입자를 전자현미경(TEM)으로 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 22 내지 25nm 크기의 PCV3 바이러스 유사 입자가 생성되었음을 확인하였다.
실시예 5. 돼지 써코바이러스 3 바이러스 유사입자( PCV3 VLP )로 면역된 미니돼지의 항체가 분석
상기 실시예 4에서 제조된 돼지 써코바이러스 3 바이러스 유사입자(porcine circovirus 3 virus like particle, PCV3 VLP)를 이용하여 돼지에서 PCV3에 대한 항체생성 여부를 확인하였다. 구체적으로, 항원인 PCV3 VLP를 Hi-5 세포에서 15일 동안 배양한 후 수거하여 0.2um로 여과하여 UF(cut off < 100kDa)로 10배 농축하였다. 농축된 항원 PCV3 VLP을 Al(OH)3(상품명 : Rehydragel)와 혼합한 후 IMS1313을 넣어 상온에서 30분 이상 혼합하였다. 상기 혼합물을 PCV2 및 PCV3에 대해 음성인 SPF 미니돼지에 2mL 접종하였다. 이를 4주 간격으로 추가 접종하였고 매주 혈청을 채혈하였다. 면역된 SPF 미니돼지의 혈청 항체가 분석을 위해, 접종 항원을 96 웰 ELISA 플레이트에 코팅한 후 탈지유로 블로킹하였다. 각 주차별 면역혈청을 PBS로 50배 희석하여 각 웰에 100uL씩 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 각 웰을 PBS-T로 5회 세척한 후 5000배 희석한 anti-swain IgG HRP conjugate를 100uL 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 웰을 PBS-T로 5회 세척한 뒤 100uL TMB 발색시약을 넣어 30분 동안 반응시켰고, 2N H2SO4 50uL을 넣어 반응을 정지시켰다. 450nm에서 반응이 정지된 웰의 흡광도를 측정하였다. PCV3 VLP를 이용한 항체가 분석 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7A에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 사용된 SPF 미니돼지의 면역에 사용한 농축 항원의 SDS-PAGE 결과, 항원 PCV3 VLP가 성공적으로 농축되었다는 것을 알 수 있다.
도 7B에 나타낸 바와 같이, SPF 미니돼지는 본 발명에 따른 항원 PCV3 VLP로 면역한 후 항체가가 증가하는 것을 확인하였다. 특히 2차 면역 후 항체가가 현저히 증가하고, 이후에도 항체가가 안정적으로 유지되는바, 백신으로서의 이용가능성이 우수하다는 것을 알 수 있다.
실시예 6. 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자를 발현하는 재조합 벡터 제작
상기 실시예 2에서 코돈 최적화된 PCV3 국내 분리주의 ORF2 유전자의 전제 염기서열 중 핵국재화신호(nuclear localization signal, NLS) 예상 부위가 제외된 ORF2 유전자(서열번호 2)를 정방향 프라이머(5-GGG AAT TCA TGG CAG GC A CCT ACT ACA CA-3) 및 역방향 프라이머(5-GGC TCG AGT TAG AGC ACG CTC TTG TAA CG-3)를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 증폭된 NLS가 제외된 PCV3 ORF2 유전자를 pET28a-TEV 및 pGEX4T1-TEV 벡터의 EcoRI/XhoI 위치에 각각 삽입하여, 재조합 벡터 pET28a-Tev-PCV3-DelNLS 및 pGEX4T1-TEV-PCV3-DelNLS를 제작하였다. 제작된 재조합 벡터 pET28a-TEV 및 pGEX4T1-TEV의 개열지도는 도 8에 나타내었다.
제작된 재조합 벡터 pET28a-TEV-PCV3-DelNLS 및 pGEX4T1-TEV-PCV3-DelNLS을 각각 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)를 이용하여, 형질전환된 대장균의 Plasmid DNA를 추출하여 전기영동을 수행하였고, 염기서열을 분석하였다. 전기영동 및 염기서열 분석 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, NLS가 제외된 PCV3 ORF2 유전자는 553bp의 크기임을 확인하였다.
실시예 7. PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 대장균 제조 및 상기 대장균으로부터 PCV3 ORF2 단백질의 분리
상기 실시예 3에서 제작한 제조합 벡터를 이용하여 Rosetta™2(DE3)(Novagen Cat. No.71397-4) 대장균에 제조사의 제공 방법에 따라 형질전환을 수행하였다. 얻어진 집락은 순수배양을 할 수 있도록 적절한 항생제가 함유된 LB배지를 이용하여 37℃에서 전 배양을 진행하였다. 본 배양은 OD600 값이 1.0될 때까지 배양한 후 단백질 발현을 유도하기 위하여 0.1mM IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 첨가하여 18℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 배양된 균을 침전시키기 위하여 저속으로 원심분리를 수행하였고, 침전된 균은 8M의 우레아 및 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)를 이용하여 풀어준 후 초음파 분쇄를 실시하였다. 분쇄된 균은 원심분리를 통하여 상층액과 침전물을 분리한 후, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 통해 단백질 발현을 확인하였다. 단백질 발현 확인 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 상층액(supernatant)에서 PCV3 ORF2 단백질의 발현을 확인하였다.
PCV3 ORF2 단백질 발현이 확인된 상층액은 FPLC(Fast protein liquid chromatography) 법으로, HisTrap™ HP 5mL 컬럼(GE Healthcare, Cat. No. 17-5248-02)을 이용하여 정제하였다. 정제 시 사용한 이동상은 300mM의 이미다졸이 포함된 6M 우레아 완충액이다. PCV3 ORF2 단백질의 정제 결과는 도 11에 나타내었다.
실시예 8. PCV3 ORF2에 대한 에피토프 선정 및 항체 제조
PCV3 ORF2(NCBI 등록번호 : KY996337)의 염기서열 분석을 통해 6곳의 에피토프(Epitope) 대상부위(10-22, 37-46, 52-61, 96-103, 122-134, 135-144)를 선정하였다. 최종적으로, 3개의 에피토프를 선정하였고, 선정된 에피토프의 N-말단에 시스테인을 추가하여 펩타이드를 합성하였다. 항체 제작을 위한 PCV3 ORF2의 에피토프 대상 부위는 도 12에 나타내었으며, 선정된 PCV3 ORF2의 에피토프 1, 2 및 3의 아미노산 서열은 표 2에 나타내었다.
에피토프 아미노산 서열
PCV3 에피토프 1(32-46) CRPTAGTYYTKKYSTM(서열번호 3)
PCV3 에피토프 2(52-66) CGTPQNNKPWHANHFI(서열번호 4)
PCV3 에피토프 3(120-134) CWLQDDPYAESSTRKV(서열번호 5)
상기 PCV3 에피토프 1, 2 및 3을 각각 운반체인 KLH(keyhole lympet hemocyanin)와 결합시킨 후 뉴질랜드 흰토끼(New Zealand White rabbit, 2.5 내지 3kg)에 2주 간격으로 총 4번 근육 주사하여 PCV3 ORF2에 대한 항체를 제조하였다. 항체 제조 시 실험은 뉴질랜드 흰토끼 2마리씩 총 4 그룹으로 나누어 진행하였고, 그 중 한 그룹은 대조군이며 나머지 그룹은 항체 제조에 사용 되었다.
실시예 9. 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자를 이용한 곤충세포에서 PCV3 ORF2 단백질 발현량 확인
실시예 2에서 제조한 코돈 최적화된 PCV3의 ORF2 유전자 이용 시 곤충세포에서의 PCV3 ORF2 단백질 발현량을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 구체적으로, 코돈 최적화된 PCV3 ORF2 유전자가 형질주입된 곤충 세포를 저속으로 원심분리를 수행하였고, 침전된 곤충 세포는 8M의 urea 및 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)를 이용하여 풀어준 후 초음파 분쇄를 실시하였다. 분쇄된 곤충 세포는 원심분리를 통하여 상층액과 침전물을 분리하여, 상층액 시료 및 침전물 시료를 제조하였다. 상층액 시료 및 침전물 시료를 각각 10% SDS-PAGE 겔에서 80V의 전압으로 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 겔은 쿠마시 블루 용액(Coomassie brilliant blue solution)으로 염색하고 탈색 용액(Destain solution)으로 탈색하여 관찰하였다. 웨스턴 블롯팅은, SDS-PAGE 겔을 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 Trans-Blot®TurboTM Trnasfer System을 이용하여 트랜스퍼하였고, TBS-T 완충액에 녹인 5% 스킴밀크(Skim-milk)를 1시간동안 처리하였다. 1차 항체로는 실시예 5에서 제조한 PCV3 ORF2 에피토프 1 내지 3에 대한 단일클론항체를 각각 사용하였다. 상기 1차 항체를 5% 스킴밀크를 녹인 TBS-T 완충액에 희석한 후, 15분씩 3번 세척하였다. 2차 항체 역시 5% 스킴밀크를 녹인 TBS-T 완충액에 희석하여 1시간 동안 처리하였고, 15분씩 3번 세척하였다. 최종적으로 멤브레인에 DAB(Sigma)를 처리하여 밴드를 관찰하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, PCV3 ORF2 에피토프 1 내지 3에 대한 단일클론항체를 이용하여 곤충세포에서 PCV3 ORF2 단백질 발현량을 확인한 결과, ORF2의 코돈최적화를 통해 곤충 세포 내에서 바이러스 유사입자인 PCV3 ORF2 단백질이 다량 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 10. 돼지 써코바이러스 3 ORF2를 이용한 돼지 써코바이러스3 감염 의심 돼지에서의 항체가 분석
문헌에 보고된 항원 PCV3의 진단용 프라이머를 이용하여 PCV3의 감염이 의심되는 농장의 개체를 음성, 위양성, 양성으로 판독하였다. 판독된 개체의 혈청을 대상으로 혈액 항체가를 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 7에서 분리된 PCV3 ORF2 항원을 코팅버퍼를 이용하여 1:200으로 희석하였다. 96 웰 플레이트를 희석된 항원(2~10ng)으로 코팅하였다. 상기 플레이트를 탈지유로 블로킹하고 대상 혈청을 PBS로 50배 희석하여 각 웰에 100uL씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 웰을 PBS-T로 5회 세척한 후 5000배 희석한 anti-swain IgG HRP conjugate를 100uL 첨가하여 37℃에 1시간 동안 반응시켰다. 각 웰을 PBS-T로 5회 세척한 후 100uL TMB 발색시약을 넣어 30분 동안 발색하였고 50uL 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응이 정지된 웰의 450nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
추가적으로, ELISA를 통해 항체가를 확인한 후 웨스턴 블롯팅을 통해 PCV3 ORF2 항원을 검출하였다. 구체적으로, PCV2 ORF2를 SDS-PAGE로 전기영동한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인에 Trans-Blot®TurboTM 트랜스퍼 시스템을 이용하여 트랜스퍼하였고, TBS-T 완충액에 녹인 5% 탈지유를 1시간 동안 처리하였다. 각각의 개체 혈청을 TBS-T 완충액에 녹인 5% 탈지유에 1차 항체를 1:50의 비율로 희석한 후 약 3시간 동안 반응시켰고, 그 후 15분씩 3회 세척하였다. 2차 항체(anti-swine IgG HRP conjugate) 역시 5% 탈지유를 녹인 TBS-T 완충액에 희석하여 1시간 동안 처리하였고, 15분씩 3회 세척하였다.
돼지 써코바이러스 3 ORF2를 이용한 돼지 써코바이러스3 감염 의심 돼지의 항체가 분석 및 웨스턴 블롯팅 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, ELISA를 이용하여 항체가를 확인한 결과, PCR 분석 결과와 일치하지 않음을 확인하였다. 추가로 실시한 웨스턴 블롯팅 결과, 멤브레인에서 PCV3에 해당하는 단백질 밴드가 확인되었다.
종합적으로, 본 발명자들은 코돈최적화된 PCV3의 ORF2 유전자를 이용하여 PCV3 바이러스 유사입자를 제조하고, 제조된 PCV3 바이러스 유사입자가 동물 모델 내에서 항체가를 증가시키는 것을 확인한바, 본 발명의 PCV3 바이러스 유사입자는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환 예방 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> Optipharm.CO.,LTD <120> Novel Virus Like Particle, Vaccine Composition for Preventing Porcine Circovirus 3 Comprising the Same, and Method for Manufacturing Thereof <130> 1-72 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized PCV3 ORF2 <400> 1 atgagacaca gagctatctt ccgtagacgt ccccgcccta ggcgccgacg acgccatcgt 60 aggcgctatg tgcggcgtag gctgttcatc aggaggccaa cagcaggcac ctactacaca 120 aaaaagtact caacgatgaa cgtcatctcc gtcggtaccc ctcagaataa caagccatgg 180 cacgctaacc atttcataac ccgcctaaac gagtgggaga ctgccattag ttttgaatat 240 tacaagatct taaagatgaa agtgacactc tcacctgtaa tttctccagc tcagcaaacg 300 aagaccatgt tcggacatac agccatagac cttgacggcg cctggacgac aaatacttgg 360 ttgcaagacg atccttatgc ggaatcgtcc actcgtaaag ttatgacttc taagaagaaa 420 cacagtcgtt acttcacacc caaacctatc ctggcgggaa ctaccagcgc tcacccgggt 480 caaagcttgt tttttttctc cagacccacc ccatggctca acacctacga tcccaccgtg 540 cagtggggag cactgctgtg gtcgatctac gtcccggaaa agactggcat gactgacttc 600 tacggtacga aggaggtttg gattcgttac aagagcgtgc tctaa 645 <210> 2 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV3 OFR2 excluded NLS <400> 2 atggcaggca cctactacac aaaaaagtac tcaacgatga acgtcatctc cgtcggtacc 60 cctcagaata acaagccatg gcacgctaac catttcataa cccgcctaaa cgagtgggag 120 actgccatta gttttgaata ttacaagatc ttaaagatga aagtgacact ctcacctgta 180 atttctccag ctcagcaaac gaagaccatg ttcggacata cagccataga ccttgacggc 240 gcctggacga caaatacttg gttgcaagac gatccttatg cggaatcgtc cactcgtaaa 300 gttatgactt ctaagaagaa acacagtcgt tacttcacac ccaaacctat cctggcggga 360 actaccagcg ctcacccggg tcaaagcttg ttttttttct ccagacccac cccatggctc 420 aacacctacg atcccaccgt gcagtgggga gcactgctgt ggtcgatcta cgtcccggaa 480 aagactggca tgactgactt ctacggtacg aaggaggttt ggattcgtta caagagcgtg 540 ctctaa 546 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV3 epitope 1 <400> 3 Cys Arg Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV3 epitope 2 <400> 4 Cys Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His Phe Ile 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV3 epitope 3 <400> 5 Cys Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu Ser Ser Thr Arg Lys Val 1 5 10 15

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 돼지 써코바이러스 3(porcine circovirus 3)의 ORF2(open reading frame 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  2. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 세포.
  3. 제2항의 형질전환 세포에 의하여 생산되는 바이러스 유사입자(virus like particle, VLP).
  4. 제3항의 바이러스 유사 입자를 유효성분으로 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 예방용 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환은 이유자돈 전신성 소모성 증후군(PMWS; postweaning multisystemic wasting syndrome), 돼지 피부염 신부전 증후군(PDNS; porcine dermatitis and nephropathy syndrome), 복합 돼지 호흡기 질병(PRDC; porcine respiratory disease complex) 및 모돈유산폐사 증후군(SAMS; sow abortion and mortality syndrome)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인, 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 예방용 백신 조성물.
  6. 제4항의 백신 조성물을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환의 예방 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 포유동물은 개, 고양이, 소, 돼지, 염소, 양, 말, 토끼 및 쥐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제3항에 따른 바이러스 유사입자를 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역반응을 유도하는 방법.
KR1020190030584A 2018-03-19 2019-03-18 신규한 바이러스 유사입자, 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 백신 조성물, 및 이의 제조 방법 KR102153365B1 (ko)

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KR1020190030584A KR102153365B1 (ko) 2018-03-19 2019-03-18 신규한 바이러스 유사입자, 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 3에 의한 질환에 대한 백신 조성물, 및 이의 제조 방법

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