ES2434117T3 - Prevención y tratamiento de pcvd subclínica - Google Patents

Abstract

Uso de una proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) o una composición inmunogénica que comprende una proteína ORF2 del PCV2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección subclínica por PCV2 en un cerdo, en donde una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho medicamento administrada a dicho cerdo reduce la deficiencia en el desarrollo o reduce la exceción nasal del virus y/o la duración de la viremia, y en donde dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza porque la carga vírica en un cerdo subclínicamente infectado es inferior a 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero y porque una muestra de 1 ml de suero o 1 mg de tejido de dicho cerdo comprende una cantidad detectable de equivalentes del genoma de PCV2.

Description

Prevención y tratamiento de PCVD subclínica

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una composición inmunogénica que comprende un antígeno de circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) para la prevención y tratamiento de infecciones subclínicas (crónicas) por PCV2 en animales, es decir, en cerdos.

Descripción de la técnica anterior

El circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) es un virus pequeño (17 - 22 nm de diámetro), icosaédrico, de ADN sin cubierta, que contiene un genoma circular de cadena sencilla. El PCV2 comparte una identidad de secuencia de aproximadamente 80% con el circovirus porcino de tipo 1 (PCV1). Sin embargo, a diferencia del PCV1, que generalmente no es virulento, la infección de suidos con PCV2 se ha asociado recientemente con varios síndromes patológicos que se han denominado colectivamente Enfermedades por Circovirus Porcino (PCVD) (también denominadas Enfermedades asociadas con el Circovirus Porcino (PCVAD)) (Allan et al, 2006, IPVS Congress). El síndrome de adelgazamiento multisistémico posterior al destete (PMWS) se considera generalmente la manifestación clínica más importante de la PCVD (Harding et al., 1997, Swine Health Prod; 5: 201-203; Kennedy et al., 2000, J. Comp. Pathol.; 122: 9-24). Otros trastornos potencialmente relacionados referidos en la bibliografía incluyen el complejo respiratorio porcino (PRDC), el síndrome de dermatopatía y nefropatía porcino (PDNS), la insuficiencia reproductora, la enteritis granulomatosa y, potencialmente, los temblores congénitos (CT-AII) y la miocarditis perinatal (Chae, Veterinary J., 2005, 169: 326-336).

La PCVD afecta a cerdos entre 5-22 semanas de edad. Clínicamente, la PCVD se caracteriza por un adelgazamiento, palidez de la piel, un desarrollo poco vigoroso, insuficiencia respiratoria, diarrea, ícterus e ictericia. En algunos suidos afectados, resultará evidente una combinación de todos los síntomas, mientras que otros suidos afectados solamente tendrán uno o dos de estos síntomas (Muirhead, 2002, Vet. Rec.; 150: 456). La tasa de mortalidad para suidos infectados con el PCV2 puede aproximarse a 50%. Durante la necropsia, también aparecen lesiones microscópicas y macroscópicas en varios tejidos y órganos, siendo los órganos linfoides el sitio más común para las lesiones (Allan y Ellis, 2000; J Vet. Diagn. Invest., 12: 3-14). Se ha observado una fuerte correlación entre la cantidad de ácidos nucleicos o antígenos del PCV2 y la gravedad de las lesiones linfoides microscópicas (Brunborg, 2004). Además, también se ha encontrado una correlación entre la cantidad de ácido nucleico o antígeno en la sangre y la gravedad de los síntomas clínicos (Brunborg, 2004; Liu, 2000; Olvera, 2004). Se ha demostrado que los cerdos afectados por PCVD presentan cargas víricas mayores que 106 equivalentes genómicos por ml.

El documento WO 2006/072065 A2 describe el uso médico de una proteína recuperada que ha sido expresada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2 en células infestadas con un virus que contiene dicho marco de lectura abierto 2. Los Ejemplos 4 y 5 (páginas 54-106) del documento WO 06/072065 A2 muestran ensayos de eficacia de siete y ocho vacunas candidato contra PCV2, respectivamente, en lechones derivados por cesárea y desprovistos de calostro (CDCD), en donde los títulos IFA de PCV2 de las cerdas eran : 1000 y el estado serológico de las cerdas era de una piara PRRS-negativa.

El documento US 6.703.023 B1 describe un protocolo de vacunación, en el que se utilizaron lechones con la enfermedad de la pérdida de peso de lechones (PWD) para evaluar la eficacia de la composición de la vacuna, que comprende fragmentos nucleicos de circovirus de tipo B de PWD (Ejemplo 5 del documento US 6.703.023 B1). Tal como se describe en dicho documento, se demostróq ue los animales que recibieron una primera y una segunda inyección de plásmido pcDNA3ORF1+, plásmido pcDNA3ORF2+ y plásmido GMCSF+ y una tercera inyección de células transformadas mediante baculovirus recombinantes BAC ORF1+ y BAC ORF2+ no exhibían hipertermia. Adicionalmente, estos animales no experimentaban una disminución en su desarrollo, siendo los dmgs equiparables a los de animales testigo no infectados, y no exhibían síntoma clínico particular alguno.

A diferencia de las manifestaciones de enfermedad clínicamente evidentes de la infección por PCV2, se cree que las infecciones sublínicas por PCV2 están presentes en los animales que están infectados con el PCV2 pero son clínicamente asintomáticos. En general, existe una relación entre estas formas de infección por el PCV2, ya que las infecciones subclínicas pueden evolucionar fácilmente a PCVD y ya que los animales convalecientes pueden permanecer infectados de forma persistente (crónica) (véase la figura 1).

Observaciones recientes han demostrado que las infecciones subclínicas por PCV2 son acontecimientos frecuentes. La existencia de infecciones subclínicas ha sido demostrada tanto en estudios experimentales como en estudios de campo. Mediante estudios de laboratorio se puede demostrar que la infección por PCV2 en cerdos individuales no está siempre asociada con signos o lesiones clínicas (Harms et al., 2001, Vet. Pathol., 38:528-539). Además, distintos estudios de campo han demostrado que la incidencia de piaras seropositivas infectadas por el PCV2 es mayor que la incidencia de piaras afectadas por la PCVD (Olvera et al., 2004, J. Virol. Methods, 117: 75-80). A menudo las piaras que han padecido un brote agudo de PCVD permanecen infectadas con el PCV2 sin mostrar ningún signo clínico evidente. Según la bibliografía, esta forma de infección subclínica (persistente) en una piara también se denomina infección "crónica" (Burch D., 2006, Pig International).

No se conoce, si es que existe, el impacto económico del PCV2 en piaras infectadas subclínicamente y nunca ha sido descrito hasta ahora. En particular, no se conocía y nunca se había dado ninguna indicación sobre si los casos subclínicos de infecciones por el PCV2 tienen algún impacto sobre el rendimiento del crecimiento de los animales o, en general, sobre la salud global de los animales afectados.

En la patente de EE.UU. nº 6.703.023 se describen estrategias para tratar las infecciones por PCV2 basadas en una vacuna de ADN. En el documento WO 03/049703 se describe la producción de una vacuna quimérica viva, que comprende un esqueleto de PCV1 en el que un gen inmunogénico de una cepa patógena de PCV2 sustituye a un gen del esqueleto del PCV1. El documento WO99/18214 ha proporcionado varias cepas de PCV2 y procedimientos para la preparación de una vacuna muerta de PVC2. Sin embargo, no se ha mostrado ningún dato de eficacia. En el documento WO06/072065 se ha mostrado una vacuna de subunidades eficaz basada en la ORF-2. Se pretende que estas dos vacunas se utilicen para la vacunación/tratamiento de suidos o cerdos mayores de 3 semanas de edad. Ninguna de estas vacunas ha sido nunca descrita para la profilaxis y el tratamiento de animales infectados subclínicamente con el PCV2. Además, no se ha descrito que tales vacunas confieran inmunidad frente a la infección del PCV2 en grupos de animales infectados subclínicamente ni que aumenten el rendimiento del crecimiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Diferentes formas de infecciones por el PCV2. Figura 2: Tasa de mortalidad y aumento de peso diario medio durante el engorde en la granja de estudio antes y después del inicio del estudio. Figura 3: Desarrollo de la diferencia relativa en el peso corporal (IVP-CP) y de la carga viral media (log10) a lo largo del estudio. Figura 4: Comparación del porcentaje de animales con una carga viral > 106 equivalentes genómicos/ml de suero en ambos grupos de tratamiento. Figura 5: Comparación del porcentaje de animales con una carga viral de 104-106 equivalentes genómicos/ml de suero en ambos grupos de tratamiento.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Las infecciones por PCV2 evidentes clínicamente se asocian con varios síndromes patológicos. Dependiendo de la forma de expresión de la enfermedad relacionada con el PCV2, los signos clínicos de una infección por PCV2 puede ser uno o más de los siguientes síntomas: a) una tasa de mortalidad aumentada significativamente (4-20% mayor), b) un aumento significativo en la frecuencia de cerdos retrasados (5-50% mayor) y c) otros signos clínicos evidentes, tales como síntomas respiratorios, diarrea, palidez de la piel, un desarrollo poco vigoroso (tasa de morbilidad de 460%). Además, títulos virales elevados de más de 106 o 107 por ml de suero o tejido son un resultado característico en la mayoría de los animales con signos agudos de PCVD. Junto con esta infección aguda por PCV2, las infecciones subclínicas por PCV2 caracterizadas por una tasa de morbilidad baja o nula se hacen cada vez más visibles. En algunos casos una situación de una infección aguda por PCV2 puede evolucionar hacia una infección por PCV2 subclínica. Sin embargo, las infecciones subclínicas también pueden producirse sin ningún signo previo de infección aguda por PCV2.

Sorprendentemente, se ha encontrado que una infección subclínica por PCV2 tiene un impacto significativo sobre parámetros de rendimiento de cerdos aparentemente saludables, en particular el rendimiento del crecimiento de los cerdos. Incluso si los animales infectados subclínicamente no desarrollan síntomas clínicos típicos que permitan la identificación de la PCVD o muestran sólo una morbilidad baja, estos animales están afectados significativamente por la infección subclínica por PCV2. Las infecciones subclínicas de cerdos con el PCV2 producen una pérdida significativa en el aumento de peso (por ejemplo, véase el ejemplo 3). Como ya se ha mencionado, hasta ahora no se ha dado en la técnica anterior ninguna evidencia de que las infecciones subclínicas por PCV2 tengan ningún impacto sobre la salud, en particular sobre el rendimiento del crecimiento, en cerdos.

Sin embargo, también se ha descubierto sorprendentemente que la reducción en el aumento de peso producido por una infección subclínica por PCV2 puede reducirse mediante el tratamiento/vacunación de los animales que han sido infectados subclínicamente con el antígeno del PCV2 (por ejemplo, véase el ejemplo 3). Por lo tanto, no solo se ha demostrado que las infecciones subclínicas por PCV2 afectan al rendimiento del crecimiento de los cerdos, sino que también se ha evidenciado que dicho impacto negativo puede reducirse significativamente mediante el tratamiento/vacunación de los animales con antígeno del PCV2. En otras palabras, aunque el fenómeno de las infecciones subclínicas ha sido descrito en la técnica anterior, ahora se ha evidenciado por primera vez que:

la infección subclínica por PCV2, observada ocasionalmente en el campo, tiene un impacto significativo

sobre el rendimiento del crecimiento de los cerdos;

la vacunación con antígeno del PCV2 de los cerdos o piaras afectados subclínicamente puede reducir

significativamente el impacto negativo de esta infección subclínica por PCV2.

Por tanto, según un aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2 en un animal o un grupo de animales, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesite dicha administración.

Una "infección subclínica por PCV2", tal como se usa en la presente memoria se caracteriza por i) una carga viral en un animal individual que permanece durante la vida entera por debajo de 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero, ii) una proporción baja de animales positivos frente al PCV2 en un grupo o piara con títulos víricos de más de 106 copias genómicas por ml de suero, iii) una persistencia del virus en un grupo o piara de al menos 6 semanas, preferiblemente al menos 8 semanas, más preferido de al menos 10 semanas y lo más preferido de al menos 12 semanas, iv) la ausencia de síntomas clínicos típicos en un animal positivo frente al PCV2, v) una tasa de morbilidad nula o solo baja en un grupo de animales o una piara de animales positivos frente al PCV2 y/o vi) una tasa de mortalidad baja en un grupo o piara de animales positivos frente al PCV2.

La expresión "proporción baja de animales positivos frente al PCV2" tal como se usa en el punto ii) anterior significa que menos de 20%, preferiblemente menos de 15%, incluso más preferiblemente menos de 10%, incluso más preferiblemente menos de 8%, incluso más preferiblemente menos de 6%, incluso más preferiblemente menos de 4%, el más preferido menos de 3% de los animales positivos frente al PCV2 en un grupo de animales o una piara tiene títulos víricos de más de 106 copias genómicas por ml de suero. En otras palabras, la expresión "baja proporción de animales positivos frente al PCV2 en un grupo o una piara con títulos víricos de más de 106 copias genómicas por ml de suero" también significa que más de 80%, preferiblemente más de 85%, incluso más preferiblemente más de 90%, incluso más preferiblemente más de 92%, incluso más preferiblemente más de 94%, incluso más preferido más de 96%, el más preferido más de 97% de los animales positivos frente al PCV2 de un grupo de animales o una piara tienen títulos víricos de menos de 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero.

La expresión "positivos frente al PCV2", tal como se usa en la presente memoria, significa, pero sin limitarse a ello, un animal que comprende una cantidad detectable de equivalente genómicos (= copias víricas) de PCV2 en una muestra (1 ml de suero o 1 mg de tejido). Una cantidad detectable de equivalente genómicos del PCV2 significa que los equivalentes genómicos del PCV2 se pueden detectar mediante un análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Una muestra se considera positiva en el análisis por PCR si dos muestras independientes dan a un resultado de PCR positivo en dicho análisis.

Métodos para la cuantificación del PCV2 mediante un ensayo por PCR son muy conocidos en la técnica. De hecho, la cuantificación de los equivalentes del genoma del PCV2 se hace/hizo mediante el método descrito en Brunborg et al., 2004; J. Virol. Methods 122: 171-178. Para la amplificación del PCV2 se usaron/usan iniciadores PCV2-841265U21 y PCVL21. Dicho método debe considerarse como ensayo de referencia en cualquier caso de duda.

La expresión "persistencia vírica", tal como se usa en la presente memoria, significa que el animal infectado tiene una carga vírica de al menos 104 copias víricas de PCV2 por ml de suero durante dicho periodo de tiempo, es decir durante al menos 6 semanas o mayor como se ha definido anteriormente.

La expresión "ausencia de síntomas clínicos típicos en animales positivos frente al PCV2", tal como se usa en la presente memoria, significa la ausencia de cualquier síntoma clínico evidente asociado con un infección clínica por PCV2 evidente que permita una identificación precisa y sin ninguna duda de una infección por PCV2 solo mediante su apariencia clínica típica. Dichos síntomas clínicos son los conocidos como PCVD, en particular palidez de la piel, desarrollo poco vigoroso, insuficiencia respiratoria, diarrea, ícterus o ictericia.

La expresión "tasa de morbilidad baja", tal como se usa en la presente memoria, es un indicador de la ausencia de signos clínicos que permitan la identificación de una infección aguda por PCV2 por su apariencia clínica. Por lo tanto es un indicador de la existencia de una infección subclínica por PCV2. La expresión "tasa de morbilidad baja", tal como se usa en la presente memoria, se refiere al porcentaje de animales con un estado general de salud alterado. Un estado general de salud alterado, tal como se usa en la presente memoria, se define como la presencia de uno o más signos clínicos relacionados con la PCVD, tales como la presencia de cerdos retrasados (definidos en la presente memoria como animales con un peso corporal 25% menor que el peso medio de su grupo de animales de la misma edad), palidez de la piel, desarrollo poco vigoroso, insuficiencia respiratoria, diarrea, ícterus o ictericia. Por lo tanto, la "morbilidad baja", tal como se usa en la presente memoria, significa que menos de 25%, preferiblemente menos de 20%, más preferido menos de 15%, incluso más preferido menos de 12%, incluso más preferido menos de 10%, incluso más preferido menos de 8%, incluso más preferido menos de 6%, lo más preferido menos de 4% de los animales de un grupo de animales o piara muestra uno o más síntomas de PCVD, preferiblemente muestran la existencia de cerdos retrasados como se ha definido anteriormente, palidez de la piel, desarrollo poco vigoroso, insuficiencia respiratoria, diarrea, ícterus o ictericia.

La expresión "tasa de morbilidad nula", tal como se usa en la presente memoria, significa que menos de 1% de los animales positivos frente al PCV2 de un grupo de animales o piara muestran uno o más de los síntomas clínicos de la PCVD, preferiblemente muestran la existencia de cerdos retrasados como se ha definido anteriormente, palidez de la piel, desarrollo poco vigoroso, insuficiencia respiratoria, diarrea, ícterus o ictericia.

La expresión "tasa de mortalidad baja", tal como se usa en la presente memoria, significa, pero sin estar limitado a ello, que la tasa de mortalidad es de menos de 20%, preferiblemente de menos de 15%, más preferido de menos de 12%, incluso más preferido de menos de 10%, incluso más preferido de menos de 8%, incluso más preferido de menos de 6%, el más preferido de menos de 4%, de los animales positivos frente al PCV2 en un grupo de animales

o una piara.

La expresión "que necesita de dicha administración" o "que necesita dicho tratamiento de administración", tal como se usa en la presente memoria, significa que la administración/tratamiento está asociado con la prevención de la salud o cualquier otro efecto medicinal positivo sobre la salud de los animales que reciben el antígeno del PCV2.

Según la descripción, se da un caso subclínico de una infección por PCV2 cuando son aplicables al menos: criterio i) "una carga vírica en un animal individual que permanece durante la vida completa por debajo de 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero", criterio ii) "una proporción baja de animales positivos frente al PCV2 en un grupo o piara con títulos víricos de más de 106 copias genómicas por ml de suero" o criterio iii) "una persistencia vírica en un grupo o piara de al menos 6 semanas, preferiblemente de al menos 8 semanas, más preferido de al menos 10 semanas, lo más preferido de al menos 12 semanas", como se han mencionado anteriormente. Más preferiblemente, un caso subclínico de infección por PCV2 se da cuando son aplicables los criterios i) y ii) como se han mencionado anteriormente.

En los casos en los que el criterio i) y/o el criterio ii) se combinan con el criterio iii) "una persistencia vírica en un grupo o piara de al menos 6 semanas, preferiblemente de al menos 8 semanas, más preferido de al menos 10 semanas, lo más preferido de al menos 12 semanas", o en cualquiera de los otros casos que comprenden el criterio iii) como se ha definido anteriormente, se considera que la infección subclínica es una "infección subclínica crónica por PCV2".

Según un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, en la que la infección subclínica por PCV2 se caracteriza por una carga vírica en un animal individual de menos de 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende antígeno del PCV2 a dicho animal que necesita dicha administración. Preferiblemente, dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza además por la presencia de menos de 20% de los animales con más de 106, preferiblemente más de 107, copias víricas de PCV2 por ml de suero en un grupo de animales o una piara y/o una persistencia vírica en dicho grupo o piara de al menos 6 semanas, preferiblemente de al menos 8 semanas, más preferido de al menos 10 semanas, lo más preferido de al menos 12 semanas. Más preferiblemente, dicha infección subclínica se caracteriza además por la ausencia de cualquier signo clínico en un animal individual positivo frente al PCV2 como se ha definido anteriormente, una tasa de morbilidad baja o nula como se ha definido anteriormente y/o una tasa de mortalidad baja como se ha definido anteriormente.

Según un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, en la que la infección subclínica por PCV2 se caracteriza por una carga vírica en un animal individual que permanecerá durante la vida completa por debajo de 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero en ausencia de cualquier administración de antígeno del PCV2, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a dicho animal que necesita dicha administración. Preferiblemente, dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza además por la presencia de menos de 20% de los animales con más de 106, preferiblemente más de 107, copias víricas de PCV2 por ml de suero en un grupo de animales o una piara y/o una persistencia vírica en dicho grupo o piara de al menos 6 semanas, preferiblemente de al menos 8 semanas, más preferido de al menos 10 semanas, lo más preferido de al menos 12 semanas. Más preferiblemente, dicha infección subclínica se caracteriza además por la ausencia de cualquier signo clínico en un animal individual positivo frente al PCV2 como se ha definido anteriormente, una tasa de morbilidad baja o nula como se ha definido anteriormente y/o una tasa de mortalidad baja como se ha definido anteriormente.

Según un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, en la que la infección subclínica por PCV2 se caracteriza por la presencia de menos de 20% de animales con más de 106, preferiblemente más de 107, copias víricas de PCV2 por ml de suero en un grupo de animales o una piara, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a dicho animal que necesita dicha administración. Preferiblemente, dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza además por una persistencia vírica en dicho grupo o piara de al menos 6 semanas, preferiblemente de al menos 8 semanas, más preferido de al menos 10 semanas, el más preferido de al menos 12 semanas. Más preferiblemente, dicha infección subclínica se caracteriza además por la ausencia de cualquier signo clínico en un animal individual positivo frente al PCV2 como se ha definido anteriormente, una tasa de morbilidad baja o nula como se ha definido anteriormente y/o una tasa de mortalidad baja como se ha definido anteriormente.

Según un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, en la que la infección subclínica se caracteriza por una persistencia vírica en un grupo de animales positivos frente al PCV2 o piara de al menos 6 semanas, preferiblemente de al menos 8 semanas, más preferido de al menos 10 semanas, el más preferido de al menos 12 semanas. Preferiblemente, dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza además por la ausencia de cualquier signo clínico en un animal individual positivo frente al PCV2 como se ha definido anteriormente, una tasa de morbilidad baja o nula como se ha definido anteriormente y/o una tasa de mortalidad baja como se ha definido anteriormente.

Según un aspecto adicional, la presente descripción también proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, en que la infección subclínica por PCV2 se caracteriza por la ausencia de cualquier signo clínico en un animal individual positivo frente al PCV2 como se ha definido anteriormente, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración. Preferiblemente, dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza además por una tasa de morbilidad baja o nula como se ha definido anteriormente y/o una tasa de mortalidad baja como se ha definido anteriormente. Más preferiblemente, dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza además por una carga vírica en un animal individual que permanece durante la vida entera por debajo de 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero y/o una proporción baja de animales positivos frente al PCV2 en un grupo o una piara con títulos víricos de más de 106 copias genómicas por ml de suero.

Según un aspecto adicional, la presente descripción también proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, en que la infección subclínica por PCV2 se caracteriza por una morbilidad baja o nula en un grupo de animales o una piara, preferiblemente de menos de 25% o inferior como se ha definido anteriormente, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración. Preferiblemente, dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza además por una carga vírica en un animal individual que permanece durante la vida entera por debajo de 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero y/o una proporción baja de animales positivos frente al PCV2 en un grupo o una piara con títulos víricos de más de 106 copias genómicas por ml de suero.

Según un aspecto adicional, la presente descripción también proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, en que la infección subclínica por PCV2 se caracteriza por una tasa de mortalidad baja, como se ha definido en la presente memoria, preferiblemente de menos de 20% o inferior, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración. Preferiblemente, dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza además por una carga vírica en un animal individual que permanece durante la vida entera por debajo de 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero y/o una proporción baja de animales positivos frente al PCV2 en un grupo o una piara con títulos víricos de más de 106 copias genómicas por ml de suero.

La administración de una cantidad eficaz de un antígeno del PCV2 a animales o un grupo de animales que están infectados subclínicamente con el PCV2 produce un aumento de peso aumentado de dichos animales durante el engorde, una reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, una reducción de la excreción nasal del virus y/o una reducción de la duración de la viremia.

Por tanto, según un aspecto adicional, la presente descripción también proporciona un método para la reducción de la pérdida de aumento de peso en animales infectados subclínicamente con el PCV2, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesite dicha administración. Preferiblemente, el aumento de peso medio aumenta en las semanas 10 a 22 de edad en más de 1,5 kg en comparación con los animales no vacunados. La expresión "durante el engorde", tal como se usa en la presente memoria, significa, pero sin limitarse a ellas, las semanas 1 a 36 de edad, preferiblemente las semanas 10 a 28 de edad, de dichos animales.

La expresión "en animales infectados subclínicamente con el PCV2", tal como se usa en la presente memoria, significa el animal individual que ha sido infectado subclínicamente con el PCV2, pero también se refiere a un grupo de animales en el que la mayoría de los animales de dicho grupo ha sido infectado subclínicamente con el PCV2. Por lo tanto, la expresión "en animales infectados subclínicamente con el PCV2" debe entenderse como i) "en animales infectados subclínicamente con el PCV2" y ii) "en animales de una piara en la que dicha piara está infectada subclínicamente con el PCV2".

Según un aspecto adicional, la presente descripción también proporciona un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero en un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con el PCV2, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración. Preferiblemente, el número de animales con 104 a 106 copias genómicas por ml de suero se puede reducir debido a la vacunación con un antígeno del PCV2 hasta menos de 30%, preferiblemente menos de 20%, incluso más preferiblemente menos de 10%, lo más preferiblemente menos de 5%, mientras que en el grupo de control no vacunado de animales infectados subclínicamente (con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero) más de 40% desarrollaron títulos de PCV2 con 104 a 106 copias genómicas por ml de suero.

Según un aspecto adicional, la presente descripción también proporciona un método para la reducción del número de animales con una carga vírica clínicamente relevante (por encima de 106 copias genómicas por ml de suero) en un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con el PCV2, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración. Preferiblemente, el número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero se puede reducir mediante la vacunación con un antígeno del PCV2 a menos de 10%, preferiblemente a menos de 5%, incluso más preferiblemente a menos de 4%, incluso más preferiblemente a menos de 3%, incluso más preferiblemente a menos de 2%, lo más preferiblemente a menos de 0,5%.

Según un aspecto adicional, la presente descripción también proporciona un método para la reducción de la excreción nasal del virus y la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con el PCV2, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesite dicha administración. Como se ha descrito anteriormente, la vacunación/tratamiento de animales infectados subclínicamente con PCV2 produjo un acortamiento de la fase virémica en comparación con los animales de control no vacunados. El acortamiento medio del tiempo de duración de la viremia fue de 17 días en comparación con los animales de control no vacunados de la misma especie. Por lo tanto, según un aspecto adicional, la presente invención también proporciona un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesite dicha administración, en el que el tratamiento o profilaxis produce un acortamiento de la fase de viremia de 5 días o más, preferiblemente de 6 días o más, aún más preferiblemente de 7 días o más, aún más preferiblemente de 8 días o más, aún más preferiblemente de 9, aún más preferiblemente de 10, aún más preferiblemente de 12, aún más preferiblemente de 14, lo más preferiblemente de más de 16 días en comparación con los animales de un grupo de control no tratado de la misma especie.

El término "antígeno", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos que produce una respuesta inmunológica en un huésped. Un antígeno, tal como se usa en la presente memoria, incluye la secuencia de longitud completa de cualquier proteína del PCV2, sus análogos o sus fragmentos inmunogénicos. La expresión "fragmento inmunogénico" se refiere a un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopes y, así, provoca la respuesta inmunológica en un huésped. Dichos fragmentos pueden identificarse utilizando cualquier técnica de representación en mapas de epítopes, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epítopes lineales se pueden determinar, por ejemplo, sintetizando concurrentemente una gran cantidad de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los peptidos a partes de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos, a la vez que los péptidos siguen estando fijados a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol.

23: 709-715. De manera similar, los epítopes conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.

Dentro de la definición de antígenos sintéticos también se incluyen, por ejemplo, los poliepítopes, epítopes flanqueantes y otros antígenos recombinantes u obtenidos de forma sintética. Véase, por ejemplo, Bergmann et al. (1993), Eur. J. Immunol., 23: 2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol., 157: 3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol., 75: 402-408; Gardner et al., (1998) 12ª Conferencia Mundial del SIDA, Ginebra, Suiza, 28 de junio-3 de julio de 1998.

Una "respuesta inmunológica" significa, pero no se limita al desarrollo en un huésped de una respuesta inmunológica celular y/o mediada por anticuerpos a un antígeno, composición inmunológica o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped exhibirá bien una respuesta inmunológica terapéutica o bien protectora (memoria), de modo que la resistencia a una nueva infección resultará reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad quedará reducida. Esta protección se verá demostrada bien por una reducción en el número o en la gravedad de los síntomas, o bien por la ausencia de uno o más de los síntomas asociados con las infecciones por PCV2, por un retraso en la aparición de viremia, por una persistencia vírica reducida, por una reducción en la carga vírica global y/o por una reducción en la excreción vírica.

La expresión “composición inmunogénica” o el término “vacuna” (ambos términos se utilizan como sinónimos), tal como se utilizan en la presente, se refieren a cualquier composición farmacéutica que contiene un antígeno del PCV2, pudiéndose utilizar dicha composición para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno asociado con una infección por PCV2 en un sujeto. Una composición inmunogénica preferida puede inducir, estimular o reforzar la respuesta inmune frente al PCV2. Por lo tanto, la expresión abarca tanto composiciones inmunogénicas de subunidades, tales como las que se describen a continuación, así como composiciones que contienen PCV2 completo matado o atenuado y/o inactivado.

Por lo tanto, según otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicho tratamiento, en la que la composición inmunogénica es una composición inmunogénica de subunidades o una composición que contiene PCV2 completo matado o atenuado y/o inactivado.

La expresión "composición inmunogénica de subunidades", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una composición que contiene al menos un polipéptido o antígeno inmunogénico, pero no todos los antígenos, derivado u homólogo de un antígeno procedente del PCV2. Una composición de este tipo está sustancialmente exenta de PCV2 intacto. Así, una "composición inmunogénica de subunidades" se prepara a partir de polipéptidos inmunogénicos procedentes del PCV2 al menos parcialmente purificados o fraccionados (preferiblemente esencialmente purificados), o análogos recombinantes de los mismos. Una composición inmunogénica de subunidades puede comprender las subunidades del antígeno o antígenos de interés esencialmente exentas de otros antígenos o polipéptidos procedentes del PCV2, o en forma fraccionada. En el contexto de la invención, la composición inmunogénica de subunidades preferida comprende la proteína ORF-2 del PCV2, como se describe a continuación. Las composiciones más preferidas son las composiciones inmunogénicas de subunidades que comprenden cualquiera de los antígenos del PCV2 proporcionados en el documento WO06/072065, que se incorporan todos en la presente memoria como referencia en su totalidad.

Según un aspecto adicional, la composición inmunogénica, como se utiliza en la presente memoria, comprende el polipéptido expresado por ORF-2 del PCV2. El ADN y la proteína ORF-2 del PCV2, utilizados en la presente memoria para la preparación de las composiciones y en los procedimientos proporcionados en la presente memoria es un dominio altamente conservado en aislados de PCV2 y, por lo tanto, cualquier ORF-2 del PCV2 será eficaz como fuente de ADN y/o de polipéptidos de ORF-2 del PCV2 tal como se usa en la presente memoria. Una proteína ORF-2 del PCV2 preferida es la de SEQ ID NO: 11 del documento WO06/072065. Un polipéptido ORF-2 del PCV más preferido se proporciona como SEQ ID NO: 5 en el documento WO06/072065. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que esta secuencia podría variar tanto como 6-10% en homología de secuencia y aún conservar las características antigénicas que la hacen útil en composiciones inmunogénicas. Las características antigénicas de una composición inmunológica pueden estimarse, por ejemplo, mediante el experimento de exposición como se proporciona en el Ejemplo 4 del documento WO06/072065. Además, se sigue conservando la característica antigénica de un antígeno modificado cuando el antígeno modificado confiere al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% de la inmunidad protectora, en comparación con la proteína ORF-2 del PCV2, codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, como se proporciona en el documento WO06/072065.

Por lo tanto, según otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 y 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración, en la que la el antígeno del PCV2 es una proteína ORF-2 del antígeno del PCV2 que presenta al menos 70%, preferiblemente 80%, incluso más preferiblemente 90% de inmunidad protectora en comparación con la proteína ORF-2 del PCV2 codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ. ID. NO: 4, como se proporciona en el documento WO06/072065. Preferiblemente, dicha ORF-2 del PCV2 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 5 del documento WO06/072065.

En algunas formas, las porciones inmunogénicas de la proteína ORF-2 del PCV2 se usan como el componente

antigénico en la composición inmunogénica, que comprende el antígeno del PCV2. La expresión “porción inmunogénica”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a formas truncadas y/o sustituidas, o a fragmentos de la proteína y/o del polinucleótido ORF-2 del PCV2, respectivamente. Preferiblemente, dichas formas truncadas y/o sustituidas o fragmentos comprenderán al menos 6 aminoácidos contiguos procedentes del polipéptido ORF-2 de longitud completa. Más preferiblemente, las formas truncadas o sustituidas, o los fragmentos, tendrán al menos 5, preferiblemente 8, más preferiblemente 10, más preferiblemente al menos 15 y aún más preferiblemente al menos 19 aminoácidos contiguos procedentes del polipéptido ORF-2 del PCV de longitud completa. Dos secuencias preferidas a este respecto se proporcionan como SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 del documento WO06/072065. Se entiende además que dichas secuencias pueden ser parte de fragmentos mayores o formas truncadas. Como se ha mencionado anteriormente, un polipéptido ORF-2 del PCV2 preferido adicionalmente es cualquiera codificado por las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que esta secuencia podría variar tanto como 6-20% en homología de secuencia y aún conservar las características antigénicas que la hacen útil en composiciones inmunogénicas. En algunas formas, se utiliza una forma truncada o sustituida o un fragmento de este polipéptido ORF-2 del PVC2 como el componente antigénico en la composición. Preferiblemente, dichas formas truncadas o sustituidas o fragmentos comprenderán al menos 18 nucleótidos contiguos procedentes de la secuencia de nucleótidos de longitud completa del ORF-2 del PCV2, por ejemplo de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Más preferiblemente, las formas truncadas o sustituidas, o los fragmentos, tendrán al menos 30, más preferiblemente al menos 45, y aún más preferiblemente al menos 57 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del ORF-2 del PCV2 de longitud completa, por ejemplo, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

“Identidad de secuencia”, tal como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, es decir una secuencia de referencia y una secuencia dada que debe ser comparada con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina comparando la secuencia dada con la secuencia de referencia después de haber alineado de forma óptima las secuencias para producir el grado más alto de similitud de secuencia, según se determina por el apareamiento entre las hebras de dichas secuencias. Tras el alineamiento, la identidad de secuencia se constata sobre una base de posición-a

posición, por ejemplo, las secuencias son “idénticas” en una posición particular si en esa posición los restos de

nucleótidos o aminoácidos son idénticos. El número total de dichas identidades de posición se divide entonces por el número total de nucleótidos o restos en la secuencia de referencia para proporcionar el % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia se puede calcular fácilmente por métodos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., comp., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., comp., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. y Griffin, H. G., comps., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., comps., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente memoria como referencia. Métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia se diseñan para obtener el apareamiento mayor entre las secuencias sometidas a ensayo. Los métodos para determinar la identidad de secuencia están codificados en programas informáticos disponibles públicamente que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Ejemplos de este tipo de programas incluyen, pero no se limitan al paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). El programa BLASTX está públicamente disponible en el NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente memoria como referencia). Estos programas alinean de forma óptima las secuencias utilizando pesos de huecos por defecto con el fin de producir el nivel más alto de la identidad de secuencia entre las secuencias dada y de referencia. Como ilustración, para un nucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de "identidad de secuencia" con una secuencia de nucleótidos de referencia, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de nucleótidos dada puede incluir hasta 15, preferiblemente hasta 10, incluso más preferiblemente hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos que tenga al menos 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de identidad con relación a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 15%, preferiblemente 10%, incluso más preferiblemente 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede tener deleciones o estar sustituido con otro nucleótido, o un cierto número de nucleótidos de hasta 15%, preferiblemente 10%, incluso más preferiblemente 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia puede estar insertado en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, entremezcladas bien individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Análogamente, para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos dada que tenga al menos, por ejemplo, 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido dado es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polipéptidos dada puede incluir hasta 15, preferiblemente hasta 10, incluso más preferiblemente hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polipéptidos dada que tenga al menos 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 15%, preferiblemente hasta 10%, incluso más preferiblemente hasta 5% de los restos aminoácidos en la secuencia de referencia puede tener deleciones o estar sustituido con otro aminoácido, o un cierto número de aminoácidos de hasta 15%, preferiblemente hasta 10%, incluso más preferiblemente hasta 5% del número total de restos aminoácidos en la secuencia de referencia puede estar insertado en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, entremezcladas individualmente entre restos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos. Sin embargo, las sustituciones conservativas no están incluidas como apareamiento cuando se determina la identidad de secuencia.

“Homología de secuencia”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un método para determinar el

grado de relación de dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, se alinean de forma óptima dos o más secuencias y, si es necesario, se introducen huecos. Sin embargo, en contraposición con la “identidad de secuencia”, las sustituciones conservativas de aminoácidos se cuentan como un apareamiento cuando se determina

la homología de secuencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido que tiene 95% de homología de secuencia con una secuencia de referencia, 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de los restos de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de referencia debe aparearse o comprender una sustitución conservativa con otro aminoácido o nucleótido, o un cierto número de aminoácidos o nucleótidos hasta 15%, preferiblemente hasta 10%, incluso más preferiblemente hasta 5% del total de restos de aminoácidos o nucleótidos, sin incluir las sustituciones conservativas, en la secuencia de referencia puede estar insertdo en la secuencia de referencia. Preferiblemente, la secuencia homóloga comprende al menos un tramo de 50, incluso más preferiblemente de al menos 100, incluso más preferiblemente de al menos 250 e incluso más preferiblemente de al menos 500 nucleótidos.

Una "sustitución conservativa” se refiere a la sustitución de un resto aminoácido o nucleótido con otro resto

aminoácido o nucleótido que tiene características o propiedades similares, incluido el tamaño, la hidrofobicidad, etc., de modo que la funcionalidad global no cambia significativamente.

“Aislado” significa alterado “por la mano del hombre” respecto a su estado natural, es decir si se produce en la

naturaleza, ha sido cambiado o separado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o

polipéptido que está presente de forma natural en un organismo vivo no está “aislado”, pero el mismo polinucleótido

o polipéptido separado de los materiales coexistentes en su estado natural está “aislado”, tal como se emplea el término en la presente memoria.

Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína ORF-2 del PCV2 a un animal que necesita dicha administración, en la que dicha proteína ORF-2 del PCV2 es cualquiera de las descritas anteriormente. Preferiblemente, dicha proteína ORF-2 del PCV2 es

i) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID

NO: 10 o SEQ ID NO: 11 del documento WO06/07065,

ii) cualquier polipéptido que es al menos 80% homólogo con el polipéptido de i),

iii) cualquier porción inmunogénica de los polipéptidos de i) y/o ii),

iv) la porción inmunogénica de iii), que comprende al menos 5, preferiblemente 8, incluso más

preferiblemente 10 aminoácidos contiguos incluidos en las secuencias de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:

6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11 del documento WO06/072065,

v) un polipéptido que es codificado por un ADN que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID

NO: 4 del documento WO06/072065,

vi) cualquier polipéptido que es codificado por un polinucleótido que es al menos 80% homólogo con el

polinucléotido de v),

vii) cualquier porción inmunogénica de los polipéptidos codificados por el polinucleótido de v) y/o vi),

viii) la porción inmunogénica de vii), en la que el polinucleótido que codifica dicha porción inmunogénica

comprende al menos 30 nucleótidos contiguos incluidos en las secuencias de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID

NO: 4 del documento WO06/072065.

Preferiblemente, cualquiera de esas porciones inmunogénicas tiene las características inmunogénicas de la proteína ORF-2 del PCV2 que es codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 del documento WO06/07065.

Según un aspecto adicional, la proteína ORF-2 del PCV2 se proporciona en la composición inmunogénica en un nivel de inclusión de antígeno eficaz para el tratamiento de animales infectados subclínicamente con PCV2. Preferiblemente, el nivel de inclusión de la proteína ORF-2 del PCV2 es al menos 0,2 µg de antígeno/ml de la composición inmunogénica final (µg/ml), más preferiblemente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 400 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 200 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,35 a aproximadamente 100 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 50 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,45 a aproximadamente 30 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 15 µg /ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 8 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 6 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 3,0 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,0 µg/ml, y lo más preferible de aproximadamente 1,6 µg/ml.

Según otro aspecto, el nivel de inclusión del antígeno ORF-2 del PCV es al menos 0,2 µg/proteína ORF-2 del PCV2, tal como se ha descrito anteriormente, por dosis de la composición antigénica final (µg/dosis), más preferiblemente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 400 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 200 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,35 a aproximadamente 100 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 50 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,45 a aproximadamente 30 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 15 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 8 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 6 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 3,0 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,0 µg/dosis, y lo más preferible aproximadamente 1,6 µg/dosis.

El polipéptido ORF-2 del PCV2 utilizado en la composición inmunogénica según la presente invención se puede obtener de cualquier manera, incluyendo el aislamiento y la purificación del ORF2 del PCV2, síntesis convencional de proteínas y metodología recombinante. Los métodos preferidos para obtener el polipéptido ORF-2 del PCV2 se proporcionan en el documento WO06/072065, cuyas enseñanzas y contenido se incorporan en la presente memoria como referencia en su totalidad. Brevemente, se infectan células susceptibles con un vector vírico recombinante que contiene secuencias codificadoras del ADN de la ORF-2 del PCV2, el polipéptido ORF-2 del PCV2 es expresado por el virus recombinante, y el polipéptido ORF-2 del PCV2 expresado se recupera del sobrenadante por filtración y se inactiva mediante cualquier método convencional, preferiblemente utilizando etilenimina binaria, que luego se neutraliza para detener el proceso de inactivación.

La composición inmunogénica, tal como se utiliza en la presente memoria, también se refiere a una composición que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF-2 del PCV2 descritas anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, y ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF-2 del PCV2, preferiblemente de un baculovirus recombinante. Además, la composición inmunogénica puede comprender i) cualquiera de las proteínas ORF-2 del PCV2 descritas anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, preferiblemente de un baculovirus recombinante y iii) una porción del sobrenadante del cultivo celular.

Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicho tratamiento, en la que el antígeno del PCV2 es el ORF-2 del PCV2 recombinante, preferiblemente un ORF-2 del PCV2 expresado por baculovirus. Preferiblemente, aquellos ORF-2 del PCV2 recombinante o expresado por baculovirus tienen la secuencia como se ha descrito anteriormente.

La composición inmunogénica, tal como se utiliza en la presente memoria, también se refiere a una composición que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF-2 del PCV2 descritas anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, preferiblemente de un baculovirus recombinante, y iii) una porción del cultivo celular; en la que aproximadamente 90% de los componentes tienen un tamaño menor de 1 µm.

La composición inmunogénica, tal como se utiliza en la presente memoria, también se refiere a una composición que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF-2 del PCV2 descritas anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) y un agente inactivante para inactivar el vector vírico recombinante, preferiblemente la BEI, en la que aproximadamente 90% de los componentes i) a iii) tienen un tamaño menor de 1 µm. Preferiblemente, la BEI está presente en concentraciones eficaces para inactivar el baculovirus, preferiblemente en una cantidad de 2 a aproximadamente 8 mM de BEI, preferiblemente de aproximadamente 5 mM de BEI.

La composición inmunogénica, tal como se utiliza en la presente memoria, también se refiere a una composición que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF-2 del PCV2 descritas anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) un agente inactivante para inactivar el vector vírico recombinante, preferiblemente BEI, y v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente inactivante, en la que aproximadamente el 90% de los componentes i) a iii) tienen un tamaño menor de 1 µm. Preferiblemente, si el agente inactivante es la BEI, dicha composición comprende tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes a la BEI.

El polipéptido se incorpora en una composición que puede ser administrada a un animal susceptible de una infección por PCV2. En las formas preferidas, la composición puede incluir también componentes adicionales conocidos por los expertos en la técnica (véase también Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18ª ed. Mack Publ., Easton). Adicionalmente, la composición puede incluir uno o más soportes aceptables desde un punto de vista veterinario. Tal como se utiliza en la presente memoria, "un vehículo aceptable desde un punto de vista veterinario" incluye uno y cualesquiera disolventes, medios dispersantes, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que retardan la adsorción y similares. En un modo de realización preferido, la composición inmunogénica comprende la proteína ORF-2 del PCV2 según se proporciona en la presente memoria, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, la cual se mezcla con un adyuvante, preferiblemente Carbopol, y disolución salina fisiológica.

Los expertos en la técnica comprenderán que la composición utilizada en la presente memoria puede incorporar disoluciones estériles inyectables fisiológicamente aceptables conocidas. Para preparar una disolución lista para el uso para inyección parenteral o infusión, se encuentran disponibles fácilmente disoluciones isotónicas acuosas, tales como, por ejemplo, disolución salina o correspondientes disoluciones de proteínas en plasma. Además, las composiciones de vacuna e inmunogénicas para uso en la presente invención pueden incluir diluyentes, agentes isotónicos, estabilizantes o adyuvantes. Los diluyentes pueden incluir agua, disolución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiaminotetracético, entre otros.

“Adyuvantes”, tal como se utiliza en la presente memoria, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio,

saponinas, por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua y emulsión de agua en aceite en agua. La emulsión puede tener una base, en particular, de aceite de parafina líquido ligero (tipo de la Farmacopea Europea); aceite isoprenoide, tal como aceite de escualano o de escualeno, que resulta de la teoligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos o alcoholes ramificados, en particular ésteres de ácido isosteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferiblemente tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitano, de manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isosteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y copolímeros de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, págs. 51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15: 564-570 (1997).

Por ejemplo, es posible utilizar la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editada por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de este mismo libro.

Un ejemplo adicional de un adyuvante es un compuesto elegido entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticulados, especialmente con polialquenil-éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen con el término de carbómero (Phameuropa, vol. 8, nº 2, junio 1996). Los expertos en la técnica también pueden referirse a la patente de EE.UU. nº 2.909.462 que describe polímeros acrílicos de este tipo reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos sustituidos con radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos con el nombre Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente apropiados. Están reticulados con una alilsacarosa o con alilpentaeritritol. Entre ellos se pueden mencionar el Carbopol 974P, 934P y 971P. Lo más preferido es el uso de Carbopol, en particular el uso de Carbopol 971P, preferiblemente en cantidades de aproximadamente 500 µg a aproximadamente 5 mg por dosis, incluso más preferido en una cantidad de aproximadamente 750 µg a aproximadamente 2,5 mg por dosis y, lo más preferido, en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis.

Adyuvantes adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a ellos, el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), copolímero de bloques (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil-lípido A, adyuvante de lípidoamina Avridina, enterotoxina térmicamente lábil procedente de E. coli (recombinante o de otra forma), toxina de cólera, IMS 1314 o dipéptido de muramilo, entre muchos otros.

Preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 µg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 µg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 500 µg hasta aproximadamente 5 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 750 µg hasta aproximadamente 2,5 mg por dosis. Lo más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis.

Adicionalmente, la composición puede incluir uno o más soportes farmacéuticamente aceptables. Tal como se utiliza en la presente memoria, "un vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye uno y cualesquiera disolventes, medios dispersantes, recubrimientos, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que retardan la adsorción y similares. Lo más preferiblemente, la composición proporcionada en la presente memoria contiene la proteína ORF-2 del PCV2 recuperada del sobrenadante de células cultivadas in vitro, en la que dichas células se infectaron con un vector vírico recombinante que contenía ADN de ORF-2 del PCV2 y que expresaban la proteína ORF-2 del PCV2, y en la que dicho cultivo celular se trató con aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mM de BEI, preferiblemente con aproximadamente 5 mM de BEI, para inactivar el vector vírico, y una concentración equivalente de un agente de neutralización, preferiblemente disolución de tiosulfato de sodio hasta una concentración final de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM.

También se describe una composición inmunogénica para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, reducir la excreción nasal del virus, reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, en la que dicha composición inmunogénica comprende i) cualquiera de las proteínas ORF-2 del PCV2 descritas anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF-2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) un agente inactivante para inactivar el vector vírico recombinante, preferiblemente BEI, v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente inactivante, preferiblemente tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes al BEI; y vi) un adyuvante adecuado, preferiblemente Carbopol 971, en las cantidades descritas anteriormente; en la que aproximadamente el 90% de los componentes i) a iii) tienen un tamaño menor de 1 µm.

Según un aspecto adicional, esta composición inmunogénica comprende, además, una sal farmacéuticamente aceptable, preferiblemente una sal de fosfato, en concentraciones fisiológicamente aceptables. Preferiblemente, el pH de dicha composición inmunogénica se ajusta a un pH fisiológico, lo que significa entre aproximadamente 6,5 y 7,5.

La composición inmunogénica, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere también a una composición que comprende, por 1 ml i) al menos 1,6 µg de proteína ORF-2 del PCV2 descrita anteriormente, ii) al menos una porción de baculovirus que expresa dicha proteína ORF-2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) BEI de aproximadamente 2 a 8 mM, v) tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes a las de la BEI; y vi) aproximadamente 1 mg de Carbopol 971, y vii) sal de fosfato en una concentración fisiológicamente aceptable; en la que aproximadamente 90% de los componentes i) a iii) tiene un tamaño menor que 1 µm, y el pH de dicha composición inmunogénica se ajusta a aproximadamente 6,5 a 7,5.

Las composiciones inmunogénicas pueden además incluir uno o más de otros agentes inmunomoduladores, tales como, por ejemplo, interleuquinas, interferones u otras citoquinas. Las composiciones inmunogénicas pueden también incluir gentamicina y mertiolato. Si bien las cantidades y concentraciones de los adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica, la presente invención contempla composiciones que comprenden de aproximadamente 50 µg a aproximadamente

2.000 µg de adyuvante y preferiblemente aproximadamente 250 µg/ml de dosis de la composición de vacuna. Así, la composición inmunogénica, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere también a una composición que comprende de aproximadamente 1 μg/ml a aproximadamente 60 μg/ml de antibióticos, y más preferiblemente menos de aproximadamente 30 µg/ml de antibióticos.

La composición inmunogénica, tal como se utiliza en la presente memoria, también se refiere a una composición que comprende i) cualquier proteína ORF-2 del PCV2 descrita anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF-2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) un agente inactivante para inactivar el vector vírico recombinante, preferiblemente BEI, v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente inactivante, preferiblemente tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes al BEI; vi) un adyuvante adecuado, preferiblemente Carbopol 971, en las cantidades descritas anteriormente; vii) una concentración farmacéuticamente aceptable de una disolución tampón salina, preferiblemente de una sal fosfato, y viii) un agente anti-microbiológico activo; en la que aproximadamente el 90% de los componentes i) a iii) tiene un tamaño menor de 1 µm.

La composición inmunogénica, tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere también a Ingelvac®, CircoFLEXTM, (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, EE.UU.), CircoVac® (Merial SAS, Lyon, Francia), CircoVent (Intervet Inc., Millsboro, DE, EE.UU.) o Suvaxyn PCV-2 One Dose® (Fort Dodge Animal Health, Kansas City, KA, EE.UU.). Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 y 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración, en la que dicha composición inmunogénica comprende un antígeno del PCV2 es Ingelvac® CircoFLEXTM, CircoVac®, CircoVent y/o Suvaxyn PCV-2 One Dose®, preferiblemente es Ingelvac® o CircoFLEXTM.

La expresión “una cantidad eficaz de un antígeno del PCV2”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa pero no se limita a una cantidad de un antígeno del PCV2 que provoca o es capaz de provocar una respuesta inmunológica en un animal, al cual se administra dicha cantidad eficaz de un antígeno del PCV2.

La cantidad que es eficaz depende de los ingredientes de una vacuna y del esquema de administración. Típicamente, cuando se utiliza una preparación con un virus inactivado o un virus vivo modificado en una vacuna de combinación, se utilizará una cantidad de vacuna que contenga aproximadamente 102,0 a aproximadamente 109,0

103,0

DICT50 por dosis, preferiblemente aproximadamente a aproximadamente 108,0 DICT50 por dosis, más preferiblemente, aproximadamente 104,0 a aproximadamente 108,0 DICT50 por dosis. En particular, cuando se utiliza PCV2 vivo modificado en una vacuna, la dosis recomendada para ser administrada al animal susceptible es preferiblemente de aproximadamente 103,0 DICT50 (50% del punto final de la dosis infecciosa en cultivo de tejido)/dosis a aproximadamente 106,0 DICT50/dosis, y más preferiblemente de aproximadamente 104,0 DICT50/dosis a aproximadamente 105,0 DICT50/dosis. En general, la cantidad de antígeno será entre 0,2 y 5.000 microgramos, y entre 102,0 y 109,0 DICT50, preferiblemente entre 103,0 y 106,0 DICT50, más preferiblemente entre 104,0 y 105,0 DICT50, cuando se utiliza un antígeno purificado.

Las vacunas de subunidades se administran normalmente con un nivel de inclusión del antígeno de al menos 0,2 µg de antígeno por dosis, preferiblemente con aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 400 µg/dosis, incluso más preferiblemente con aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 200 µg/dosis, incluso más preferiblemente con aproximadamente 0,35 hasta aproximadamente 100 µg/dosis, incluso más preferiblemente con aproximadamente 0,4 hasta aproximadamente 50 µg/dosis, incluso más preferiblemente con aproximadamente 0,45 hasta aproximadamente 30 µg/dosis, incluso más preferiblemente con aproximadamente 0,6 hasta aproximadamente 16 µg/dosis, incluso más preferiblemente con aproximadamente 0,75 hasta aproximadamente 8 µg/dosis, incluso más preferiblemente con aproximadamente 1,0 hasta aproximadamente 6 µg/dosis, y incluso más preferiblemente con aproximadamente 1,3 hasta aproximadamente 3,0 µg/dosis.

Se ha demostrado que la inmunidad procedente de la madre confiere un determinado grado de protección frente a la infección por PCV2 y a las enfermedades clínicas asociadas con las infecciones por PCV2. Se ha demostrado que esta protección es dependiente de la titulación: las titulaciones más altas son protectoras generalmente mientras que las titulaciones más bajas no lo son (McKeown et al., 2005; Clin. Diagn. Lab. Immunol.; 12: 1347-1351). Se ha estimado que la semivida media de los anticuerpos en los animales destetados es de 19,0 días, y la ventana para la degradación del anticuerpo pasivo contra el PCV2 en una población es relativamente amplia (Opriessnig et al., 2004,

J. Swine Health Prod., 12: 186-191). La presencia de anticuerpo procedente de la madre no sólo puede conferir un determinado grado de protección frente a infecciones virales, que, sin embargo, no se puede predecir, sino que también se sabe que disminuye la eficacia de la inmunización. Se ha descubierto, de forma sorprendente, que la presencia de anticuerpos anti-PCV2, en particular de títulos de anticuerpos anti-PCV2 de hasta 1:1000, no afecta a la eficacia del tratamiento con PCV2.

Por lo tanto, según otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración, en la que los animales en el momento de la vacunación tienen anticuerpos anti-PCV2, preferiblemente en la que dichos animales tienen en el momento de la vacunación un título de anticuerpos anti-PCV2 detectable de hasta 1:100, preferiblemente de más de 1:100, incluso más preferiblemente de más de 1:250, incluso más preferiblemente de más de 1:500, incluso más preferiblemente de 1:640, incluso más preferiblemente de más de 1:750, y lo más preferible de más de 1:1000. Preferiblemente, esta titulación de anticuerpos anti-PCV2 es detectable y cuantificable en un ensayo inmune específico anti-PCV2, preferiblemente en el ensayo tal como se describe en el Ejemplo 2.

Métodos para la detección y cuantificación de anticuerpos anti-PCV2 son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, la detección y cuantificación de anticuerpos del PCV2 puede realizarse por inmunofluorescencia indirecta, como se describe en Magar et al., 2000, Can. J. Vet Res.; 64: 184-186 o Magar et al., 2000, J. Comp. Pathol.; 123: 258-269. Ensayos adicionales para la cuantificación de anticuerpos anti-PCV2 se describen en Opriessnig et al., 2006, 37th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians. Además, el ejemplo 2 también describe un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, que puede utilizar un experto en la técnica. En los casos de resultados controvertidos y en cualquier caso de duda, las titulaciones de anti-PCV2 tal y como se mencionan en la presente memoria, se refieren a las que se estiman/pueden estimarse por el ensayo tal y como se describe en el Ejemplo 2.

Por lo tanto, según otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 y 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal joven que necesita dicha administración.

La expresión “animal joven” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un animal de 1 a 22 días de edad. Preferiblemente, la expresión animal joven indica un animal de 1 a 20 días de edad. Más preferiblemente, la expresión animal joven se refiere a un animal de 1 a 15 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 día de edad a 14 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 a 12 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 a 10 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 a 8 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 a 7 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 a 6 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 a 5 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 a 4 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 a 3 días de edad, incluso más preferiblemente de 1 ó 2 días de edad y lo más preferiblemente a un animal de 1 día de edad.

Debido a la ubicuidad del PCV2 en el campo, la mayoría de los lechones jóvenes son seropositivos con respecto al PCV2. Por lo tanto, según un aspecto adicional, dichos animales jóvenes, en el día de la vacunación/tratamiento, tienen una titulación detectable de anticuerpos anti-PCV2 de hasta 1:100, preferiblemente de más de 1:100, incluso más preferiblemente de más de 1:250, incluso más preferiblemente de más de 1:500, incluso más preferiblemente de 1:640, incluso más preferiblemente de más de 1:750, y lo más preferiblemente de más de 1:1000 en el día de la vacunación/tratamiento.

La composición según la invención se puede aplicar por vía intradérmica, intratraqueal o intravaginal. Preferiblemente, la composición se puede aplicar por vía intramuscular o intranasal, lo más preferiblemente por vía intramuscular. En un cuerpo animal, se puede manifestar ventajoso aplicar las composiciones farmacéuticas, como se han descrito anteriormente, mediante una inyección intravenosa o por inyección directa en los tejidos diana. Para la aplicación sistémica, se prefieren las vías intravenosa, intravascular, intramuscular, intranasal, intraarterial, intraperitoneal, oral o intratecal. Se puede efectuar una aplicación más local por vía subcutánea, intradérmica, intracutánea, intracardial, intralobular, intramedular, intrapulmonar o directamente en o cerca del tejido a tratar (tejido conjuntivo, óseo, muscular, nervioso o epitelial). Dependiendo de la duración y eficacia de tratamiento deseados, las composiciones pueden administrarse una o varias veces, también de forma intermitente, por ejemplo sobre una base diaria durante varios días, semanas o meses y en diferentes dosificaciones. Preferiblemente, al menos una dosis de la composición inmunogénica, tal como se ha descrito anteriormente, se administra por vía intramuscular al sujeto que lo necesite. Según un aspecto adicional, el antígeno del PCV2 o la composición inmunogénica que comprende cualquiera de dichos antígenos del PCV2 como se han descrito en la presente memoria, se embotella y se administra de un (1) mL a cinco (5) ml por dosis, preferiblemente a 1 ml por dosis. Por lo tanto, según un aspecto adicional, también se proporciona una composición inmunogénica de 1 ml a 5 ml, preferiblemente de 1 ml, que comprende un antígeno del PCV2 como se ha descrito en la presente memoria, para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2 en un animal o grupo de animales (piara), para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 y 106 copias genómicas por ml de suero, para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, para la reducción de la excreción nasal del virus y la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración. La presente invención también se refiere a un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2 en un animal o grupo de animales (piara), un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar de 1 a 5 ml, preferiblemente 1 ml de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración.

Según un aspecto adicional se da al menos una administración adicional de al menos una dosis de la composición inmunogénica, tal como se ha descrito anteriormente, a un sujeto que lo necesita, en la que la segunda o cualquier administración adicional se da al menos 14 días más tarde de la administración inicial o de cualquier administración anterior. Preferiblemente, la composición inmunogénica se administra con un estimulante inmunológico. Preferiblemente, dicho estimulante inmunológico se administra al menos dos veces. Preferiblemente, hay un espacio de tiempo de al menos 3 días, más preferiblemente al menos 5 días, incluso más preferiblemente al menos 7 días entre las primera y segunda administración o cualquier administración adicional del estimulante inmunológico. Preferiblemente, el estimulante inmunológico se da al menos 10 días, preferiblemente 15 días, incluso más preferiblemente 20, incluso más preferiblemente al menos 22 días más tarde de la administración inicial de la composición inmunogénica proporcionada en la presente memoria. Un estimulante inmunológico preferido es, por ejemplo, la hemocianina de lapa de agujero (KLH), preferiblemente emulsionada con adyuvante de Freund incompleto (KLH/ICFA). Sin embargo, se entiende con la presente que también se puede usar cualquier otro

estimulante inmunológico conocido por los expertos en la técnica. La expresión “estimulante inmunológico”, tal como

se utiliza en la presente memoria, significa cualquier agente o composición que pueda disparar la respuesta inmunológica, preferiblemente sin iniciar ni aumentar una respuesta inmunológica específica, por ejemplo la respuesta inmunológica contra un agente patógeno específico. Se instruye, además, administrar el estimulante inmunológico en una dosis adecuada.

La presente descripción también se refiere al uso de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 para la preparación de una medicina para la profilaxis y el tratamiento de una infección crónica por PCV2 en un animal o grupo de animales (piara), para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, para la reducción de la excreción nasal del virus y la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente y un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente. Preferiblemente, el antígeno del PCV2 es un antígeno recombinante, preferiblemente ORF-2 del PCV2, e incluso más preferiblemente Ingelvac® CircoFLEXTM.

El “animal”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa un suido, cerdo o lechón. Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2 en cerdos, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica comprendida entre 104 y 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga vírica por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a cerdos que necesitan dicha administración. Preferiblemente, el antígeno de PCV2 o la composición inmunogénica que comprende el antígeno de PCV2 es cualquiera de los descritos anteriormente, más preferiblemente el antígeno de PCV2 es Ingelvac® CircoFLEXTM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS MODOS DE REALIZACIÓN PREFERIDOS

Los siguientes ejemplos recogen materiales y procedimientos preferidos de acuerdo con la presente invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria pueden usarse en la práctica o ensayos de la presente invención, se describen ahora los métodos, mecanismos y materiales preferidos. Ha de entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración solamente, y nada en ellos debe considerarse una limitación del alcance global de la invención, que se define por las reivindicaciones.

EJEMPLO 1 Preparación del antígeno ORF-2 del PCV2

Cultivos de células SF+ iniciales que estaban conservados en nitrógeno líquido se cultivaron en medio Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) en suspensión en matraces de centrifugación estériles con agitación constante. Los cultivos se hicieron crecer en matraces de centrifugación de 100 mL a 250 mL con 25 a 150 mL de medio exento de suero Excell 420. Cuando las células se habían multiplicado hasta una densidad de células de 1,0-8,0x106 células/mL, estos se dividieron en nuevos recipientes con una densidad de siembra de 0,5-1,5x106 células/mL. Los cultivos por expansión posteriores se hicieron crecer en matraces de centrifugación de hasta 36 litros de capacidad o en biorreactores de acero inoxidable de hasta 300 litros durante un periodo de 2-7 días a 25-29°C.

Después de la siembra, los matraces se incubaron a 27°C durante cuatro horas. Posteriormente, cada matraz se sembró con un baculovirus recombinante que contenía el gen ORF-2 del PCV2 (SEQ ID NO: 4). El baculovirus recombinante que contenía el gen ORF-2 del PCV2 se generó como se describe en el documento WO06/072065. Después de ser sembrados con el baculovirus, los matraces se incubaron luego a 27±2°C durante 7 días y se agitaron también a 100 rpm durante ese tiempo. Los matraces utilizaban tapones ventilados para permitir el flujo de aire.

Después de la incubación, se recogió el sobrenadante resultante, se filtró para eliminar los residuos celulares y se inactivó. El sobrenadante se inactivó llevando su temperatura hasta 37±2°C, y se añadió etilenimina binaria (BEI) al sobrenadante hasta una concentración final de 5 mM. Las muestras se agitaron entonces continuamente durante 72 a 96 horas. Se añadió una disolución de tiosulfato de sodio 1,0 M para proporcionar una concentración final mínima de 5 mM para neutralizar cualquier BEI residual. Después de la inactivación, se añadió ORF-2 del PCV2 tamponado con tampón fosfato y Carpopol a aproximadamente 0,5 a 2,5 mg/dosis. La dosis final comprende aproximadamente 16 µg de antígeno ORF-2 de PCV2.

EJEMPLO 2 Inmunoensayo anti-PCV2 Se sembraron células PK15 (por ejemplo, ATCC CCL-33) o VIDO R1 descritas en el documento WO 02/07721, en una placa de 96 pocillos (aproximadamente 20.000 a 60.000 células por pocillo). Las células se infectaron con un aislado de PCV2 cuando las monocapas tenían una confluencia de aproximadamente 65% a 85%. Las células infectadas se incubaron durante 48 horas. Se eliminó el medio y los pocillos se lavaron 2 veces con PBS. Se eliminó el tampón de lavado y las células se trataron con fijador de metanol/acetona 50/50 frío (aproximadamente 100 µl/pocillo) durante aproximadamente 15 min a aproximadamente -20°C. Se desechó el fijador y las placas se secaron al aire. Se prepararon diluciones en serie de muestras de suero porcino en PBS, se añadieron a las placas y se incubaron para permitir que los anticuerpos, si estaban presentes, se unieran en las muestras de suero durante aproximadamente 1 hora a 36,5 1°C. Además, se ensayaron en paralelo diluciones en serie de una muestra control anti-PCV2 positiva y negativa (muestras de control positivo y muestras de control negativo). Las placas se lavaron entonces tres veces con PBS. Se eliminó el PBS. Las placas se tiñeron entonces con un conjugado comercial antisuido de cabra FITC diluido 1:100 en PBS y se incubó durante aproximadamente 1 hora a 36,5±1°C, lo que permite la detección de los anticuerpos unidos a las células infectadas. Después de completar la incubación, las microplacas se retiraron del incubador, el conjugado se eliminó y las placas se lavaron dos veces con PBS. Las placas se leyeron utilizando microcopía de UV y los pocillos individuales se registraron como positivos o negativos. Las muestras de control positivo y de control negativo se emplearon para controlar el sistema de ensayo. Si los controles se encuentran dentro de los intervalos esperados, los resultados del ensayo se consideran aceptables con respecto a los parámetros del método de ensayo. Las titulaciones del anticuerpo en suero se calcularon utilizando la dilución más alta que muestra una reactividad IFA específica y se calcula el número de pocillos positivos por dilución o un 50% del punto final utilizando la fórmula de Reed-Muench apropiada.

EJEMPLO 3 Eficacia de ORF-2 del PCV2 (Ingelvac® CircoFLEXTM) en el tratamiento de la infección crónica por PCV2

OBJETIVO Y DISEÑO DEL ESTUDIO

En este estudio se incluyeron lechones convencionales de cinco grupos de semanas consecutivas, comprendiendo cada una de ellas aproximadamente 300 animales. Los animales se distribuyeron igualmente en dos grupos de tratamiento con respecto al peso corporal inicial y asignación de la camada. El día del destete un grupo (n = 775) se vacunó con Ingelvac® CircoFLEX, que contenía la liberación mínima de contenido de antígeno, y el otro grupo (n = 773) recibió un producto de control (disolución salina fisiológica). La vacuna y el producto de control (PC) se dieron como una dosis única de 1 ml intramuscularmente en la región derecha del cuello cuando los lechones tenían aproximadamente 21 días de edad. Se registraron los pesos corporales individuales de todos los animales de estudio. Se realizaron observaciones clínicas respecto a los síntomas asociados con el PCV2 y se registraron las desviaciones del estado de salud general normal en una base de animales individuales. Se analizó cuantitativamente la presencia de PCV2 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en muestras de suero y de secreciones nasales. Además, se analizaron los títulos de anticuerpos del PCV2 en todos los animales de estudio en el momento de la vacunación y del mismo 5% de los animales de estudio preseleccionados se analizaron por titulación indirecta de anticuerpos fluorescentes (IFAT) como se ha descrito en el Ejemplo 2.

Confirmación del estado crónico (subclínico) del sitio de estudio:

El primer diagnóstico de la PCVD en la granja se realizó 4 meses antes de la realización del estudio. Se identificó una tasa de mortalidad de 14,1% y la presencia de cerdos retrasados en la unidad de engorde. El rendimiento del crecimiento fue más bien pequeño (644 g/d). La presencia de infecciones por PCV2 se confirmó mediante examen histológico. Las muestras pulmonares mostraron neumonía intersticial y se identificó el PCV2 por IHC entre las lesiones.

En la figura 1 se puede observar que la tasa de mortalidad durante el engorde disminuyó considerablemente de 14,1% a 8,1% lo que sugiere una evolución de una infección de PCVD aguda a una infección subclínica.

Confirmación de la infección subclínica de los animales de estudio

La evolución a infección subclínica en la granja se confirmó mediante los resultados obtenidos durante el estudio. Los animales de estudio se caracterizaron por una carga vírica subclínica predominante, una tasa de mortalidad baja (por debajo de 10%) y una tasa de morbilidad baja (por debajo de 10%).

RESULTADOS

Viremia

La mayor proporción de animales virémicos se observó en la semana 14 del estudio, con 55,5% de animales virémicos en el grupo tratado con PC y aproximadamente 10% de animales virémicos en el grupo vacunado. Como se muestra en las figuras 4 y 5, la mayoría de los animales en ambos grupos de tratamiento tenían solo cargas víricas subclínicas (definida como 104-106 equivalentes genómicos por ml). La mayor proporción de animales con cargas de PCV2 clínicamente relevantes (> 106 equivalentes genómicos por ml) fue de 2,52% para los animales tratados con PC y 0,87% para los animales vacunados.

Mortalidad

La tasa de mortalidad antes y después del inicio de la viremia fue más bien baja. Antes del inicio de la viremia, la tasa de mortalidad fue de 1,55% en los animales vacunados y 2,19% en los animales tratados con PC. Después del inicio de la viremia se observó un aumento en la tasa de mortalidad en los animales tratados con PC (de 1,55% a 3,02%) mientras que la tasa de mortalidad en los animales vacunados disminuyó ligeramente en comparación con el tiempo antes del inicio de la viremia (de 2,19% a 1,98%). Las diferencias en la tasa de mortalidad entre ambos grupos de tratamiento antes y después del inicio de la viremia no fueron estadísticamente significativas.

Signos clínicos una coinfección con PRRSV y Mycoplasma hyopneumoniae. Sin embargo, ni el PCV2 ni ningún otro patógeno coinfeccioso produjo signos clínicos graves. Consecuentemente, la proporción de animales con síntomas respiratorios tales como tos y/o disnea fue de solo 3,9% y 0,7% en el grupo tratado con PC y 3,0% y 0,4% en el grupo vacunado La frecuencia de otros síntomas clínicos fue siempre inferior a 1% y sin diferencias entre los grupos

5 de tratamiento.

Frecuencia de cerdos retrasados

No se observaron diferencias significativas en la frecuencia de ‘cerdos retrasados’ entre el grupo vacunado y el

grupo tratado con placebo en ninguno de los respectivos momentos de peso. Después del inicio global de la viremia 10 por PCV2, la frecuencia de ‘cerdos retrasados’ fue baja, en general, en ambos grupos de tratamiento (3,3-4,7%).

Tabla 1: Comparación de la frecuencia de ‘cerdos retrasados’ (datos reunidos de los tres grupos de semana)

Antes de la aparición de viremia

Después de la aparición de viremia

Semana del estudio

0 7 12 17 22

CP IVP P

11,51% 10,84% 0,6874 11,94% 10,46% 0,3728 5,68% 4,78% 0,4884 4,72% 3,36% 0,1898 4,53% 3,27% 0,2259

P: valor de p del ensayo de la t para la comparación entre grupos: p > 0,05 no significativo

15 Impacto de la infección subclínica sobre el rendimiento del crecimiento

El aumento de peso corporal hasta la semana 17 del estudio fue 2,36 kg mayor y hasta la semana 19 fue 2,39 kg mayor en el grupo vacunado que en el grupo tratado con PC. Como se muestra en la figura 2, la diferencia en el

20 peso corporal comenzó a aumentar ligeramente en el momento del inicio de la viremia (semana 12 del estudio). En la semana 17 del estudio, la diferencia alcanzó 2,36 kg. Debido al mayor aumento de peso, el tiempo medio entre el destete y el sacrificio fue 1,9 días más corto para los animales vacunados que para los animales tratados con PC.

Tabla 2: Comparación del aumento de peso y ADWG (datos colectivos de los cinco grupos semanales)

Semana del estudio

Grupo tratado con PC (LS Media) Grupo vacunado (LS Media) Diferencia (IVP menos CP) Valor de p1)

Aumento de peso

0-7 20,63 kg 20,71 kg 0,08 kg 0,7166 ns

0-17

76,73 kg 79,09 kg 2,36 kg <0,0001 ***

0-19

86,75 kg 89,14 kg 2,39 kg <0,0001 ***

12-17

29,05 kg 30,73 kg 1,68 kg <0,0001 ***

7-19

66,07 kg 68,38 kg 2,31 kg <0,0001 ***

1) Valor de p del ensayo de la t para la comparación entre grupos, ns: no significativo; * significativo, p ≤ 0.05; *** significativo, p ≤ 0,001

25 Duración de la viremia en la sangre

Cuando se comparó la duración media total y la duración mediana en los dos grupos de tratamiento, se detectó una duración de la viremia significativamente mayor (p = 0,0003) en los animales tratados con PC. El grupo IVP

30 presentaba una duración de la viremia media de 5,8 días, mientras que el grupo PC presentaba una duración media de 21,8 días. Esto corresponde a una duración de la viremia reducida en un 73% en el grupo IVP.

Tabla 3: Duración de la viremia media y mediana

Grupo de tratamiento

Número de Cerdos Media (días) Mediana (días) Valor p

Total

CP 76 21,8 14,0 0,0003 ***

IVP

18 5,8 0,0

IVP menos CP

-16,0 -14,0

P: valor de p del ensayo de la t para la comparación entre grupos ns: no significativo, p>0,05; * significativo, p ≤ 0.05

CONCLUSIÓN

5 El estudio ha sido realizado en una granja que evolucionó de un estado agudo a crónico con una infección subclínica muy poco antes de la realización del estudio. La carga vírica de los animales de estudio durante el estudio confirmo

esta suposición. Muy pocos animales de estudio (< 2,19%) tenían una carga vírica en el suero por encima del “límite clínico” de 106 copias genómicas/ml.

10 La vacunación consiguió reducir de forma importante el porcentaje de animales infectados en el grupo vacunado. Por lo tanto, la vacunación permitió la comparación de los animales no infectados (grupo vacunado) con los animales infectados subclínicamente (grupo placebo). Los animales vacunados demostraron que tenían un mejor rendimiento del crecimiento que los animales infectados subclínicamente. En la semana 17 del estudio, la diferencia

15 alcanzó 2,36 kg. Los animales vacunados presentaban una duración de la viremia menor en más de 16 días en comparación con el grupo no vacunado.

Se puede concluir que aunque los animales infectados permanecían aparentemente saludables, la infección subclínica por PCV2 puede tener un impacto negativo importante en el rendimiento del crecimiento.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA INC.

<120> PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE PCBVD SUBCLÍNICA 5

<130> P-01-2179

10 <160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 15 <211> 8

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 20 <223> Esta es una secuencia de Kozak modificada.

<400> 1 ccgccatg 8

<210> 2

<211> 6

<212> ADN

<213> Artificial 30

<220>

<223> Esta es una secuencia de Eco R1 recombinante.

<400> 2 35 gaattc 6

<210> 3

<211> 713

<212> ADN 40 <213> Circovirus Porcino

<400> 3

<210> 4 45 <211> 713

<212> ADN

<213> Circovirus Porcino

<400> 4

<210> 5

<211> 233

<212> PRT

<213> Circovirus Porcino

<400> 5

<210> 6

<211> 233

<212> PRT

<213> Circovirus Porcino

<400> 6

<210> 7

<211> 756

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Esta secuencia es del circovirus porcino tipo 2, marco de lectura abierto 2, junto con una porción del vector pGEM T-easy.

<400> 7

<210> 8

<211> 10387

<212> ADN

<213> Artificial 15

<220>

<223> Esta es una secuencia del circovirus porcino de tipo 2, constructo ORF-2, que incluye las secuencias codificadoras del baculovirus y pGEM T-easy.

20 <400> 8

<210> 9 5 <211> 20

<212> PRT

<213> Circovirus porcino

<400> 9 10

<210> 10

<211> 19 15 <212> PRT

<213> Circovirus porcino

<400> 10

<210> 11

<211> 233

<212> PRT 25 <213> Artificial <220>

<223> Este es una secuencia de aminoácidos del circovirus porcino tipo 2, marco de lectura abierto 2.

<400> 11

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Uso de una proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) o una composición inmunogénica que comprende una proteína ORF2 del PCV2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección subclínica por PCV2 en un cerdo, en donde una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho medicamento administrada a dicho cerdo reduce la deficiencia en el desarrollo o reduce la exceción nasal del virus y/o la duración de la viremia, y en donde dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza porque la carga vírica en un cerdo subclínicamente infectado es inferior a 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero y porque una muestra de 1 ml de suero o 1 mg de tejido de dicho cerdo comprende una cantidad detectable de equivalentes del genoma de PCV2.

2. 2.

   El uso según la reivindicación 1, en donde se reduce la deficiencia en el desarrollo debida a la infección subclínica por PCV2.

3. 3.

   El uso según la reivindicación 1 ó 2, en donde se reduce la exceción nasal del virus y/o la duración de la viremia en un cerdo subclínicamente infectado con PCV2.

4. 4.

   El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína ORF2 del PCV2 es una proteína ORF-2 de PCV2 expresada en baculovirus recombinante.

5. 5.

   Proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) o una composición inmunogénica que comprende una proteína ORF2 del PCV2 para uso en un método para el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, en donde dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza porque la carga vírica en un cerdo subclínicamente infectado es inferior a 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero y porque una muestra de 1 ml de suero o 1 mg de tejido de dicho cerdo comprende una cantidad detectable de equivalentes del genoma de PCV2, y en donde en dicho uso una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha proteína ORF2 de PCV2 o dicha composición inmunogénica que comprende proteína ORF2 de PCV2 administrada a dicho cerdo reduce la deficiencia en el desarrollo o reduce la exceción nasal del virus y/o la duración de la viremia

6. 6.

   La proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) o composición inmunogénica que comprende proteína ORF2 del PCV2 para uso en un método según la reivindicación 5, en donde se reduce la deficiencia en el desarrollo debida a infección subclínica por PCV2.

7. 7.

   La proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) o composición inmunogénica que comprende proteína ORF2 del PCV2 para uso en un método según la reivindicación 5 ó 6, en donde se reduce la exceción nasal del virus y/o la duración de la viremia en un cerdo subclínicamente infectado con PCV2.

8. 8.

   La proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) o composición inmunogénica que comprende proteína ORF2 del PCV2 para uso en un método según una cualquiera de las reivindicación 5 a 7, en donde dicha proteína ORF2 de PCV-2 es una proteína ORF-2 de PCV2 expresada en un baculovirus recombinante.