RU2520759C2 - Предупреждение и лечение субклинической формы болезней, вызываемых цирковирусом свиней (pcvd) - Google Patents

Предупреждение и лечение субклинической формы болезней, вызываемых цирковирусом свиней (pcvd) Download PDF

Info

Publication number
RU2520759C2
RU2520759C2 RU2009134222/15A RU2009134222A RU2520759C2 RU 2520759 C2 RU2520759 C2 RU 2520759C2 RU 2009134222/15 A RU2009134222/15 A RU 2009134222/15A RU 2009134222 A RU2009134222 A RU 2009134222A RU 2520759 C2 RU2520759 C2 RU 2520759C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
pcv2
animals
infection
animal
subclinical form
Prior art date
Application number
RU2009134222/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2009134222A (ru
Inventor
ФАХИНГЕР Викки
ЭЛЬБЕРС Кнут
КИКСМЁЛЛЕР Марион
ОРВЕЛЛОН Франсуа-Ксавьер
ФРАЙН-ФОН-РИХТХОФЕН Изабелла
ЛИШЕВСКИ Аксель
Original Assignee
Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38191300&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2520759(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. filed Critical Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк.
Publication of RU2009134222A publication Critical patent/RU2009134222A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2520759C2 publication Critical patent/RU2520759C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10071—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Заявленная группа изобретений относится к области ветеринарии и предназначена для лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции у животных. Заявлены способ лечения субклинической формы вызываемой PCV 2 инфекции; способ уменьшения нарушения роста из-за субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции; способ снижения количества животных с вирусной нагрузкой, превышающей 106 геномных копий на мл сыворотки; способ снижения выделения вируса из носа и/или продолжительности виремии у животных, инфицированных субклинической формой PCV2. Заявленные способы включают этап введения терапевтически эффективного количества протеина OFR-2 PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей протеин OFR-2 PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. При этом субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается уровнем вирусной нагрузки в организме индивидуального животного менее 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки. Заявлено также применение протеина OFR-2 PCV2 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для осуществления заявленных способов. Заявленная группа изобретений высокоэффективна для лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции животных. 8 н. и 16 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 3 пр.

Description

В настоящую заявку входит перечень последовательностей в бумажной и электронной версии, сущность и содержание которых включены в настоящее описание в качестве ссылки. Перечень последовательностей идентичен перечню, включенному в WO 06/072065.
Предпосылки создания изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению иммуногенной композиции, которая содержит антиген цирковируса свиней типа 2 (PCV2), для предупреждения и лечения субклинических (хронических) форм вызываемых PCV2 инфекций у животных, предпочтительно у молодых (не достигших половой зрелости) свиней.
Описание известного уровня техники
Цирковирус свиней типа 2 (PCV2) представляет собой небольшой (диаметром 17-22 нм) ДНКовый не имеющий оболочки вирус с икосаэдральной структурой, который несет одноцепочечный кольцевой геном. Последовательность PCV2 примерно на 80% идентична последовательности цирковируса свиней типа 1 (PCV1). Однако в настоящее время установлено, что в отличие от PCV1, который, как правило, является невирулентным, заражение свиней PCV2 ассоциировано с рядом болезненных синдромов, которые в целом обозначают как болезни, вызываемые цирковирусом свиней (PCVD) (известные также как цирковирус-ассоциированные заболевания свиней (PCVAD)) (Allan и др., IPVS Congress, 2006). Как правило, основным клиническим проявлением PCVD считается синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS) (Harding и др., Swine Health Prod; 5, 1997, cc.201-203; Kennedy и др., J Comp Pathol; 122, 2000, cc.9-24). Из литературы известно несколько других потенциально родственных состояний, включая комплекс респираторных болезней свиней (PRDC), синдром свиного дерматита и нефропатии (PDNS), снижение репродуктивной функции, гранулематозные энтериты и, возможно, врожденный тремор (CT-AII) и перинатальный миокардит (Chae, Veterinary J., 169, 2005, cc.326-336).
PCVD поражает молодых свиней возрастом 5-22 недели. С клинической точки зрения PCVD характеризуется истощением, бледностью кожи, худосочностью, респираторным дистресс-синдромом, диареей, желтухой и разлитием желчи. У некоторых пораженных заболеванием свиней проявляется комбинация всех симптомов, в то время как у других свиней проявляются только один или два из указанных симптомов (Muirhead, Vet. Rec., 150, 2002, с.456). Коэффициенты смертности у свиней, инфицированных PCV2, могут достигать 50%. При вскрытии трупа выявляют также микроскопические и макроскопические повреждения многих тканей и органов, причем наиболее часто повреждения встречаются в лимфоидных органах (Allan и Ellis, J Vet. Diagn. Invest., 12, 2001, cc.3-14). Обнаружена выраженная корреляция между уровнем нуклеиновой кислоты или антигена PCV2 и серьезностью микроскопических лимфоидных повреждений (Brunborg, 2004). Кроме того, обнаружена корреляция между уровнем нуклеиновой кислоты или антигена в крови и серьезностью клинических симптомов (Brunborg, 2004; Liu, 2000; Olvera, 2004). Установлено, что у молодых свиней, страдающих PCVD, уровень вирусной нагрузки превышал 106 геномных эквивалентов на мл.
В отличие от клинически выраженных проявлений болезней, вызываемых PCV2, считается, что субклинические формы вызываемых PCV2 инфекций присутствуют у тех животных, которые инфицированы PCV2, но имеют клинически бессимптомное течение. В целом, существует взаимосвязь между этими формами вызываемых PCV2 инфекций, поскольку субклинические формы инфекций могут легко переходить в PCVD, и поэтому выздоравливающие животные могут оставаться постоянно зараженными в течение длительного периода времени (хронически) (см. фиг.1).
В современных исследованиях продемонстрировано, что субклинические формы вызываемых PCV2 инфекций часто встречаются. Наличие субклинической формы инфекций продемонстрировано как экспериментально, так и в полевых условиях. В лабораторных опытах можно продемонстрировать, что вызываемая PCV2 инфекция индивидуальных молодых свиней не всегда связана с клиническими симптомами или повреждениями (Harms и др. Vet. Pathol., 38, 2001, cc.528-539). Кроме того, в нескольких полевых опытах установлено, что заболеваемость инфицированных PCV2 серопозитивных стад выше, чем заболеваемость стад, пораженных PCVD (Olvera и др., J. Virol. Methods, 117, 2004, cc.75-80). Часто стада, в которых обнаружена острая вспышка PCVD, остаются инфицированными PCV2 без проявления заметных клинических симптомов. В литературе принято обозначать также эту субклиническую (постоянную) форму заражения стада как «хроническую» инфекцию (Burch D., Pig International, 2006).
Экономическая роль PCV2 в инфицированных субклинической формой стадах, если это имеет место, является неизвестной, и ранее никогда не была описана. В частности, пока не известно и не установлено, могут ли субклинические формы вызываемых PCV2 инфекций оказывать влияние на показатели роста животных или на общее состояние здоровья в целом пораженных животных.
Подходы к лечению вызываемых PCV2 инфекций, основанные на применении ДНК-вакцины, описаны в US 6703023. В WO 03/049703 описано получение живой химерной вакцины, содержащей каркас PC VI, в котором ген каркаса PCV1 заменен на иммуногенный ген патогенных штаммов PCV2. В WO 99/18214 описано несколько штаммов PCV2 и процедуры получения убитой вакцины против PVC2. Однако отсутствуют данные об их эффективности. Эффективная субъединичная вакцина на основе ОРС-2 (открытая рамка считывания 2) описана в WO 06/072065. Любая из указанных вакцин предназначена для применения с целью вакцинации/лечения свиней или молодых свиней старше 3 недель. Ни для одной из указанных вакцин не описано применение для профилактики или лечения животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции. Кроме того, не описано, что такие вакцины могут вызывать иммунитет против вызываемой PCV2 инфекции у групп животных с субклинической формой заболевания и улучшать показатели их роста. Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг.1 - различные формы вызываемых PCV2 инфекций,
на фиг.2 - коэффициент смертности и среднесуточный прирост массы в период откорма, определенный на опытной ферме до и после начала эксперимента,
на фиг.3 - динамика различия между массой тела (IVP-CP (обработка исследуемым ветеринарным продуктом/контрольным продуктом)) и средним уровнем вирусной нагрузки (log 10) в процессе эксперимента,
на фиг.4 - сравнение процента животных с уровнем вирусной нагрузки >10 геномных эквивалентов/мл сыворотки в обеих обрабатываемых группах,
на фиг.5 - сравнение процента животных с уровнем вирусной нагрузки в сыворотке 104-10Е6 геномных эквивалентов/мл сыворотки в обеих обрабатываемых группах.
Подробное описание изобретения
Клиническое проявление вызываемых PCV2 инфекций ассоциировано с различными синдромами заболевания. В зависимости от формы проявления выражения родственного PCV2 заболевания клинические симптомы острой вызываемой PCV2 инфекции могут представлять собой один или несколько из следующих показателей: а) существенное повышение коэффициента смертности (повышение на 4-20%), б) существенное повышение частоты встречаемости «малорослых» животных (повышение на 5-50%) или в) другие симптомы клинического проявления, такие как респираторные симптомы, диарея, бледность кожи, желтуха, худосочность (коэффициент заболеваемости 4-60%). Кроме того, высокие вирусные титры, превышающие 106 или 107 на мл сыворотки или ткани, являются характерным признаком у большинства животных с острыми симптомами PCVD. Помимо острой вызываемой PCV2 инфекции, субклиническая форма вызываемых PCV2 инфекций, отличающаяся отсутствием заболеваемости или низким коэффициентом заболеваемости, становится все более и более распространенной. В некоторых случаях острая вызываемая PCV2 инфекция может переходить в субклиническую форму вызываемой PCV2 инфекции. Однако субклинические формы инфекций могут также иметь место без наличия каких-либо предшествующих симптомов острой вызываемой PCV2 инфекции.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции оказывает существенное воздействие на характеристики внешне здоровых молодых свиней, в частности на показатель роста молодых свиней. Даже если при субклинической форме у инфицированных животных не развиваются типичные клинические симптомы, которые позволяют идентифицировать PCVD, или у них обнаружен лишь невысокий уровень заболеваемости, эти животные в значительной степени поражены субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции. Субклиническая форма вызываемых PCV2 инфекций у молодых свиней приводит к заметной потере прироста массы (см. пример 3). Как отмечалось ранее, в существующих к настоящему времени прототипах отсутствуют данные о том, что субклиническая форма вызываемых PCV2 инфекций оказывает какое-либо воздействие на здоровье, в частности показатель роста молодых свиней.
Кроме того, при создании изобретения неожиданно было установлено, что снижение прироста массы, обусловленное субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, можно уменьшать путем лечения/вакцинации животных, которые приобрели субклиническую форму заболевания, антигеном PCV2 (например, см. пример 3). Таким образом, при создании изобретения не только было установлено, что субклиническая форма вызываемых PCV2 инфекций влияет по показатель роста молодых свиней, но получены также данные о том, что такое отрицательное воздействие можно существенно снижать путем лечения/вакцинации животных антигеном PCV2. Другими словами, даже если из существующего уровня техники известен феномен субклинической формы инфекций, при создании изобретения впервые были получены данные о том, что
- субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции, иногда обнаруживаемая в полевых условиях, может оказывать существенное влияние на показатель роста молодых свиней;
- вакцинация пораженных субклинической формой молодых свиней или стад с помощью антигена PCV2 может существенно снижать отрицательное воздействие этой субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции.
Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции у животного или группы животных, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении.
«Субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции» в контексте настоящего описания характеризуется I) вирусной нагрузкой в организме индивидуального животного, которая сохраняется в течение всей жизни на уровне ниже 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки, II) низким относительным количеством РСV2-позитивных животных в группе или стаде с вирусными титрами, превышающими 106 геномных копий на мл сыворотки, III) сохранением вируса в группе или стаде в течение по меньшей мере 6 недель, предпочтительно по меньшей мере 8 недель, более предпочтительно по меньшей мере 10 недель, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12 недель, IV) отсутствием типичных клинических симптомов у РСV2-позитивного животного, V) отсутствием или лишь невысоким коэффициентом заболеваемости в группе животных или стаде РСV2-позитивных животных и/или VI) невысоким коэффициентом смертности в группе животных или стаде РСV2-позитивных животных.
Понятие «низкое относительное количество РСV2-позитивных животных», которое используется выше в качестве критерия II), означает, что менее 20%, предпочтительно менее 15%, еще более предпочтительно менее 10%, еще более предпочтительно менее 8%, еще более предпочтительно менее 6%, еще более предпочтительно менее 4%, наиболее предпочтительно менее 3% PCV-2-позитивных животных в группе животных или в стаде имеют вирусные титры, превышающие 106 геномных копий на мл сыворотки. Другими словами, понятие «низкое относительное количество РСV2-позитивных животных в группе животных или в стаде, которые имеют вирусные титры, превышающие 10 геномных копий на мл сыворотки» означает также, что более 80%, предпочтительно более 85%, еще более предпочтительно более 90%, еще более предпочтительно более 92%, еще более предпочтительно более 94%, еще более предпочтительно более 96%, наиболее предпочтительно более 97% PCV2-позитивных животных в группе или стаде имеют вирусные титры ниже 10 геномных копий PCV2 на мл сыворотки.
Понятие «РСV2-позитивный» в контексте настоящего описания означает, но, не ограничиваясь только указанным, что животное содержит выявляемое количество геномных эквивалентов PCV2 (т.е. вирусных копий) в образце (1 мл сыворотки или 1 мг ткани). Выявляемое количество геномных эквивалентов PCV2 означает, что геномные эквиваленты PCV2 можно выявлять с помощью анализа на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Образец считается ПЦР-позитивным, если два независимых образца дают положительный результат по данным ПЦР при таком анализе.
Методы количественной оценки PCV2 с помощью ПЦР-анализа хорошо известны в данной области. Фактически количественную оценку геномных эквивалентов PCV2 осуществляли/осуществляют с помощью метода, описанного у Brunborg и др., J.Virol Methods 122, 2004, cc.171-178. Для амплификации PCV2 применяли/применяют праймеры PCV2-84-1265U21 и PCV2-84-1319L21. Такой метод можно применять в качестве референс-анализа в случае любых сомнений.
Понятие «сохранение вируса» в контексте настоящего описания означает, что зараженное животное имеет вирусную нагрузку по меньшей мере 104 вирусных копий PCV2 на мл сыворотки в течение указанного выше периода времени, т.е. по меньшей мере 6 недель или более.
Понятие «отсутствие типичных клинических симптомов у PCV2-позитивного животного» в контексте настоящего описания означает отсутствие любых видимых клинических симптомов, которые в норме ассоциированы с клиническим проявлением вызываемой PCV2 инфекции, что позволяет точно и недвусмысленно идентифицировать вызываемую PCV2 инфекцию только на основе типичного клинического проявления. Эти клинические симптомы соответствуют известным для PCVD, в частности представляют собой бледность кожи, худосочность, респираторный дистресс-синдром, диарею, желтуху или разлитие желчи.
Понятие «невысокий коэффициент заболеваемости» в контексте настоящего описания является показателем отсутствия клинических симптомов, которые позволяют идентифицировать острую вызываемую PCV2 инфекцию по ее клиническому проявлению. Это является также показателем присутствия субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции. Понятие «невысокий коэффициент заболеваемости» в контексте настоящего описания относится к проценту животных с измененным общим состоянием здоровья. Понятие «измененное общее состояние здоровья» в контексте настоящего описания относится к наличию одного или нескольких связанных с PCVD клинических симптомов, таких как наличие «малорослых» животных (к которым в контексте настоящего описания относятся животные, у которых масса тела на 25% ниже, чем средняя массы животных такой же возрастной группы), бледность кожи, худосочность, респираторный дистресс-синдром, диарея, желтуха или разлитие желчи. Таким образом, «невысокий коэффициент заболеваемости» в контексте настоящего описания означает, что у менее 25%, предпочтительно у менее 20%, более предпочтительно у менее 15%, еще более предпочтительно у менее 12%, еще более предпочтительно у менее 10%, еще более предпочтительно у менее 8%, еще более предпочтительно у менее 6%, наиболее предпочтительно у менее 4% животных в группе животных или в стаде обнаружен один или несколько клинических симптомов PCVD, предпочтительно обнаружено наличие «малорослых» животных, как определено выше, бледности кожи, худосочности, респираторного дистресс-синдрома, диареи, желтухи или разлития желчи.
Понятие «отсутствие коэффициента заболеваемости» в контексте настоящего описания означает, что менее чем у 1% РСV2-позитивных животных в группе животных или стаде обнаружен один или несколько клинических симптомов PCVD, предпочтительно обнаружено наличие «малорослых» животных, как определено выше, бледности кожи, худосочности, респираторного дистресс-синдрома, диареи, желтухи или разлития желчи.
Понятие «невысокий коэффициент смертности» в контексте настоящего описания означает, но, не ограничиваясь только указанным, что коэффициент смертности РСV2-позитивных животных в группе животных или стаде составляет менее 20%, предпочтительно менее 15%, более предпочтительно менее 12%, еще более предпочтительно менее 10%, еще более предпочтительно менее 8%, еще более предпочтительно менее 6%, наиболее предпочтительно менее 4%.
Понятие «нуждающийся в таком введении» или «нуждающийся в таком лечении» в контексте настоящего описания означает, что введение/лечение ассоциировано с профилактикой здоровья или с любым другим положительным воздействием на здоровье животных, получающих антиген PCV2.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения принимается, что субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции относится к случаю, удовлетворяющему по меньшей мере критерию I) «вирусная нагрузка в организме индивидуального животного, которая сохраняется с течение всей жизни на уровне ниже 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки», критерию
II) «низкое относительное количество РСV2-позитивных животных в группе или стаде с вирусными титрами, превышающими 106 геномных копий на мл сыворотки», или критерию III) «сохранение вируса в группе или стаде в течение по меньшей мере 6 недель, предпочтительно по меньшей мере 8 недель, более предпочтительно по меньшей мере 10 недель, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12 недель». Наиболее предпочтительно принимается, что субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции относится к случаю, удовлетворяющему указанным выше критериям I) и II).
В случаях, когда критерий I) и/или критерий II) объединены с критерием
III) «сохранение вируса в группе или стаде в течение по меньшей мере 6 недель, предпочтительно по меньшей мере 8 недель, более предпочтительно по меньшей мере 10 недель, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12 недель» или в любых других случаях, удовлетворяющих критерию III), как указано выше, то субклиническая форма инфекции рассматривается как «хроническая субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции».
Другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается вирусной нагрузкой в организме индивидуального животного на уровне ниже 10 геномных копий PCV2 на мл сыворотки, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Предпочтительно субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается также присутствием менее 20% животных, несущих более 106, предпочтительно более 107 вирусных копий PCV2 на мл сыворотки, в группе животных или стаде и/или отличается сохранением вируса в такой группе или стаде в течение по меньшей мере 6 недель, предпочтительно по меньшей мере 8 недель, более предпочтительно по меньшей мере 10 недель, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12 недель. Более предпочтительно такая субклиническая форма инфекции отличается также отсутствием каких-либо клинических симптомов у индивидуального РСV2-позитивного животного, как определено выше, отсутствием или невысоким коэффициентом заболеваемости, как определено выше, и/или невысоким коэффициентом смертности, как определено выше.
Следующим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается вирусной нагрузкой в организме индивидуального животного, которая может сохраняться в течение всей его жизни на уровне ниже 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки, в отсутствии какого-либо введения антигена PCV2, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Предпочтительно субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается также присутствием менее 20% животных в группе животных или в стаде, которые имеют вирусные титры, превышающие 106, предпочтительно 107 вирусных копий PCV2 на мл сыворотки, и/или отличается сохранением вируса в такой группе или стаде в течение по меньшей мере 6 недель, предпочтительно по меньшей мере 8 недель, более предпочтительно по меньшей мере 10 недель, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12 недель. Более предпочтительно такая субклиническая форма инфекции отличается также отсутствием каких-либо клинических симптомов у индивидуального РСV2-позитивного животного, как определено выше, отсутствием или невысоким коэффициентом заболеваемости, как определено выше, и/или невысоким коэффициентом смертности, как определено выше.
Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается присутствием менее 20% животных в группе животных или в стаде, которые имеют вирусные титры, превышающие 106, предпочтительно 107 вирусных копий PCV2 на мл сыворотки, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Предпочтительно субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается также сохранением вируса в такой группе или стаде в течение по меньшей мере 6 недель, предпочтительно по меньшей мере 8 недель, более предпочтительно по меньшей мере 10 недель, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12 недель. Более предпочтительно такая субклиническая форма инфекции отличается также отсутствием каких-либо клинических симптомов у индивидуального РСV2-позитивного животного, как определено выше, отсутствием или невысоким коэффициентом заболеваемости, как определено выше, и/или невысоким коэффициентом смертности, как определено выше.
Следующим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается сохранением вируса в такой группе или стаде в течение по меньшей мере 6 недель, предпочтительно по меньшей мере 8 недель, более предпочтительно по меньшей мере 10 недель, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12 недель. Предпочтительно такая субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается также отсутствием каких-либо клинических симптомов у индивидуального РСV2-позитивного животного, как определено выше, отсутствием или невысоким коэффициентом заболеваемости, как определено выше, и/или невысоким коэффициентом смертности, как определено выше.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается отсутствием каких-либо клинических симптомов у индивидуального PCV2-позитивного животного, как определено выше, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Предпочтительно субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается также отсутствием или невысоким коэффициентом заболеваемости, как определено выше, и/или невысоким коэффициентом смертности, как определено выше. Более предпочтительно субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается также тем, что вирусная нагрузка в организме индивидуального животного сохраняется в течение всей его жизни на уровне ниже 10 геномных копий PCV2 на мл сыворотки и/или низким относительным количеством PCV-2-позитивных животных в группе или стаде, которые имеют вирусные титры, превышающие 106 геномных копий на мл сыворотки.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается отсутствием или невысоким коэффициентом заболеваемости в группе животных или стаде, предпочтительно на уровне, не превышающем 25% или ниже, как определено выше, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Предпочтительно субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается также тем, что вирусная нагрузка в организме индивидуального животного сохраняется в течение всей его жизни на уровне ниже 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки и/или низким относительным количеством PCV-2-позитивных животных в группе или стаде, которые имеют вирусные титры, превышающие 106 геномных копий на мл сыворотки.
Следующим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается невысоким коэффициентом смертности, как определено выше, предпочтительно на уровне, не превышающем 20% или ниже, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Предпочтительно субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается также тем, что вирусная нагрузка в организме индивидуального животного сохраняется в течение всей его жизни на уровне ниже 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки и/или низким относительным количеством PCV-2-позитивных животных в группе или стаде, которые имеют вирусные титры, превышающие 106 геномных копий на мл сыворотки.
Введение в эффективном количестве антигена PCV2 животным или группе животных, которые имеют субклиническую форму вызываемой PCV2 инфекции, приводит к повышению прироста массы у этих животных в процессе периода откорма, к снижению количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим 10-10 геномных копий на мл сыворотки, к снижению выделения вируса через нос и/или снижению продолжительности виремии.
Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является также способ снижения потери прироста массы у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Предпочтительно средний прирост массы возрастает в период с 10 по 22 неделю жизни более чем на 1,5 кг по сравнению с невакцинированными животными. Понятие «в процессе периода откорма» в контексте настоящего описания означает, но, не ограничиваясь только указанными, животных возрастом от 1 до 36 недель, предпочтительно от 10 до 28 недель.
Понятие «животные с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции» в контексте настоящего описания относится к индивидуальному животному, которое становится субклинически инфицированным PCV2, но относится также к группе животных, где большинство животных в этой группе становятся субклинически инфицированными PCV2. Таким образом, понятие «животные с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции» относится как к I) «животным с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции», так и к II) « животным стада, где стадо субклинически инфицировано PCV2».
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим 104-106 геномных копий на мл сыворотки, в группе животных (стаде), субклинически инфицированном PCV2, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Предпочтительно количество животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим 104-106 геномных копий на мл сыворотки, может снижаться в результате вакцинации антигеном PCV2 до менее чем 30%, предпочтительно до менее чем 20%, еще более предпочтительно до менее чем 10%, наиболее предпочтительно до менее чем 5%, в то время как в невакцинированной контрольной группе субклинически инфицированных животных (с уровнем вирусной нагрузки, составляющим 10-10 геномных копий на мл сыворотки) более чем у 40% возникают титры PCV2, составляющие от 104 до 10 геномных копий на мл сыворотки.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является также способ снижения количества животных с клинически значимым уровнем вирусной нагрузки (превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки) в группе животных (стаде), субклинически инфицированной PCV2, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Предпочтительно количество животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, можно снижать в результате вакцинации антигеном PCV2 до менее чем 10%, предпочтительно до менее чем 5%, еще более предпочтительно до менее чем 4%, еще более предпочтительно до менее чем 3%, еще более предпочтительно до менее чем 2%, наиболее предпочтительно до менее чем 0,5%.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является также способ снижения выделения вируса через нос, снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Как описано выше, вакцинация/лечение животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции приводит к укорочению фазы виремии по сравнению с невакцинированными контрольными животными. Среднее укорочение продолжительности виремии составляло 17 дней по сравнению с невакцинированными контрольными животными этого же вида. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является также способ снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении, где лечение или профилактика приводят к укорочению фазы виремии на 5 или более дней, предпочтительно 6 или более дней, еще более предпочтительно 7 или более дней, еще более предпочтительно 8 или более дней, еще более предпочтительно 9 или более дней, еще более предпочтительно 10 или более дней, еще более предпочтительно 12 или более дней, еще более предпочтительно 14 или более дней, наиболее предпочтительно более 16 дней, по сравнению с невакцинированными контрольными животными этого же вида.
Понятие «антиген» в контексте настоящего описания относится к аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунный ответ у хозяина. Антиген в контексте настоящего описания включает полноразмерную последовательность любых белков PCV2, их аналогов или их иммуногенных фрагментов. Понятие «иммуногенный фрагмент» обозначает фрагмент белка, который содержит один или несколько эпитопов и в результате этого вызывает иммунный ответ у хозяина. Такие фрагменты можно идентифицировать с помощью любого из многочисленных методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66, под ред. Glenn E.Morris, изд-во Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Например, линейные эпитопы можно выявлять, например, осуществляя конкурентный синтез большого количества пептидов на твердых подложках, где пептиды соответствуют фрагментам молекулы белка, и, подвергая пептиды взаимодействию с антителами, при этом пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например в US 4708871; у Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 3998-4002; Geysen и др., Molec. Immunol. 23, 1986, cc.709-715. Аналогично этому, конформационные эпитопы легко можно идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса (см., например, Epitope Mapping Protocols, выше).
Понятие включает также синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие полученные методами рекомбинации или синтеза антигены (см., например, Bergmann и др., Eur. J. Immunol. 23, 1993, cc.2777-2781; Bergmann и др., J. Immunol. 157, 1996, cc.3242-3249; Suhrbier A., Immunol, и Cell Biol. 75, 1997, cc.402-408; Gardner и др., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland (12-ая Всемирная конференция по СПИДу Женева, Швейцария) 28 июня-3 июля 1998 г.).
Понятие «иммунный ответ» относится, но не ограничиваясь только указанным, к формированию в хозяине клеточно- и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющий интерес антиген, композицию или вакцину. Как правило, «иммунный ответ» включает, но, не ограничиваясь только ими, одну или несколько из следующих реакций:
производство или активацию антител, В-клеток, Т-клеток-хелперов, Т-клеток-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенный(е) в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно организм-хозяин должен вырабатывать либо терапевтический, либо защитный иммунологический (вторичный иммунный) ответ так, чтобы повышалась устойчивость к новой инфекции и/или снижалась клиническая серьезность заболевания. Такое защитное действие можно выявлять либо по снижению уровня или серьезности, либо по отсутствию одного или нескольких симптомов, ассоциированных с вызываемыми PCV2 инфекциями у хозяина, замедлению появления вируса в крови (виремия), снижению персистентности вируса, снижению общей вирусной нагрузки и/или снижению вирусной экскреции.
Понятия «иммуногенная композиция» или «вакцина» (оба понятия являются синонимами) в контексте настоящего описания относятся к любой фармацевтической композиции, которая содержит антиген PCV2, при этом, композицию можно применять для предупреждения или лечения заболевания или состояния, ассоциированного с вызываемой PCV2 инфекцией, у животного. Предпочтительная иммуногенная композиция может индуцировать, стимулировать или повышать иммунный ответ на PCV2. Под это понятие подпадают как субъединичные иммуногенные композиции, описанные ниже, так и композиции, которые содержат убитые (полностью обезвреженные) или ослабленные и/или инактивированные PCV2.
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, способ повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 10 до 10 геномных копий на мл сыворотки, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, способ снижения выделения вируса из носа, способ снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, способ снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, в каждом случае заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении, где иммуногенная композиция представляет собой субъединичную иммуногенную композицию, композицию, содержащую полностью обезвреженные или ослабленные и/или инактивированные PCV2.
В контексте настоящего описания понятие «субъединичная иммуногенная композиция» относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один иммуногенный полипептид или антиген, но не все антигены, выведенные или являющиеся гомологами антигена PCV2. Такая композиция практически свободна от интактного PCV2. Таким образом, «субъединичную иммуногенную композицию» получают по меньшей мере из частично очищенных или фракционированных (предпочтительно практически очищенных) иммуногенных полипептидов из PCV2 или их рекомбиантных аналогов. Субъединичная иммуногенная композиция может содержать субъединицу антигена или антигенов, представляющих интерес, которые практически свободны от других антигенов или полипептидов из PCV2 или являются фракционированными. Предпочтительная иммуногенная субъединичная композиция содержит белок ОРС-2 PCV2, описанный ниже. Наиболее предпочтительными являются иммуногенные субъединичные композиции, которые содержат любой из антигенов PCV2, представленных в WO 06/072065, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Таким образом, следующим объектом изобретения является иммуногенная композиция, как она определена в контексте настоящего описания, которая наиболее предпочтительно содержит полипептид или его фрагмент, экспрессируемый ОРС-2 PCV2. ДНК ОРС-2 PCV2 и белок, которые применяют согласно изобретению для приготовления композиций и с помощью способов, предлагаемых в изобретении, представляет собой высококонсервативный домен в изолятах PCV2 и поэтому согласно изобретению любая ОРС-2 PCV2 должна быть эффективной в качестве источника ДНК ОРС-2 PCV и/или полипептида. Предпочтительным белком ОРС-2 PCV2 является белок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 11 в WO 06/072065. Другим предпочтительным полипептидом ОРС-2 PCV является полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 5 в WO 06/072065. Однако специалистам в данной области должно быть очевидно, что последовательность может варьироваться в пределах 6-10% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. Антигенные характеристики иммунологической композиции можно оценивать, например, путем экспериментов по контрольному заражению, описанных в примере 4 WO 06/072065. Кроме того, антигенные характеристики модифицированного антигена все еще сохраняются, когда модифицированный антиген обеспечивает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ОРС-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065.
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, способ повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 10 до 10 геномных копий на мл сыворотки, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, способ снижения выделения вируса из носа, способ снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, способ снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, в каждом случае заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении, где антиген PCV2 представляет собой антигенный белок ОРС-2 PCV2, который обеспечивает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ОРС-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065. Предпочтительно белок ОРС-2 PCV2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:5 в WO 06/072065.
В некоторых вариантах иммуногенные участки белка ОРС-2 PCV2 применяют в качестве антигенного компонента в иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2. Понятие «иммуногенный участок» в контексте настоящего описания относится к укороченным и/или имеющим замены формам или фрагментам белка и/или полинуклеотида ОРС-2 PCV2 соответственно. Предпочтительно такие укороченные и/или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 6 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ОРС-2. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 5, предпочтительно 8, более предпочтительно 10, более предпочтительно по меньшей мере 15 и еще более предпочтительно по меньшей мере 19 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ОРС-2. PCV. Две предпочтительные в этом плане последовательности представлены в виде SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO:10 в WO 06/072065. Следует понимать также, что указанные последовательности могут представлять собой часть более крупных фрагментов или укороченных форм.
Как указано выше, предпочтительным является также любой полипептид ОРС-2 PCV2, который кодируется нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Кроме того, как должно быть очевидно специалистам в данной области, эта последовательность может варьироваться в пределах 6-20% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. В некоторых вариантах укороченные или имеющие замены формы или фрагменты полипептида ОРС-2 PVC2 применяют в качестве антигенного компонента в композиции. Предпочтительно такие укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ОРС-2 PVC2, например, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 45 и еще более предпочтительно по меньшей мере 57 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ОРС-2 PVC2, например, представленной в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
Понятие «идентичность последовательностей», как известно в данной области, относится к родству между двумя или большим количеством полипептидных последовательностей или двумя или большим количеством полинуклеотидных последовательностей, а именно между референс-последовательностью и рассматриваемой последовательностью, подлежащей сравнению с референс-последовательностью. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения данной последовательности с референс-последовательностью после оптимального выравнивания последовательностей для получения наиболее высокой степени сходства последовательностей, что определяют по совместимости отрезков указанных последовательностей. После выравнивания идентичность последовательностей оценивают по находящимся в одинаковых положениях основаниям (по типу «положение с положением»), например, последовательности являются «идентичными» в определенном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее количество таких идентичных положений затем делят на общее количество нуклеотидов или остатков в референс-последовательности, получая % идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей легко можно рассчитывать с помощью известных методов, включая, но, не ограничиваясь только ими, описанные в:
Computational Molecular Biology, под ред. Lesk A.N., изд-во Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, под ред. Smith D.W., изд-во Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, часть I, под ред. Griffin A.M. и Griffin H. G., изд-во Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., изд-во Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, под ред. Gribskov M. и Devereux J., изд-во M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo H. и Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, с.1073, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительные методы определения идентичности последовательностей созданы так, чтобы получать наибольшее соответствие между изучаемыми последовательностями. Методы определения идентичности последовательностей приведены в систему в доступных общественности компьютерных программах, которые позволяют определять идентичность последовательностей для рассматриваемых последовательностей. Примерами таких программ являются, но, не ограничиваясь только ими, пакет программ GCG (Devereux J. и др.. Nucleic Acids Research, 12(1), 1984, с.387), BLASTP. BLASTN и FASTA (Altschul S.F. и др., J. Molec. Biol, 215, 1990, cc.403-410). Программа BLASTX является доступной общественности от NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul S. и др., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul S. F. и др., J. Molec. Biol, 215, 1990, cc.403-410), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Эти программы позволяют осуществлять оптимальное выравнивание последовательностей с помощью принимаемых по умолчанию значений, таких как вес бреши, для того, что получать наиболее высокий уровень идентичности последовательностей для рассматриваемой последовательности и референс-последовательности. В качестве иллюстрации: когда упоминается полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% «идентична последовательности» нуклеотидной референс-последовательности, то подразумевается, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того, что данная полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще боле предпочтительно вплоть до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-последовательности. Другими словами, для того, чтобы полинуклеотид имел нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще боле предпочтительно на 95% с нуклеотидной референс-последовательностью, вплоть до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% нуклеотидов в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид, или вплоть до 15% нуклеотидов, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти мутации референс-последовательности могут иметь место на 5'- или 3'-конце нуклеотидной референс-последовательности или в любом положении между этими концами, либо находясь индивидуально среди нуклеотидов в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Аналогично этому, когда упоминают полипептид, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере, например на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% аминокислотной референс-последовательности, то подразумевают, что рассматриваемая аминокислотная последовательность полипептида идентична референс-последовательности за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 аминокислотных замен на каждые 100 аминокислот аминокислотной референс-последовательности. Другими словами, для получения данной полипептидной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% идентична последовательности аминокислотной референс-последовательности, вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% аминокислотных остатков в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другую аминокислоту, или вплоть до 15% аминокислот, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности могут иметь место на амино- или карбоксиконце аминокислотной референс-последовательности или в любом положении между этими концевыми положениями, либо находясь индивидуально среди остатков в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Предпочтительно положения остатков, которые являются неидентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не относят к совместимым при определении идентичности последовательностей.
Определение «гомологии последовательностей» в контексте настоящего описания относится к методу определения сходства двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей две или большее количество последовательностей подвергают оптимальному выравниванию и при необходимости интродупируют бреши. В отличие от оценки идентичности последовательностей при определении гомологии последовательностей консервативные аминокислотные замены считают удовлетворяющими условиям гомологии. Другими словами, для того, чтобы полипептид или полинуклеотид имел 95%-ную гомологию последовательности с референс-последовательностью, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в референс-последовательности должны соответствовать или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или количество аминокислот или нуклеотидов, составляющее вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены, в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность содержит по меньшей мере участок, состоящий из 50, еще более предпочтительно из 100, еще более предпочтительно из 250, еще более предпочтительно из 500 нуклеотидов.
Понятие «консервативная замена» относится к замене аминокислотного остатка или нуклеотида на другой аминокислотный остаток или нуклеотид, имеющий сходные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.д., в результате чего общая функциональность не изменяется существенно.
Понятие «выделенный» означает «измененный человеком» относительно его встречающегося в естественных условиях состояния, т.е., если он встречается в природе, то его изменяют или удаляют из естественного окружения, или осуществляют и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, встречающийся в естественных условиях в живом организме, не является «выделенным», но этот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от материала, вместе с которым он присутствует в своем естественном состоянии, является «выделенным» согласно применяемому в описании понятию.
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, способ повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, способ снижения выделения вируса из носа, способ снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, способ снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, в каждом случае заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве белок ОРС-2 PCV2 животному, которое нуждается в таком введении, где белок ОРС-2 PCV2 представляет собой любой из указанных выше белков. Предпочтительно белок ОРС-2 PCV2 представляет собой:
I) полипептид, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 в WO 06/07065;
II) любой полипептид, который по меньшей мере на 80% гомологичен полипептиду, указанному в I);
III) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, указанных в I) и/или II);
IV) иммуногенный фрагмент, указанный в III), который содержит по меньшей мере 5, предпочтительно 8, еще более предпочтительно 10 смежных аминокислот, входящих в последовательности, представленные в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 в WO 06/072065;
V) полипептид, который кодируется ДНК, содержащей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 в WO 06/072065;
VI) любой полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который по меньшей мере на 80% гомологичен полинуклеотиду, указанному в V);
VII) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, которые кодируются полинуклеотидом, указанным в V) и/или VI);
VIII) иммуногенный фрагмент, указанный в VII), где полинуклеотид, кодирующий иммуногенный фрагмент, содержит по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов, входящих в последовательности, которые представлены в SEQ ID N0: 3 или SEQ ID NO: 4 в WO 06/072065.
Предпочтительно любой из указанных иммуногенных фрагментов имеет иммуногенные характеристики белка ОРС-2 PCV2, кодируемого последовательностями, которые представлены в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 в WO 06/07065.
Таким образом, согласно следующему объекту изобретения белок ОРС-2 PCV2 содержится в иммуногенной композиции с таким уровнем включения антигена, который является эффективным для лечения животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции. Предпочтительно уровень включения белка ОРС-2 PCV2 соответствует по меньшей мере 0,2 мкг антигена/мл конечной иммуногенной композиции (мкг/мл), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/мл и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/мл.
Согласно еще одному объекту изобретения уровень включения антигена ОРС-2 PCV составляет по меньшей мере 0,2 мкг белка ОРС-2 PCV2, описанного выше, на дозу конечной антигенной композиции (мкг/дозу), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/дозу и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/дозу.
Полипептид ОРС-2 PCV2, применяемый в иммуногенной композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, можно получать любым методом, включая выделение и очистку ОРС-2 PCV2, стандартный метод синтеза белков и метод рекомбинантной ДНК. Предпочтительные методы получения полипептида ОРС-2 PCV2 представлены в WO 06/072065, сущность и содержание которой полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. В целом, метод состоит в следующем: заражают чувствительные клетки рекомбинантным вирусным вектором, который содержит кодирующие последовательности ДНК ОРС-2 PCV2, экспрессируют полипептид ОРС-2 PCV2 с помощью рекомбинантного вируса и выделяют экспрессируемый полипептид ОРС-2 PCV2 из супернатанта путем фильтрации, и инактивируют общепринятым методом, предпочтительно используя бинарный этиленимин (БЭИ), который затем нейтрализуют для прекращения процесса инактивации.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой белок ОРС-2 PCV2, описанный выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, и II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса. Кроме того, иммуногенная композиция может содержать I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей часть вирусного вектора, экспрессирующего белок ОРС-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и III) часть супернатанта клеточной культуры.
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, способ повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, способ снижения выделения вируса из носа, способ снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, способ снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, в каждом случае заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве белок ОРС-2 PCV2 животному, которое нуждается в таком введении, где антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный ОРС-2 PCV2, предпочтительно экспрессируемый в бакуловирусе ОРС-2 PCV2. Предпочтительно рекомбинантные или экспрессируемые в бакуловирусе ОРС-2 PCV2 имеют указанную выше последовательность.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и III) часть клеточной культуры; где примерно 90% компонентов имеют размер менее 1 мкм.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм. Предпочтительно БЭИ присутствует в концентрациях, эффективных для инактивации бакуловируса, предпочтительно от 2 до примерно 8 мМ БЭИ, предпочтительно примерно 5 мМ БЭИ.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, и V) нейтрализующий агент, предназначенный для прекращения инактивации, опосредуемой инактивирующим агентом, где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм. Предпочтительно, если инактивирующий агент представляет собой БЭИ, то указанная композиция содержит тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ.
Полипептид включают в композицию, которую можно вводить животному, чувствительному к вызываемой PCV2 инфекции. В предпочтительных вариантах в композицию можно включать дополнительные компоненты, известные специалистам в данной области (см. также Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., изд-во Mack Publ., Easton, 1990). Кроме того, в состав композиции могут входить один или несколько приемлемых для применения в ветеринарии носителей. В контексте настоящего описания понятие «приемлемый для применения в ветеринарии носитель» включает, но, не ограничиваясь только ими, любые из перечисленных или все растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, адъюванты, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты для придания изотоничности, замедляющие адсорбцию агенты и т.п. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция содержит белок ОРС-2 PCV2, описанный выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, которые смешивают с адъювантом, предпочтительно карбополом, и физиологическим раствором.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что композиция, которую применяют согласно изобретению, может включать известные пригодные для инъекции физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к применению раствора для парентеральной инъекции или инфузии широко используют водные изотонические растворы, такие, например, как физиологический раствор или соответствующие растворы белков плазмы. Кроме того, иммуногенные композиции и вакцины, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать разбавители, агенты для придания изотоничности, стабилизаторы или адъюванты. Разбавители могут представлять собой воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Агенты для придания изотоничности могут представлять собой среди прочего хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы представляют собой среди прочего альбумин и соли щелочных металлов и этилендиаминтетрауксусной кислоты.
Понятие «адъюванты» в контексте настоящего описания может относиться к гидроксиду алюминия и фосфату алюминия, сапонинам, таким, например, как Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кембридж, шт.Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт.Алабама), эмульсии вода-в-масле, эмульсии масло-в-воде, эмульсии вода-в-масле-в-воде. Основой эмульсии может являться, в частности, легкое жидкое парафиновое масло (соответствующее Европейской фармакопеи); изопреноидное масло, такое как сквалан или сквален; масло, образовавшееся в результате олигомеризации алкенов, прежде всего изобутена или децена; эфиры кислот или спиртов, содержащие линейную алкильную группу, более конкретно растительные масла, этилолеат, ди(каприлат/капрат) пропиленгликоля, три(каприлат/капрат) глицерина или диолеат пропиленгликоля; эфиры разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, эфиры изостеариновой кислоты. Масла применяют в сочетании с эмульгаторами для получения эмульсии. Эмульгаторы предпочтительно представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества, прежде всего сложные эфиры сорбитана, маннида (например, безводный маннитолеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолеиновой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности продукты типа Pluronic, прежде всего L121 (см. Hunter и др., The Theory and Practical Application of Adjuvants, под ред. Stewart-Tull D.E.S., изд-во John Wiley and Sons, NY, cc.51-94, 1995 и Todd и др., Vaccine 15, 1997, cc. 564-570).
Например, можно применять SPT-эмульсию, описанную на с.147 в: «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach», под ред. M. Powell и М. Newman, изд-во Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на с.183 в этой же публикации.
Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Предпочтительными адъювантами являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, прежде всего, сшитые с простыми полиалкениловыми эфирами сахаров или многоатомными спиртами. Эти соединения известны под названием карбомеры (Phameuropa, т.8, №2 июня 1996 г.). Специалистам в данной области в качестве ссылки можно предложить US 2909462, в котором описаны указанные акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, которое имеет по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода по меньшей мере трех гидроксильных групп замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, которые имеют по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными являются радикалы, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винильные, аллильные и другие ненасыщенные группы ряда этилена. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Наиболее предпочтительными являются продукты, поступающие в продажу под названием карбопол (фирма BF Goodrich, шт.Огайо). Их сшивают с аллилсахарозой или аллилпентаэритритолом. Среди них прежде всего следует упомянуть карбопол 974Р, 934Р и 971P. Наиболее предпочтительным для применения является карбопол 971Р. Наиболее предпочтительно применяют карбопол, в частности можно применять карбопол 971Р, предпочтительно в количествах от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу и наиболее предпочтительно в количестве примерно 1 мг на дозу.
Другими пригодными адъювантами являются, но, не ограничиваясь только ими, система RIBI-адъювантов (фирма Ribi Inc.), блок-сополимеры (фирма CytRx, Атланта, шт.Джорджия), SAF-M (фирма Chiron, Эмеривилле, шт.Калифорния), монофосфорил-липид А, адъювант на основе амина липида авридина, термолабильный энтеротоксин Е. coil (рекомбинантный или нерекомбинантный), токсин холеры, IMS 1314 или мурамил-дипептид.
Предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.
Кроме того, композиция может включать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. В контексте настоящего описания понятие «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой из перечисленных или все растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты для придания изотоничности, замедляющие адсорбцию агенты и т.п. Наиболее предпочтительно композиция, предлагаемая в изобретении, содержит белок ОРС-2 PCV2, выделенный из супернатанта культивируемых in vitro клеток, где указанные клетки инфицируют рекомбинантным вирусным вектором, который содержит ДНК ОРС-2 PCV2 и экспрессирует белок ОРС-2 PCV2, и где указанную клеточную культуру обрабатывают от примерно 2 до примерно 8 мМ БЭИ, предпочтительно примерно 5 мМ БЭИ, для инактивации вирусного вектора и нейтрализующим агентом, взятым в эквивалентной концентрации, предпочтительно раствором тиосульфата натрия в конечной концентрации от примерно 2 до примерно 8 мМ, предпочтительно примерно 5 мМ.
Настоящее изобретение относится также к применению иммуногенной композиции для повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, снижения выделения вируса из носа, снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, где иммуногенная композиция содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, и V) нейтрализующий агент, предназначенный для прекращения инактивации, опосредуемой инактивирующим агентом, предпочтительно тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ; и VI) приемлемый адъювант, предпочтительно карбопол 971 в указанных выше количествах; где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм.
Согласно еще одному объекту изобретения указанная иммуногенная композиция содержит также фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно фосфат, в физиологически приемлемых концентрациях. Предпочтительно значение рН указанной иммуногенной композиции доводят до физиологического значения рН, т.е. примерно до уровня от 6,5 до 7,5.
В контексте настоящего описания иммуногенная композиция представляет собой также композицию, которая содержит в одном мл: I) по меньшей мере 1,6 мкг белка ОРС-2 PCV2, описанного выше, II) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) примерно от 2 до 8 мМ БЭИ, V) тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ, и VI) примерно 1 мг карбопола 971, и VII) фосфат в физиологически приемлемой концентрации; где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм, и значение рН указанной иммуногенной композиции доведено примерно до 6,5-7,5.
Иммуногенные композиции могут содержать также один или несколько других иммуномодулирующих агентов, таких, например, как интерлейкины, интерфероны или другие цитокины. Иммуногенные композиции могут содержать также гентамицин и мертиолат. Хотя специалист в данной области легко может определять количества и концентрации адъювантов и добавок, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, в настоящем изобретении предложены композиции, содержащие от примерно 50 до примерно 2000 мкг адъюванта и предпочтительно примерно 250 мкг/мл дозы композиции вакцины. Так, иммуногенная композиция, предлагаемая в изобретении, представляет собой также композицию, которая содержит от примерно 1 до примерно 60 мкг/мл антибиотиков и более предпочтительно менее примерно 30 мкг/мл антибиотиков.
В контексте настоящего описания иммуногенная композиция представляет собой также композицию, которая содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, и V) нейтрализующий агент, предназначенный для прекращения инактивации, опосредуемой инактивирующим агентом, предпочтительно тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ; VI) приемлемый адъювант, предпочтительно карбопол 971 в указанных выше количествах; VII) соляной буфер в фармацевтически приемлемой концентрации, предпочтительно фосфтат, и VIII) противомикробное действующее вещество; где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к Ingelvac® CircoFLEX™ (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, Сант-Хосе, шт.Миссури, США), CircoVac® (фирма Merial SAS, Лион, Франция), CircoVent (фирма Intervet Inc., Моллсборо, шт.Делавэр, США) или Suvaxyn PCV-2 One Dose® (фирма Fort Dodge Animal Health, Канзас-Сити, шт.Канзас, США). Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, способ повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, способ снижения выделения вируса из носа, способ снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, способ снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, в каждом случае заключающийся в том, что вводят в эффективном количестве антиген PCV2 животному, которое нуждается в таком введении, где иммуногенная композиция, содержащая антиген PCV2, представляет собой Ingelvac® CircoFLEX™, CircoVac®, CircoVent и/или Suvaxyn PCV-2 One Dose®, предпочтительно Ingelvac® CircoFLEX™.
Понятие «эффективное количество антигена PCV2» в контексте настоящего описания означает, но, не ограничиваясь только указанным, количество антигена, которое вызывает или может вызывать иммунный ответ у животного, которому вводят антиген PCV2 в эффективной дозе.
Эффективное количество зависит от ингредиентов вакцины и схемы введения. Как правило, когда в комбинированной вакцине применяют препарат инактивированного вируса или модифицированного живого вируса, то вакцину применяют в количестве, составляющем от примерно 102,0 до примерно 109,0 TCID50 на дозу, предпочтительно от примерно 103,0 до примерно 108,0 ТСID50 на дозу, более предпочтительно от примерно 104,0 до примерно 108,0 TCID50 на дозу. В частности, когда в вакцинах применяют модифицированный живой PCV2, то рекомендованная доза, предназначенная для введения чувствительному животному, составляет предпочтительно от примерно 103,0 TCID50 (средняя цитопатогенная доза, инфицирующая 50% клеток) /дозу до примерно 106,0 ТСID50/дозу и более предпочтительно от примерно 104,0 ТСID50/дозу до примерно 105,0 ТСID50/дозу. В целом, количество антигена должно составлять от примерно 0,2 до 5000 мкг и от 102,0 до 109,0 TCID50, предпочтительно от 103,0 до 106,0 TCID50, более предпочтительно от 104,0 до 105,0 TCID50, при применении очищенного антигена.
Субъединичные вакцины, как правило, вводят с уровнем включения антигена, составляющим по меньшей мере 0,2 мкг антигена на дозу, предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 16 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу.
Установлено, что полученный от матери иммунитет обеспечивает определенную степень защиты от вызываемой PCV2 инфекции и клинических заболеваний, связанных с вызываемой PCV2 инфекцией. Установлено, что указанная защита зависит от титра антител: как правило, более высокие титры обеспечивают защитное действие, а при более низких титрах оно отсутствует (McKeown и др., Clin. Diagn. Lab. Immunol, 12, 2005, сс.1347-1351). Установлено, что среднее время полужизни антител у животных-отъемышей составляет 19,0 дней, и окно распада связанных с пассивной иммунизацией антител к PCV2 в популяции является относительно широким (Opriessnig и др., J. Swine Health Prod. 12, 2004, сс.186-191). Присутствие полученных от матери антител не только может обеспечивать определенную степень защиты от вирусной инфекции, что однако является непрогнозируемым, но так же, как известно, влияет на эффективность иммунизации. При создании изобретения неожиданно было установлено, что присутствие антител к PCV, в частности титров антител к PCV2 вплоть до 1:1000, не оказывает влияния на эффективность лечения PCV2.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, способ повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, способ снижения выделения вируса из носа, способ снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, способ снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, в каждом случае заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении, где животное в момент вакцинации имеет антитела к PCV2, предпочтительно животное в момент вакцинации имеет выявляемый титр антитела к PCV2, составляющий вплоть до 1:100, предпочтительно превышающий 1:100, еще более предпочтительно превышающий 1:250, еще более предпочтительно превышающий 1:500, еще более предпочтительно превышающий 1:640; еще более предпочтительно превышающий 1:750, наиболее предпочтительно превышающий 1:1000. Предпочтительно указанный титр антител к PCV2 можно определять и оценивать количественно с помощью специфического иммунного анализа антител к PCV2, предпочтительно анализа, описанного в примере 2.
Методы выявления и количественной оценки антител к PCV2 хорошо известны в данной области. Например, выявление и количественную оценку антител к PCV2 можно осуществлять с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции, описанного у Magar и др., Can. J. Vet Res.; 64, 2000, сс.184-186 или у Magar и др., J. Соmр. Pathol.; 123, 2000, сс.258-269. Другие методы количественной оценки антител к PCV2 описаны у Opriessnig и др., 37th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians (37-й Ежегодный съезд американской ассоциации по ветеринарии свиней), 2006 г.). Кроме того, в примере 2 описан также непрямой иммунофлуоресцентный анализ, который может применять специалист в данной области. В случае спорных результатов и при любых сомнениях следует иметь в виду, что указанные в настоящем описании титры антител к PCV2 относятся к титрам, которые установлены/могут быть установлены с помощью анализа, описанного в примере 2.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, способ повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, способ снижения выделения вируса из носа, способ снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, способ снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, в каждом случае заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, молодому животному, которое нуждается в таком введении.
Понятие «молодое животное» в контексте настоящего описания относится к животному возрастом от 1 до 22 дней. Предпочтительно под понятием молодое животное подразумевают животное возрастом от 1 до 20 дней. Более предпочтительно под понятием «молодое животное» подразумевают животное возрастом от 1 до 15 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 дня до 14 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 12 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 10 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 8 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 7 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 6 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 5 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 4 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 3 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 2 дней, наиболее предпочтительно животное возрастом 1 день.
Из-за повсеместного распространения PCV2 в полевых условиях большая часть молодых поросят являются серопозитивными в отношении PCV2. Таким образом, согласно еще одному объекту изобретения молодые животные в день вакцинации/обработки имеют выявляемый титр антител к PCV2 на уровне вплоть до 1:100, предпочтительно превышающий 1:100, еще более предпочтительно превышающий 1:250, еще более предпочтительно превышающий 1:500, еще более предпочтительно 1:640, еще более предпочтительно превышающий 1:750, наиболее предпочтительно превышающий 1:1000, в день вакцинации/обработки.
Композицию, предлагаемую в изобретении, можно вводить внутрикожно, внутритрахеально или внутривлагалищно. Предпочтительно композицию следует вводить внутримышечно или интраназально, наиболее предпочтительно внутримышечно. Может оказаться предпочтительным вводить описанные выше фармацевтические композиции в организм животного внутривенно или путем инъекции непосредственно в ткани-мишени. Для системного введения предпочтительными являются внутривенный, внутрисосудистый, внутримышечный, интраназальный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, оральный или внутриоболочечный пути введения. Более локальное введение можно осуществлять подкожно, интрадермально, внутрикожно, внутрисердечно, внутридольково, интрамедуллярно, внутрилегочно или непосредственно в ткань, подлежащую обработке, или в близлежащую область (соединительная, костная, мышечная, нервная, эпителиальная ткань). В зависимости от требуемой продолжительности и эффективности лечения композиции, предлагаемые в изобретении, можно вводить один или несколько раз, а также периодически, например, с интервалом в один день в течение нескольких дней, недель или месяцев и с использованием различных доз.
Предпочтительно по меньшей мере одну дозу описанной выше иммуногенной композиции вводят внутримышечно субъекту, нуждающемуся в этом. Еще одним объектом изобретения является антиген PCV2 или иммуногенная композиция, содержащая любой описанный выше антиген PCV2, которую фасуют в пузырьки и вводят из расчета от одного (1) мл до пяти (5) мл на дозу, предпочтительно 1 мл на дозу. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является иммуногенная композиция объемом от 1 до мл, предпочтительно 1 мл, которая содержит описанный выше антиген PCV-2, предназначенная для профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции у животного или группы животных (стада), повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, снижения выделения вируса из носа, снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, при этом в каждом случае вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении. Настоящее изобретение относится также к способу профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции у животного или группы животных (стада), способу повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способу снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, способу снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, способу снижения выделения вируса из носа, способу снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способу снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, способу снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, в каждом случае заключающемуся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве, составляющем 1-5 мл, предпочтительно 1 мл антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком введении.
Согласно еще одному объекту изобретения осуществляют по меньшей мере одно дополнительное введение по меньшей мере одной дозы иммуногенной композиции, описанной выше, животному, которое нуждается в этом, где второе или любое дополнительное введение осуществляют по меньшей мере через 14 дней после первого или любого другого предыдущего введения. Предпочтительно иммуногенную композицию вводят в сочетании с агентом, стимулирующим иммунитет. Предпочтительно указанный агент, стимулирующий иммунитет, вводят по меньшей мере дважды. Предпочтительно между первым и вторым или любым следующим введением агента, стимулирующего иммунитет, должно пройти по меньшей мере 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 5 дней, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 дней. Предпочтительно агент, стимулирующий иммунитет, вводят по меньшей мере через 10 дней, предпочтительно 15 дней, еще более предпочтительно 20 дней, еще более предпочтительно по меньшей мере 22 дня, после первоначального введения иммуногенной композиции, предлагаемой в изобретении. Предпочтительным агентом, стимулирующим иммунитет, является, например, гемоцианин лимфы улитки (KLH), предпочтительно эмульгированный с помощью неполного адъюванта Фрейнда (KLH/ICFA). Однако, как должно быть очевидно, можно применять любой другой агент, стимулирующий иммунитет, известный специалисту в данной области. Понятие «агент, стимулирующий иммунитет» в контексте настоящего описания относится к любому агенту или композиции, который/которая может «запускать» иммунный ответ, предпочтительно без инициации или повышения специфического иммунного ответа, например, иммунного ответа на специфический патоген. Кроме того, принято вводить агент, стимулирующий иммунитет, в приемлемой дозе.
Настоящее изобретение относится также к применению антигена PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для профилактики и лечения хронической вызываемой PCV2 инфекции у животного или группы животных (стада), с целью повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 10 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, снижения выделения вируса из носа и снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде. Предпочтительно антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный антиген, предпочтительно ОРС-2 PCV2, еще более предпочтительно Ingelvac® CircoFLEX™.
Понятие «животное» в контексте настоящего описания включает свинью, молодую (не достигшую половой зрелости) свинью или поросенка.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции у молодых свиней, способ повышения среднего прироста массы у животного или группы животных (стадо) с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, составляющим от 104 до 106 геномных копий на мл сыворотки, способ снижения количества животных с уровнем вирусной нагрузки, превышающим 106 геномных копий на мл сыворотки, в субклинически инфицированном стаде, способ снижения выделения вируса из носа, способ снижения продолжительности виремии у животных с субклинической формой вызываемой PCV2 инфекции, способ снижения коэффициента заболеваемости в субклинически инфицированном стаде, способ снижения коэффициента смертности в субклинически инфицированном стаде, в каждом случае заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, молодым свиньям, которые нуждаются в таком введении. Предпочтительно антиген PCV2 или иммуногенная композиция, содержащая антиген PCV2, представляют собой любой/любую из перечисленных выше, наиболее предпочтительно антиген PCV2 представляет собой Ingelvac® CircoFLEX.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Ниже в примерах представлены предпочтительные материалы и процедуры, применяемые в настоящем изобретении. Хотя при воплощении на практике и проверке настоящего изобретения можно применять любые методы и материалы, аналогичные или эквивалентные представленным в настоящем описании, ниже описаны предпочтительные методы, устройства и материалы. Однако следует понимать, что эти примеры даны только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение общего объема изобретения.
Пример 1
Получение антигена ОРС-2 PCV2
Начальные культуры клеток линии SF+, взятые из хранящейся в жидком азоте культуры, выращивали в среде Excell 420 (фирма JRH Biosciences, Inc., Ленекса, шт.Канзас) в суспензии в стерильных вращающихся колбах при постоянном перемешивании. Культуры выращивали во вращающихся колбах объемом от 100 до 250 мл, содержащих от 25 до 150 мл бессывороточной среды Excell 420. Когда клетки размножались до клеточной плотности 1,0-8,0×106 клеток/мл, их разделяли, перенося в новые сосуды, используя плотность посева 0,5-1,5×10 клеток/мл. Следующие размножающиеся культуры выращивали во вращающихся колбах объемом вплоть до 36 л или биореакторах из нержавеющей стали объемом вплоть до 300 л в течение 2-7 дней при 25-29ºС.
После посева колбы инкубировали при 27ºС в течение 4 ч. Затем в каждую колбу вносили рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ОРС-2 PCV2 (SEQ ID NO: 4). Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ОРС-2 PCV2, создавали согласно методу, описанному в WO 06/072065. После внесения бакуловируса колбы инкубировали при 27±2ºС в течение 7 дней и перемешивали при 100 об/мин в течение этого времени. Колбы закрывали вентилируемыми крышками, пропускающими воздушный поток. После инкубации полученный супернатант собирали, фильтровали для удаления клеточного дебриса и инактивировали. Для инактивации супернатанта его температуру доводили до 37±2ºС и к супернатанту добавляли бинарный этиленимин (БЭИ) до конечной концентрации 5 мМ. Последующее перемешивание образца продолжали в течение 72-96 ч. Добавляли 1,0 М раствор тиосульфата натрия до конечной минимальной концентрации 5 мМ для нейтрализации любых остаточных количеств БЭИ. После инактивации ОРС-2 PCV2 забуферивали фосфатным буфером и добавляли карбопол до достижения концентрации примерно 0,5-2,5 мг/дозу. Конечная доза содержала примерно 16 мкг антигена ОРС-2 PCV2.
Пример 2
Иммуноанализ антител к PCV-2
Клетки линии РК15 (например, АТСС CCL-33) или VIDO R1, описанные в WO 02/07721, высевали в 96-луночный планшет (примерно 20000-60000 клеток на лунку). Клетки заражали изолятом PCV2, когда конфлюэнтность монослоев достигала примерно 65-85%. Зараженные клетки инкубировали в течение 48 ч. Среду удаляли и лунки отмывали дважды ЗФР. Буфер для отмывки отбрасывали и клетки обрабатывали холодным фиксатором, представляющим собой смесь 50/50 метанол/ацетон (~100 мкл/лунку) в течение примерно 15 мин при температуре примерно -20ºС. Фиксатор отбрасывали и планшеты сушили на воздухе. Готовили серийные разведения свиной сыворотки в ЗФР, добавляли в планшеты и инкубировали, давая антителам, если они присутствовали в образцах сыворотки, связываться, в течение примерно 1 ч при 36,5±1ºС. Кроме того, параллельно оценивали серийные разведения, положительные в отношении антител к PCV2, и отрицательные контрольные образцы (образцы, представляющие собой положительный контроль и отрицательный контроль).
Затем планшеты отмывали трижды ЗФР. ЗФР отбрасывали. Затем планшеты окрашивали поступающим в продажу козьим антисвиным антителом, конъюгированным с ФИТЦ, разведенным в соотношении 1:100 в ЗФР, и инкубировали в течение примерно 1 ч при 36,5±1ºС, что давало возможность выявлять антитела, связанные с зараженными клетками. После завершения инкубации микропланшеты изымали из инкубатора, конъюгат отбрасывали и планшеты отмывали дважды ЗФР. Планшеты оценивали с помощью УФ-микроскопа и индивидуальные лунки обозначали как позитивные или негативные. Для оценки тест-системы использовали образцы, представляющие собой положительный контроль и отрицательный контроль. Если результаты, полученные для контролей, находились в ожидаемых пределах, то результаты опыта принимались как приемлемые с позиций метода оценки параметров. Титры сывороточных антител рассчитывали на основе наибольшего разведения, при котором наблюдалась специфическая IFA реактивность(метод непрямой иммунофлуоресценции), и определяли количество позитивных лунок для каждого разведения, или рассчитывали конечное значение ТСID50 с помощью соответствующей формулы Рида-Менча.
Пример 3
Эффективность ОРС-2 PCV2 ORF-2 fingelvac® CircoFLEX™ в отношении лечения хронической вызываемой PCV2 инфекции
Задача и план эксперимента
В этом эксперименте использовали обычных молодых свиней, принадлежащих к пяти последовательным возрастным группам, отличающимся друг от друга по возрасту на одну неделю, каждая из которых включала примерно 300 животных. Животных поровну разделяли с учетом начальной массы тела и принадлежности к определенному приплоду на две обрабатываемые группы. В день отъема одну группу (n=775) вакцинировали с помощью Ingelvac® CircoFLEX, содержащей минимальное количество высвобождающегося антигена, а другой группе поросят
(n=773) вводили контрольный продукт (физиологический раствор). Вакцину и контрольный продукт (СР) вводили в виде одной дозы объемом 1 мл внутримышечно в правую шейную область поросят возрастом примерно 21 день.
Получали данные о живой массе всех подопытных животных индивидуально. Осуществляли клинические обследования в отношении ассоциированных с PCV2 симптомов и фиксировали для каждого животного отклонения от нормального общего состояния здоровья.
Образцы сыворотки и выделения из носа анализировали количественно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в отношении присутствия PCV2. Кроме того, титры антител к PCV2 у всех подопытных животных в момент вакцинации и у 5% этих же предварительно отобранных подопытных животных анализировали титрованием методом непрямой иммунофлуоресценции (IFAT), описанным в примере 2.
Подтверждение хронического (субклиническая форма) статуса в месте проведения эксперимента:
Впервые PCVD диагностирован на ферме за 4 месяца до осуществления эксперимента. Коэффициент смертности составлял 14,1% и идентифицировано присутствие «малорослых» животных в откормочном хозяйстве. Показатель роста оказался относительно невысоким (644 г/д). Присутствие вызываемых PCV2 инфекций подтверждено гистологической оценкой. В образце легкого выявлена интерстициальная пневмония и в повреждениях с помощью ИГХ (иммуногистохимии) обнаружен PCV2.
Как видно из фиг.1, коэффициент смертности в процессе откорма существенно снижался с 14,1% до 8,1%, что позволяет предположить переход острой вызываемой PCVD инфекции в субклиническую форму инфекции.
Подтверждение субклинической формы инфекции у подопытных животных
Результаты, полученные в процессе эксперимента, подтверждали переход в субклиническую форму инфекции на ферме. Для подопытных животных были характерны доминирующая субклиническая форма вирусной нагрузки, невысокий коэффициент смертности (ниже 10%) и невысокий коэффициент заболеваемости (ниже 10%).
Результаты
Виремия
Наибольшее относительное количество животных, у которых выявлена виремия, обнаружено на неделе 14 эксперимента, при этом 55,5% животных с выявленной виремией обнаружено в группе, обработанной СР, и примерно 10% животных с выявленной виремией обнаружено в вакцинированной группе. Как видно из фиг.4 и 5, большинство животных в обеих обрабатываемых группах имели лишь субклиническую форму вирусной нагрузки (что соответствует 10-106 геномных эквивалентов на мл). Наибольшее относительное количество животных с соответствующей клинической форме нагрузкой PCV2 (>10 геномных эквивалентов на мл) составляло 2,52% для обработанных СР животных и 0,87% для вакцинированных животных.
Смертность
Коэффициент смертности до и после начала виремии был относительно невысоким. До начала виремии коэффициент смертности составлял 1,55% в группе вакцинированных животных и 2,19% в группе обработанных СР животных. После начала виремии обнаружено повышение коэффициента смертности в группе обработанных СР животных (с 1,55% до 3,02%), в то время как коэффициент смертности в группе вакцинированных животных несколько понизился по сравнением с моментом времени до начала виремии (с 2,19% до 1,98%). Различия коэффициента смертности между двумя обрабатываемыми группами до и после начала виремии не достигали статистически значимого уровня.
Клинические симптомы
До начала виремии лишь несколько клинических симптомов выявлено в обеих обрабатываемых группах, частота встречаемости которых составляла менее 1% для каждого из анализируемых параметров. Началу виремии сопутствовало одновременное заражение PRRSV и Mycoplasma hyopneumoniae. Однако ни PCV2, ни другие коинфицирующие патогены не вызывали серьезных клинических симптомов. Так, относительное количество животных с респираторными симптомами, такими как кашель и/или одышка, составляло лишь 3,9% и 0,7% в обработанной СР группе и 3,0% и 0,4% в вакцинированной группе. Частота встречаемости других клинических признаков составляла во всех случаях менее 1% и не обнаружено различий между обрабатываемыми группами.
Частота встречаемости «малорослых» животных
Никакой существенной разницы не обнаружено в частоте встречаемости «малорослых» животных между вакцинированной и обработанной плацебо группами в любой из соответствующих моментов времени проведения взвешивания. В целом, после начала РСУ2-виремии частота встречаемости «малорослых» животных, как правило, была низкой в обеих обрабатываемых группах (3,3-4,7%).
Таблица 1: Сравнение частоты встречаемости «малорослых» животных (объединенные данные для всех трех возрастных групп, отличающихся на неделю)
  До начала виремии После начала виремии
Неделя эксперимента 0 7 12 17 22
СР 11,51% 11,94% 5,68% 4,72% 4,53%
IVP 10,84% 10,46% 4,78% 3,36% 3,27%
Р 0,6874 0.3728 0,4884 0,1898 0,2259
Р: р-значение согласно t-критерию для сравнения между группами; р>0,05 - несущественно
Воздействие субклинической формы инфекции на показатели роста
Прирост массы тела до недели 17 эксперимента был на 2,36 кг выше и до недели 19 эксперимента на 2,39 кг выше в вакцинированной группе по сравнению с обработанной СР группе. Как видно из фиг.3, различие массы тела начинало слегка увеличиваться к моменту началу виремии (неделя 12 эксперимента). На неделе 17 эксперимента различие достигало уже 2,36 кг. В результате большего прироста массы средняя продолжительность времени от отъема до убоя оказалась на 1,9 дня короче для вакцинированных животных по сравнению с обработанными СР животными.
Таблица 2: Сравнение прироста массы и среднего суточного прироста массы (ADWG) (объединенные данные для всех пяти возрастных групп, отличающихся на неделю)
  Неделя эксперимента Обработанная СР группа (среднеквадратичное значение) Вакцинированная группа (среднеквадратичное значение) Разница (IVP минус СР) Значение р1)
Прирост массы 0-7 20,63 кг 20,71 кг 0,08 кг 0,7166 ns
         
0-17 76,73 кг 79,09 кг 2,36 кг <0,0001 ***
0-19 86,75 кг 89,14 кг 2,39 кг <0,0001 ***
         
12-17 29,05 кг 30,73 кг 1,68 кг <0,0001***
         
7-19 66,07 кг 68,38 кг 2,31 кг <0,0001 ***
1) р-значение согласно t-критерию для сравнения между группам, ns: несущественно; *: существенно, р≤0.05; ***: существенно, р<0,001
Продолжительность виремии в крови
При сравнении общего среднего и медианного значения продолжительности виремии в двух обрабатываемых группах существенно более продолжительная (р=0,0003) виремия выявлена у обработанных СР животных. В обработанной IVP группе средняя продолжительность виремии составляла 5,8 дня, а в обработанной СР группе средняя продолжительность составляла 21,8 дня. Это соответствовало снижению продолжительности виремии на 73% в обработанной IVP группе.
Таблица 3: Среднее и медианное значение продолжительности виремии
  Обрабатываемая группа Количество молодых свиней Среднее значение (дни) Медианное значение (дни) Значение p
Всего СР 76 21,8 14,0 0.0003***
IVP 18 5,8 0,0
IVP минус СР -16,0 -14,0
Р: р-значение согласно t-критерию для сравнения между группам, ns: несущественно, р>0,05; *: существенно, р<0,05
Заключение
Эксперимент проводили на ферме, на которой произошел переход острого статуса в хронический, характеризующийся субклинической формой инфекции, незадолго до осуществления эксперимента. Вирусная нагрузка в организме подопытных животных в процессе эксперимента подтверждала это предположение. У очень небольшого количества подопытных животных (<2,19%) вирусная нагрузка в сыворотке превышала «клинический порог», составляющий 106 геномных копий/мл.
Вакцинация обладала эффективностью, приводя к резкому снижению процента инфицированных животных в вакцинированной группе. Таким образом, вакцинация позволяет осуществлять сравнение неинфицированных животных (вакцинированная группа) с инфицированными субклинической формой животными (обработанная плацебо группа). Для вакцинированных животных выявлены улучшенные показатели роста по сравнению с инфицированными субклинической формой животными. На неделе 17 эксперимента различие достигало уже 2,36 кг. У вакцинированных животных оказалась более чем на 16 дней короче продолжительность виремии по сравнению с невакцинированной группой.
Отсюда можно заключить, что хотя инфицированные животные оставались внешне здоровыми, субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции может оказывать отрицательное воздействие на показатели роста.

Claims (24)

1. Способ лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции у индивидуального животного или группы животных, включающий этап введения терапевтически эффективного количества протеина ORF-2 PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей протеин ORF-2 PCV2, животному, которое нуждается в таком введении, при этом субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается уровнем вирусной нагрузки в организме индивидуального животного менее 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки.
2. Способ по п.1, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается тем, что максимум 20% животных в стаде имеет вирусные титры, превышающие 106 геномных копий на мл сыворотки.
3. Способ по п.1, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается тем, что вирус сохраняется в стаде в течение по меньшей мере 6 недель.
4. Способ по п.2, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается отсутствием заболеваемости или невысоким коэффициентом заболеваемости, составляющим менее 25% от РСV2-позитивных животных в стаде.
5. Способ по п.2, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается невысоким коэффициентом смертности, составляющим менее 20% от PCV2-позитивных животных в стаде.
6. Способ уменьшения нарушения роста из-за субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, включающий этап введения терапевтически эффективного количества протеина ORF-2 PCV2 или иммуногенной композиции, содержащую протеин ORF-2 PCV2, животному, которое нуждается в таком введении, при этом субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается уровнем вирусной нагрузки в организме индивидуального животного менее 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки.
7. Способ снижения количества животных с вирусной нагрузкой, превышающей 106 геномных копий на мл сыворотки, в группе животных (стада), инфицированных субклинической формой PCV2, включающий этап введения терапевтически эффективного количества протеина ORF-2 PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей протеин ORF-2 PCV2, животному, которое нуждается в таком введении, при этом субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается уровнем вирусной нагрузки в организме индивидуального животного менее 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки.
8. Способ снижения выделения вируса из носа и/или продолжительности виремии у животных, инфицированных субклинической формой PCV2, включающий этап введения терапевтически эффективного количества протеина ORF-2 PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей протеин ORF-2 PCV2, животному, которое нуждается в таком введении, при этом субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается уровнем вирусной нагрузки в организме индивидуального животного менее 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки.
9. Способ по одному из пп.1-8, в котором протеин ORF-2 PCV2 представляет собой полипептид, гомологичный по меньшей мере на 80% ОRF-2 PCV2.
10. Способ по одному из пп.1-8, в котором протеин ORF-2 PCV-2 представляет собой рекомбинантный экспрессируемый бакуловирусом ORF-2 PCV2.
11. Способ по одному из пп.1-8, в котором протеин ORF-2 PCV2 представляет собой Ingelvac® CircoFLEX™.
12. Способ по одному из пп.1-8, в котором животное представляет собой свинью.
13. Применение протеина ORF-2 PCV2 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции у индивидуального животного или группы животных, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается уровнем вирусной нагрузки в организме индивидуального животного менее 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки, а лекарственное средство вводят в терапевтически эффективном количестве животному, которое нуждается в таком введении.
14. Применение по п.13, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается тем, что максимум 20% животных в стаде имеет вирусные титры, превышающие 106 геномных копий на мл сыворотки.
15. Применение по п.13, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается тем, что вирус сохраняется в стаде в течение по меньшей мере 6 недель.
16. Применение по п.13, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается отсутствием заболеваемости или невысоким коэффициентом заболеваемости, составляющим менее 25% от PCV2-позитивных животных в стаде.
17. Применение по п.14, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается невысоким коэффициентом смертности, составляющим менее от 20% PCV2-позитивных животных в стаде.
18. Применение протеина ORF-2 PCV2 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для уменьшения нарушения роста из-за субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается уровнем вирусной нагрузки в организме индивидуального животного менее 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки, а лекарственное средство вводят в терапевтически эффективном количестве животному, которое нуждается в таком введении.
19. Применение протеина ORF-2 PCV2 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для снижения количества животных с вирусной нагрузкой, превышающей 106 геномных копий на мл сыворотки, в группе животных (стада), инфицированных субклинической формой PCV2, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается уровнем вирусной нагрузки в организме индивидуального животного менее 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки, а лекарственное средство вводят в терапевтически эффективном количестве животному, которое нуждается в таком введении.
20. Применение протеина ORF-2 PCV2 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для снижения выделения вируса из носа и/или продолжительности виремии у животных, инфицированных субклинической формой PCV2, в котором субклиническая форма вызываемой PCV2 инфекции отличается уровнем вирусной нагрузки в организме индивидуального животного менее 106 геномных копий PCV2 на мл сыворотки, а лекарственное средство вводят в терапевтически эффективном количестве животному, которое нуждается в таком введении.
21. Применение по одному из пп.13-20, в котором протеин ORF-2 PCV2 представляет собой полипептид, гомологичный по меньшей мере на 80% ОРС-2 PCV2.
22. Применение по одному из пп.13-20, в котором протеин ORF-2 PCV-2 представляет собой рекомбинантный экспрессируемый бакуловирусом ОРС-2 PCV2.
23. Применение по одному из пп.13-20, в котором протеин ORF-2 PCV2 представляет собой Ingelvac® CircoFLEX™.
24. Применение по одному из пп.13-20, в котором животное представляет собой свинью.
RU2009134222/15A 2007-02-13 2008-02-11 Предупреждение и лечение субклинической формы болезней, вызываемых цирковирусом свиней (pcvd) RU2520759C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20070102250 EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2007-02-13 Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
EP07102250.3 2007-02-13
PCT/EP2008/051628 WO2008098909A1 (en) 2007-02-13 2008-02-11 Prevention and treatment of sub-clinical pcvd

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2009134222A RU2009134222A (ru) 2011-03-20
RU2520759C2 true RU2520759C2 (ru) 2014-06-27

Family

ID=38191300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009134222/15A RU2520759C2 (ru) 2007-02-13 2008-02-11 Предупреждение и лечение субклинической формы болезней, вызываемых цирковирусом свиней (pcvd)

Country Status (23)

Country Link
US (5) US7943298B2 (ru)
EP (3) EP1958644A1 (ru)
JP (1) JP5562041B2 (ru)
KR (1) KR101521465B1 (ru)
CN (1) CN101610786B (ru)
AR (1) AR065319A1 (ru)
AU (1) AU2008214639B2 (ru)
BR (1) BRPI0807493A2 (ru)
CA (1) CA2676568C (ru)
CL (1) CL2008000445A1 (ru)
CY (1) CY1114577T1 (ru)
DK (2) DK2114447T3 (ru)
ES (2) ES2434117T3 (ru)
MX (1) MX2009008577A (ru)
MY (1) MY152149A (ru)
PL (1) PL2114447T3 (ru)
PT (1) PT2114447E (ru)
RU (1) RU2520759C2 (ru)
SI (1) SI2114447T1 (ru)
TW (1) TWI438003B (ru)
UA (1) UA100507C2 (ru)
WO (1) WO2008098909A1 (ru)
ZA (1) ZA200904806B (ru)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
JP5394750B2 (ja) 2005-12-29 2014-01-22 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド 多価ｐｃｖ２免疫原性組成物及び当該組成物を製造する方法
MX338626B (es) 2005-12-29 2016-04-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Uso de una composicion inmunogenica de pcv2 para producir los sintomas clinicos en cerdos.
EP2099927A4 (en) * 2006-11-22 2010-05-05 Boehringer Ingelheim Vetmed METHODS FOR REDUCING FLAMBEES OF DISEASES ASSOCIATED WITH PORCINIC CIRCOVIRUS
WO2008073464A2 (en) 2006-12-11 2008-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
PL2481420T3 (pl) 2006-12-15 2019-08-30 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Jednodawkowa szczepionka anty-PCV2 dla świń
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
CN101980720A (zh) 2008-01-23 2011-02-23 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法
WO2009103037A1 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
MX2011005231A (es) * 2008-11-19 2011-07-29 Avi Mex S A De C V Lab Vacuna recombinante de vector viral inactivado.
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
JP5902160B2 (ja) * 2010-07-08 2016-04-13 ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレーテッドＵｎｉｔｅｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ デザイナーペプチドベースのｐｃｖ２ワクチン
WO2014182872A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Protatek International, Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
US20140348874A1 (en) * 2013-05-22 2014-11-27 Boehringer Ingelheim Espana, S.A. Method for the reduction of pcv-2 in a herd of swine
ES2778425T3 (es) 2013-10-02 2020-08-10 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Variante de la proteína ORF2 del PCV2 y partículas similares a virus compuestas por esta
DK3076996T3 (en) 2013-12-03 2020-03-09 Intervet Int Bv Vaccine mod porcint circovirus type 2
DK3399040T3 (da) * 2015-12-28 2021-08-30 Agricultural Tech Res Inst Fremgangsmåde til fremstilling af porcine circovirus type 2 capsid-protein og farmaceutisk sammensætning omfattende samme

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
ZA881694B (en) * 1987-03-17 1988-09-06 Akzo N.V. Adjuvant mixture
US5069901A (en) 1988-02-03 1991-12-03 Jones Elaine V Preparation of a recombinant subunit vaccine against pseudorabies infection
DE69027112T2 (de) 1989-01-23 1997-01-09 Auspharm International Ltd 4Th Impfstoffzusammensetzung
US5155037A (en) 1989-08-04 1992-10-13 The Texas A&M University System Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems
US5202430A (en) 1990-01-16 1993-04-13 University Of Tennessee Transmissible gastroenteritis virus genes
ES2112274T5 (es) 1990-05-29 2006-03-01 Wyeth Holdings Corporation Vacuna contra la pneumonia en cerdos y metodo para la preparacion de la misma.
US5565205A (en) 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
GB9023111D0 (en) 1990-10-24 1990-12-05 Wellcome Found Expression system
DK0555366T3 (da) 1990-11-01 2000-08-28 Univ Iowa State Res Found Inc Fremgangsmåde til bakteriel svækkelse og vaccine
US6042830A (en) 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
CA2076744C (en) 1991-08-26 2000-06-27 Danny W. Chladek Viral agent associated with mystery swine disease
US5580557A (en) 1991-10-09 1996-12-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Live, avirulent salmonella choleraesuis vaccine used for inducing an immune response in animals
US5338543A (en) 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
PT1820512E (pt) 1994-05-10 2013-10-09 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacina viva modificada melhorada contra brsv
US5885823A (en) 1995-06-05 1999-03-23 Nobl Laboratories, Inc. Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
AU4231897A (en) 1996-08-16 1998-03-06 Southwest Foundation For Biomedical Research Compositions and methods for delivery of nucleic acids to hepatocytes
DK0835930T3 (da) 1996-10-09 2001-06-18 Akzo Nobel Nv Europæiske vaccinestammer af porcint reproduktions- og respirationssyndrom-virus. (PRRSV)
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US20060029617A1 (en) 1997-10-03 2006-02-09 Charreyre Catherine E Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use
US7211379B2 (en) 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
FR2781159B1 (fr) 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US7192594B2 (en) 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
UA78180C2 (ru) 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кольцевой вирус свиньи, вакцины и диагностические реагенты
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
RU2000118777A (ru) 1997-12-11 2002-07-10 Университи Оф Саскачеван (Ca) Вирус синдрома мультисистемного истощения свиньи у поросят-отъемышей
WO1999045956A1 (en) 1998-03-13 1999-09-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vaccines against circovirus infections
US6294176B1 (en) 1998-07-10 2001-09-25 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species
US6472193B1 (en) 1998-11-19 2002-10-29 Azwell Inc. Recombinant lysophosphatidic acid phosphatase
FR2789695B1 (fr) 1999-02-11 2003-03-07 Merial Sas Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs
US6943152B1 (en) * 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
GB9921146D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB9921147D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
WO2001017556A1 (fr) 1999-09-07 2001-03-15 Shionogi & Co., Ltd. Préparations vaccinales administrables par les muqueuses
US6656478B1 (en) 1999-11-12 2003-12-02 Samuel D. Charles Cross-protective salmonella vaccines
DK1248646T3 (da) 1999-12-21 2008-05-19 Merial Sas Præparater og vacciner indeholdende antigen(er) fra cryptosporidium parvum og fra andet enterisk patogen
JP2004503234A (ja) 2000-06-15 2004-02-05 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション ブタの先天性振せん用ワクチン
US6808900B2 (en) * 2000-06-15 2004-10-26 Manitoba, University Of Cryptosporidium parvum antigens, antibodies thereto and diagnostic and therapeutic compositions thereof
ES2290157T3 (es) 2000-07-20 2008-02-16 Lauras As Uso de inhibidores de cox-2 como inmunoestimulantes en el tratamiento de vih o sida.
US7018638B2 (en) 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
MY129765A (en) 2000-12-19 2007-04-30 Wyeth Corp Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
JP2002247979A (ja) 2001-02-23 2002-09-03 Nippon Biologicals Inc マレック病ワクチンおよびその製造方法
DK1379671T3 (da) 2001-03-27 2009-06-29 Univ Saskatchewan Fremgangsmåder til dyrkning af circovirus
US20030096377A1 (en) * 2001-06-28 2003-05-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2
BR0210804A (pt) * 2001-07-02 2005-05-03 Pfizer Prod Inc Vacinação de dose única com mycoplásma hyopneumoniae
US7361352B2 (en) 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US6841364B2 (en) 2002-01-22 2005-01-11 Protatek International, Inc. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof
US20040121465A1 (en) 2002-02-14 2004-06-24 Novavax, Inc. Optimization of gene sequences of virus-like particles for expression in insect cells
WO2003077860A2 (en) 2002-03-13 2003-09-25 Biophysica, Inc. BOSWELLIN COMPOSITIONS ENHANCED WITH 3-β-ACETYL-11-KETO-β-BOSWELLIC ACID (“AKBA”), INDUSTRIAL MANUFACTURE AND THEIR USES
US20030215455A1 (en) * 2002-05-14 2003-11-20 Bailey Reynolds Vaccine stabilizer and method of use
US7335362B2 (en) 2002-07-19 2008-02-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of treating pre-eclampsia or eclampsia
US7223207B1 (en) 2002-09-13 2007-05-29 Simon Basyuk Exercise and massage device
AU2002951692A0 (en) 2002-09-23 2002-10-17 Vital Biotech (Hong Kong) Limited Improvements in or relating to vaccines
US7408636B2 (en) 2002-10-31 2008-08-05 Chemimage Corporation Method and apparatus for dark field chemical imaging
EP1599164B1 (en) 2003-02-03 2015-04-08 Cerebus Biologicals, Inc. Methods for treating, preventing and detecting helicobacter infection
US7563449B2 (en) 2003-04-21 2009-07-21 Pfizer Inc, Methods for reducing cattle reproductive diseases
CN1458167A (zh) 2003-06-02 2003-11-26 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 截短表达的猪圆环病毒ⅱ型衣壳蛋白抗原及其应用
US7335361B2 (en) * 2003-06-09 2008-02-26 Animal Technology Institute Taiwan Fusion antigen used as vaccine
WO2005009462A2 (en) 2003-07-24 2005-02-03 Merial Limited Vaccine formulations comprising an oil-in-water emulsion
ES2333334T5 (es) * 2003-07-25 2018-08-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia intracellularis de origen europeo y vacunas, agentes de diagnóstico y métodos de uso de la misma
FR2861731B1 (fr) * 2003-10-30 2006-02-24 Centre Nat Rech Scient Nouvelle proteine de fixation du phosphate, compositions pharmaceutiques la contenant et ses utilisations
WO2005112995A1 (en) 2004-04-26 2005-12-01 Choongang Vaccine Laboratory Co., Ltd. Inactivated mixed vaccine for porcine respiratory disease and the method of manufacturing thereof
CN1579553A (zh) 2004-05-18 2005-02-16 浙江大学 Ii型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用
KR100478845B1 (ko) 2004-06-22 2005-03-24 채찬희 돼지 이유자돈 전신성 소모성 증후군 예방 및 치료용 생물학적 조성물
KR20070052273A (ko) 2004-06-30 2007-05-21 아이디 바이오메디컬 코포레이션 오브 퀘벡 코로나바이러스 감염의 치료를 위한 백신 조성물
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US7700285B1 (en) * 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
ATE462445T1 (de) 2005-01-13 2010-04-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Prrs-impfstoffe
US7300785B2 (en) 2005-02-03 2007-11-27 Universiteit Ghent Culturing circular ssDNA viruses for the production of vaccines
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
KR101369656B1 (ko) 2005-04-13 2014-03-04 메리얼 리미티드 돼지 써코바이러스 제조 방법 및 제조 모니터링을 위한검정법
US7691368B2 (en) 2005-04-15 2010-04-06 Merial Limited Vaccine formulations
CN101277717A (zh) 2005-09-09 2008-10-01 英特威国际有限公司 Pcv-2疫苗
JP5394750B2 (ja) 2005-12-29 2014-01-22 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド 多価ｐｃｖ２免疫原性組成物及び当該組成物を製造する方法
MX338626B (es) 2005-12-29 2016-04-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Uso de una composicion inmunogenica de pcv2 para producir los sintomas clinicos en cerdos.
EP2099927A4 (en) 2006-11-22 2010-05-05 Boehringer Ingelheim Vetmed METHODS FOR REDUCING FLAMBEES OF DISEASES ASSOCIATED WITH PORCINIC CIRCOVIRUS
WO2008073464A2 (en) 2006-12-11 2008-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
PL2481420T3 (pl) 2006-12-15 2019-08-30 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Jednodawkowa szczepionka anty-PCV2 dla świń
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) * 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
GB0712160D0 (en) * 2007-06-22 2007-08-01 Univ Ghent Methods and compositions in the treatment of procine circoviral infection
US20090017064A1 (en) 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
CN101980720A (zh) 2008-01-23 2011-02-23 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法
WO2009103037A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
US8444989B1 (en) 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
US20100150959A1 (en) 2008-12-15 2010-06-17 Vectogen Pty Ltd. PCV 2-Based Methods and Compositions for the Treatment of Pigs
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
US20110150770A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent vaccine against porcine teschovirus and other disease causing organisms in swine
BR112012023234A2 (pt) 2010-03-16 2016-05-17 Virginia Tech Intell Prop vacina de circovírus vivo atenuado quimérico porcino
US9580474B2 (en) 2010-09-08 2017-02-28 The Johns Hopkins University Polyionic papilloma virus-like particle (VLP) vaccines
CN103122352B (zh) 2012-09-27 2015-02-11 华中农业大学 一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用
ES2734374T3 (es) 2013-03-01 2019-12-05 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Cuantificación de composiciones de vacuna
CN105246505A (zh) 2013-04-30 2016-01-13 勃林格殷格翰动物保健公司 PCV2a亚型(PCV2a)的ORF2蛋白用于交叉保护中的用途
US20140348874A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Boehringer Ingelheim Espana, S.A. Method for the reduction of pcv-2 in a herd of swine
WO2015026912A1 (en) 2013-08-23 2015-02-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine circovirus type 2 (pcv2) subunit vaccine
ES2778425T3 (es) 2013-10-02 2020-08-10 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Variante de la proteína ORF2 del PCV2 y partículas similares a virus compuestas por esta
EP3277315A2 (en) 2015-03-30 2018-02-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 carrier platform

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAE . A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and deseases// Veterinary journal, 2005, вып.169, N3, с.326-336. KIM J ET AL. Association of porcine circovirus 2 with porcine respratiry disease complex// Veterinary journal, 2003, вып.166, N3, с.251-256. Ingelvac® CircoFLEX" 06.07.2006 [Найдено 25.11.2011] [он-лайн], Найдено из Интернет: *

Also Published As

Publication number Publication date
MY152149A (en) 2014-08-15
US9555092B2 (en) 2017-01-31
TW200902057A (en) 2009-01-16
US20170087241A1 (en) 2017-03-30
AU2008214639B2 (en) 2014-04-17
AU2008214639A1 (en) 2008-08-21
US20110182935A1 (en) 2011-07-28
US9943587B2 (en) 2018-04-17
AR065319A1 (es) 2009-05-27
PL2114447T3 (pl) 2014-01-31
US8496940B2 (en) 2013-07-30
DK2481421T3 (en) 2016-01-04
EP2114447B1 (en) 2013-08-07
US20130273099A1 (en) 2013-10-17
DK2114447T3 (da) 2013-10-28
US9132187B2 (en) 2015-09-15
WO2008098909A1 (en) 2008-08-21
RU2009134222A (ru) 2011-03-20
CA2676568A1 (en) 2008-08-21
UA100507C2 (ru) 2013-01-10
US20150343052A1 (en) 2015-12-03
CN101610786B (zh) 2012-10-10
JP5562041B2 (ja) 2014-07-30
CL2008000445A1 (es) 2008-07-04
US20090010954A1 (en) 2009-01-08
US7943298B2 (en) 2011-05-17
EP2114447A1 (en) 2009-11-11
PT2114447E (pt) 2013-10-10
EP1958644A1 (en) 2008-08-20
CN101610786A (zh) 2009-12-23
KR20090109584A (ko) 2009-10-20
ES2555132T3 (es) 2015-12-29
MX2009008577A (es) 2009-08-21
ES2434117T3 (es) 2013-12-13
BRPI0807493A2 (pt) 2014-05-27
CY1114577T1 (el) 2016-10-05
ZA200904806B (en) 2013-09-25
KR101521465B1 (ko) 2015-05-19
EP2481421B1 (en) 2015-09-23
SI2114447T1 (sl) 2013-11-29
JP2011511754A (ja) 2011-04-14
EP2481421A1 (en) 2012-08-01
TWI438003B (zh) 2014-05-21
CA2676568C (en) 2019-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2520759C2 (ru) Предупреждение и лечение субклинической формы болезней, вызываемых цирковирусом свиней (pcvd)
US10780156B2 (en) Treatment of pigs with PCV2 antigen
RU2522849C2 (ru) Лечение prdc у молодых свиней
JP2014065741A (ja) ブタのｐｒｄｃの治療

Legal Events

Date Code Title Description
PC43 Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions

Effective date: 20191108