KR101777243B1 - PCV2(Porcine Circovirus type2) 백신의 대량 생산 방법 및 이를 이용한 백신 조성물 - Google Patents

PCV2(Porcine Circovirus type2) 백신의 대량 생산 방법 및 이를 이용한 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코돈 최적화된 PCV2(Porcine Circovirus type2)의 ORF2 유전자를 이용한 PCV2 백신의 대량 생산 방법, 이를 이용한 PCV2 감염 질환 예방용 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 돼지에게 투여하여 PCV2 감염 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이용할 경우, 정상 PCV2의 ORF2 유전자를 이용하는 경우에 비해 곤충세포에서의 발현양이 최대 10배까지 증가하는 바, 이를 이용하여 대량으로 PCV2 백신을 생산할 수 있으며, 상기 방법을 통해 제조된 백신 조성물은 항체 생성능 및 바이러스 방어능이 우수하여 PCV2 감염 질환의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PCV2(Porcine Circovirus type2) 백신의 대량 생산 방법 및 이를 이용한 백신 조성물{Method for mass production of PCV2 vaccine and vaccine composition using the same}
본 발명은 코돈 최적화된 PCV2(Porcine Circovirus type2)의 ORF2 유전자를 이용한 PCV2 백신의 대량 생산 방법, 이를 이용한 PCV2 감염 질환 예방용 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 돼지에게 투여하여 PCV2 감염 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다.
PCV2(Porcine Circovirus type2)는 원형의 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하는 작은(17 nm) 정이십면체 비외피형 바이러스로서 지금까지 알려진 가장 작은 동물 바이러스 중 하나이다. PCV2 게놈의 길이는 약 1768 bp이다. PCV2는 PCV1(Porcine Circovirus type1)과 대략 80%의 서열 동일성을 공유한다. 하지만 일반적으로 비-병독성인 PCV1과는 대조적으로, PCV2에 감염된 돼지는 통상적으로 이유후 전신성 소모성 증후군 (PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome)이라고 하는 증상을 나타낸다. PMWS는 임상적으로 소모 (wasting), 피부의 창백함, 수척함, 호흡 곤란, 설사, 황달을 보이는 것이 특징이다. PCV2 감염 돼지를 부검하는 동안, 미시적 병변 및 육안 병변이 다수의 조직 및 기관에서 또한 나타나는데, 림프 기관이 가장 흔한 병변 부위이다. PCV2 핵산 또는 항원의 양과 미시적 림프 병변의 중증도 간에 강한 상관관계가 관찰되었다. PCV2에 감염된 돼지의 사망률은 80%에 이르며, PMWS 외에도, PCV2는 가성 광견병 (pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia)을 포함하는 다수의 다른 감염을 동반한다. 따라서, PCV2의 감염을 예방할 수 있는 백신 치료제에 대한 필요성이 매우 크다.
한편, PCV2의 OFR2(Open Reading Frame 2) 유전자는 외피단백질(capsid protein)을 암호화하는 것으로, 상기 ORF2에 의해 생성된 외피단백질은 바이러스 유사 입자(virus like particle)을 형성한다. 대략 30kDa의 분자량을 갖는 PCV2의 ORF2 단백질은 상기 ORF2 유전자를 포함하는 바이러스 벡터로 세포를 감염시켜, 이로부터 분리하는 방법을 통해 일반적으로 수득되는데, 이러한 방법은 형질전환 세포에서의 단백질의 추출 과정에서 비용과 시간이 많이 요구된다는 단점이 있으며 세포로부터 회수되는 ORF2 단백질의 양이 매우 적다. 따라서, 백신 등에 사용하기 위한 충분한 양의 ORF2 단백질을 수득하기 위한 대량 생산 방법에 대한 연구가 필요하다.
이에 본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하고자 연구를 계속한 결과, 국내 유래 PCV2(Porcine circovirus type 2)의 ORF2(Open Reading Frame 2) 유전자를 분석해서 코돈 최적화 하고, 이를 이용하는 경우 곤충세포에서 ORF2 단백질의 발현양을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이용한 PCV2 백신의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 방법에 의해 생산되는 PCV2 감염 질환 예방용 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 PCV2 감염 질환의 예방 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
1) 코돈 최적화된 PCV2(Porcine circovirus type 2)의 ORF2(Open Reading Frame 2) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 1)단계의 벡터를 베큘로바이러스(baculovirus)에 도입하는 단계;
3) 상기 2)단계의 재조합 베큘로바이러스(baculovirus)로 곤충세포를 감염시키는 단계; 및
4) 상기 3)단계의 감염된 곤충세포로부터 바이러스 유사 입자(virus like particle)를 수득하는 단계;를 포함하는 PCV2(Porcine circovirus type 2) 백신의 대량 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 생산되는 PCV2 감염 질환 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 PCV2 감염 질환의 예방 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이용할 경우, 정상 PCV2의 ORF2 유전자를 이용하는 경우에 비해 곤충세포에서의 발현양이 최대 10배까지 증가하는 바, 이를 이용하여 대량으로 PCV2 백신을 생산할 수 있으며, 상기 방법을 통해 제조된 백신 조성물은 항체 생성능 및 바이러스 방어능이 우수하여 PCV2 감염 질환의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 국내 분리주의 PCV2 염기 서열과 코돈 최적화된 PCV2 염기 서열을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 구축한 후, 재조합 벡터의 정상적인 발현을 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 곤충세포가 재조합 베큘로바이러스에 감염되었는지 여부를 확인한 도이다.
도 5는 재조합 베큘로바이러스로 감염된 곤충세포로부터 생산된 바이러스 유사 입자를 전자현미경(TEM)으로 확인한 도이다.
도 6은 감염된 곤충세포에 의해 생산된 PCV2 ORF2 단백질의 발현양을 웨스턴 블롯팅 및 SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다.
도 7은 감염된 곤충세포에 의해 생산된 PCV2 ORF2 단백질의 발현양을 ELISA를 통해 확인한 도이다.
도 8은 기니픽에서 PCV2 백신 조성물에 의한 항체 생성능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 SPF miniature 돼지에서 PCV2 백신 조성물에 의한 항체 생성능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 PCV2 백신 조성물의 투여에 의한 바이러스 방어능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 코돈 최적화된 PCV2(Porcine circovirus type 2)의 ORF2(Open Reading Frame 2) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계, 2) 상기 1)단계의 벡터를 베큘로바이러스(baculovirus)에 도입하는 단계, 3) 상기 2)단계의 재조합 베큘로바이러스(baculovirus)를 곤충세포에 감염시키는 단계, 및 4) 상기 3)단계의 감염된 곤충세포로부터 바이러스 유사 입자(virus like particle)를 수득하는 단계를 포함하는 PCV2(Porcine circovirus type 2) 백신의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 PCV2(Porcine circovirus type 2)의 OFR2(Open Reading Frame 2)는 외피단백질(capsid protein)을 암호화하는 것으로, 상기 ORF2에 의해 생성된 외피 단백질은 바이러스 유사 입자를 형성한다.
상기 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 상기 서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 PCV2 의 ORF2 유전자는 국내 분리주에서 유래된 것으로서 국내 분리주의 ORF2 서열을 곤충 세포 시스템에 맞도록 코돈 최적화시킨 것이다.
본 발명에서 "코돈 최적화(codon optimization)"란 특정 유전자를 다른 개체에서 발현시키는 경우, 유전자가 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현할 수 있도록 유전자의 염기서열을 변환시키는 것을 말한다.
본 발명에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 벡터는 목적한 코딩 서열과 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는 데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 본 발명의 일실시예에서는 pVL1392 벡터를 이용하였으며, 이에 제한되지 않는다. (도 2 참조)
본 발명에서 "곤충 세포"는 Sf9, Sf21, High five 세포 또는 Tn5 등의 일반적인 곤충 세포를 포함하며, 바람직하게는 Sf9 또는 High five 세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "바이러스 유사 입자"는 바이러스 핵산을 함유하도록 조립된 단백질 코트 또는 캡시드를 포함하는 것으로, 상기 바이러스 유사 입자는 바이러스의 외피(capsid) 형태를 유지하여 살아있는 바이러스와 유사한 효과를 가진다. 또한 PCV2의 ORF2 단백질 단독 형태에 비해 면역원성이 증가된다.
본 발명의 일실시예에서는 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이용하면 정상 PCV2의 ORF2 유전자를 이용하는 경우에 비해 곤충세포에서 PCV2의 ORF2의 발현양이 크게 증가함을 확인하였으며 이를 이용하여 대량으로 PCV2 백신을 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 백신 조성물은 항체 생성능 및 바이러스 방어능이 우수한 바, PCV2 감염 질환의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산되는 PCV2 감염 질환 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "백신"은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신으로, PCV2에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다.
본 발명의 "PCV2 감염 질환"에는 이유후 전신성 소모성 증후군 (PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome), 가성 광견병 (pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 유효 성분인 PCV2의 ORF2의 단백질 또는 바이러스 유사 입자 이외에도 백신 조성물을 구성하는 데 적절한 하나 이상의 면역증강제 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에의 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전 일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판 (Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 PCV2 감염 질환의 예방 방법을 제공한다.
본 발명에서 돼지에 백신 조성물을 투여하는 방법은 일반적인 백신 투여 방법에 의할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 장내 또는 비경구 경로, 경구, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 피내 또는 다른 적절한 경로를 통한 투여를 수행할 수 있고, 바람직하게는 근육 내, 피내, 피하에 투여된다.
본 발명에서 백신 접종의 대상인 돼지는 이에 제한되지 않으나, 모돈 또는 자돈이다.
본 발명에서 돼지에게 백신 조성물 투여는 면역학적 유효량으로 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 PCV2 관련된 질병의 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들은 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 - 코돈 최적화된 PCV2 의 ORF2 유전자의 제조
곤충 세포에서 발현 효율을 높이기 위해 국내 분리주로부터 얻은 PCV2의 ORF2 유전자(NCBI 등록번호 FJ755686)의 염기서열을 곤충세포에 맞도록 코돈 최적화했다. 코돈 최적화는 원래의 염기서열을 곤충세포에서 주로 사용되는 염기서열로 변경하는 방법으로 수행하였다. 본 발명의 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자가 곤충세포에서 발현되는 경우 원래 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 상기와 같은 방법으로 코돈 최적화시킨 서열은 서열번호 1로 표시된다.
국내 분리주로부터 얻은 유전자 서열과 코돈 최적화된 서열을 비교하면 도 1과 같다.
도 1에서 나타낸 바와 같이 코돈 최적화한 결과 정상 유전자와 96개의 염기 서열에서 차이가 있음을 확인하였다. 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이후 실험에 사용하였다.
실시예 2 - 코돈 최적화된 PCV2 의 ORF2 의 발현을 위한 재조합 벡터의 구축
상기 실시예 1에서 얻은 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하였으며 이의 구조를 도 2에 간략하게 나타내었다. 발현 벡터의 백본으로는 pVL1392 벡터를 이용하였으며, 코돈 최적화된 서열의 cold-fusion을 위해 PCR 기법으로 벡터 서열을 PCV2의 ORF2 서열에 도입한 후, pVL1392 벡터에 클로닝하였다.
상기와 같은 방법으로 제조한 재조합 발현벡터의 발현을 확인하기 위해서, 정방향 프라이머(GCGGCCGCATGACGTATCCAAGGAGGCAT) 및 역방향 프라이머(GGATCCTCAGGGTTTAAGTGGGGGGTC)를 사용하여, 하기 표 1의 조건으로 PCR을 수행한 후, 전기영동을 통해 확인하였다.
Figure 112015106457609-pat00001
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이 전기영동을 통해 제조합 벡터의 정상적인 발현을 확인하였고 이를 이후 실시예에 사용하였다.
실시예 3 - 재조합 베큘로바이러스의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 재조합 발현벡터를 이용하여 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 발현하는 재조합 베큘로바이러스에 감염된 곤충세포를 제조하였다. 구체적으로, Sf9 세포주를 60mm 디쉬에 1x106 세포로 넣어주고, Sf-900III SFM (Gibco-BRL, USA) 3ml을 첨가하여 27℃에서 최소 1시간 이상 배양함으로써 세포를 디쉬에 부착시켰다. 상기 실시예 2에서 제조한 재조합 벡터와 BD BaculoGold DNA를 Sf-900III SFM 100μl 에 혼합한 용액 A, 및 CELLFECTIN Reagent(Gibco-BRL, USA) 와 Sf-900II SFM 100μl를 혼합한 용액 B를 27℃에서 각각 15-30분간 반응시켰다. 반응 후, 용액 A, B를 혼합한 후, 27℃에서 15-30분간 반응시켰으며, 1x106 세포로 분주된 Sf9 세포주에 접종하여 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 감염시켰다.
상기 방법으로 제조한 재조합 베큘로바이러스를 접종하여 감염된 곤충세포 및 배양액으로부터 DNA를 추출하여 전기 영동으로 형질감염 여부를 확인하였다. 또한 세포 형태, 세포 크기 등의 변화를 통하여 재조합 베큘로바이러스에 감염되어진 세포와 그렇지 않은 세포를 비교하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이 대조군과 비교한 결과 곤충세포가 재조합 베큘로바이러스에 감염되었음을 확인하였다.
실시예 4 - 재조합 베큘로바이러스를 이용한 바이러스 유사 입자의 제조
상기 실시예 3에서 제조한 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 접종하여 이로부터 바이러스 유사 입자(VLP)를 얻었다.
보다 구체적으로, Sf9 세포주를 T-75 플라스크에 5x106 개의 세포주로 넣어주고, Sf-900III SFM (Gibco-BRL, USA) 10ml을 첨가하여 27℃에서 최소 1시간 이상 배양함으로써 세포를 디쉬에 부착시켰다. 그 후 세포에 재조합 베큘로바이러스를 접종하였고, 세포 및 배양액을 수거하여 이로부터 바이러스 유사 입자를 얻었다.
상기 방법으로 얻어진 바이러스 유사 입자를 전자현미경(TEM)으로 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이 700nm 크기의 PCV2 바이러스 유사 입자 cluster는 이질염색질(heterochromatin)과 구별되도록 생성되었음을 확인하였다.
실시예 5 - 코돈 최적화된 PCV2 의 ORF2 유전자를 이용한 곤충세포에서 PCV2 ORF2 단백질의 발현능 확인
상기 실시예 1에서 제조한 PCV2의 ORF2 유전자 이용시 곤충세포에서의 ORF2 단백질 발현양을 웨스턴 블롯팅, SDS-PAGE 및 ELISA 방법으로 확인하였다.
구체적으로, SDS-PAGE를 위해 시료를 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 80V의 전압으로 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 겔은 Coomassie brilliant blue solution로 염색하고 Destaining solution으로 탈색하여 관찰하였다. 웨스턴 블롯팅은, SDS-PAGE 겔을 nitrocellulose membrane에 300mA로 2-3시간동안 트랜스퍼하였고, 차단을 위하여 TBS-T 완충액에 녹인 5% 스킴 밀크를 1시간 처리하였다. 1차 항체로 메디안디노스틱사의 PCV2 단클론항체 (Anti-PCV2, Cat.No. 9051, 1:500)를 5% 스킴 밀크를 녹인 TBS-T 완충액에 희석하여 1시간 처리한 후, 15분씩 3번 세척하였다. 2차 항체 역시 5% 스킴 밀크를 녹인 TBS-T 완충액에 희석하여 1시간 동안 처리하였고, 15분씩 3번 세척하였다. 최종적으로 membrane에 DAB (Sigma)를 처리하여 특이 밴드를 관찰하였다. 또한, ELISA는 Synbiotics사의 Ag detection ELISA 키트를 이용하였으며, 각 시료를 PBS로 10-4의 농도가 되게 10진 희석하여 웰당 100μl씩 1시간 처리한 후, PBS-T 완충액으로 3번 세척하였다. 여기에 2차 항체를 PBS에 희석하여 1시간 동안 처리하였고, PBS-T 완충액으로 3번 세척한 후, TMB 용액으로 발색정도를 관찰하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 결과를 도 6에, ELISA 분석 결과를 도 7에 나타내었다.
도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 코돈 최적화 과정을 거치지 않은 ORF2 유전자를 이용할 때 보다 본 발명의 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이용할 경우, 곤충세포에서 최대 10배의 ORF2 단백질 생산 효율이 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2 유전자를 이용하면 PCV2의 대량 생산이 가능하다.
실시예 6 - PCV2 백신 조성물의 제조 및 항체 생성능 확인
항원의 안정성 확인과 함께 항체 형성여부를 확인하기 위해서 모델 동물인 기니픽(guinea pig)을 이용한 동물 실험으로 항체 생성 여부를 확인하였다. 동물 실험은 농림축산검역 본부의 PCV2 바이러스 검정법을 기반으로 진행하였으며, 상업용 백신인 CircoFLEXTM을 대조군으로 하여 2종류 부형제에 대한 테스트를 진행하였다. 이때 사용한 부형제는 0.1% Carbopol(부형제 A) 또는 10% Rehydrogel이 포함된 30% Al(OH)3(부형제 B)이다. 면역을 위하여, 3개체의 기니픽에 CircoFLEXTM와 동량의 코돈 최적화된 PCV2 발현단백질을 부형제와 1:1 (v/v)로 희석하여 1ml씩 주사하였다. 주사는 3주 간격으로 2회 주사하였으며 주사 뒤 1, 2주일 뒤에 혈청을 분리하여 시료로 사용하였다. 항원에 대한 특이 항체의 생성여부 및 혈액내 항체가를 분석하기 위해서 Synbiotics사의 항체가 측정용 ELISA 키트(SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking)를 사용하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 이때, 흡광도 값이 낮을수록(0.4 이하) PCV2에 대한 방어 항체가 대량 생산된 것으로 측정하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이 본 발명의 코돈 최적화된 PCV2의 ORF2를 이용한 백신 조성물의 안정성 및 항체 생성능이 있음을 확인하였다.
실시예 7 - SPF miniature pig에서 PCV2 백신 조성물의 항체 생성능 확인
돼지에서 상기 실시예 6에서 제조한 본 발명의 백신 조성물의 항체 생성능 확인을 위하여, PCV2 항체가가 음성인 SPF miniature pig 3두에 본 발명의 백신 조성물을 접종한 뒤 1주 간격으로 혈액을 채혈하고 Synbiotics 사의 PCV2 Ab ELISA 키트를 이용해 항체가를 측정하였다. 대조군으로는 CircoFLEXTM를 사용하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 백신 조성물의 접종 후 6주차까지 항체가가 지속적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 8 - 백신 투여에 의한 바이러스 방어능 확인
본 발명의 백신 투여에 의한 바이러스 방어능을 확인하기 위해서, 사양 농가의 사양 시험을 진행했다. 구체적으로 본 발명의 재조합 PCV2 ORF2 항원을 주사한 10두, 양성 대조군으로서 상업용 백신 (CircoFLEXTM)을 주사한 10두 및 음성 대조군으로서 백신 주사를 하지 않은 자돈 10두를 이용한 시험을 수행하였다. 백신은 1회 접종하였고 안정성 확인을 위해 접종량의 10배까지 접종을 진행하였다. 3주령에 실험을 시작하였고 5주령에 PCV2 바이러스를 돼지의 비강으로 분무하는 방식으로 공격접종 하였다. 한편 백신 접종 후 매주 채혈과 임상증상을 비교하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 재조합 PCV2 항원 접종군은 상업용 백신과 유사한 항체가 패턴으로 PCV2 바이러스에 대한 방어능력을 나타냈다.
본 발명의 백신 투여에 의한 바이러스 방어능을 추가적으로 확인하기 위해서 real-time PCR 기법으로 PCV2 바이러스의 공격접종 후 혈액 내 바이러스의 항원을 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112015106457609-pat00002
( PCV2 공격 접종 후 혈액내 바이러스 측정 (real-time PCR 검정))
그 결과 상업용 백신과 본 발명의 재조합 항원을 주사한 개체에서는 바이러스 항원이 측정되지 않았고 접종하지 않은 대조군에서는 바이러스 항원이 검출되었다.
따라서, 본 발명의 백신 조성물은 상업용 백신과 유사한 패턴으로 항체 생성능 및 PCV2 바이러스에 대한 방어능을 나타내므로, PCV2 백신을 대량 생산하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.
하기에 본 발명의 백신 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1 - 산제의 제조
PCV2의 ORF2 10mg
유당 100mg
탈 10mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2 - 주사제의 제조
PCV2의 ORF2 100μg
주사용 멸균 증류수 적량
조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 3 - 액제의 제조
PCV2의 ORF2 10mg
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 100ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.
<110> Optipharm.CO.,LTD <120> Method for mass production of PCV2 vaccine and vaccine composition using the same <130> 1-9P <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized PCV2 ORF2 <400> 1 atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga cgtagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60 caaatcctca ggcgccgccc ttggctggtc catccaagac accgtcaccg ctggcgcagg 120 aagaacggta tcttcaacac acgcctctcg agaaccttcg gatacaccat caaacgtacg 180 acagttaaga cgccctcatg ggcggtggac atgatgcgtt tcaatattaa tgacttcctg 240 ccgccaggcg gcggatcaaa cccgagatct gtgccttttg agtattaccg aatacgtaag 300 gttaaagtag agttttggcc ttgctcccct atcacccaag gtgacagggg agtgggcagc 360 agtgctgtta tcctagatga taactttgta acaaaggcca ctgccctcac ttatgaccca 420 tacgtcaact actcgtcccg acataccatt acccaaccct tctcatacca ctctaggtac 480 tttaccccta aacctgtgtt ggattccaca attgattatt tccaaccaaa caacaaaaga 540 aaccagctgt ggttgagact gcagactgct gggaatgtcg accacgtcgg tttgggtact 600 gcattcgaaa acagtatata cgaccaggag tacaacatcc gtgtaactat gtacgtgcag 660 ttcagggaat tcaatcttaa ggacccccca ttaaagccc 699

Claims (7)

1) 서열번호 1로 표시되는 코돈 최적화된 PCV2(Porcine circovirus type 2)의 ORF2(Open Reading Frame 2) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 1)단계의 벡터를 베큘로바이러스(baculovirus)에 도입하는 단계;
3) 상기 2)단계의 재조합 베큘로바이러스(baculovirus)로 곤충세포를 감염시키는 단계; 및
4) 상기 3)단계의 감염된 곤충세포로부터 바이러스 유사 입자(virus like particle)를 수득하는 단계;를 포함하는 PCV2(Porcine circovirus type 2) 백신의 대량 생산 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 벡터는 하기 벡터맵으로 표시되는 것을 특징으로 하는, PCV2 백신의 대량 생산 방법.
Figure 112015106457609-pat00003

제1항에 있어서, 상기 곤충 세포는 Sf9 또는 하이 파이브(High five) 세포인 것을 특징으로 하는, PCV2 백신의 대량 생산 방법.
제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 PCV2 감염 질환 예방용 백신 조성물.
제5항의 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계;를 포함하는, PCV2 감염 질환의 예방 방법.
제6항에 있어서, 상기 예방 방법은 상기 백신 조성물을 근육 내, 피내 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 접종하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염 질환의 예방 방법.





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