JP2004503234A - ブタの先天性振せん用ワクチン - Google Patents
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Abstract
ブタ・シルコウイルス(PCV)とブタにおける先天性振せん(震顫)との関連性の同定に関し、関連する診断および治療組成物および方法に関する。より詳細には、特定の先天性振せん関連PCV核酸およびポリペプチドに関する。特に、ブタ・シルコウイルス(PCV)から単離された核酸であって、配列番号1から配列番号7からなる群から選択された配列と同一の配列を有する核酸を提供する。
Description
【0001】
本出願は、35U.S.C.§119(e)に基づいて2000年6月15日に出願された米国特許仮出願第60/211710の優先権を主張するものであり、その出願の全体を参照により本明細書の一部とする。
【0002】
【従来の技術】
本発明は、ブタ・シルコウイルス(PCV)とブタにおける先天性振せん(震顫)との関連性の同定に関し、関連する診断および治療組成物および方法に関する。本発明は、より詳細には、特定の先天性振せん関連PCV核酸およびポリペプチドに関する。
【0003】
ブタ・シルコウイルス(PCV)は、当初は、ブタ腎臓細胞系、PK−15の非細胞変性性混入物として発見された(Tischer等、Medizinische Mikrobiologie und Parasitologie 226:153−167、1974)。このウイルスは、1982年に特性決定され(Tischer等、Nature、295:64−66、1982)、ニワトリ貧血ウイルス(Yuasa等、Avian Diseases 23:366、1979)、オウム嘴羽毛病ウイルス(PassおよびPerry、Austrial Veterinary Journal、61:69−74、1984)、およびハト・シルコウイルス(Woods等、Journal of Veterinary Diagnostic Investigations:5:609−612、1983)と共にシルコウイルス科に分類された。シルコウイルスのゲノムは、環状1本鎖アンビセンスDNAゲノムの単一コピーからなる(Lukert等、Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses、166−168、1995)。このゲノムの大きさは、1.7から2.3kbの間で多様である。シルコウイルスは、非エンベロープ型であり、正20面体対称を有する。PK−15細胞由来のPCVは、初め病原性ではないと考えられていた。その完全ゲノムが配列決定され(Meehan等、Journal of General Virology 78:221−227、1997)、電子顕微鏡検査法によって特性決定された(Stevenson等、Veterinary Pathology 36:368−378、1999)。PK−15−PCVは自然発生疾患と関連づけて考えられたことはなく、ブタの実験接種は臨床的疾患を生じなかった(Tischer等、Archives of Virology 91:271−276、1986、Allan等、Journal of Comparative Pathology 121:1−11、1995)。
【0004】
PK−15−PCV、ニワトリおよびオウム動物シルコウイルス、植物ジェミニウイルスおよびナノウイルス(以前には植物シルコウイルスとして知られていた)の系統発生分析は、PK−15−PCVをオウム嘴羽毛病ウイルスにもっとも近いと分類し、PK−15−PCVとオウム・シルコウイルスは共に、2種の植物ウイルス群と特徴を共有しており、それらの中間であった(Niagro等、Archives of Virology 143:1723−1744、1998)。さらなる分析は、PK−15−PCVおよび/またはオウム・シルコウイルスの前身は、脊椎動物宿主に感染して、脊椎動物感染RNAウイルス、おそらくはカリチウイルスと組み換えられた植物ナノウイルスに源を発することを示唆した(GibbsおよびWeiller、Proceedings of the National Academy of Sciences、USA、96:8022−8027、1999)。
【0005】
PCVによる感染は、離乳後多臓器性発育不全症候群(PMWS)と関連づけられており、この症候群は離乳後のブタにおける進行性体重減少、呼吸困難、頻呼吸、および黄疸によって臨床的に特徴づけられる(Daft等、Meeting of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians、Little Rock、AR、USA、32頁、1996、Clark、Proceedings of the 28th Annual Meeting of the American Association of Swine Practitioners、Quebec City、Quebec、499−501頁、1997、Kiupel等、Indiana.Veterinary Pathology 35:303−307、1998、Ellis等、Canadian Veterinary Journal 39:44−51、1998、AllanおよびEllis、Journal of Veterniary Diagnostic Investigations 12:3−14、2000)。いくつかのPMWS関連PCVの完全ゲノム配列は入手可能である(Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998、Meehan等、Journal of General Virology 79:2171−2179、1998、Morozov等、Journal of Clinical Microbiology 9:2535−2541、1998、Mankerts等、Virus Research、6665−77、2000、WO99/18214、WO99/45956、米国特許第6217883号)。PMWS−PCVの単離株は、抗原的および遺伝子的にPK−15−PCVと異なる(Allan等、Journal of Veterniary Diagnostic Investigations 10:3−10、1998、Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998)。したがって、PCV1と呼ばれる元のPK−15細胞培養単離株と対照的に、これらのPMWS−関連PCVはPCV2と呼ばれた(Meehan等、Journal of General Virology 79:2171−2179、1998)。
【0006】
ブタにおける先天性振せん(CT)は、ミエリン欠損と関連づけられており、遺伝的異常(Harding等、Vet Rec 92:527−529、1973、Patterson等、J Neurochem 26:481−485、1976)、胎内トリクロルフォン毒性(Knox等、Nord Veterinaermed 30:538−545、1978)、および古典的ブタコレラ・ウイルスの胎内感染(Harding等、Vet Rec 79:388−390、1966)、またはアウエスキー・ウイルス(Mare等、J Am Vet Med Assoc 164:309−310、1974)が原因である可能性がある。北米でもっとも一般的なCTの形態は伝染性であり、A2型と分類されている(Done等、Veterinary Annual 16:98−102、1976)。CTA2型の疫学はこれまで検討されてきた(Bolin等、Leman AD、Straw BE、Mengeling WL、D’Allaire S、Taylor DJ編、第7版、247−249頁、1992)。疾患はすべての品種で起こり、季節性ではなく、初産雌ブタの同腹子でより一般的であり、しばしば外部からの補充繁殖家畜の導入に伴う(Stromberg等、Am J Vet Res 19:377−382、1958)。冒された同腹子内の有病率は0−100%まで多様である。発生は一般に1−8週間続くが、疾患が風土性であることはまれである。罹患ブタは、異なる重篤度で骨格筋の間代性収縮を示し、これは一般に4週齢までに減少、消散するが、屠殺齢まで持続する可能性もある。ブタが安静にしているとき、ミオクロヌスは弱まり、外部刺激によって増悪する(Christensen等、Nord Veterinaermed 8:921−943、1956、Stromberg等、Am J Vet Res 20:319−323頁および627−633頁、1959)。罹患ブタの死亡率は50%という高い率となる可能性があり、これは哺乳ができないことによる。
【0007】
ウイルスとCTA2型との関連性は長い間知られてきたが、これまでのところそのウイルス株は同定されていない。最初の研究は、CTA2型を有する新生ブタ由来の1次腎細胞培養物から得た濾液中の約20nmの立方体様未同定ウイルスを記載している(Kanitz CL、1972、Myoclonia congenita:Studies of the resistance to viral infection of tissue culture cell lines derived from myclonic pigs、博士論文、Purdue University、West Lafayette、IN)。これらの研究には、腎細胞培養物上澄みの濾液として調製された立方体様ウイルスによる妊娠雌ブタの筋肉内接種も含まれており、これによって先天性振せんを有する同腹子が分娩された。他の研究者等は、CTA2型を有するブタから得た1次腎細胞培養物から塩化セシウム勾配でウイルスを精製し、そのウイルスを形態学および間接免疫法に基づいてPCVと同定した(Hines RK、1994、Porcine circovirus causes congenital tremors type A−11 proved by fulfilling Koch’s postulates、博士論文、University of Georgia、Athens、GA)。続いて妊娠第3三半期の妊娠ブタに精製ウイルスを皮下、経鼻、および経口接種することによって、先天性振せんを有するブタが分娩された。PCVは、CTを有するブタの腸管組織から再単離されたが、神経組織からは再単離されず、擬接種雌親由来の正常な対照ブタの組織からは再単離されなかった。PMWSPCV単離株を増幅するために設計されたPCRプライマー・セットを用いて、CTを有するブタ群の試料からPCVDNAも見出された(G.W.Stevenson等、IX International Symposium、College Station、Texas、1999年6月)。
【0008】
しかしながら、CTに関連するPCV単離株の遺伝子分析は、まだ報告されていない。したがって、PCVと先天性振せんとの関連性を確認すること、この疾患に関わるPCVの型を正確に同定することが求められている。現在は先天性振せんに対する有効な診断試験もワクチンも入手不可能であり、実際のところ、そのような分析によってのみ、ブタの先天性振せんに対する診断用および治療用ツールの製造が可能となるかもしれない。
【0009】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明は、先天性振せんを有するブタのブタ・シルコウイルス(PCV)株のクローニングに基づく。
【0010】
これらの結果は、診断および治療応用例の発展の第一段階を提供する。
【0011】
したがって本発明は、ブタの先天性振せんの病理原因を診断する方法を提供し、その方法は、そのブタがブタ・シルコウイルス株の1型または2型に感染しているかどうかを判別することを含む。
【0012】
本発明はさらに、ブタの先天性振せんを予防または治療する方法を提供し、その方法は、有効量の免疫原性PCV1またはPCV2ポリペプチド、あるいはこのポリペプチドをエンコードする核酸をそのブタに投与することを含む。
【0013】
本発明の他の主題は、本発明者等によって同定された新規なPCV核酸配列、その配列によってエンコードされたポリペプチド、ならびに新規なPCV単離株およびその免疫原性製剤である。
【0014】
したがって、本発明は単離されたブタ・シルコウイルス(PCV)に関し、その核酸は、配列番号1から配列番号7からなる群から選択された配列と同一である配列を有する。
【0015】
本発明はさらに、ブタ・シルコウイルス(PCV)から単離された核酸に関し、その核酸は、任意の配列番号1から配列番号7の配列の、任意のORF1からORF11によってコードされた配列かならなる群から選択された配列を有するシルコウイルス・ポリペプチドをコードする配列を含む。
【0016】
本発明の他の主題は、発現制御配列と有効に結合しているこの核酸を含む発現ベクターである。
【0017】
この発現ベクターは、薬学的に許容される賦形剤と結合してワクチンを形成することができ、これも本発明の一部である。
【0018】
本発明はさらに、この発現ベクターを含む宿主細胞を対象とする。
【0019】
本発明はさらに、PCVタンパク質を産生する方法を提供し、その方法は、シルコウイルスをコードする核酸の発現をもたらす条件下で、この宿主細胞を培養することを含む。
【0020】
任意の配列番号1から配列番号7のORF1からORF11によってエンコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびにそれらのポリペプチドに対する抗体も本明細書に記載される。
【0021】
本発明のさらなる主題は、ブタ・シルコウイルス株を培養する方法であり、その方法は、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含む核酸を、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス粒子の産生をもたらす条件下で、適切な宿主細胞に導入することを含む。
【0022】
本発明はさらに、配列番号1から配列番号6から選択された配列を含むゲノムを有する単離PCV株を包含する。
【0023】
【発明の実施の形態】
本発明は、先天性振せんに関する病原体の株を確実に同定するという問題を解決する。先天性振せんを有するブタのブタ・シルコウイルス(PCV)株をクローニングおよび配列決定し、それらをPMWSに関連するPCV株と比較することによって、プライマー、プローブ、またはウイルス株などの多くの有用な材料の発展に至った。本発明は、知られているCT病原性の株のクローニング、ウイルスの培養を可能にする。
【0024】
本発明は、ブタのニューロンに存在する、ならびにより少ない程度で脳のグリア細胞および脊髄に存在するPCVゲノムDNAが、離乳後多臓器性発育不全症候群(PMWS)に関連する株のゲノムDNAと、約95%を超える非常に近い配列類似性を共有するという発見に部分的に基づいている。先天性振せん(CT)またはPMWSを有するブタから得た7種のPCV単離株の全ゲノムを、クローン化し、配列決定した。単離株の1種は、1960年代終わりに単離されたCTA2型を有する新生ブタから得たものであった。2種の新しいPCV単離株は、無関係に発生したCTA2型を有する異なる農場の2頭の感染新生ブタから得た。4種の単離株は、PMWSを有するブタの、4つの異なる農場を起源とするものであった。この4種のPMWS−PCVの比較分析は、それらが互いに99%の配列同一性を共有し、以前に配列決定されたPMWS−PCVと96%を超える配列同一性を共有することを実証した。しかしながら2種の新しいCT−PCVは、互いに、さらに興味深いことに新しいPMWS−PCV単離株とも99%の同一性を共有した。PMWSと新しいCT単離株との間に、一貫したゲノムの相違はなかった。古いCT−PCVは、PK−I5由来PCV株と98%の同一性を示し、新しいCT−PCVとはわずか72%の同一性を示した。系統発生分析は、PCV単離株が2つのグループに分類できることを確認した。PCVI型は、PK−15−PCV、および本発明の古いCT−PCV単離株からなり、PCV2型は、PMWS、および本発明の新しいCT単離株を含む。
【0025】
さらなる研究によって、in−situハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、および凍結組織切片の間接蛍光抗体試験を用いて、天然CTA2型を有する1−2日齢ブタにおけるPCVの組織分布、および遺伝子型を確立した。CTA2型が発生した米国中西部の4つの農場を起源とする、CT罹患ブタ、および臨床的に正常なブタを選択した。CTブタのすべて、および正常ブタのほとんどが、PCVに感染していた。PCVは感染ブタの組織に広範に分布しており、中枢神経組織、および肝臓にもっとも一般的に分布していた。すべての感染ブタにおいて、非神経組織に比べて、脳および脊髄により多くのPCV感染細胞が存在した。CTブタは、分布が広汎で、感染細胞の割合が高いために、臨床的に正常なブタに比べて、脳および脊髄により多くのPCV感染細胞を有した。脳および脊髄において、もっとも一般的にPCVが感染した細胞は、大ニューロンであった。非神経組織では、マクロファージがもっとも高頻度に感染した細胞型であった。PCR試験は、4つのすべての農場のすべてのPCV感染ブタにおいて、PCV2型のみを実証し、PCV1型は実証されなかった。
【0026】
本発明はさらに、PCV2が感染雌ブタから胎内の同腹子に伝播され得るという証拠に基づいている。したがってPCV2は、単独で、あるいは補因子との組合せによって、先天的に伝播可能である。
【0027】
上述のとおり、これらの発見は、PCVのCTとの病因論的関係、ならびにPMWSに関連するPCVウイルス間の関係のあいまいさを解明する(従来の研究は、たとえば、実際にPCVがCTの病原体であった場合にも、別のPCVウイルス株がCTに関連する可能性を残していた)。したがって、本明細書に記載した新規なPCV株(たとえば、PMWS−PCV−P1、PMWS−PCV−P2、PMWS−PCV−P3、PMWS−PCV−P4、CT−PCV−P5、CT−PCV−P6、およびCT−PCV−P7)に加えて、本発明は、これらの試薬をベースとする診断および治療方法および材料を提供し、診断上の評価、および治療的、特に免疫学的介入の標的としてPCV、特にPCV2型を同定する。
【0028】
本明細書では、「PCV」という用語は、たとえばブタおよびウシ・シルコウイルス単離株の全ゲノムの距離マトリクス分析(図3)に示したように、特にブタ・シルコウイルスを指す。特に、PCVという用語は、PMWS−PCV−P1(配列番号1)、PMWS−PCV−P2(配列番号2)、PMWS−PCV−P3(配列番号3)、PMWS−PCV−P4(配列番号4)、CT−PCV−P5(配列番号5)、およびCT−PCV−P6(配列番号6)を意味する。さらに、PCVには、CT−PCV−P7(配列番号7)、PK−15PCV(Meehan等、1997)、およびPMWS−PCV(Hamel等、1998)が含まれる。
【0029】
「PCVポリペプチド」(または「PCVタンパク質」)は、PCVオープン・リーディング・フレーム(ORF)によってエンコードされたポリペプチド遺伝子産物を指す。各PCVは11のORFを有し、したがって上記のとおり、各株に対してORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7、ORF8、ORF9、ORF10、およびORF11が存在する。ORFおよびそれらがエンコードするポリペプチドの特徴は、以下の実施例1の表、および図4−14に示す。
【0030】
「ワクチン」という用語は、レシピエント(受容者)において防御免疫性を誘導するために用いることのできる組成物(タンパク質またはベクター。後者は、厳密でなく「DNAワクチン」と呼ぶこともできるが、RNAベクターも使用可能である)を指す。本発明のワクチンは母集団の一部において免疫性を誘導することができ、いくらかの個体では、強固な免疫応答、または防御的な免疫応答を開始できず、あるいは場合によってはいかなる免疫応答も開始できない可能性があることに留意されたい。この無効性は、個々の遺伝的背景に由来するか、あるいは免疫欠損状態(後天性または先天性)、または免疫抑制(たとえば、器官拒絶を防ぐため、または自己免疫状態を抑制するための免疫抑制剤による治療)によるものである。
【0031】
「免疫療法」という用語は、病原体特異免疫応答の活性化に基づく治療計画を指す。ワクチンは、免疫療法の一形態であり得る。ex vivo(その後、対象に移植)、またはin vivoで、樹状細胞に、PCVポリペプチド、場合によっては刺激サイトカイン、たとえばGM−CSFまたはFlt3リガンドを負荷することも免疫療法の一形態である。
【0032】
本明細書では、「防御する」という用語は、対象におけるPCV感染の予防または治療、あるいは適宜その両方を意味する。したがって、ワクチンの予防的投与は、レシピエント対象をPCV感染から防御することができ、たとえば感染性単核球症、またはリンパ増殖性疾患を予防することができる。ワクチンの治療的投与または免疫療法は、レシピエントをPCV感染媒介性病因から防御することができ、たとえばPMWSまたはCTなどの疾患または障害を治療することができる。
【0033】
本明細書では、「対象」という用語は、PCVを支持(維持)する動物を指す。特に、この用語はブタを指す。
【0034】
本明細書では、「ブタにおける発現のためのベクター」、または「ブタ発現ベクター」という用語は、ブタ細胞において有効なプロモータを少なくとも含むベクターを意味し、好ましくはブタにおいて安全で有効なベクターを意味する。そのようなベクターは、たとえば、免疫性の発展に関与しない外来遺伝子を除外する。ベクターがウイルス・ベクターである場合、強固な感染の複製および展開を可能にする部位を除外し、in vivoでの複製能力の発達を回避するために操作される。そのようなベクターは、好ましくは、農場のブタに用いるのに安全であり、より好ましい実施形態において、ベクターは、ブタにおける臨床試験または使用に関して、政府規制機関(たとえば、米国農務省など)によって承認されている。特定のベクターは以下に詳しく記載する。
【0035】
本明細書では、「免疫原性ポリペプチド」という用語は、そのポリペプチドが、体液性または細胞性、好ましくは両方の免疫応答を誘導できることを意味する。免疫原性ポリペプチドは抗原性でもある。ある分子は、免疫系の抗原認識分子、たとえば免疫グロブリン(抗体)、またはT細胞抗原受容体などと特異的に相互作用することができるとき、「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約5個、好ましくは少なくとも約10個のアミノ酸のエピトープを含有する。本明細書ではエピトープとも呼ばれるポリペプチドの抗原性部分は、抗体またはT細胞受容体認識に関して免疫優性な部分であることが可能であり、あるいはその抗原性部分を免疫化のための担体ポリペプチドと複合して、その分子に対する抗体を産生するために用いられる部分であることができる。抗原性である分子は、それ自体が免疫原性である、すなわち担体なしに免疫応答を誘導できる必要はない。
【0036】
「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。アジュバントは、ゆっくりと抗原を放出する組織貯蔵所として機能することができ、さらに非特異的に免疫応答を増強するリンパ系活性化剤として機能することも可能である(Hood等、Immunology、第2版、1984、Benjamin/Cummings、Menlo Park、California、384頁)。多くの場合、アジュバントが存在しないとき、抗原単独による1次投与は、体液性または細胞性免疫応答を誘導できないであろう。アジュバントには、これに限定されるものではないが、Freund完全アジュバント、Freund不完全アジュバント、サポニン、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウムなど、界面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油、または炭化水素エマルジョンなど、および潜在的に有用なヒト・アジュバント、たとえばBCG(カルメット・ゲラン杆菌)および挫瘡プロピオンバクテリウムなどが含まれる。別法として、またはこれに加えて、以下に記載する免疫刺激タンパク質をアジュバントとして、またはワクチンに対する免疫応答を高めるために用いることができる。好ましくは、このアジュバントは薬学的に許容される。
【0037】
「薬学的に許容される」、または「獣医学的に許容される」という語句は、動物に投与されたとき、生理的に耐性であり、典型的にアレルギー反応、または類似の不都合な反応、たとえば胃の不調、めまい感などを生じない分子実体、および組成物を指す。本明細書では、好ましくは、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されている、あるいは米国薬局方、または動物に用いるための一般に認められている他の薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」という用語は、それと共に化合物を投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。滅菌水または水溶液、食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は、特に注射可能溶液用に担体として好ましく用いられる。適切な薬剤担体は、E.W.Martinの「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【0038】
本明細書では、「単離」という用語は、言及された材料が、その天然の環境、たとえば細胞から取り出されることを意味する。したがって、単離された生物材料は、いくつかの、またはすべての細胞成分、すなわちその天然材料が天然に発生する細胞の成分(たとえば、細胞質成分または細胞膜成分)を含まないことが可能である。ある材料が細胞抽出物中に存在する場合、または異種細胞または細胞抽出物中に存在する場合、単離されたものとみなされる。核酸分子の場合、単離核酸には、PCR産物、単離mRNA、cDNA、または制限フラグメントが含まれる。単離核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列が含まれ、すなわちそれがキメラ組換え核酸構成体の一部を形成する。したがって、特定の実施形態において、組換え核酸は単離核酸である。単離タンパク質は、それが細胞内で結合する他のタンパク質、または核酸、あるいはその両方と結合していてもよく、あるいは膜結合タンパク質である場合、細胞膜と結合していてもよい。単離小器官、細胞、または組織は、生体においてそれが見出される解剖学的部位から取り出される。単離材料は、必要ではないが、精製することができる。
【0039】
本明細書では、「精製」という用語は、その材料が得られた天然材料を含む関連のない材料、すなわち不純物の存在を低減または排除する条件下で単離された材料を指す。たとえば、精製タンパク質は、好ましくは、細胞内でそれが結合している他のタンパク質、または核酸を実質的に含まず、精製核酸分子は、好ましくは、細胞内でそれとともに見出される可能性のある、タンパク質、または他の関連のない核酸分子を実質的に含まない。本明細書では、「実質的に含まない」という用語は、材料の分析試験のコンテクストにおいて適切に用いられる。好ましくは、実質的に不純物を含まない精製材料は、少なくとも50%の純度である。純度は、クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的検定、および当分野で知られる他の方法によって評価することができる。
【0040】
本発明に従って、当分野の技術の範囲内である通常の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技法を用いることができる。そのような技法は文献において充分に説明されている。たとえば、Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(本明細書において「Sambrook等、1989」とする)、DNA Cloning:A Practical Approach、第1巻および第2巻(D.N.Glover編、1985)、Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984)、Nucleic Acid Hybridization[B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1985)]、Transcription And Translation[B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1984)]、Animal Cell Culture[R.I.Freshney編(1986)]、Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press(1986)]、B.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)、F.M.Ausubel等(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons,Inc.(1994)を参照されたい。
【0041】
「オープン・リーディング・フレーム」、「コード配列」、または発現産物、たとえばRNA、ポリペプチド、タンパク質、または酵素などを「エンコードする」配列は、発現したときに、RNA、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列であり、すなわちそのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質、または酵素のアミノ酸配列をエンコードする。タンパク質のコード配列には、開始コドン(一般にATG)、および終止コドンを含むことができる。
【0042】
RNAポリメラーゼがコード配列をRNA、特にmRNAに転写し、次いでそれがトランスRNAスプライシングされ(イントロンを含有する場合)、そのコード配列によってエンコードされたタンパク質に翻訳されるとき、コード配列は、細胞内で転写および翻訳制御配列の「制御下にある」か、あるいは「機能的に結合している」。
【0043】
「発現調節配列」は、エンハンサ、レプレッサ、またはプロモータ配列を含む、転写または翻訳調節配列である。
【0044】
「プロモータ」または「プロモータ配列」は、細胞内でRNAポリメラーゼを結合し、下流(3’方向)のコード配列の転写を開始することのできるDNA調節領域である。本発明を定義するために、プロモータ配列は、転写開始部位によってその3’末端に結合され、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むために上流(5’方向)に延長する。プロモータ配列内で、転写開始部位(たとえば、ヌクレアーゼS1を用いるマッピングによって都合よく定義される)、ならびにRNAポリメラーゼの結合を起こすタンパク質結合領域(コンセンサス配列)が見出される。
【0045】
「ベクター」、「クローニング・ベクター」、および「発現ベクター」という用語は、それによってDNAまたはRNA配列(たとえば、外来遺伝子)を宿主細胞に導入し、それによって宿主を形質転換し、導入された配列の発現(たとえば、転写および翻訳)を促進することのできるビヒクルを意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれ、それらについては以下に詳しく論じる。
【0046】
ベクターは典型的に、伝達性因子のDNAを含有し、その中に外来DNAが挿入される。DNAの1つの断片をDNAの別の断片に挿入する一般的な方法には、制限部位と呼ばれる特定の部位(特定のヌクレオチド群)でDNAを開裂する制限酵素と呼ばれる酵素を使用することが含まれる。
【0047】
「カセット」は、定義された制限部位でベクターに挿入されることのできる発現産物をコードするDNAコード配列、またはDNAの断片を指す。カセット制限部位は、適切なリーディング・フレーム内に確実にカセットを挿入するように設計されている。一般に、外来DNAは、ベクターDNAの1つまたは複数の制限部位に挿入され、次いで、ベクターによって伝達性ベクターDNAと共に宿主細胞に運ばれる。発現ベクターなどの挿入または付加DNAを有するDNAの断片または配列は、「DNA構成体」と呼ぶこともできる。ベクターの一般的な型は「プラスミド」であり、これは一般的に、通例は細菌起源の2本鎖DNAの自己完結型分子であり、容易に追加の(外来)DNAを受容することができ、容易に適切な宿主細胞に導入される。プラスミド・ベクターは多くの場合、コーディングDNAおよびプロモータDNAを含有し、外来DNAの挿入に適した1つまたは複数の制限部位を有する。コーディングDNAは、特定のタンパク質または酵素に関する特定のアミノ酸配列をエンコードするDNA配列である。プロモータDNAは、コーディングDNAの発現を開始、調節、あるいは仲介、または制御するDNA配列である。プロモータDNA、およびコーディングDNAは、同一の遺伝子由来であることができ、あるいは異なる遺伝子由来であることができ、さらに同一の生体由来、または異なる生体由来であることができる。プラスミドおよび菌類ベクターを含む多数のベクターが、多様な真核生物および原核生物宿主における複製および/または発現に関して記載されてきた。非限定的な例には、pKKプラスミド(Clonetech)、pUCプラスミド、pETプラスミド(Novagen,Inc.、Madison、WI)、pRSETまたはpREPプラスミド(Invitrogen、San Diego、CA)、またはpMALプラスミド(New England Biolabs、Beverly、MA)、および本明細書に記載または引用した方法、あるいは関連分野の技術者に知られている方法を用いる多くの適切な宿主細胞が含まれる。組換えクローニング・ベクターは多くの場合、クローニングまたは発現のための1つまたは複数の複製系、宿主における選択のための1つまたは複数のマーカ、たとえば抗生物質抵抗性など、および1つまたは複数の発現カセットを含む。
【0048】
「発現する」および「発現」という用語は、遺伝子またはDNA配列の情報が顕性となるのを可能にすること、あるいはそれをもたらすことを意味し、たとえば対応する遺伝子またはDNA配列の転写および翻訳に関わる細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生する。DNA配列は、細胞において、または細胞によって発現し、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、たとえば生じたタンパク質も、その細胞によって「発現した」と言うことができる。発現産物は、細胞内、細胞外、または分泌型として特徴づけることができる。「細胞内」という用語は、細胞の内部にあるものを意味する。「細胞外」という用語は、細胞の外部にあるものを意味する。ある物質が細胞上または内部のどこからか、著しい程度で細胞外部に現れる場合、その物質は細胞によって「分泌」されている。
【0049】
「トランスフェクション」という用語は、細胞への外来核酸の導入を意味する。「形質転換」という用語は、「外来」(すなわち、外在または細胞外)遺伝子、DNAまたはRNA配列の宿主細胞への導入を意味し、それによって宿主細胞は導入遺伝子または配列を発現し、所望の物質、典型的には導入遺伝子または配列によってコードされたタンパク質または酵素を産生することになる。導入遺伝子または配列は、「クローン」または「外来」遺伝子または配列と呼ぶこともでき、調節または制御配列、たとえば開始、終止、プロモータ、シグナル、分泌、または細胞の遺伝子機構によって用いられる他の配列などを含むことができる。この遺伝子または配列は、非機能性配列、または未知の機能を有する配列を含むことができる。導入DNAおよびRNAを受容し、発現する宿主細胞は、「形質転換」されており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されたDNAまたはRNAは、任意の供給源由来であることができ、宿主細胞と同一の属または種の細胞、あるいは異なる属または種の細胞を含む。
【0050】
「宿主細胞」という用語は、たとえば遺伝子、DNAまたはRNA配列、タンパク質、または酵素の細胞による発現など、細胞による物質の産生のために、選択、修飾、形質転換、増殖、あるいは任意の方法で用いられるか、操作される任意の生体の任意の細胞を意味する。適切な宿主細胞には、1次マクロファージ、特にブタ・マクロファージ、またはそのマクロファージ細胞系、ブタ腎細胞、あるいはPCVがウイルスを産生できる、またはそれがウイルス感染を支持できる、またはその両方であるような他の哺乳動物細胞が含まれる。
【0051】
「発現系」という用語は、たとえばベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入された外来DNAによってコードされるタンパク質の発現のためなどの、適切な条件下にある宿主細胞、および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系には、大腸菌宿主細胞およびプラスミド・ベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルス・ベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが含まれる。特定の実施形態において、当該タンパク質は、COS−1、またはC2C12細胞に発現する。他の適切な細胞には、CHO細胞、HeLa細胞、293T(ヒト腎細胞)、マウス1次筋芽細胞、およびNIH3T3細胞が含まれる。
【0052】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体」とは、所与のコドン位置における1つまたは複数のヌクレオチドの変化が、その位置でエンコードされたアミノ酸に変更を生じない変異体である。
【0053】
「機能保存的変異体」とは、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変更することなく、変化している変異体であって、これに限定されるものではないが、類似の特性(たとえば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など)を有するものによるアミノ酸の置換が含まれる。類似の特性を有するアミノ酸は、当技術分野においてよく知られている。たとえば、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンは、親水性−塩基性アミノ酸であり、互換性である可能性がある。同様に、疎水性アミノ酸のイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、またはバリンと置換することができる。そのような変化は、見かけの分子量、あるいはタンパク質またはポリペプチドの等電点にほとんど、またはまったく影響を及ぼさないことが予期される。保存として指示された以外のアミノ酸はタンパク質または酵素中で異なっている可能性があり、そのため類似の機能を有する任意の2つのタンパク質の、タンパク質またはアミノ酸配列の類似性パーセントは多様であり、MEGALIGNアルゴリズムに基づくCluster Methodなどによるアライメント・スキームによって求めた類似性は、たとえば70%から99%であることができる。「機能保存的変異体」はさらに、BLASTまたはFASTAアルゴリズムによって求めたアミノ酸同一性が、少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、もっとも好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%であって、比較される天然または親タンパク質または酵素と同一の、または実質的に類似の特性または機能を有するポリペプチドまたは酵素を含む。
【0054】
本明細書では、すべての文法形態および綴りの変形形態の「相同性(homologous)」という用語は、スーパーファミリー由来のタンパク質(たとえば、免疫グロブリン・スーパーファミリー)、および異なる種由来の相同性タンパク質(たとえば、ミオシン軽鎖など)を含む、「共通の進化学的起源」を有するタンパク質間の関係を指す(Reeck等、Cell 50:667、1987)。そのようなタンパク質(およびそれらのエンコード遺伝子)は、類似性パーセントまたは保存位置における特定の残基またはモチーフの存在という点において、それらの配列類似性によって表される配列相同性を有する。
【0055】
したがって、すべての文法形態の「配列類似性」という用語は、共通の進化学的起源を共有していても、共有していなくてもよいタンパク質の核酸またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度を指す(上述のReeck等を参照のこと)。しかしながら、慣例的な使用、および本出願において、「高度に」などの副詞によって修飾されているとき、「相同性」という用語は、配列類似性を指すことができ、共通の進化学的起源に関連しても、関連していなくてもよい。
【0056】
特定の実施形態において、BLAST、FASTA、DNAStriderなどの配列比較アルゴリズムによって求められたDNA配列の定義された長さに渡るヌクレオチドの一致が、少なくとも約80%、もっとも好ましくは少なくとも約90または95%であるとき、2つのDNA配列は、「実質的に相同性」、または「実質的に類似性」である。そのような配列の例は、本発明の特定の遺伝子の対立遺伝子、または種変異体である。実質的に相同性である配列は、たとえば特定のシステムに関して定義された厳格な条件下で、配列データバンクで入手可能な標準的なソフトウェアを用いて、またはサザン・ハイブリダイゼーション実験において、配列を比較することによって同定できる。
【0057】
同様に、特定の実施形態において、80%を超えるアミノ酸が同一であるとき、または約90%を超えるアミノ酸が類似している(機能的に同一である)とき、2つのアミノ酸配列は、「実質的に相同性」、または「実質的に類似性」である。好ましくは、類似性または相同性配列は、たとえばGCG(Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package、バージョン7、Madison、Wisconsin)パイルアップ・プログラム、または上記の任意のプログラム(BLAST、FASTAなど)を用いるアライメントによって同定される。
【0058】
核酸分子の1本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、他の核酸分子とアニール可能なとき、その核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAなどの別の核酸分子と「ハイブリダイゼーション可能」である(上述のSambrook等を参照)。温度およびイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同性核酸の予備スクリーニングの場合、Tm(融解温度)55℃に対応するストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件を用いることができ、たとえば、5×SSC、0.1%SDS、0.25%乳、ホルムアミド非含有、または30%ホルムアミド、5×SSC、0.5%SDSである。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに対応し、たとえば、40%ホルムアミド、5×または6×SSCである。ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件は、最高温度のTmに対応し、たとえば、50%ホルムアミド、5×または6×SSCである。SCCは、0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸Naである。ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含有していることを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間の誤対合も可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、および相補性の程度に応じて決まり、変数は当分野においてよく知られている。2つのヌクレオチド配列の類似性または相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するTm値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性(より高いTmに対応する)は、以下の順序で減少する。RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。ヌクレオチドが100を超える長さのハイブリッドの場合、Tmを算出するための等式がすでに得られている(上述のSambrook等、9.50〜9.51を参照のこと)。短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、誤対合の位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(上述のSambrook等、11.7〜11.8を参照のこと)。ハイブリダイゼーション可能な核酸の最短の長さは、少なくとも約10のヌクレオチド、好ましくは約15のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約20のヌクレオチドの長さである。
【0059】
特定の実施形態において、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、Tm55℃を指し、上述の条件を用いる。好ましい実施形態において、Tmは60℃であり、より好ましい実施形態において、Tmは65℃である。特定の実施形態において、「高いストリンジェンシー」は、0.2×SSC中68℃、50%ホルムアミド、4×SSC中42℃のハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件、またはこれら2つのいずれかの条件下で認められるものと同等のハイブリダイゼーションレベルが得られる条件下を指す。
【0060】
本明細書では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般にヌクレオチドが少なくとも10、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも20で、好ましくはヌクレオチドが100以下の核酸を指し、遺伝子、mRNA、cDNA、または他の対象となる核酸をエンコードするゲノムDNA分子、cDNA分子、またはmRNA分子とハイブリダイゼーション可能である。オリゴヌクレオチドは、たとえば32P−ヌクレオチド、またはビオチンなどの標識が共有的にコンジュゲートしているヌクレオチドで標識することができる。一実施形態において、標識ヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。他の実施形態において、オリゴヌクレオチド(1つまたは両方が標識されていてよい)は、遺伝子の全長またはフラグメントをクローニングするため、またはそのタンパク質をエンコードする核酸の存在を検出するためのPCRプライマーとして用いることができる。さらなる実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、DNA分子と共に3重らせんを形成することができる。一般にオリゴヌクレオチドは、合成によって、好ましくは核酸合成装置で調製される。したがって、オリゴヌクレオチドは、非天然ホスホエステルアナログボンド、たとえばチオエステルボンドなどを用いて調製することができる。
【0061】
PCVのクローニングおよび発現
本発明は、7種のブタ・シルコウイルス(PCV)株のクローン化、および配列決定に成功した。1960年代終わりに単離され(本明細書ではCT−PCV7と称する)、2型の先天性振せん(CT)を有する新生ブタを起源とする1種のウイルス株、CTを示すブタから得た2種の新しいPCV単離株(本明細書ではCT−PCV−P5、およびCT−PCV−P6と称する)、および離乳後多臓器性発育不全症候群(PMWS)の徴候を示すブタから得た4種のPCV株(本明細書ではPMWS−PCV−P1、PMWS−PCV−P2、PMWS−PCV−P3、およびPMWS−PCV−P4と称する)である。
【0062】
PMWS−PCV単離株は、互いに約99%のヌクレオチド配列同一性を生じることが見出された。さらに、1990年代終わりの新しいCT−PCV単離株、および1960年代終わりの古いCT−PCV単離株はCT A2型を有する新生ブタを起源としたが、それらはわずか72%のヌクレオチド配列同一性を共有した。2種の新しいCT−PCVのゲノムは、2型のPMWS−PCV単離株と高い配列相同性を共有する。他方、CT−PCV−7株は、1型のPK−15−PCV変株に非常に近いことが見出された。
【0063】
したがって本発明の主題は、PCVから単離された核酸であって、その核酸は、配列番号1から配列番号7からなる群から選択された配列を含む。
【0064】
本発明の他の主題は、PCVから単離された核酸であって、配列番号1から配列番号7からなる群から選択された配列と同一の配列を有する。
【0065】
本発明の核酸配列は、生物試料中のPCV核酸の存在を検出するためのプローブまたはプライマーを設計するのに有用である可能性がある。そのようなプローブまたはプライマーは、より詳細にはオリゴヌクレオチドの形態であることができ、ストリンジェンシーの高い条件下でPCV核酸配列に特異的にハイブリダイズする。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも約20の塩基を含み、配列番号1から配列番号7の20個の連続塩基に見出される配列、またはそれらの相補鎖を有する。
【0066】
11種のオープン・リーディング・フレーム(ORF)配列が決定され、それを実施例の表2および4に示す。対応するポリペプチド配列も、図4から14に示す。
【0067】
したがって、本発明はさらに、その核酸が任意の配列番号1から配列番号7の配列の、任意のORF1からORF11によってコードされたアミノ酸配列からなる群から選択された配列を有するシルコウイルス・ポリペプチドをコードする配列を含む、PCV由来の核酸を提供する。より詳細には、本発明の核酸は、任意の配列番号1から配列番号7の配列の、任意のORF1からORF11から選択された配列を含む。これらの中で、ORF1、2、3、または4が特に興味深い。
【0068】
本発明は、保存的配列、すなわち記載された配列、またはその配列によってエンコードされたポリペプチドの機能性または株特異性を変化しない配列を包含する。これらの配列はまた、「機能保存的変異体」とも呼ばれる。「配列保存的変異体」と呼ばれる、コードの縮重によって異なる配列も包含される。
【0069】
本発明はさらに、ストリンジェンシーの高い条件下で上記の配列とハイブリダイズすることができ、かつ/または本発明の株と非常に高い相同性を有するという点において同等の配列を包含する。
【0070】
任意のこれらの核酸配列を含むクローニング・ベクターも、本発明の一部である。そのようなベクターの調製は、当分野の技術者によく知られており、上述の定義に記載されている。
【0071】
これらの核酸配列およびそのフラグメントは、適切な発現ベクターの助力によって、in vitroまたはin vivoでのポリペプチドの発現に有利に用いることができる。
【0072】
これらのベクターは、より詳細には、発現制御配列と有効に結合した、任意の配列番号1から配列番号7の配列の任意のORF1からORF11からなる群から選択された配列を含む。
【0073】
本発明のベクターは、宿主細胞をトランスフェクトするために用いることができ、これも本発明の一部である。ベクターは当分野で知られている方法、たとえば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション(リソーム融合)、遺伝子銃、またはDNAベクター・トランスポータの使用によって所望の宿主細胞に導入される(たとえばWu等、J.Biol.Chem.267:963−967、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.263:14621−14624、1988、Hartmut等、カナダ特許出願第2012311号、1990年3月15日出願を参照されたい)。
【0074】
本発明はさらに、PCVタンパク質を産生する方法を提供し、その方法は、シルコウイルス・タンパク質をコードする核酸の発現を生じる条件下で、上に定義したように発現ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞を培養することを含む。大腸菌、またはバキュロウイルスは、この目的のために用いることのできる発現系である(米国特許第4745051号)。コード配列は、バキュロウイルスゲノム(たとえば、baculovirus Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV)に組み込むことができ、次いで後者を昆虫細胞、たとえばSpodoptera frugiperda Sf9(寄託番号ATCC CRL 1711)上で増殖できる。
【0075】
より一般的には、本発明は、in vivo、in vitro、またはex vivoでのPCVポリペプチドまたはタンパク質の発現を対象とする。これらの様々な目的に関して、当分野の技術者は、以下に記載する任意の適切な発現系を選択することができる。
【0076】
発現系
多様な宿主/発現ベクターの組合せ(すなわち、発現系)を、本発明のポリペプチドの発現に用いることができる。有用な発現ベクターは、たとえば、染色体、非染色体、および合成DNA配列のセグメントからなることができる。適切なベクターには、SV40の誘導体、および既知の細菌プラスミド、たとえば大腸菌プラスミドcolE1、pCR1、pBR322、pMal−C2、pET、pGEX(Smith等、Gene 67:31−40、1988)、pMB9およびその誘導体、プラスミド、たとえばRP4など;グラム陽性ベクター、たとえばStrep.gardoniiなど;ファージDNA、たとえばファージ1の多数の誘導体、たとえばNM989、および他のファージDNA、たとえばM13、および糸状1本鎖ファージDNA;酵母プラスミド、たとえば2μプラスミドまたはその誘導体など;真核細胞に有用なベクター、たとえば昆虫または哺乳動物細胞に有用なベクター;プラスミドおよびファージDNAの組合せから誘導されたベクター、たとえばファージDNAまたは他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミドなどが含まれる。
【0077】
タンパク質またはポリペプチドの発現は、当分野で知られる任意のプロモータ/エンハンサ因子によって制御することができるが、これらの調節因子は、発現のために選択された宿主において機能性でなければならない。遺伝子発現を制御するために用いることのできるプロモータには、これに制限されるものではないが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ、SV40初期プロモータ領域(Benoist、およびChambon、1981、Nature 290:304−310)、ラウス肉腫ウイルスの3’側長末端反復に含有されたプロモータ(Yamamoto等、Cell 22:787−797、1980)、ヘルペスチミジンキナーゼ・プロモータ(Wagner等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441−1445、1981)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster等、Nature 296:39−42、1982);原核生物発現ベクター、たとえばb−ラクタマーゼ・プロモータ(Villa−Komaroff等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727−3731、1978)、またはtacプロモータ(DeBoer等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21−25、1983);さらに「Useful proteins from recombinant bacteria」、Scientific American、242:74−94、1980を参照のこと;酵母または他の真菌のプロモータ因子、たとえばGal4プロモータ、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモータ、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモータ、アルカリホスファターゼプロモータなど;造血組織特異性を示す制御部位、特に骨髄性細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御部位(Mogram等、Nature 315:338−340、1985、Kollias等、Cell 46:89−94、1986)、造血幹細胞分化因子プロモータ、エリトロポイエチン受容体プロモータ(Maouche等、Blood、15:2557、1991)など、および粘膜上皮細胞特異性を示す制御部位が含まれる。
【0078】
特にin vitro細胞アッセイ、およびin vivoまたはex vivoワクチン接種に好ましいベクターは、ウイルス・ベクター、たとえばレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および望ましい細胞親和性を備えた他の組換えウイルスなどである。したがって、免疫原性ポリペプチドをエンコードするベクターは、ウイルス・ベクターを用いて、またはDNAの直接導入によって、in vivo、ex vivo、またはin vitroで導入することができる。標的組織における発現は、ウイルス・ベクターまたは受容体リガンドなどを用いてトランスジェニック・ベクターを特定の細胞に向けることによって、または組織特異性プロモータを用いて、あるいはその両方によって実施することができる。標的遺伝子送達は、1995年10月公開の国際特許公開WO95/28494に記載されている。
【0079】
in vivoまたはex vivoでの標的化およびワクチン接種手順に一般に用いられるウイルス・ベクターは、DNAをベースとするベクター、およびレトロウイルス・ベクターである。ウイルス・ベクターを構成する方法、および用いる方法は、当分野で知られている(Miller、およびRosman、Bio Techniques、7:980−990、1992を参照のこと)。好ましくは、ウイルス・ベクターは複製欠損であり、すなわち標的細胞において自律的に複製することができない。好ましくは、この複製欠損ウイルスは最小ウイルスであり、すなわちウイルス粒子を産生するためにゲノムを包膜するのに必要なゲノムの配列のみを保持している。
【0080】
DNAウイルス・ベクターには、弱毒または欠損DNAウイルスが含まれ、たとえば、これに限定されるものではないが、単純疱疹ウイルス(HSV)、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス(AAV)、ワクシニアウイルスなどである。特定のベクターの例には、これに限定されるものではないが、欠損ヘルペスウイルス1(HSV1)ベクター(Kaplitt等、Molec.Cell.Neurosci.2:320−330、1991、国際特許公開WO94/21807、1994年9月29日公開、国際特許公開WO92/05263、1994年4月2日公開)、弱毒アデノウイルス・ベクター、たとえばStratford−Perricaudet等によって記載されているベクターなど(J.Clin.Invest.90:626−630、1992、さらにLa Salle等、Science 259:988−990、1993を参照のこと)、および欠損アデノ関連性ウイルス・ベクター(Samulski等、J.Virol.61:3096−3101、1987、Samulski等、J.Virol.63:3822−3828、1989、Lebkowski等、Mol.Cell.Biol.8:3988−3996、1988)が含まれる。
【0081】
多数の会社が商業的にウイルス・ベクターを製造しており、これに限定されるものではないが、Avigen,Inc.(Alameda、CA、AAVベクター)、Cell Genesys(Foster City、CA、レトロウイルス、アデノウイルス、AAVベクター、およびレンチウイルス・ベクター)、Clontech(レトロウイルス、およびバキュロウイルスベクター)、Genovo,Inc.(Sharon Hill、PA、アデノウイルス、およびAAVベクター)、Genvec(アデノウイルス・ベクター)、IntroGene(Leiden、Netherlands、アデノウイル・スベクター)、Molecular Medicine(レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、およびヘルペスウイルス・ベクター)、Norgen(アデノウイルス・ベクター)、Oxford BioMedica(Oxford、英国、レンチウイルス・ベクター)、およびTransgene(Strasbourg、フランス、アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルス・ベクター)が含まれる。
【0082】
アデノウイルス・ベクター。アデノウイルスは、本発明の核酸を多様な細胞型に有効に送達するために修飾することのできる真核生物DNAウイルスである。アデノウイルスの様々な血清型が存在する。これらの血清型において、本発明の範囲内で、2型または5型ヒト・アデノウイルス(Ad2またはAd5)、あるいは動物起源のアデノウイルス(WO94/26914参照)を用いることが好ましい。本発明の範囲内で用いることのできるそのような動物起源アデノウイルスには、イヌ、ウシ、マウス(例Mav1、Beard等、Virology 75(1990)81)、ヒツジ、ブタ、鳥類、およびサル(例SAV)起源のアデノウイルスが含まれる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌ・アデノウイルスであり、より好ましくはCAV2アデノウイルスである(たとえば、Manhattan、またはA26/61株(ATCCVR−800))。種々の複製欠損アデノウイルス、および最小アデノウイルス・ベクターが記載されている(WO94/26914、WO95/02697、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697、WO96/22378)。本発明による複製欠損組換えアデノウイルスは、当分野の技術者に知られている任意の技法で調製することができる(Levrero等、Gene 101:195、1991、EP185573、Graham、EMBO J.3:2917、1984、Graham等、J.Gen.Virol.36:59、1977)。組換えアデノウイルスは、標準的な分子生物学技法を用いて回収、および精製され、それらは当分野の技術者によく知られている。
【0083】
アデノ関連性ウイルス。アデノ関連性ウイルス(AAV)は、安定な部位特異的な方式で、それらが感染する細胞のゲノムに組み込まれることのできる比較的小さなサイズのDNAウイルスである。アデノ関連性ウイルスは、細胞増殖、形態、または分化への影響を誘発することなく広範囲の細胞に感染することができ、ヒトの病理には関係していないと考えられる。AAVゲノムはクローン化され、配列決定され、特性付けされている。in vitroおよびin vivoで遺伝子を伝達するためにAAVから誘導されたベクターを用いることが記載されている(WO91/18088、WO93/09239、US4797368、US5139941、EP488528を参照のこと)。本発明による複製欠損組換えAAVは、2つのAAV逆位末端反復(ITR)領域に脇を固められた対象となる核酸配列を含有するプラスミド、およびAAV包膜遺伝子(repおよびcap遺伝子)を有するプラスミドを、ヒト・ヘルパー・ウイルス(たとえば、アデノウイルス)に感染している細胞系に共トランスフェクションすることによって調製できる。その後、産生されたAAV組換え型を標準的な技法によって精製する。
【0084】
レトロウイルス・ベクター。他の実施形態において、たとえば、Anderson他、米国特許第5399346号、Mann等、Cell 33:153、1983、Temin他、米国特許第4650764号、Temin他、米国特許第4980289号、Markowitz等、J.Virol.62:1120、1988、Temin他、米国特許第5124263号、EP453242、EP178220、Bernstein等、Genet.Eng.7(1985)235、McCormick、BioTechnology 3(1985)689、Dougherty他による1995年3月16日公開の国際特許公開WO95/07358、およびKuo等、Blood 82:845、1993に記載されているように、遺伝子をレトロウイルス・ベクターに導入することができる。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組込みウイルスである。レトロウイルス・ゲノムは、2つのLTR、包膜配列、3つのコード領域(gag、pol、およびenv)を含む。組換えレトロウイルス・ベクターにおいて、gag、pol、およびenv遺伝子は一般に、全体的または部分的に除去され、対象となる異種核酸配列と置き換えられる。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス、たとえばHIV、MoMuLV(マウスモロニー白血病ウイルス)、MSV(マウスモロニー肉腫ウイルス)、HaSV(ハーベイ肉腫ウイルス)、SNV(脾臓壊死ウイルス)、RSV(ラウス肉腫ウイルス)、およびフレンドウイルスなどから構成することができる。適切なパッケージング細胞系統は従来技術に記載されており、特に細胞系PA317(US4861719)、PsiCRIP細胞系(WO90/02806)、およびGP+envAm−12細胞系(WO89/07150)である。さらに、組換えレトロウイルス・ベクターは、転写活性を抑制するためのLTP内の修飾、ならびにgag遺伝子の一部を含むことのできる延長包膜配列を含有することができる(Bender等、J.Virol.61:1639、1987)。組換えレトロウイルス・ベクターは、当分野の技術者に知られている標準的な技法によって精製される。
【0085】
レトロウイルス・ベクターはまた、DNAウイルスによって導入されることができ、それにより1サイクルのレトロウイルス複製が可能となり、トランスフェクション効率が増幅される(WO95/22617、WO95/26411、WO96/39036、WO97/19182を参照のこと)。
【0086】
レンチウイルス・ベクター。他の実施形態において、脳、網膜、筋肉、肝臓、および血液を含むいくつかの組織型で、導入遺伝子を直接送達し、持続発現させるための因子としてレンチウイルス・ベクターを用いることができる。このベクターは、それらの組織において分裂および非分裂細胞を有効に形質導入し、対象となる遺伝子の長期発現を維持することができる。概説として、Naldini、Curr.Opin.Biotechnol.、9:457−63、1998、さらにZufferey等、J.Virol.、72:9873−80、1998を参照されたい。レンチウイルス・パッケージング細胞系は入手可能であり、当分野で一般に知られている。これらは、遺伝子治療のための高力価レンチウイルス・ベクターの産生を促進する。例としては、テトラサイクリン誘導VSV−Gシュードタイプ・レンチウイルス・パッケージング細胞系であり、これは少なくとも3から4日間、106IU/mlを超える力価でウイルス粒子を産生することができる(Kafri等、J.Virol.、73:576−584、1999)。in vitroおよびin vivoで非分裂細胞を有効に形質導入するための必要に応じて、誘導細胞系によって産生されたベクターを濃縮することができる。
【0087】
非ウイルス・ベクター。他の実施形態において、ベクターは、naked DNAとしてリポフェクションによって、または他のトランスフェクション促進剤(ペプチド、ポリマーなど)を用いてin vivoで導入することができる。マーカをエンコードする遺伝子のin vivoトランスフェクションのリポソームを調製するために、合成カチオン脂質を用いることができる(Felgner等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413−7417、1987、FelgnerおよびRingold、Science 337:387−388、1989、Mackey等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8027−8031、1988参照、Ulmer等、Science 259:1745−1748、1993)。核酸を伝達するのに有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開WO95/18863、およびWO96/17823、ならびに米国特許第5459127号に記載されている。脂質は、標的化のために他の分子と化学的に結合することができる(上記のMackey等を参照のこと)。標的化ペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質、たとえば抗体、または非ペプチド分子などは、化学的にリポソームと結合することができる。
【0088】
他の分子も、in vivoでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用であり、たとえばカチオンオリゴペプチド(たとえば、国際特許公開WO95/21931)、DNA結合タンパク質から誘導されたペプチド(たとえば、国際特許公開WO96/25508)、またはカチオンポリマー(たとえば、国際特許公開WO95/21931)などである。
【0089】
さらに、in vivoでnaked DNAプラスミドとしてベクターを導入することも可能である。遺伝子治療に用いるnaked DNAベクターは、当分野で知られている方法、たとえばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用(弾道トランスフェクション)、またはDNAベクター・トランスポータの使用によって所望の宿主細胞に導入することができる(たとえばWu等、J.Biol.Chem.267:963−967、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.263:14621−14624、1988、Hartmut等、カナダ特許出願第2012311号、1990年3月15日出願、Williams等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2726−2730、1991を参照されたい)。受容体媒介DNA送達法も用いることができる(Curiel等、Hum.Gene Ther.3:147−154、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.262:4429−4432、1987)。米国特許第5580859号および第5589466号は、トランスフェクション促進剤を含まない外因性DNA配列の哺乳動物における送達を開示している。最近、比較的低電圧で効率の高い、電気伝達と呼ばれるin vivoのDNA伝達技法が記載された(Mir等、C.P.Acad.Sci.、321:893、1998、WO99/01157、WO99/01158、WO99/01175)。
【0090】
PCVポリペプチドの精製
そのようにして産生されたポリペプチドは回収し、好ましくは精製することができる。精製方法は当分野でよく知られている。精製方法には、これに限定されるものではないが、分取ディスク・ゲル電気泳動および等電点電気泳動;アフィニティ、HPLC、逆相HPLC、ゲル濾過またはサイズ排除、イオン交換、および分配クロマトグラフィ;沈降および塩析クロマトグラフィ;抽出、および向流分配が含まれる。目的によっては、タンパク質が精製を促進する追加の配列標識を含有するような組換え系でポリペプチドを生成することが好ましく、これに限定されるものではないが、たとえばポリヒスチジン配列、またはFLAGおよびGSTなどの抗体と特異的に結合する配列などである。次いでこのポリペプチドを、適切な固相マトリクスのクロマトグラフィによって、宿主細胞の粗溶解産物から精製することができる。別法として、タンパク質に対して、またはそれから誘導されたペプチドに対して産生された抗体を、精製試薬として用いることができる。
【0091】
抗PCV抗体
そのような抗体には、これに限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリが含まれる。
【0092】
PCVポリペプチド、あるいはその誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体を産生するために、当分野で知られる様々な手順を用いることができる。抗体の産生のために、抗原性ポリペプチドを注入することによって種々の動物を免疫化することができ、これに限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。好ましくは、免疫化動物は、抗体に対するアレルギー反応を回避するために、受動免疫法においてその抗体を受容する動物と同一の種である。
【0093】
PCVポリペプチドに対するモノクローナル抗体を調製するために、培養において連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いることができる。これらの技法には、これに限定されるものではないが、KohlerおよびMilsteinによって最初に開発されたハイブリドーマ技法(Nature 256:495−497、1975)、ならびにトリオーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozbor等、Immunology Today 4:72、1983、Cote等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026−2030、1983)、およびヒト・モノクローナル抗体を産生するためのEBV−ハイブリドーマ技法(Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、77−96頁、1985)が含まれる。本発明のさらなる実施形態では、モノクローナル抗体は、無菌動物において産生することができる(国際特許公開WO89/12690、1989年12月28日公開)。
【0094】
本発明によれば、単鎖抗体を産生するために記載された技法(Hustonの米国特許第5476786号および第5132405号、米国特許第4946778号)を、PCVポリペプチド特異単鎖抗体を産生するために適合させることができる。さらに、これらの遺伝子は、in vivoでの発現のために送達することができる。本発明のさらなる実施形態は、Fab発現ライブラリを構成するために記載された技法(Huse等、Science 246:1275−1281、1989)を用い、PCVポリペプチド、あるいはその誘導体または類似体に対する所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定を可能にする。
【0095】
抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、知られている技法によって産生することができる。たとえば、そのようなフラグメントには、これに限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生することのできるF(ab’)2フラグメント、F(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって産生することのできるFab’フラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって産生できるFabフラグメントが含まれる。
【0096】
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当分野で知られている技法によって達成することができ、たとえばラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(たとえば、金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる)、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ(たとえば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどである。一実施形態において、抗体結合は、1次抗体における標識を検出することにより検出することができる。他の実施形態において1次抗体は2次抗体または試薬の1次抗体との結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、2次抗体は標識される。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が当分野で知られており、それらは本発明の範囲内である。
【0097】
PCVのin vitroでの培養
本発明はさらに、ブタ・シルコウイルス株を培養する方法に関し、その方法は、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含む核酸を、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス粒子の産生をもたらす条件下で、適切な宿主細胞に導入することを含む。
【0098】
任意の型の非感染細胞、好ましくはブタ細胞(たとえば、Sus scrofa、またはTayassu tajacu由来の細胞)、より好ましくは神経誘導ブタ細胞(たとえば、グリア細胞)、ブタ腎細胞(たとえば、PK−15細胞)、またはブタ・マクロファージ細胞は、本発明のPCV核酸(たとえば、1本鎖、好ましくは2本鎖ゲノムDNA、あるいはPCVゲノムDNAを含む1つまたは複数のプラスミド)を細胞に導入することによって感染させることができる。宿主細胞系の感染またはトランスフェクションは、当分野で一般に知られている技法であり、当分野の技術を有する任意の実施者によって行うことができる。たとえば、実施例1は、PCVDNAを用いてPK−15細胞をトランスフェクトする手順を含む(クローン化PCVDNAのトランスフェクションおよびPCVの検出を参照されたい)。
【0099】
感染後、感染細胞系の1つまたは複数のクローンを選択し、増殖させることができる。選択されたクローンの細胞を貯蔵(たとえば、凍結)し、マスター細胞バンクとして用いることができ、そこから試料を取り、複数の使用細胞系を産生するために用いることができる。ワクチンの生成のために用いられ、かつウイルスタンパク質源として用いられるウイルス粒子は、この使用細胞系から得ることができる。詳細には、使用細胞系は、凍結マスター細胞系の試料を融解し、培養においてその細胞を増殖することによって産生することができ、その増殖細胞培養の細胞を使用細胞系として用いる。たとえば、マスター細胞系を融解し、多量の細胞を産生するために、Nunc Cell Factory(Nalge Nunc International、Rochester、NY)で増殖することができる。
【0100】
ウイルス粒子は、当分野の技術者に一般に知られている方法によって、使用細胞系から得ることができる。たとえば、使用細胞系の培養上澄み中のウイルス粒子を採取し、濾過し、精製して(たとえば、勾配遠心分離によって)、ワクチン生成に用いることができる。
【0101】
先天性振せんの診断
ブタ・シルコウイルスと先天性振せん(CT)とが関連するという証拠によって、本発明者等は、ブタまたはその子孫における先天性振せん(CT)の病因を診断する方法を提供することができ、その方法は、そのブタがブタ・シルコウイルスに感染しているかどうかを判別することを含む。
【0102】
本明細書では、「診断」という用語は、進行の任意の病期にある疾患の同定を指し、さらに胎児または新生子ブタがその疾患を発現する素因、または雌ブタが胎児にその疾患を伝染する素因を判別することを含む。
【0103】
本発明の診断方法は、1型または2型の任意のPCV株を検出することを含むことができる。2種の型間のPCV株の再分配を図3に示す。1型のPCV株には、より詳細には、PK−15PCV、または配列番号7の核酸配列を含むいわゆる「CT−PCV−7」株が含まれる。2型のPCV株には、より詳細には、配列番号1から配列番号6の任意の核酸配列を含む株が含まれる。PMWSに関連するPCV株(PMWS−PCV)も、この標的PCV株に含まれる。
【0104】
本発明の診断方法は、たとえば国際出願WO99/18214に概説されているとおり、当分野の技術者によく知られている標準的な技法で実施することができる。
【0105】
第1の実施形態において、感染の判別は、試験ブタの生物試料中のPCV核酸の存在を検出することを包含できる。
【0106】
第2の実施形態において、感染の判別は、試験ブタの生物試料中のPCVポリペプチドの存在を検出することを包含できる。
【0107】
第3の実施形態において、感染の判別は、試験ブタの生物試料中のPCVポリペプチドに対する抗体の存在を検出することによって行うことができる。
【0108】
生物試料は任意の種類であることができ、流体試料(血液、血漿、血清、脳脊髄液など)、あるいは器官または組織試料(神経節、肝臓など)を含む。より詳細には死後診断のために、中枢神経系から得た細胞または細胞抽出物を用いることができる。
【0109】
しかしながら、好ましい試験試料および方法は、農場において獣医師または動物飼育者によって容易に実施できるものである。したがって、ウエスタンブロット、免疫蛍光検査法、ELISA、または免疫クロマトグラフィは、これらの応用例に非常によく適合する。
【0110】
ELISAアッセイでは、本発明のポリペプチド、またはそのエピトープ・フラグメントを、選択された表面上、たとえばポリスチレンのマイクロタイタ・プレートのウェルなどタンパク質を結合することのできる表面上に固定する。不完全に吸着されたポリペプチドを洗浄によって除去した後、試験試料に対して抗原性が中性であることが知られているウシ血清アルブミン(BSA)溶液などの非特異タンパク質を、選択された表面に結合することができる。これによって固定化表面の非特異吸着部位が遮断され、したがって抗血清の表面への非特異結合によって起こるバックグラウンドが低減される。次いで固定化表面を、免疫複合体(抗原/抗体)が形成されるようなやり方で、試験される臨床材料または生物材料などの試料と接触させる。これには、試料を、BSA溶液、ウシ・ガンマグロブリン(BGG)、および/またはリン酸緩衝食塩水(PBS)/Tweenなどの希釈剤で希釈することを含むことができる。その後、2から4時間、約25℃から37℃程度の温度で、試料をインキュベートする。インキュベーションに続いて、試料に接触した表面を洗浄して、非免疫複合体化材料を除去する。洗浄手順には、PBS/Tween、またはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄することを含むことができる。試験試料と結合ポリペプチドとの間の特異的免疫複合体の形成、その後の洗浄に続いて、第1の抗体に対して特異性を有する第2の抗体にその免疫複合体を供することによって、免疫複合体形成の発生を判別し、さらにはその量まで求めることができる。検出手段を提供するために、第2の抗体は、たとえば適切な色素形成基質と共にインキュベートすることによって発色を生じる酵素活性など、関連した活性を有することができる。次いで、たとえば可視スペクトル分光計を用いて発色の程度を測定することによって、定量化を行うことができる。
【0111】
免疫クロマトグラフィ技法に関して、当分野の技術者は、F.Zurk等のClin.Chem.31/7、1141−1150(1985)、ならびに特許および特許出願WO88/08534、WO91/12528、EP291176、EP299428、EP291194、EP284232、US5120643、US5030558、US5266497、US4740468、US5266497、US4855240、US5451504、US5141850、US5232835、US5238652に詳細な情報を見出すことができる。
【0112】
別法には、生物試料中のPCV核酸の存在を検出するために、オリゴヌクレオチドなどの核酸配列を用いることが含まれる。
【0113】
この目的のために、当分野の技術者は、溶液ハイブリダイゼーションにおいて、および固相法を用いる実施形態において、ハイブリダイゼーション・プローブを用いることができる。固相法を含む実施形態において、選択されたマトリクスまたは表面に試料を吸着させるか、あるいは付着させる。次いで、固定1本鎖核酸を、選択されたプローブと共に特異ハイブリダイゼーションに供する。
【0114】
他の実施形態において、当分野の技術者は、生物試料に潜在的に存在する標的PCV核酸を特異的に増幅するために、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)などの増幅技法において、オリゴヌクレオチド・プライマーを用いることができる。そのようなプライマーの例を、実施例1の表1に示す。
【0115】
先天性振せんの予防および治療
本発明は、先天性振せんを予防または治療するための、ワクチン接種、または受動免疫化を企図する。本発明の抗原性または免疫原性組成物は、ブタ・シルコウイルスによる感染からブタまたはその子孫を防御するために、広く適用可能である。本明細書では、「防御する」という用語は、PCV感染および先天性振せんの治療または予防を意味する。したがって、この種の感染に対して感受性である任意の動物にワクチン接種することができる。ブタは任意の年齢で治療することができ、新生子ブタを含む。雌ブタの治療は、胎児を防御するために特に有用である。
【0116】
本発明は、より詳細には、シルコウイルス抗原、獣医学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤、さらに通例は獣医学的に許容されるアジュバントを含む抗原性または免疫原性組成物に関する。
【0117】
免疫原性組成物は、免疫応答を誘導し、その必要はないが防御的であり得る。ワクチン組成物は、防御反応を誘導する。したがって、「免疫原性組成物」という用語は、ワクチン組成物を含む(前者は防御的組成物であり得る)。
【0118】
本発明の主題はさらに、先天性振せんに対する免疫化またはワクチン接種の方法であって、ブタ・シルコウイルスに対する免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む。この免疫化またはワクチン接種の方法は、特に以下に定義されるワクチンを用いる。
【0119】
したがって本発明の主題は、先天性振せん(CT)に対する抗原性製剤であり、少なくとも1種のブタ・シルコウイルス(PCV)抗原を含む。この抗原は、弱毒化生全PCV、不活性化全PCV、サブユニット抗原、組換え生ベクター、またはDNAベクターからなることができる。
【0120】
全PCVワクチン
本発明の主題は、単離ブタ・シルコウイルス株であり、配列番号1から配列番号7の任意の配列の、任意のORF1からORF11からなる群から選択された核酸配列を含むゲノムを有する。これらの配列を承知する当分野の技術者は、ビリオンの精製製剤を得ることができる。
【0121】
これらのウイルスは、先天性振せんに対してブタにワクチン接種するための抗原性組成物に用いることができる。この目的のために、以下に記載するとおり、当分野の技術者によく知られている標準的な技法によって、ウイルス粒子を弱毒化、不活性化、または不活化することができる。
【0122】
シルコウイルス抗原性製剤を生成するために、細胞、特に細胞系、たとえばPK/15細胞における継代後、シルコウイルスを得ることができる。場合によって標準的な技法で精製した、培養上澄みまたは抽出物を抗原性製剤として用いることができる。
【0123】
弱毒化抗原性製剤、および弱毒化免疫原性組成物またはワクチンというコンテクストにおいて、弱毒化は、慣例的な方法によって行うことができ、たとえば細胞での継代、好ましくはブタ細胞での継代、PK/15など、特に細胞系での継代による(たとえば継代50から150、特に100程度)。これらの免疫原性組成物およびワクチンは一般に、獣医学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤、場合によってはさらに獣医学的に許容されるアジュバント、ならびに場合によっては凍結乾燥安定剤を含む。
【0124】
これらの抗原性製剤、免疫原性組成物、およびワクチンは、好ましくは、TCID50 103から107の対象弱毒化ウイルスを含むことになる。
【0125】
それらは、不活性化全抗原をベースとする抗原性製剤、免疫原性組成物およびワクチンであることができる。不活性化免疫原性組成物およびワクチンはさらに、獣医学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤、場合によってはさらに獣医学的に許容されるアジュバントを含む。
【0126】
本発明によるシルコウイルスは、存在する可能性のある分画と共に、当分野の技術者に知られている技法によって不活性化される。不活性化は、好ましくは、化学的経路によって、たとえばホルムアルデヒド(ホルマリン)、パラホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、またはエチレンイミン、あるいはその誘導体などの化学薬剤に抗原を暴露することによって行われる。本発明において不活性化の好ましい方法は、化学薬剤、特にエチレンイミン、またはβ−プロピオラクトンへの暴露であろう。
【0127】
抗原性製剤、免疫原性組成物、およびワクチンは、好ましくは、TCID50が105から108の当該不活性化全ウイルスを含むことになる。
【0128】
好ましくは、本発明による弱毒化または不活性化抗原性製剤、ならびに弱毒化または不活性化免疫原性組成物およびワクチンにはアジュバントが補足され、有利には、当分野の技術者によく知られる技法に従って、エマルジョン、たとえば油中水型、または水中油型の形態で提供される。有効成分に慣例的なアジュバント化合物を組み込むことで、アジュバントの特性を得ることも可能である。
【0129】
用いることのできるアジュバントのなかで、例として挙げることができるのは、水酸化アルミニウム、サポニン(たとえば、QuillajaサポニンまたはQuilA、Vaccine Design、The Subunit and Adjuvant Approach、1995、Michael F.Powel、Mark J.Newman編、Plennum Press、New York、London、210頁を参照のこと)、Avridine.RTM.(Vaccine Design 148頁)、DDA(臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Vaccine Design 157頁)、ポリホスファゼン(Vaccine Design 204頁)、あるいは鉱油をベースとする水中油型エマルジョン、スクアレン(たとえば、SPTエマルジョン、Vaccine Design 147頁)、スクアレン(たとえば、MF59、Vaccine Design 183頁)、または代謝可能な油をベースとする油中水型エマルジョン(好ましくはWO94/20071による)、ならびに米国特許第5422109号に記載のエマルジョンである。アジュバントの組合せ、たとえばエマルジョンと組み合わせたAvridine.RTM.またはDDAを選択することも可能である。
【0130】
凍結乾燥安定剤として、例として挙げることができるのは、SPGA(Bovarnik等、J.Bacteriology 59、509、950)、炭水化物、たとえばソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、またはグルコースなど、タンパク質、たとえばアルブミン、またはカゼインなど、これらの化合物の誘導体、または緩衝剤、たとえばアルカリ金属リン酸塩などである。
【0131】
サブユニットおよびベクター・ワクチン
本明細書では、「サブユニット抗原」という用語は、抗原性PCVポリペプチド、またはその抗原性フラグメントを指す。「サブユニットまたはポリペプチド・ワクチン」という用語は、免疫原性ポリペプチド、および通例はアジュバントを含むワクチンを指す。
【0132】
「ベクター・ワクチン」は、「組換え生ベクター」、または「DNAベクター」を含む。
【0133】
本明細書では、「組換え生ベクター」という用語は、in vivoまたはex vivoワクチン接種のための抗原性または免疫原性ポリペプチドを発現するために用いられるベクターを指す。好ましいベクターは、DNAをベースとするベクター、およびレトロウイルス・ベクターなどのウイルス・ベクターである。適切な生ベクターとして、好ましく用いることができるのは、当分野の技術者によく知られている技法に従って、好ましくはブタにおいて増殖することができ、ブタに対して非病原性の(天然に非病原性であるか、あるいはそのようにされた)生ウイルスである。特に用いることができるのは、パルボウイルス(US6217883)、ブタ・ヘルペスウイルス、たとえばアウエスキー病ウイルスなど、ブタ・アデノウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリ・ポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ブタ痘ウイルスである。DNAベクターも、ベクターとして用いることができる(WO90/11092、WO93/19813、WO94/21797、WO95/20660)。一般に、ベクターはin vivoで投与されるが、適切な抗原呈示細胞、たとえば樹状細胞などのex vivo形質導入、その形質導入細胞のin vivo投与も企図される。
【0134】
他の実施形態において、ベクターは、naked DNAとして、または他のトランスフェクション促進剤(ペプチド、ポリマーなど)と共にリポフェクションによってin vivoで導入されることのできるDNA分子の形態であることができる。この実施形態は、本明細書において「DNAベクター」技術と呼ばれる。in vivoトランスフェクションのためのリポソームを調製するために、合成カチオン脂質を用いることができる(Felgner等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413−7417、1987、FelgnerおよびRingold、Science 337:387−388、1989、Mackey等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8027−8031、1988参照、Ulmer等、Science 259:1745−1748、1993)。核酸の伝達に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開WO95/18863、およびWO96/17823、ならびに米国特許第5459127号に記載されている。脂質は、標的化のために他の分子と化学的に結合することができる(上記のMackey等を参照のこと)。標的ペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質、たとえば抗体、または非ペプチド分子などは、化学的にリポソームと結合することができる。他の分子も、in vivoでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用であり、たとえばカチオンオリゴペプチド(たとえば、国際特許公開WO95/21931)、DNA結合タンパク質から誘導されたペプチド(たとえば、国際特許公開WO96/25508)、またはカチオンポリマー(たとえば、国際特許公開WO95/21931)などである。さらに、in vivoでnaked DNAプラスミドとしてベクターを導入することも可能である。遺伝子治療に用いるnaked DNAベクターは、当分野で知られている方法、たとえばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用(弾道トランスフェクション)、またはDNAベクター・トランスポータの使用によって所望の宿主細胞に導入することができる(たとえばWu等、J.Biol.Chem.267:963−967、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.263:14621−14624、1988、Hartmut等、カナダ特許出願第2012311号、1990年3月15日出願、Williams等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2726−2730、1991を参照されたい)。受容体媒介DNA送達法も用いることができる(Curiel等、Hum.Gene Ther.3:147−154、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.262:4429−4432、1987)。米国特許第5580859号および第5589466号は、トランスフェクション促進剤を含まない外因性DNA配列の哺乳動物における送達を開示している。最近、比較的低電圧で効率の高い、電気伝達と呼ばれるin vivoのDNA伝達技法が記載された(Mir等、C.P.Acad.Sci.、321:891、1998、WO99/01157、WO99/01158、WO99/01175)。
【0135】
ワクチン接種方法
先天性振せんに対して対象にワクチン接種するために、種々の方法を用いることができる。ポリペプチド・ワクチン製剤は、皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、真皮下(s.d.)、真皮内(i.d.)によって、または抗原呈示細胞へのex vivo投与、それに続く細胞の対象への投与によって送達することができる。
【0136】
同様に、たとえば遺伝子銃または直接注入などによる、naked DNAおよびRNA送達など、上に記載した任意の遺伝子送達方法を、対象にベクター・ワクチンを投与するために用いることができる。
【0137】
ワクチン接種の有効性は、免疫刺激分子、たとえば免疫刺激または免疫増強活性サイトカイン、リンホカイン、またはケモカインを、そのワクチン、特にベクター・ワクチンと併用投与することによって増強することができる。たとえば、サイトカインまたはサイトカイン遺伝子、たとえばインターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13、顆粒球マクロファージ(GM)コロニー刺激因子(CSF)、マクロファージ炎症因子など、ならびにいくつかの主要共刺激分子またはその遺伝子(たとえば、B7.1、B7.2)を用いることができる。
【0138】
粘膜ワクチン接種。感染は多くの場合粘膜を経て起こるので、粘膜ワクチン方法は多くの病原性細菌に関して特に有効である。したがって、ポリペプチド、およびDNAワクチンの両方に関して粘膜ワクチン接種方法が企図される。粘膜はワクチンの局所送達によって標的とされることができる一方、種々の方法が免疫原性タンパク質を粘膜に送達するために用いられてきた(これらの方法には、たとえばベクター標的タンパク質として特定の粘膜標的タンパク質を用いることによって、または粘膜標的タンパク質との混合剤でワクチン・ベクターを送達することによってDNAワクチンを送達することも含む)。
【0139】
たとえば特定の実施形態において、免疫原性ポリペプチドまたはベクター・ワクチンを、コレラ毒素B、またはコレラ毒素A/Bキメラなどのコレラ毒素との混合剤で、あるいはコレラ毒素との複合体またはキメラfustionタンパク質として、投与することができる(Hajishengallis等、J Immunol.、154:4322−32、1995、JoblingおよびHolmes、Infect Immun、60:4915−24、1992)。コレラ毒素Bサブユニットの使用に基づく粘膜ワクチンは、これまでに記載されている(LebensおよびHolmgren、Dev Biol Stand 82:215−27、1994)。他の実施形態において、易熱性エンテロトキシン(LT)との混合剤を、粘膜ワクチン接種のために調製することができる。
【0140】
他の粘膜免疫化方法には、免疫原をマイクロカプセルに被包すること(米国特許第5075109号、第5820883号、および第5853763号)、および免疫増強活性膜様担体を用いること(WO98/0558)が含まれる。経口投与された免疫原の免疫原性は、赤血球(rbc)、またはrbcゴーストを用いることによって(米国特許第5643577号)、またはブルータング抗原を用いることによって(米国特許第5690938号)増強することができる。標的化免疫原の全身投与も、粘膜免疫化をもたらすことができる(米国特許第5518725号を参照)。
【0141】
粘膜組織での発現のために遺伝子を送達するために、キメラ・ライノウイルス(米国特許第5714374号)、アデノウイルスの使用、または核酸の特異標的化(WO97/05267)など、種々の方法を用いることができる。
【0142】
受動免疫化
上に記載した能動免疫化ワクチン接種方法に加えて、本発明はさらに、好ましくはPCV抗原に対して産生されたPCV抗原反応性抗体による受動免疫化を企図する。受動免疫化は、宿主の免疫機構が応答できる以前の初期感染または確立感染に対して特に有効である。
【0143】
受動免疫化に用いる抗体源の1つは、感染宿主と同一種の罹患動物の回復期血清から得られる。したがって、たとえば、好ましくはPCVポリペプチドに対する親和精製によってブタ血清から抗体を単離し、新しく感染したブタを受動的に免疫化するために用いることができる。
【0144】
別法として、抗体を免疫原性ポリペプチドに対して産生することができ、すなわちワクチン方法を、受動免疫化の抗体を産生するためにも用いることができる。
【0145】
本発明の抗PCV抗体は、交叉反応性であることができ、たとえば種々のPCV株を認識することができる。ポリクローナル抗体は、交叉反応性である可能性が高い。
【0146】
先天性振せんに対する防御免疫のイムノアッセイ
他の実施形態において、本発明の免疫原性ポリペプチドは、ブタの先天性振せんに対する防御抗体を検出するためのイムノアッセイに用いることができる。本発明の発見に基づいて、高力価のPCV抗原との(特異的な)抗体反応性は、その個体がPCVによる感染から、したがって先天性振せんから防御されている可能性を示す。PCV抗原との低い、または検出されない抗体反応性は、その個体が感染から防御されていない可能性を示す。
【0147】
本発明のイムノアッセイは、たとえば回復期血清など、PCV感染に暴露された対象において抗体レベルを検出するために用いることができる。このイムノアッセイはさらに、未知の状態の対象において抗体を検出するために用いることもできる。そのような対象の高レベルの抗体力価は、PCVへの事前暴露、および防御免疫性の可能性を示す。最後に、このイムノアッセイは、本発明のワクチンの有効性を評価するために用いることができる。
【0148】
上述の任意のイムノアッセイ方式を、本発明のイムノアッセイに用いることができる。好ましくは、PCVポリペプチドを固相に吸着させ、血清(好ましくは段階希釈中)を固相に接触させ、たとえば血清中の抗体に特異的な標識抗体を用いて抗体結合を検出するELISAアッセイを用いる。別法として、血清試料中の抗PCV抗体が、たとえば上述のとおり調製されたPCVポリペプチドに特異的な標識抗体に対して固相ポリペプチドへの結合を競合する、競合ELISA方式を用いることができる。さらなる別法においては、ポリペプチドを標識し、そのポリペプチドに特異的な抗体を、固相支持体に吸着させる。生物試料(たとえば、血清)中に抗体が存在すると、ポリペプチドに対する競合が生じ、標識の吸着抗体への結合を妨げることになる。さらに、以下に記載する都合のよいクロマトグラフィ・イムノアッセイ方式を用いることができる。
【0149】
ここに記載したイムノアッセイは、血清における抗PCV抗体の存在を試験することに関しているが、抗体を提供する任意の生物試料を試験することができ、これらに限定することなく、血液、血清、血漿、組織試料、リンパ、粘膜分泌物、痰、滑液、および他の炎症性流体などが含まれる。
【0150】
キット
イムノアッセイを実施するための構成要素は、都合よくキット形態で提供することができる。もっとも基本的な実施形態において、本発明のキットは、PCVポリペプチド、および試験される対象の抗体に特異的な標識抗体などの抗体検出剤を提供する。それぞれの量を予め測定して、規定数のアッセイを提供することができる。
【0151】
さらなる実施形態において、このキットは、プレートなどの、好ましくはプラスチック、またはタンパク質の非特異結合を回避するように処理された材料のアッセイ容器を含む。本明細書では、容器という用語はもっとも広範な意味を有し、すなわち材料または試薬を保持するための任意の入れ物である。この容器は、ガラス、プラスチック、セラミック、金属などから製造することができる。
【0152】
さらなる実施形態において、このキットは、PCVポリペプチド、またはPCVポリペプチドに特異的な抗体いずれか1種の試薬が不可逆的に結合した、免疫クロマトグラフィ膜または支持体を含む。免疫クロマトグラフィ・アッセイに関して当分野で知られている多くの方法および装置を、本発明において用いることができる。上述のとおり、免疫クロマトグラフィ・アッセイは、実験室の機器が利用できない野外条件下で特に有用である。そのようなアッセイの例は、米国特許第5248619号、第5451504号、第5500375号、第5624809号、および第5658801号に記載されている。
【0153】
本発明のキットは、好ましくは、包装、および、たとえば包装上の、または包装に挿入された使用説明書を含む。
【0154】
複合法
複合免疫化またはワクチン接種プログラムに関して、ブタ・シルコウイルスに対する免疫化またはワクチン接種を、他のブタ病原体、特にPMWS症候群に関連する病原体に対する免疫化またはワクチン接種と組み合わせることも可能である。したがって、本発明による免疫原性組成物またはワクチンは、パルボウイルス(US6217883)から、PRRS(ブタ繁殖呼吸障害症候群)、および/またはMycoplasma hyopneumoniae、および/または大腸菌、および/または萎縮性鼻炎、および/または仮性狂犬病(アウエスキー病)ウイルス、および/またはブタ・インフルエンザ、および/またはアクチノバチルス胸膜肺炎、および/またはブタ・コレラ、およびそれらの組合せから選択された別のブタ病原体に対応する別の価を含むことができる。好ましくは、本発明による免疫化またはワクチン接種プログラム、およびワクチンは、シルコウイルスに対する免疫化またはワクチン接種と、PRRS(WO93/07898、WO94/18311、FR−A−2709966、C.Charreyre等、Proceedings of the 15.sup.th.IPVS Congress、Birmingham、England、7月5−9、1998、139頁)、および/またはMycoplasma hyopneumoniae(EP−A−597852、EP−A−550477、EP−A571648、O.Martinon等、157、284、285頁、およびG.Reynaud等、150頁、すべてProceedings of the 15.sup.th.IPVS Congress)、および/またはブタ・インフルエンザと組み合わせられる。したがって、本明細書に記載のとおり、ブタ・シルコウイルスに対する免疫原性組成物またはワクチンと組み合わせるために、任意の適切な形態の免疫原性組成物またはワクチン、特に任意の市販のワクチンを用いることが可能である。
【0155】
したがって、本発明の主題はさらに、多価免疫原性組成物およびワクチン、多ワクチンキット、およびそのような複合免疫化またはワクチン接種プログラムの使用を可能にする複合免疫化またはワクチン接種方法である。
【0156】
本発明は以下の実施例を参照することによってよりよく理解されるであろうが、実施例は例示のために示されるものであって、本発明を限定するものではない。
【0157】
【実施例】
実施例I:ブタの先天性振せんに関連するブタ・シルコウイルスの配列分析
方法
PCV感染組織試料および細胞系:PCVに感染したブタを、米国インディアナ州の農場から得た。ブタは最初に、PMWSまたはCTいずれかの徴候によって、続いて組織切片の顕微鏡検査によって識別した。組織中のPCVの存在は、さらにPCV特異オリゴヌクレオチド・プローブを用いるin situハイブリダイゼーション、PCVに対する抗血清を用いる間接蛍光抗体アッセイ(IFA)、およびPCVに特異的なプライマーを用いるPCRによって確認した。PMWSの徴候を示すブタから採取した4種のPCV単離株は、PMWS−PCV−P1、PMWS−PCV−P2、PMWS−PCV−P3、およびPMWS−PCV−P4と命名した。CTの徴候を示すブタから採取した2種のPCV単離株は、CT−PCV−P5、およびCT−PCV−P6と命名した。
【0158】
歴史上重要なPCV単離株を単離するために、PCV混入細胞系(PCNS)を、CTの徴候を示すブタの脳から誘導した。妊娠した雌ブタに、CTブタ腎細胞から得た細胞培養上澄みを実験的に接種した(GustafsonおよびKanitz、1974)。PCNS細胞を、10%FetalCloneIII(HyClone,Inc.)を含有するイーグル最小必須培地(EMEM)[Life Technologies,Inc.]中で増殖した。細胞を採取し、PCV特異オリゴヌクレオチド・プローブを用いるin situハイブリダイゼーション、電子顕微鏡検査(EM)、およびPCV特異プライマーを用いるPCRによって、PCVに関して試験した。このPCV単離株は、CT−PCV−P7と命名した。
【0159】
DNA単離およびPCR:細胞が培地で浮動を開始したときに、EMEMで増殖させたPCNS細胞を採取した。細胞ペレットを、SDSプロナーゼ(10mMのTris、pH7.4、10mMのEDTA、および0.5%のSDS中プロナーゼ500μg/ml)で溶解し、一晩37℃でインキュベートした。全細胞DNAを、フェノールの抽出、続いてエタノールの沈殿によって単離した。
【0160】
PMWS−PCV−P1、P2、P3、P4、およびCT−PCV−P6のリンパ節、ならびにCT−PCV−P5の肝臓を、ティシュマイザ(tissumizer)を用い、続いて音波破砕機を用いる音波破砕によってEMEM中で均質化した。組織ホモジネートを、等量のSDS−プロナーゼ(20mMのTris、pH7.4、20mMのEDTA、および1%のSDS中プロナーゼ1mg/ml)と共に、一晩37℃でインキュベートした。フェノール抽出、およびエタノール沈殿によって、全細胞DNAを得た。全PCVゲノムを増幅するための2対のプライマーと共にVent DNAポリメラーゼ(New England BioLab)を用いるPCRに、このDNAをテンプレートとして用いた。PMWS−PCV−P1、P2、およびP3、CT−PCV−P5、およびP6に対して、PCV2−1およびPCV2−2と、PCV2−3およびPCV2−4のプライマー・セットを用いた(表1)。PMWS−PCV−P4に対しては、PCV2−1およびPCV2−2と、PCV4−1およびPCV4−2のプライマー・セットを用いた(表1)。CT−PCV−P7に対しては、PCV1−3およびPCV1−4と、PCV7−1およびPCV7−2のプライマー・セットを用いた(表1)。PCR産物を、1%アガロース・ゲルで分析し、UVトランスイルミネータで視覚化した。
【表1】
【0161】
PCR産物のクローニング:PCR産物を、T4DNAリガーゼ(New England BioLab)を用いる平滑末端ライゲーションによって、pUC18のSmaI部位にクローン化した。PMWS−PCV−P1、−P2、および−P3の全ゲノムを構成するために、PCV2−1および2プライマーで増幅したnt1076−679のPCR産物、PCV2−3および4プライマーで増幅したnt7−1657のPCR産物を含有するpUC18を、StuIおよびKpnIを用いて消化した。PCV2−1および2で増幅したPCR産物を含有するpUC18の4kbのStuI−KpnIフラグメントを用いて、PCV2−3および4で増幅したPCR産物を含有するpUC18の1.3kbのStuI−KpnIフラグメントを挿入し、ヌクレオチド1076−1768、および1−1657のPCVゲノムを含有するpUC18を生じた。結果として生じたPMWS−PCV−P1、−P2、または−P3いずれかのゲノムを含有するプラスミドを、それぞれ、pPCV−P1、pPCV−P2、およびpPCV−P3と命名した。これらのプラスミドをSacII135で消化して、完全PCVゲノムの線形化形態を産生した。同様に、他のPCV株から得たPCR産物も、平滑末端ライゲーションによって、pUC18のSmaI部位でクローン化した。プラスミドDNAを、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配中、等密度遠心分離によって精製した(Sambrook等、Molecular cloning:A laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989)。
【0162】
クローンPCVDNAのトランスフェクションおよびPCVの検出:PCVDNA(PPCV−P1、−P2、および−P3)の全ゲノムを含有するプラスミドをSacIIで消化して、2つのフラグメント、全PCVゲノムDNA、pUC18とPCVDNAの一部、を生じた。6ウェル・プレート中のPCVを含まないPK−15細胞の半融合単一層を、リポフェクチン媒介トランスフェクション・プロトコル(Life Technologies,Inc.)を用いて、1μgのライゲートしたPCVゲノムでトランスフェクトした。細胞を3回継代した。3回目の継代後、細胞を採取し、サイトスピンし、アセトンで固定した。ウサギで作製したPMWS−PCVに対するポリクローナル抗体を(MorozovおよびPaul、Iowa State University、Ames、Iowa)、IFAに用いた。EMのために、細胞ペレットに水を加え、細胞内容物を5分間10000rpmで遠心分離した。上澄みを集め、40分間20000rpmで遠心分離した。細胞ペレットを、3%リンタングステン酸、および1%ウシ血清アルブミンを含有する水に再懸濁した。試料を、炭素被覆グリッド上で霧状にし、Philips201電子顕微鏡で検査した。
【0163】
DNA配列決定および配列分析:PCVDNAを含有するプラスミドを、ユニバーサル・プライマーおよびリバース・プライマーを用いて配列決定した。その後、DNAの両株を、応用Biosystems373A自動配列装置を用いて、プライマー・ウォーキングによって配列決定した。7種のPCV単離株(PMW−PCV−P1、−P2、−P3、−P4、およびCT−PCV−P5、−P6、および−P7)の全ゲノムを、GCG配列分析ソフトウェア(Wisconsin package)を用いて分析した。
【0164】
系統発生の算出:ClustalWプログラムによって、配列アライメントを得た。系統発生の算出を、PHYLIPプログラム・パッケージ、バージョン3.572cによって行った(Felsenstein、Cladistics 5:164−166、1989)。最大節約分析のために、ProtparsまたはDNAparsプログラムを用いた。距離分析のために、Protdist(DayhoffPAM001マトリクス)またはDNAdist(Kimura2パラメータ)、続いてFitch(全体的な再配列を伴う)を適用した。ブートストラップ分析の間、上記の算出をSeqboot(100データ・セット)によって進め、続いてConsensusプログラムによって、コンセンサス系統樹を得た。最後に、Tree Viewプログラムによって結果を視覚化した(Page、Computer Applications in the Biosciences 12:357−358、1996)。応用した方法のより詳細な説明は他に発表されている(HarrachおよびBenko、Adenovirus Methods and Protocols Methods in Molecular Medicine、21:309−339、1998)。
【0165】
結果
PCVを含まないPK−15細胞のPCVDNAによるトランスフェクション。最初に、PMWSに関連する3種のPCV単離株(PMWS−PCV−P1、−P2、および−P3)の全ゲノムを、2組のプライマーを用いてPCRによって増幅した。PCR産生フラグメントを用いて、PCVゲノムを含有するプラスミド(pPCV−P1、−P2、および−P3)を構成した。これらのプラスミドをSacIIで消化して、完全PCVゲノムの線状形態を得た。クローンPCVゲノムが感染しているかどうかを試験するために、SacII消化再ライゲート、または非ライゲートpPCV−P1、−P2、および−P3を用いて、PCVを含まないPK−15細胞をトランスフェクトした。3回の継代後に細胞を採取し、IFAによってPCV抗原の存在を分析した。IFAによって、SacII消化再ライゲートPCVDNAでトランスフェクトしたいくつかの細胞はPCV抗原に対して陽性であり、それに対して、SacII消化非ライゲートPCVDNAでトランスフェクトした細胞はPCV抗原に対して陰性であった。PCVDNAによるトランスフェクションがPCVビリオンの産生をもたらすのかどうかをさらに確認するために、PCVDNAでトランスフェクトしたPK−15細胞をEMによって分析した。直径約17nmの小さい球状ウイルスが認められた。PCVDNAでトランスフェクトした細胞におけるPCV抗原の検出、およびウイルス粒子の観察は、クローン全長環状PCVDNAが、ウイルスの複製、およびウイルス粒子の産生をもたらすことを示した。PCRによって増幅されたこの全長PCVゲノムは感染性であったので、本発明者等はPCR技法を用いて、他のPCV野外株のゲノムを増幅した。
【0166】
PMWS−PCVと、旧および新CT−PCV単離株の配列比較。本発明者等は、PMWSに関連する4種のPCV単離株(PMWS−PCV−P1、−P2、−P3、および−P4)、1990年代終わりのCTに関連する2種のPCV単離株(CT−PCV−P5、および−P6)、および1960年代終わりのCTに関連する1種のPCV単離株(CT−PCV−P7)の全ゲノムを配列決定した。これらの単離の配列を、以前に記載されたPMWS−PCV単離株(Hamel等、1998)、およびPK−15−PCV単離株(Meehan等、Journal of General Virology 78:221−227、1997)の配列と比較した。PMWS−PCV−P1、−P2、および−P4のゲノムは1768ヌクレオチド(nt)の長さであり、それに対してPMWS−PCV−P3は、820と825ntとの間で6ntが欠失しているため、他のPMWS−PCV単離株よりも6ヌクレオチド短かった(図1)。本発明のすべてのPMWS−PCV単離株は、互いに全体で99%のnt配列同一性を有した。PMWS−PCV−P1の各ORFの配向、および相対的長さを示す(図2A)。PMWS−PCVのゲノムにおける各ORFのコーディング鎖、アミノ酸数、および位置を表に示す(表2)。
【表2】
【0167】
ORF1のアミノ酸配列は、これらのすべてのPMWS−PCV単離株の間で高度に相同性であった(アミノ酸レベルで約99%の相同性)。これらのPMWS−PCV単離株のいくつかのORFにおいて認められたアミノ酸残基の変化を表に示す(表3)。ORF2は、ORF1と比較してPMWS−PCVの間でアミノ酸変化が多かったが、それでも約97%の相同性を有した。オープン・リーディング・フレーム3、4、7、および8は、PMWS−PCV単離株の間で同一であり、他のORFでは少数のみが変化していた(表3)。
【表3】
【0168】
PMWS−PCV−P4のORF、およびPMWS−PCV−P3のORF10は、本発明の他のPMWS−PCV単離株の対応するORFと比べて、それぞれアミノ酸54個、および26個長かった。
【0169】
1990年代終わりに単離された2種の新しいCT−PCV単離株(CT−PCV−P5、および−P6)は、1768ntの長さであった(図2)。これらのCT−PCVは、約99%のnt配列同一性を有した。興味深いことに、新しいCT−PCV単離株はさらに、新しいPMWS−PCV単離株と、約99%のnt配列同一性を示した。PMWS−PCV−P1とCT−PCV−P5のゲノムは同一であった。PMWS−PCVおよび新しいCT−PCVのゲノムは共に11の潜在ORFをエンコードする。PMWS−PCV−P1のORFと比較した新しいCT−PCVの種々のORFにおけるアミノ酸変化を表に示す(表3)。
【0170】
古いCT−PCV(CT−PCV−P7)のゲノムは、1759ヌクレオチドの長さであった(図1)。CT−PCV−P7のゲノムも、11の潜在ORFをエンコードした。各ORFの配向、相対的長さを図2Bに示す。
【0171】
CT−PCV−P7の各ORFのアミノ酸数、および位置を示す(表4)。
【表4】
【0172】
CT−PCV−P7のゲノムは、PMWS−PCV、および両方の新しいCT−PCVとわずか約72%のnt配列同一性を有したが、驚くことにPK−15−PCVと約98%のnt配列同一性を共有した。CT−PCV−P7のすべてのORFのアミノ酸配列も、PK−15−PCVのORFと高度に相同性であった。PK−15−PCVのORFと比較したCT−PCV−P7の種々のORFにおけるアミノ酸変化を表に示す(表3)。
【0173】
Meehan等、J Gen Virol 78:221−227、1997は、PK−15−PCVのステム・ループ構造の先端にノナヌクレオチド配列の存在を認めており、これは植物のナノウイルスおよびジェミニウイルスで述べられたものと類似していた。本発明のすべてのPCV単離株は、ステム・ループ構造およびノナヌクレオチド(A/TAGTATTAC)を保存しており、これはローリング・サークル型DNA複製の起点を表す(Mankerts等、Journal of Virology 71:2562−2566、1997、Journal of General Virology 79:381−384、1998)。以前にHamel等(1998)によって報告されている潜在的なグリコシル化部位(N−X−T、またはN−X−S、Xは任意のアミノ酸)は、6位でアミノ酸残基「N」が「D」と置き換わっているCT−PCV−P7のORF6を除いて、本発明のすべてのPCV単離株で保存された。
【0174】
系統発生分析:複製関連タンパク質(ORF1/レプリカーゼ/rep/coat/P35.8タンパク質)、およびタンパク質P27.9(ORF2)などの個々のタンパク質の推定アミノ酸配列、または完全ゲノムのヌクレオチド配列を系統発生分析に用いたとき、距離マトリクスおよび最節約分析は共に、かなり類似したトポロジーを有する2つの別個の集団を生じた。株間の相違は適度なものであり、距離マトリクス分析がより一貫性のあるデータを与えると考えられたので(HarrachおよびBenko、Adenovirus Methods and Protocols Methods in Molecular Medicine、21:309−339、1998)、本発明者等は研究結果を完全ゲノムの距離マトリクス分析によって示すことを選択した(図3)。
【0175】
種々のブタおよびウシ・シルコウイルスゲノムに関する距離マトリクス分析のもっとも明白な結果は、単離株の2集団への明確な単離であった(図3)。検査したゲノムの数は(7つの新しい配列を含む)29であり、単離株の起源は地理的に遠い地域に及んだが、中間の遺伝子型は見つからなかった。
【0176】
小さいほうの集団(1型)は、PK−15細胞系の異なる系統由来の単離株、および異なる病理学的実体(PMWSおよびCT)から単離された2種のシルコウイルス株(PMWSアクセッション番号AF012107、およびCT−PCV−P7)を含有した。他方のかなり大きい集団(2型)は、PMWSを有するブタ由来の21種、2種の新しいCT単離株(CT−PCV−P5および−6)、およびウシ単離株(AF109397)を含む残りの24種の単離株を含有した。この系統樹に基づいて考えると、シルコウイルス株の遺伝的関係は、その病原性能と直接関連していないように思われる。
【0177】
考察
本研究の目的は、CTに関連するPCVの遺伝的変異性を求めることであった。PMWS−PCV単離株は、互いに約99%のnt配列同一性を有し、さらに英国、カナダ、フランス、および米国で単離されたPMWS−関連PCVと96%のnt同一性を有し(Meehan等、Journal of General Virology 79:2171−2179、1998、Morozov等、Journal of Clinical Microbiology 9:2535−2541、1998、Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998、Mankertz等、Virus Research、6665−77、2000)、種々のPMWS−PCV単離株はその起源の場所にかかわらず相同性が高いことを示している。
【0178】
1990年代終わりの新しいCT−PCV単離株、および1960年代終わりの古いCT−PCV単離株は、CTA2型を有する新生ブタを起源としたが、それらはわずか72%のnt配列同一性を共有した。2種の新しいCT−PCVのゲノムは、PMWSPCVの新しい単離株とかなり類似しており、それに対して古いCT−PCV単離株は、PK−15−PCV変株に非常に近かった。広範な系統発生算出に基づいて、異なるPCV単離株を、2つのグループに分けることができる。PK−15−PCV変株、本発明の古いCT−PCV−P7、および単一の特性決定されていないPMWS単離株(AF012107)は、PCV1型(PCV1)を構成し、残りの20種の新しいPMWS−PCV、および2種の新しいCT−PCV野外単離株(CT−PCV−P5および−P6)は、PCV2型(PCV2)を構成する。PK−15−PCVおよび4種のPMWS関連PCV単離株の配列分析に基づいて、PK−15−PCVをPCV1、PMWS−PCV単離株をPCV2と分類する予備案が提示された(Meehan等、1998)。
【0179】
PK−15−PCV(PCV1単離株)は、離乳ブタの接種実験において臨床的に非病原性であったが(Tischer等、Archives of Virology 91:271−276、1986、Allan等、Veterinary Microbiology 44:49−64、1995)、それに対してCT−PCV−P7単離株(同じくPCV1)は1960年代終わりにCTを有する新生ブタから得られたものであり、妊娠70日で妊娠雌ブタに接種したとき、子孫に先天性振せんを引き起こすようである(Kanitz、博士論文、Purdue University、1972)。PK−15−PCVもCTの原因となり得るのか、あるいはCT−PCV−P7が離乳ブタにおいて病原性であるのかどうかは明らかでない。年齢、感染経路、および/またはいくつかの他の要因が、PCV1およびPCV2の病原性および臨床的発現を決定する可能性がある。新しいCT−PCVおよびPMWS−PCV株の間に約99%のnt配列同一性が存在することは、最近のPMWSおよびCTの発生がPCVの同一の型(すなわち、PCV2)に関連していることを示唆している。PMWSを有するブタの報告された年齢は6−12週であるのに対して(Ellis等、Canadian Veterinary Journal 39:44−51、1998、Kiupel等、Indiana.Veterinary Pathology 35:303−307、1998、Rosell等、Journal of Comparative Pathology 120:59−78、1999)、CTは新生ブタの疾患である(Stevenson等、Journal of Veterinary Diagnostic Investigations、印刷中)。PCVによって起こる症候群の型の決定には、年齢が重要な役割を果たしているようである。最近、自然発生のCTを有する新生ブタの脳および脊髄の多数のニューロンにおいて、PCV2DNAの存在が実証された。胎児の発育中、神経細胞分裂が排他的に起こる。PCVはその複製に細胞分裂を必要とするので、胎児発育中が、PCVにとって神経組織内で複製し、CTの徴候に至ることのできる唯一の期間である可能性がある(Tischer等、Archives of Virology 96:39−57、1987)。PCV2を無菌ブタに接種したとき、接種後35日までに病変が発現するが、PMWSの典型的な臨床疾患ではない。しかしながら、PCV2をブタ・パルボウイルスまたはブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスと共に接種したとき、PCVの複製は増強され、PMWSが再現される(Allan等、Journal of Comparative Pathology 121:1−11、1999)。他のウイルスは、PCV標的細胞の分裂を直接または間接的に引き起こすことによって、PCV複製を強化する可能性がある。
【0180】
PCV1は、最初に1960年代および70年代に同定され(Tischer等、Zentrablatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten, und Hygiene−Erste Abteilung Originale−ReiheA:Medizinische Mikrobiologie und Parasitologie 226:153−167、1974、Meehan等、Journal of General Virology 78:221−227、1997、本研究)、それに対してPCV2は、1990年代終わりに同定された(Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998、Meehan等、Journal of General Virology 79:2171−2179、1998、Mankertz等、Virus Research、6665−77、2000)。配列分析に基づいて、PCV2はPCV1に由来する可能性があると考えられる。しかしながら、2種の型の間に大きな系統発生距離があること、および中間体が完全に欠けていると思われることは、2種の型の間の直接的な最近の関係に矛盾する。これらの発見は、蔓延したPCV感染(たとえば、ワクチン媒介疾患)の起源としてのPK−15細胞系の役割を支持しない。2型PCVの集団には、単一のウシ起源シルコウイルス単離株が含まれる。シルコウイルス感染がどのようにウシに広がったのかはわかっていない。この単一ウシ単離株とPCV2との間の高い類似性に基づいて考えると、この2種の異なるPCV系統が、アデノウイルスの場合に見られるように(RussellおよびBenko、Encyclopedia of Virology、14−21頁、1999)、ブタおよびウシ宿主において以前に、同時に進化したという魅力的な推測は否定される。しかしながら、そのようなPCV1およびPCV2株の進化は、2種以上のまだ同定されていない宿主種で発生した可能性はある。
【0181】
実施例II:自然発生先天性振せんを有するブタにおけるブタ・シルコウイルスの組織分布および遺伝子タイピング
材料および方法
研究計画:2日齢未満のブタを、CTA2型と一致する疾患が発生した米国中西部の4つの農場から選択した。各農場から、CTを有するブタ2−4頭(n=13)、および臨床的に正常なブタ1−2頭(n=6)を、Purdue Animal Disease Diagnostic Laboratory、Lafayette、INに移送し、ペントバルビタールで安楽死させた。死体解剖検査を行い、試験のために組織を採取した。大脳、小脳、脳橋、脊髄分節C1、C4、C7、T3、T6、T9、T12、L2、L5、およびS2、肺、肝臓、腎臓、脾臓、扁桃、腸間膜および鼡径リンパ節の試料を、試験のために、中性緩衝ホルマリン中に採取するか、または−20℃で凍結した。
【0182】
組織病理学およびin situハイブリダイゼーション:慣例的な方法によって、組織を室温で24時間固定し、次いでパラフィンに包埋し、薄片にして、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。すべての組織を、顕微鏡的病変に関して評価した。前に記載したとおり、PCV1およびPCV2の両方でハイブリダイズすることが知られているPCVオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、in situハイブリダイゼーションを行った(Kiupel等、Eur J Vet Pathol.、1999、Rossell等、Encyclopedia of Virology、14−21頁、1999)。PCV特異オリゴヌクレオチドをジゴキシゲニンで3’末端標識した(Boehringer Mannheim Biochemica、Indianapolis、IN)。脱パラフィン化し、0.25%のペプシンを用いて105℃で8分間、続いて37℃で10分間タンパク質酵素消化を行い、オートメーション・バッファで洗浄、100%のホルムアミドを用いて105℃で5分間プレハイブリダイゼーションした後、市販のワークステーション(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)を用いて、プローブ濃度5μl/mlで、105℃で5分間、および37℃で60分間、ハイブリダイゼーションを行った。食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液で高ストリンジェンシーの洗浄を行い、プローブと標的の結合を確実にした。アルカリホスファターゼとコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体からなる検出系(希釈1:500)(Boehringer Mannheim Biochemica、Indianapolis、IN)を37℃で45分間適用し、基質「NBT/X−Phos」(ニトロブルー・テトラゾリウム5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート)(Boehringer Mannheim Biochemica、Indianapolis、IN)を適用した。連続切片上で、45分、90分、および180分間、不溶性青色ホルマザンに色素還元した。対照は、PCV1感染PK−15細胞(Stevenson等、Veterinary Pathology 36:368−378、1999)、PCV2−感染ブタ(Kiupel等、Indiana.Veterinary Pathology 35:303−307、1998)およびPCVを持たないノイバイオート・ブタの脳、脊髄、およびリンパ組織のドット・ブロット・スライドを含んだ。スライドを、プローブを用いずにハイブリダイゼーション溶液でインキュベートし、陰性試薬対照として用いた。
【0183】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試験:PCVの遺伝子型を1型または2型として求めるために、すべてのブタから得た小脳および肝臓試料のPCR試験を行った。対照は、in situハイブリダイゼーション試験と同じものを用いた。組織を、ティシュマイザーを用い、等量のTE(10mMのTris−HCl、1mMのEDTA、pH7.5)中で均質化した。標準的なプロトコルを用いて、全細胞DNAを抽出した(Sambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、1989)。PCV(Meehan等、Journal of General Virology 78:221−227、1997)、またはPCV2(Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998)に対して特異性となるようにプライマー・セットを設計し、VentDNAポリメラーゼ(New England Biolab,Inc.、Beverly、MA)を用いてPCRによってPCV配列を増幅するためにそれを用いた。PCR増幅DNA試料を、電気泳動によって1%アガロース・ゲル上で分析し、予期されるサイズの帯を、UVトランスイルミネーターで視覚化した。PCR成果物の特異性は、配列分析によって確認した。
【0184】
凍結切片間接免疫蛍光抗体試験:前にin situハイブリダイゼーションによってPCVに関して陽性を試験した肝臓および小脳の試料を、各群1頭のブタから選択した。PCV特異抗原の存在を確認するために、間接蛍光抗体試験を行った。凍結組織切片を調製し、間接蛍光抗体試験は、1:500希釈のウサギで作製した精製PCV2に対して作られた市販のポリクローナル抗体(MorozovおよびPaul、Iowa State University、Ames、IA)、および1:250希釈のフルオレセイン・コンジュゲート・マウス抗ウサギIgGを用いて、慣例的な方法で行った。
【0185】
他の因子の試験:仮性狂犬病ウイルス(NYSL、AMES、IA)、ブタ・インフルエンザウイルス(NYSL、AMES、IA)、ブタ・ロタウイルス(NYSL、AMES、IA)、ブタ血球凝集性脳炎ウイルス(NYSL、AMES、IA)、ブタ・パルボウイルス(American Bioresearch、Sevierville、TN)、および伝染性胃腸炎ウイルス(American Bioresearch、Sevierville、TN)を含む、他のブタ・ウイルス因子に関して、間接免疫蛍光を用いる慣例試験を、Purdue Animal Disease Diagnostic Laboratory、Lafayette INで市販の診断用試薬を用いて行った。血清、脾臓、および肺の試料を、ブタ繁殖呼吸障害症候群(PRRS)ウイルスに関して、ブタ1次肺胞マクロファージ細胞培養物中、ウイルス単離によって試験した。脳、脾臓、および扁桃の試料を、仮性狂犬病ウイルスに関して、直接蛍光抗体試験およびブタ鼻甲介細胞中ウイルス単離によって試験した。脳、脾臓、および扁桃の試料を、細胞変性ウイルスに関して、ブタ鼻甲介およびブタ精巣細胞中で試験した。
【0186】
結果
CTが発生した4つの農場はすべて、外部の供給源から更新用の種蓄を購入していた。種蓄の供給源は各農場で異なっており、いずれの農場も共通の遺伝を共有していなかった。ブタが屠殺齢まで維持された3つの農場では、最近のPMWS歴はなかった。試験に用いるために選択されたCTを有するブタはすべて、生後48時間以下で、中程度から重篤な振せんを伴い、ブタが自発的運動を試みたときにもっとも重篤であった。ブタが安静なときは、振せんが部分的に弱まった。年齢を対応させた臨床的に正常な対照ブタとして選択されたブタはすべて、CTブタのいないリフター(lifter)を起源とした。試験に選択されたブタはすべて敏捷で、活発であり、他の点では臨床的に正常であった。
【0187】
いずれのCTブタまたは正常ブタにおいても、肉眼的病変、または顕微鏡的病変はなかった。PRRSウイルス、仮性狂犬病ウイルス、および他の細胞変性ウイルスに関するすべての試験は陰性であった。PCVは、in situハイブリダイゼーション、PCR、およびIFA試験によって、CTブタ13頭中13頭、臨床的正常ブタ6頭中5頭の組織で実証された。CTブタおよび臨床的正常ブタの両方で、もっとも一般的にPCVに感染していた組織は、中枢神経組織および肝臓であった。in situハイブリダイゼーションは、PCV陽性ブタにおいて、CTブタの12/13および臨床的正常ブタの5/6の中枢神経組織、CTブタの11/13および臨床的正常ブタの2/6の肝臓、ならびにより低い割合でCTブタおよび臨床的正常ブタ5/6のすべての他の組織で、PCVを実証した。形態学的にマクロファージの典型である分散細胞の少数が、肝臓および他の非神経組織において陽性であった。PCV核酸は、陽性のマクロファージの細胞質のほとんど、陽性マクロファージの少数の核にのみ存在した。CTブタおよび臨床的正常ブタの両方の中枢神経組織に、他の組織より多くのPCV陽性細胞が存在した。脳および脊髄の陽性細胞は、主として大ニューロンであり、陽性小ニューロンはそれよりも少なく、陽性稀突起神経膠細胞は希少であった。大脳および骨髄の核において大ニューロンが陽性であり、小脳のプルキンエ細胞が陽性であり、脊髄灰白質の大ニューロン、特に下位運動ニューロンが陽性であった。マクロファージと同様に、陽性ニューロンは一般に、細胞質にのみPCV核酸を有し、核には希少であった。
【0188】
中枢神経系のPCV感染細胞は、臨床的に正常なブタよりもCTブタにおいて、数が多く、より広範に分布していた(表5)。一般に、CTブタは、脳および脊髄に広範に分布した多数の陽性大ニューロンを有した。臨床的に正常なブタは、脳および脊髄に多焦点に分布した、より少数のPCV陽性大ニューロンを有した。
【表5】
【0189】
各群1頭のブタから得た小脳および肝臓の凍結切片の間接蛍光抗体試験によって、in situハイブリダイゼーション試験の結果が確認された。PCV特異抗原は、in situハイブリダイゼーションのPCV特異核酸とほぼ同じ数および細胞型で、同じ細胞位置において実証された。すべてのブタから得た小脳および肝臓のPCR試験は、4つすべての農場のすべての陽性ブタにおいて、PCV2特異配列の増幅を実証したが、PCV1特異配列は実証されなかった。
【0190】
考察
CTA2型の発生中に、臨床的に正常なブタ、およびCTブタの両方が、1−2日齢でPCV2に感染していた。両方とも、先天的にウイルスに感染していたと思われる。PCV2は、すべての感染ブタで広範囲に分布しており、もっとも一般的には中枢神経組織に存在していた。
【0191】
しかしながら、臨床的に正常なブタと比較したとき、分布がより広範で、感染細胞の割合が高いために、CTブタの脳および脊髄により多くのPCV感染細胞が存在した。もっとも一般的な感染細胞は、脳および脊髄の大ニューロン、ならびに非神経組織のマクロファージであった。稀突起神経膠細胞はほとんど感染していなかった。
【0192】
CTブタが脳および脊髄において先天的にミエリンを欠損していることは、以前の研究で実証されている(Christensen、Nord Veterinaermed 8:921−943、1956)。他の研究は、年齢および遺伝的に対応する正常な対照ブタと比較して、CTブタが不相応に低いセレブロシド、および高いコレステロールからなる異常に未熟なミエリンを有することを実証した(Patterson、J.Neurochem 26:481−485、1976)。稀突起神経膠細胞がCNSにおいてPCVに感染する主要な細胞であって、それがミエリン合成の減少および異常の原因であろうというのが、本研究以前の仮説であった。脳および脊髄において多数のPCV感染ニューロンが見つかったことは驚くべきことであり、さらにこのことがミエリン欠損は別にして、あるいはミエリン欠損に加えて、CTの重要な原因である可能性がある。以前の研究は、CTブタにおけるミエリン欠損の程度は変化し、振せんの重篤度とは密接に関連していないことを実証した(Fletcher、J.Am Vet Med Assoc 29(12):2255−2262、1968)。この発見は、ミエリン異常は、単独ではCTの原因となり得ないことを示唆している。一研究において、CTおよび対照ブタの神経系で、大脳除去、片側迷路摘出、腰仙根の片側神経根切断、および胸髄離断を含む外科的切除が行われ、手術後神経学的検査によって振せんの原因が脊髄レベルに位置することが確認された。他の研究によって、CTブタにおける脊髄反射は、単シナプス過剰興奮性であることが判明した(Stromberg、Am J Vet Res 20:319−323、1959)。脊髄の運動ニューロンのPCV感染が機能に直接影響を及ぼし、運動ニューロンをより興奮性にし、それによって脊髄反射弓に影響を与えている可能性がある。
【0193】
PCV2感染稀突起神経膠細胞が少数であることは、PCV2感染稀突起神経膠細胞の機能障害をCTA2型におけるミエリン欠損の原因とする仮説を支持しない。しかしながら、本発明者等はこれらのブタにおいてミエリン欠損を確認しておらず、そのため存在しなかったことも考えられる。さらに、これらのブタにおいて、以前にPCV誘発の稀突起神経膠細胞の喪失および除去があった可能性も排除できない。PMWSを有するブタにおけるPCV2感染に伴う肉芽腫性炎症性反応は、これらのCTブタのいずれのPCV2感染組織においても認められなかった。炎症が見られない理由は明らかではないが、胎内でのPCV感染は免疫耐性を誘導する可能性がある。
【0194】
実施例III:PCV2の先天性伝播
方法
ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)にセロネガティブである、健康状態の高い民間のブタ農場から入手した8頭の多経産妊娠雌ブタを、帝王切開/初乳非投与(CD/CD)ブタを産生するために用いた。すべての雌ブタを、妊娠後90日より前にPurdue Universityの隔離室に移し、妊娠第94日に、4頭の雌ブタに、組織培養適合PCV2(PMWS−PCV−P4)1.0ml(107TCID50/ml)を筋肉内および鼻腔内接種した。妊娠第114日に、4頭のPCV接種雌ブタ、および4頭の非PCV接種雌ブタに帝王切開手術を行い、続いて安楽死をさせて、先天的にPCV2にされた暴露CD/CDブタ(C+ブタ)、および先天的にPCV2を伴わないCD/CDブタ(C−ブタ)を産生した。雌ブタの死体解剖検査を行い、種々のブタ・ウイルスに関して試験をするために、血清、脳、脊髄、肝臓、肺、脾臓、気管気管支リンパ節、および鼡径リンパ節の試料を採取した。各同腹子から3頭のブタを生後3日に安楽死させた。残りの新生ブタは、PMWSの病変を産生するための実験に用いた。安楽死させたブタ、および帝王切開後の最初の2週間の間に死亡したブタの完全な死体解剖検査を行った。各ブタから脳、脊髄、肝臓、肺、腎臓、脾臓、扁桃、骨髄、胸腺、気管気管支リンパ節、および鼡径リンパ節の試料を採取し、−20℃で保存するか、あるいは中性緩衝ホルマリンに保存(血清および血液以外)した。組織病理学、およびPCVin situハイブリダイゼーションをすべての組織で行い、顕微鏡的病変、およびPCV分布を評価した。選択したプール試料でPCV2PCRを行った。
【0195】
結果
帝王切開後、最初の2週の間に、4頭のC+雌ブタ由来の15頭が死亡し、さらに3頭を安楽死させた。最初の3日間で死亡した4頭のブタ、さらに死産であった1頭の子ブタは、ドーム形状の頭を有し、小さく、虚弱で、環境に順応することが困難であった。11頭のC+ブタはすべて活力に欠け、数頭は細菌性敗血症によって死亡した。全体として、C−ブタに比べて、C+ブタは活力に欠け、生後2週間まで生育することができなかった。研究の最初の3週間の間に死体解剖を行った19頭のC+ブタにおいて、PMWSに特徴的な肉眼的病変は同定されなかった。
【0196】
顕微鏡的には、最初の3週で死亡した8頭のC+ブタは、重篤な間質性肺炎を有し、細菌性敗血症を示した。これらのブタにおいて他の顕微鏡的病変は見られなかった。3週齢の間に死亡した5頭のC+ブタから得たリンパ節の切片、1頭のブタの肝臓の切片、2頭の肺の切片、および1頭のブタの心臓の切片は、in situハイブリダイゼーションによってPCV2が疑われた。個々のブタから得た脾臓、扁桃、気管支、および腸間膜リンパ節を含むリンパ組織のプールは、19頭のC+ブタの7頭で、PCVによってPCV2に陽性であった。すべてのC+ブタの肺、脾臓、および気管支リンパ節の試料は、および仮性狂犬病ウイルス(PRV)、ブタ・インフルエンザウイルス(SIV)、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ブタ・パルボウイルス(PPV)、または伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)に関して、ウイルス単離およびFA試験によって陰性であった。3週齢の間に出血した3頭のC+ブタの利用可能な血液試料は、PCV2、およびPPVに対して血清学的に陰性であった。このPCV2接種材料は、PPVが混入していることがわかった。
【0197】
考察
これらの結果は、PCV2が、感染した雌ブタからその同腹子に伝播され得ることを示唆した。PCV2単独で、または補助因子との組合せで、先天的に伝播することが可能であった。
【0198】
実施例IV:ウサギにおけるPCV特異抗体の作製
PMWS−PCV−P1 ORF1(314R)、PMWS−PCV−P1 ORF2カルボキシ領域(129R)、CT−PCV−P6 ORF3(104R)、CT−PCV−P6 ORF4(59R)、CT−PCV−P7 ORF2(カルボキシ部)を代表するオープン・リーディング・フレーム(ORF)を、適切なプライマーを用いてPCRによって増幅した。PCR産物を、ヒスチジンカセットに融合した異種挿入物の発現を駆動する細菌発現および精製ベクターpET30aに挿入した。細菌におけるPCVタンパク質の発現は非常に効率がよく、これらのORFが機能タンパク質をコードする可能性を有することを示唆した。融合タンパク質としてPCV特異タンパク質をNi++アフィニティ・クロマトグラフィによって精製した。これらの精製タンパク質を、ウサギを免疫化して抗体を作製するために用いた。
【0199】
実施例V:PCV2抗体をスクリーニングするためのELISAの発展
本発明者等は、細菌性発現PMWS−PCV−P1 ORF2カルボキシ部精製タンパク質を用いてプレートを被覆することによって、PCV2に対する抗体を検出するためにブタ血清をスクリーニングするELISAアッセイをより詳細に発展させた。
【0200】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。さらに上記の説明および添付の図面から、本明細書に記載したものに加えて本発明の様々な変更が当分野の技術者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の請求の範囲に含まれるものとする。
【0201】
さらに、すべての値が近似値であり、説明のために提供されたものであることが理解される。
【0202】
本明細書において引用したすべての特許、特許出願、刊行物、および他の資料は、その全体を参照により本明細書の一部とする。
【0203】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】
PMWS−PCV−P1、P2、P3、P4、およびCT−PCV−P5、P6、P7のヌクレオチド配列の比較を示す図である。
−は同一のヌクレオチドを表す。
・は欠失ヌクレオチドを表す。
PMWS−PCV、およびPK−15−PCVのヌクレオチド配列は、それぞれHamel等、1998、およびMeehan等、1997から採用した。
【図2】
PMWS−PCV−P1(図2A)、およびCT−PCV−P7(図2B)の11種のORFの概略図である。PMWS−PCV−P1、およびCT−PCV−P7のゲノムの大きさは、それぞれヌクレオチド1768、および1759である。矢印の方向は、各ORFの配向を表す。
【図3】
ブタおよびウシ・シルコウイルス単離株の全ゲノムの距離マトリクス分析を示す図である。枝の長さは、単離株の系統発生距離に比例する。線は2つの配列間の10%の差異を表す。無根系統樹、1型株(CT−P7、PMWS−AF012107、およびPK−15細胞系由来株)はアウトグループとして用いた。ブートストラップ値(100データセット)を示す(全長アラインメントによって得られた系統樹トポロジーが確認されなかったPCV2−Bの場合を除く)。ウイルス株は、原因疾患(既知の場合)、および株名(得られる場合。得られない場合は、アクセッション番号、または提示された制限酵素フラグメンテーションの型)によって表す。株(本発明のもの以外)、およびそのGenBankアクセッション番号は以下のとおりである。PK−15細胞系由来株:PK−ISA(U49186)、PK−15B(Y09921)、PK−15C(AF071879)、PMWS株:PMWS−AF012107、P/48121(Imp.1011 48121、AF055393)、P/ISU−31(AJ223185)、P/48285(Imp.1011 48285、AF055394)、P/AF027217、P/ISUVDL(ISUVDL98−15237、AF147751)、(Imp.999(AF055391)、P/Imp.1010(Imp.1010−Stoon、AF055392)、疾患の記載のない株:Tainan(AF166528)、MLTW98(AF154679)、B9(AF086834)、9741(AF086835)、412450(AF085695)、M226(AF086836)、制限酵素フラグメンテーション・パターンの型名を有する株:PCV2−B(AF112862)、PCV2−C(AF109398)、PCV2−D(AF117753)、PCV2−E(AF109399)、ウシ・シルコウイルス:Bovine CV(AF109397)。
【図4】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム1(ORF1)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図5】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム2(ORF2)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図6】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム3(ORF3)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図7】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム4(ORF4)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図8】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム5(ORF5)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図9】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム6(ORF6)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図10】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム7(ORF7)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図11】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム8(ORF8)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図12】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム9(ORF9)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図13】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム10(ORF10)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図14】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム11(ORF11)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
本出願は、35U.S.C.§119(e)に基づいて2000年6月15日に出願された米国特許仮出願第60/211710の優先権を主張するものであり、その出願の全体を参照により本明細書の一部とする。
【0002】
【従来の技術】
本発明は、ブタ・シルコウイルス(PCV)とブタにおける先天性振せん(震顫)との関連性の同定に関し、関連する診断および治療組成物および方法に関する。本発明は、より詳細には、特定の先天性振せん関連PCV核酸およびポリペプチドに関する。
【0003】
ブタ・シルコウイルス(PCV)は、当初は、ブタ腎臓細胞系、PK−15の非細胞変性性混入物として発見された(Tischer等、Medizinische Mikrobiologie und Parasitologie 226:153−167、1974)。このウイルスは、1982年に特性決定され(Tischer等、Nature、295:64−66、1982)、ニワトリ貧血ウイルス(Yuasa等、Avian Diseases 23:366、1979)、オウム嘴羽毛病ウイルス(PassおよびPerry、Austrial Veterinary Journal、61:69−74、1984)、およびハト・シルコウイルス(Woods等、Journal of Veterinary Diagnostic Investigations:5:609−612、1983)と共にシルコウイルス科に分類された。シルコウイルスのゲノムは、環状1本鎖アンビセンスDNAゲノムの単一コピーからなる(Lukert等、Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses、166−168、1995)。このゲノムの大きさは、1.7から2.3kbの間で多様である。シルコウイルスは、非エンベロープ型であり、正20面体対称を有する。PK−15細胞由来のPCVは、初め病原性ではないと考えられていた。その完全ゲノムが配列決定され(Meehan等、Journal of General Virology 78:221−227、1997)、電子顕微鏡検査法によって特性決定された(Stevenson等、Veterinary Pathology 36:368−378、1999)。PK−15−PCVは自然発生疾患と関連づけて考えられたことはなく、ブタの実験接種は臨床的疾患を生じなかった(Tischer等、Archives of Virology 91:271−276、1986、Allan等、Journal of Comparative Pathology 121:1−11、1995)。
【0004】
PK−15−PCV、ニワトリおよびオウム動物シルコウイルス、植物ジェミニウイルスおよびナノウイルス(以前には植物シルコウイルスとして知られていた)の系統発生分析は、PK−15−PCVをオウム嘴羽毛病ウイルスにもっとも近いと分類し、PK−15−PCVとオウム・シルコウイルスは共に、2種の植物ウイルス群と特徴を共有しており、それらの中間であった(Niagro等、Archives of Virology 143:1723−1744、1998)。さらなる分析は、PK−15−PCVおよび/またはオウム・シルコウイルスの前身は、脊椎動物宿主に感染して、脊椎動物感染RNAウイルス、おそらくはカリチウイルスと組み換えられた植物ナノウイルスに源を発することを示唆した(GibbsおよびWeiller、Proceedings of the National Academy of Sciences、USA、96:8022−8027、1999)。
【0005】
PCVによる感染は、離乳後多臓器性発育不全症候群(PMWS)と関連づけられており、この症候群は離乳後のブタにおける進行性体重減少、呼吸困難、頻呼吸、および黄疸によって臨床的に特徴づけられる(Daft等、Meeting of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians、Little Rock、AR、USA、32頁、1996、Clark、Proceedings of the 28th Annual Meeting of the American Association of Swine Practitioners、Quebec City、Quebec、499−501頁、1997、Kiupel等、Indiana.Veterinary Pathology 35:303−307、1998、Ellis等、Canadian Veterinary Journal 39:44−51、1998、AllanおよびEllis、Journal of Veterniary Diagnostic Investigations 12:3−14、2000)。いくつかのPMWS関連PCVの完全ゲノム配列は入手可能である(Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998、Meehan等、Journal of General Virology 79:2171−2179、1998、Morozov等、Journal of Clinical Microbiology 9:2535−2541、1998、Mankerts等、Virus Research、6665−77、2000、WO99/18214、WO99/45956、米国特許第6217883号)。PMWS−PCVの単離株は、抗原的および遺伝子的にPK−15−PCVと異なる(Allan等、Journal of Veterniary Diagnostic Investigations 10:3−10、1998、Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998)。したがって、PCV1と呼ばれる元のPK−15細胞培養単離株と対照的に、これらのPMWS−関連PCVはPCV2と呼ばれた(Meehan等、Journal of General Virology 79:2171−2179、1998)。
【0006】
ブタにおける先天性振せん(CT)は、ミエリン欠損と関連づけられており、遺伝的異常(Harding等、Vet Rec 92:527−529、1973、Patterson等、J Neurochem 26:481−485、1976)、胎内トリクロルフォン毒性(Knox等、Nord Veterinaermed 30:538−545、1978)、および古典的ブタコレラ・ウイルスの胎内感染(Harding等、Vet Rec 79:388−390、1966)、またはアウエスキー・ウイルス(Mare等、J Am Vet Med Assoc 164:309−310、1974)が原因である可能性がある。北米でもっとも一般的なCTの形態は伝染性であり、A2型と分類されている(Done等、Veterinary Annual 16:98−102、1976)。CTA2型の疫学はこれまで検討されてきた(Bolin等、Leman AD、Straw BE、Mengeling WL、D’Allaire S、Taylor DJ編、第7版、247−249頁、1992)。疾患はすべての品種で起こり、季節性ではなく、初産雌ブタの同腹子でより一般的であり、しばしば外部からの補充繁殖家畜の導入に伴う(Stromberg等、Am J Vet Res 19:377−382、1958)。冒された同腹子内の有病率は0−100%まで多様である。発生は一般に1−8週間続くが、疾患が風土性であることはまれである。罹患ブタは、異なる重篤度で骨格筋の間代性収縮を示し、これは一般に4週齢までに減少、消散するが、屠殺齢まで持続する可能性もある。ブタが安静にしているとき、ミオクロヌスは弱まり、外部刺激によって増悪する(Christensen等、Nord Veterinaermed 8:921−943、1956、Stromberg等、Am J Vet Res 20:319−323頁および627−633頁、1959)。罹患ブタの死亡率は50%という高い率となる可能性があり、これは哺乳ができないことによる。
【0007】
ウイルスとCTA2型との関連性は長い間知られてきたが、これまでのところそのウイルス株は同定されていない。最初の研究は、CTA2型を有する新生ブタ由来の1次腎細胞培養物から得た濾液中の約20nmの立方体様未同定ウイルスを記載している(Kanitz CL、1972、Myoclonia congenita:Studies of the resistance to viral infection of tissue culture cell lines derived from myclonic pigs、博士論文、Purdue University、West Lafayette、IN)。これらの研究には、腎細胞培養物上澄みの濾液として調製された立方体様ウイルスによる妊娠雌ブタの筋肉内接種も含まれており、これによって先天性振せんを有する同腹子が分娩された。他の研究者等は、CTA2型を有するブタから得た1次腎細胞培養物から塩化セシウム勾配でウイルスを精製し、そのウイルスを形態学および間接免疫法に基づいてPCVと同定した(Hines RK、1994、Porcine circovirus causes congenital tremors type A−11 proved by fulfilling Koch’s postulates、博士論文、University of Georgia、Athens、GA)。続いて妊娠第3三半期の妊娠ブタに精製ウイルスを皮下、経鼻、および経口接種することによって、先天性振せんを有するブタが分娩された。PCVは、CTを有するブタの腸管組織から再単離されたが、神経組織からは再単離されず、擬接種雌親由来の正常な対照ブタの組織からは再単離されなかった。PMWSPCV単離株を増幅するために設計されたPCRプライマー・セットを用いて、CTを有するブタ群の試料からPCVDNAも見出された(G.W.Stevenson等、IX International Symposium、College Station、Texas、1999年6月)。
【0008】
しかしながら、CTに関連するPCV単離株の遺伝子分析は、まだ報告されていない。したがって、PCVと先天性振せんとの関連性を確認すること、この疾患に関わるPCVの型を正確に同定することが求められている。現在は先天性振せんに対する有効な診断試験もワクチンも入手不可能であり、実際のところ、そのような分析によってのみ、ブタの先天性振せんに対する診断用および治療用ツールの製造が可能となるかもしれない。
【0009】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明は、先天性振せんを有するブタのブタ・シルコウイルス(PCV)株のクローニングに基づく。
【0010】
これらの結果は、診断および治療応用例の発展の第一段階を提供する。
【0011】
したがって本発明は、ブタの先天性振せんの病理原因を診断する方法を提供し、その方法は、そのブタがブタ・シルコウイルス株の1型または2型に感染しているかどうかを判別することを含む。
【0012】
本発明はさらに、ブタの先天性振せんを予防または治療する方法を提供し、その方法は、有効量の免疫原性PCV1またはPCV2ポリペプチド、あるいはこのポリペプチドをエンコードする核酸をそのブタに投与することを含む。
【0013】
本発明の他の主題は、本発明者等によって同定された新規なPCV核酸配列、その配列によってエンコードされたポリペプチド、ならびに新規なPCV単離株およびその免疫原性製剤である。
【0014】
したがって、本発明は単離されたブタ・シルコウイルス(PCV)に関し、その核酸は、配列番号1から配列番号7からなる群から選択された配列と同一である配列を有する。
【0015】
本発明はさらに、ブタ・シルコウイルス(PCV)から単離された核酸に関し、その核酸は、任意の配列番号1から配列番号7の配列の、任意のORF1からORF11によってコードされた配列かならなる群から選択された配列を有するシルコウイルス・ポリペプチドをコードする配列を含む。
【0016】
本発明の他の主題は、発現制御配列と有効に結合しているこの核酸を含む発現ベクターである。
【0017】
この発現ベクターは、薬学的に許容される賦形剤と結合してワクチンを形成することができ、これも本発明の一部である。
【0018】
本発明はさらに、この発現ベクターを含む宿主細胞を対象とする。
【0019】
本発明はさらに、PCVタンパク質を産生する方法を提供し、その方法は、シルコウイルスをコードする核酸の発現をもたらす条件下で、この宿主細胞を培養することを含む。
【0020】
任意の配列番号1から配列番号7のORF1からORF11によってエンコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびにそれらのポリペプチドに対する抗体も本明細書に記載される。
【0021】
本発明のさらなる主題は、ブタ・シルコウイルス株を培養する方法であり、その方法は、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含む核酸を、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス粒子の産生をもたらす条件下で、適切な宿主細胞に導入することを含む。
【0022】
本発明はさらに、配列番号1から配列番号6から選択された配列を含むゲノムを有する単離PCV株を包含する。
【0023】
【発明の実施の形態】
本発明は、先天性振せんに関する病原体の株を確実に同定するという問題を解決する。先天性振せんを有するブタのブタ・シルコウイルス(PCV)株をクローニングおよび配列決定し、それらをPMWSに関連するPCV株と比較することによって、プライマー、プローブ、またはウイルス株などの多くの有用な材料の発展に至った。本発明は、知られているCT病原性の株のクローニング、ウイルスの培養を可能にする。
【0024】
本発明は、ブタのニューロンに存在する、ならびにより少ない程度で脳のグリア細胞および脊髄に存在するPCVゲノムDNAが、離乳後多臓器性発育不全症候群(PMWS)に関連する株のゲノムDNAと、約95%を超える非常に近い配列類似性を共有するという発見に部分的に基づいている。先天性振せん(CT)またはPMWSを有するブタから得た7種のPCV単離株の全ゲノムを、クローン化し、配列決定した。単離株の1種は、1960年代終わりに単離されたCTA2型を有する新生ブタから得たものであった。2種の新しいPCV単離株は、無関係に発生したCTA2型を有する異なる農場の2頭の感染新生ブタから得た。4種の単離株は、PMWSを有するブタの、4つの異なる農場を起源とするものであった。この4種のPMWS−PCVの比較分析は、それらが互いに99%の配列同一性を共有し、以前に配列決定されたPMWS−PCVと96%を超える配列同一性を共有することを実証した。しかしながら2種の新しいCT−PCVは、互いに、さらに興味深いことに新しいPMWS−PCV単離株とも99%の同一性を共有した。PMWSと新しいCT単離株との間に、一貫したゲノムの相違はなかった。古いCT−PCVは、PK−I5由来PCV株と98%の同一性を示し、新しいCT−PCVとはわずか72%の同一性を示した。系統発生分析は、PCV単離株が2つのグループに分類できることを確認した。PCVI型は、PK−15−PCV、および本発明の古いCT−PCV単離株からなり、PCV2型は、PMWS、および本発明の新しいCT単離株を含む。
【0025】
さらなる研究によって、in−situハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、および凍結組織切片の間接蛍光抗体試験を用いて、天然CTA2型を有する1−2日齢ブタにおけるPCVの組織分布、および遺伝子型を確立した。CTA2型が発生した米国中西部の4つの農場を起源とする、CT罹患ブタ、および臨床的に正常なブタを選択した。CTブタのすべて、および正常ブタのほとんどが、PCVに感染していた。PCVは感染ブタの組織に広範に分布しており、中枢神経組織、および肝臓にもっとも一般的に分布していた。すべての感染ブタにおいて、非神経組織に比べて、脳および脊髄により多くのPCV感染細胞が存在した。CTブタは、分布が広汎で、感染細胞の割合が高いために、臨床的に正常なブタに比べて、脳および脊髄により多くのPCV感染細胞を有した。脳および脊髄において、もっとも一般的にPCVが感染した細胞は、大ニューロンであった。非神経組織では、マクロファージがもっとも高頻度に感染した細胞型であった。PCR試験は、4つのすべての農場のすべてのPCV感染ブタにおいて、PCV2型のみを実証し、PCV1型は実証されなかった。
【0026】
本発明はさらに、PCV2が感染雌ブタから胎内の同腹子に伝播され得るという証拠に基づいている。したがってPCV2は、単独で、あるいは補因子との組合せによって、先天的に伝播可能である。
【0027】
上述のとおり、これらの発見は、PCVのCTとの病因論的関係、ならびにPMWSに関連するPCVウイルス間の関係のあいまいさを解明する(従来の研究は、たとえば、実際にPCVがCTの病原体であった場合にも、別のPCVウイルス株がCTに関連する可能性を残していた)。したがって、本明細書に記載した新規なPCV株(たとえば、PMWS−PCV−P1、PMWS−PCV−P2、PMWS−PCV−P3、PMWS−PCV−P4、CT−PCV−P5、CT−PCV−P6、およびCT−PCV−P7)に加えて、本発明は、これらの試薬をベースとする診断および治療方法および材料を提供し、診断上の評価、および治療的、特に免疫学的介入の標的としてPCV、特にPCV2型を同定する。
【0028】
本明細書では、「PCV」という用語は、たとえばブタおよびウシ・シルコウイルス単離株の全ゲノムの距離マトリクス分析(図3)に示したように、特にブタ・シルコウイルスを指す。特に、PCVという用語は、PMWS−PCV−P1(配列番号1)、PMWS−PCV−P2(配列番号2)、PMWS−PCV−P3(配列番号3)、PMWS−PCV−P4(配列番号4)、CT−PCV−P5(配列番号5)、およびCT−PCV−P6(配列番号6)を意味する。さらに、PCVには、CT−PCV−P7(配列番号7)、PK−15PCV(Meehan等、1997)、およびPMWS−PCV(Hamel等、1998)が含まれる。
【0029】
「PCVポリペプチド」(または「PCVタンパク質」)は、PCVオープン・リーディング・フレーム(ORF)によってエンコードされたポリペプチド遺伝子産物を指す。各PCVは11のORFを有し、したがって上記のとおり、各株に対してORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7、ORF8、ORF9、ORF10、およびORF11が存在する。ORFおよびそれらがエンコードするポリペプチドの特徴は、以下の実施例1の表、および図4−14に示す。
【0030】
「ワクチン」という用語は、レシピエント(受容者)において防御免疫性を誘導するために用いることのできる組成物(タンパク質またはベクター。後者は、厳密でなく「DNAワクチン」と呼ぶこともできるが、RNAベクターも使用可能である)を指す。本発明のワクチンは母集団の一部において免疫性を誘導することができ、いくらかの個体では、強固な免疫応答、または防御的な免疫応答を開始できず、あるいは場合によってはいかなる免疫応答も開始できない可能性があることに留意されたい。この無効性は、個々の遺伝的背景に由来するか、あるいは免疫欠損状態(後天性または先天性)、または免疫抑制(たとえば、器官拒絶を防ぐため、または自己免疫状態を抑制するための免疫抑制剤による治療)によるものである。
【0031】
「免疫療法」という用語は、病原体特異免疫応答の活性化に基づく治療計画を指す。ワクチンは、免疫療法の一形態であり得る。ex vivo(その後、対象に移植)、またはin vivoで、樹状細胞に、PCVポリペプチド、場合によっては刺激サイトカイン、たとえばGM−CSFまたはFlt3リガンドを負荷することも免疫療法の一形態である。
【0032】
本明細書では、「防御する」という用語は、対象におけるPCV感染の予防または治療、あるいは適宜その両方を意味する。したがって、ワクチンの予防的投与は、レシピエント対象をPCV感染から防御することができ、たとえば感染性単核球症、またはリンパ増殖性疾患を予防することができる。ワクチンの治療的投与または免疫療法は、レシピエントをPCV感染媒介性病因から防御することができ、たとえばPMWSまたはCTなどの疾患または障害を治療することができる。
【0033】
本明細書では、「対象」という用語は、PCVを支持(維持)する動物を指す。特に、この用語はブタを指す。
【0034】
本明細書では、「ブタにおける発現のためのベクター」、または「ブタ発現ベクター」という用語は、ブタ細胞において有効なプロモータを少なくとも含むベクターを意味し、好ましくはブタにおいて安全で有効なベクターを意味する。そのようなベクターは、たとえば、免疫性の発展に関与しない外来遺伝子を除外する。ベクターがウイルス・ベクターである場合、強固な感染の複製および展開を可能にする部位を除外し、in vivoでの複製能力の発達を回避するために操作される。そのようなベクターは、好ましくは、農場のブタに用いるのに安全であり、より好ましい実施形態において、ベクターは、ブタにおける臨床試験または使用に関して、政府規制機関(たとえば、米国農務省など)によって承認されている。特定のベクターは以下に詳しく記載する。
【0035】
本明細書では、「免疫原性ポリペプチド」という用語は、そのポリペプチドが、体液性または細胞性、好ましくは両方の免疫応答を誘導できることを意味する。免疫原性ポリペプチドは抗原性でもある。ある分子は、免疫系の抗原認識分子、たとえば免疫グロブリン(抗体)、またはT細胞抗原受容体などと特異的に相互作用することができるとき、「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約5個、好ましくは少なくとも約10個のアミノ酸のエピトープを含有する。本明細書ではエピトープとも呼ばれるポリペプチドの抗原性部分は、抗体またはT細胞受容体認識に関して免疫優性な部分であることが可能であり、あるいはその抗原性部分を免疫化のための担体ポリペプチドと複合して、その分子に対する抗体を産生するために用いられる部分であることができる。抗原性である分子は、それ自体が免疫原性である、すなわち担体なしに免疫応答を誘導できる必要はない。
【0036】
「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。アジュバントは、ゆっくりと抗原を放出する組織貯蔵所として機能することができ、さらに非特異的に免疫応答を増強するリンパ系活性化剤として機能することも可能である(Hood等、Immunology、第2版、1984、Benjamin/Cummings、Menlo Park、California、384頁)。多くの場合、アジュバントが存在しないとき、抗原単独による1次投与は、体液性または細胞性免疫応答を誘導できないであろう。アジュバントには、これに限定されるものではないが、Freund完全アジュバント、Freund不完全アジュバント、サポニン、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウムなど、界面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油、または炭化水素エマルジョンなど、および潜在的に有用なヒト・アジュバント、たとえばBCG(カルメット・ゲラン杆菌)および挫瘡プロピオンバクテリウムなどが含まれる。別法として、またはこれに加えて、以下に記載する免疫刺激タンパク質をアジュバントとして、またはワクチンに対する免疫応答を高めるために用いることができる。好ましくは、このアジュバントは薬学的に許容される。
【0037】
「薬学的に許容される」、または「獣医学的に許容される」という語句は、動物に投与されたとき、生理的に耐性であり、典型的にアレルギー反応、または類似の不都合な反応、たとえば胃の不調、めまい感などを生じない分子実体、および組成物を指す。本明細書では、好ましくは、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されている、あるいは米国薬局方、または動物に用いるための一般に認められている他の薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」という用語は、それと共に化合物を投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。滅菌水または水溶液、食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は、特に注射可能溶液用に担体として好ましく用いられる。適切な薬剤担体は、E.W.Martinの「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【0038】
本明細書では、「単離」という用語は、言及された材料が、その天然の環境、たとえば細胞から取り出されることを意味する。したがって、単離された生物材料は、いくつかの、またはすべての細胞成分、すなわちその天然材料が天然に発生する細胞の成分(たとえば、細胞質成分または細胞膜成分)を含まないことが可能である。ある材料が細胞抽出物中に存在する場合、または異種細胞または細胞抽出物中に存在する場合、単離されたものとみなされる。核酸分子の場合、単離核酸には、PCR産物、単離mRNA、cDNA、または制限フラグメントが含まれる。単離核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列が含まれ、すなわちそれがキメラ組換え核酸構成体の一部を形成する。したがって、特定の実施形態において、組換え核酸は単離核酸である。単離タンパク質は、それが細胞内で結合する他のタンパク質、または核酸、あるいはその両方と結合していてもよく、あるいは膜結合タンパク質である場合、細胞膜と結合していてもよい。単離小器官、細胞、または組織は、生体においてそれが見出される解剖学的部位から取り出される。単離材料は、必要ではないが、精製することができる。
【0039】
本明細書では、「精製」という用語は、その材料が得られた天然材料を含む関連のない材料、すなわち不純物の存在を低減または排除する条件下で単離された材料を指す。たとえば、精製タンパク質は、好ましくは、細胞内でそれが結合している他のタンパク質、または核酸を実質的に含まず、精製核酸分子は、好ましくは、細胞内でそれとともに見出される可能性のある、タンパク質、または他の関連のない核酸分子を実質的に含まない。本明細書では、「実質的に含まない」という用語は、材料の分析試験のコンテクストにおいて適切に用いられる。好ましくは、実質的に不純物を含まない精製材料は、少なくとも50%の純度である。純度は、クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的検定、および当分野で知られる他の方法によって評価することができる。
【0040】
本発明に従って、当分野の技術の範囲内である通常の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技法を用いることができる。そのような技法は文献において充分に説明されている。たとえば、Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(本明細書において「Sambrook等、1989」とする)、DNA Cloning:A Practical Approach、第1巻および第2巻(D.N.Glover編、1985)、Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984)、Nucleic Acid Hybridization[B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1985)]、Transcription And Translation[B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1984)]、Animal Cell Culture[R.I.Freshney編(1986)]、Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press(1986)]、B.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)、F.M.Ausubel等(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley&Sons,Inc.(1994)を参照されたい。
【0041】
「オープン・リーディング・フレーム」、「コード配列」、または発現産物、たとえばRNA、ポリペプチド、タンパク質、または酵素などを「エンコードする」配列は、発現したときに、RNA、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列であり、すなわちそのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質、または酵素のアミノ酸配列をエンコードする。タンパク質のコード配列には、開始コドン(一般にATG)、および終止コドンを含むことができる。
【0042】
RNAポリメラーゼがコード配列をRNA、特にmRNAに転写し、次いでそれがトランスRNAスプライシングされ(イントロンを含有する場合)、そのコード配列によってエンコードされたタンパク質に翻訳されるとき、コード配列は、細胞内で転写および翻訳制御配列の「制御下にある」か、あるいは「機能的に結合している」。
【0043】
「発現調節配列」は、エンハンサ、レプレッサ、またはプロモータ配列を含む、転写または翻訳調節配列である。
【0044】
「プロモータ」または「プロモータ配列」は、細胞内でRNAポリメラーゼを結合し、下流(3’方向)のコード配列の転写を開始することのできるDNA調節領域である。本発明を定義するために、プロモータ配列は、転写開始部位によってその3’末端に結合され、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むために上流(5’方向)に延長する。プロモータ配列内で、転写開始部位(たとえば、ヌクレアーゼS1を用いるマッピングによって都合よく定義される)、ならびにRNAポリメラーゼの結合を起こすタンパク質結合領域(コンセンサス配列)が見出される。
【0045】
「ベクター」、「クローニング・ベクター」、および「発現ベクター」という用語は、それによってDNAまたはRNA配列(たとえば、外来遺伝子)を宿主細胞に導入し、それによって宿主を形質転換し、導入された配列の発現(たとえば、転写および翻訳)を促進することのできるビヒクルを意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれ、それらについては以下に詳しく論じる。
【0046】
ベクターは典型的に、伝達性因子のDNAを含有し、その中に外来DNAが挿入される。DNAの1つの断片をDNAの別の断片に挿入する一般的な方法には、制限部位と呼ばれる特定の部位(特定のヌクレオチド群)でDNAを開裂する制限酵素と呼ばれる酵素を使用することが含まれる。
【0047】
「カセット」は、定義された制限部位でベクターに挿入されることのできる発現産物をコードするDNAコード配列、またはDNAの断片を指す。カセット制限部位は、適切なリーディング・フレーム内に確実にカセットを挿入するように設計されている。一般に、外来DNAは、ベクターDNAの1つまたは複数の制限部位に挿入され、次いで、ベクターによって伝達性ベクターDNAと共に宿主細胞に運ばれる。発現ベクターなどの挿入または付加DNAを有するDNAの断片または配列は、「DNA構成体」と呼ぶこともできる。ベクターの一般的な型は「プラスミド」であり、これは一般的に、通例は細菌起源の2本鎖DNAの自己完結型分子であり、容易に追加の(外来)DNAを受容することができ、容易に適切な宿主細胞に導入される。プラスミド・ベクターは多くの場合、コーディングDNAおよびプロモータDNAを含有し、外来DNAの挿入に適した1つまたは複数の制限部位を有する。コーディングDNAは、特定のタンパク質または酵素に関する特定のアミノ酸配列をエンコードするDNA配列である。プロモータDNAは、コーディングDNAの発現を開始、調節、あるいは仲介、または制御するDNA配列である。プロモータDNA、およびコーディングDNAは、同一の遺伝子由来であることができ、あるいは異なる遺伝子由来であることができ、さらに同一の生体由来、または異なる生体由来であることができる。プラスミドおよび菌類ベクターを含む多数のベクターが、多様な真核生物および原核生物宿主における複製および/または発現に関して記載されてきた。非限定的な例には、pKKプラスミド(Clonetech)、pUCプラスミド、pETプラスミド(Novagen,Inc.、Madison、WI)、pRSETまたはpREPプラスミド(Invitrogen、San Diego、CA)、またはpMALプラスミド(New England Biolabs、Beverly、MA)、および本明細書に記載または引用した方法、あるいは関連分野の技術者に知られている方法を用いる多くの適切な宿主細胞が含まれる。組換えクローニング・ベクターは多くの場合、クローニングまたは発現のための1つまたは複数の複製系、宿主における選択のための1つまたは複数のマーカ、たとえば抗生物質抵抗性など、および1つまたは複数の発現カセットを含む。
【0048】
「発現する」および「発現」という用語は、遺伝子またはDNA配列の情報が顕性となるのを可能にすること、あるいはそれをもたらすことを意味し、たとえば対応する遺伝子またはDNA配列の転写および翻訳に関わる細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生する。DNA配列は、細胞において、または細胞によって発現し、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、たとえば生じたタンパク質も、その細胞によって「発現した」と言うことができる。発現産物は、細胞内、細胞外、または分泌型として特徴づけることができる。「細胞内」という用語は、細胞の内部にあるものを意味する。「細胞外」という用語は、細胞の外部にあるものを意味する。ある物質が細胞上または内部のどこからか、著しい程度で細胞外部に現れる場合、その物質は細胞によって「分泌」されている。
【0049】
「トランスフェクション」という用語は、細胞への外来核酸の導入を意味する。「形質転換」という用語は、「外来」(すなわち、外在または細胞外)遺伝子、DNAまたはRNA配列の宿主細胞への導入を意味し、それによって宿主細胞は導入遺伝子または配列を発現し、所望の物質、典型的には導入遺伝子または配列によってコードされたタンパク質または酵素を産生することになる。導入遺伝子または配列は、「クローン」または「外来」遺伝子または配列と呼ぶこともでき、調節または制御配列、たとえば開始、終止、プロモータ、シグナル、分泌、または細胞の遺伝子機構によって用いられる他の配列などを含むことができる。この遺伝子または配列は、非機能性配列、または未知の機能を有する配列を含むことができる。導入DNAおよびRNAを受容し、発現する宿主細胞は、「形質転換」されており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されたDNAまたはRNAは、任意の供給源由来であることができ、宿主細胞と同一の属または種の細胞、あるいは異なる属または種の細胞を含む。
【0050】
「宿主細胞」という用語は、たとえば遺伝子、DNAまたはRNA配列、タンパク質、または酵素の細胞による発現など、細胞による物質の産生のために、選択、修飾、形質転換、増殖、あるいは任意の方法で用いられるか、操作される任意の生体の任意の細胞を意味する。適切な宿主細胞には、1次マクロファージ、特にブタ・マクロファージ、またはそのマクロファージ細胞系、ブタ腎細胞、あるいはPCVがウイルスを産生できる、またはそれがウイルス感染を支持できる、またはその両方であるような他の哺乳動物細胞が含まれる。
【0051】
「発現系」という用語は、たとえばベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入された外来DNAによってコードされるタンパク質の発現のためなどの、適切な条件下にある宿主細胞、および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系には、大腸菌宿主細胞およびプラスミド・ベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルス・ベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが含まれる。特定の実施形態において、当該タンパク質は、COS−1、またはC2C12細胞に発現する。他の適切な細胞には、CHO細胞、HeLa細胞、293T(ヒト腎細胞)、マウス1次筋芽細胞、およびNIH3T3細胞が含まれる。
【0052】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体」とは、所与のコドン位置における1つまたは複数のヌクレオチドの変化が、その位置でエンコードされたアミノ酸に変更を生じない変異体である。
【0053】
「機能保存的変異体」とは、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変更することなく、変化している変異体であって、これに限定されるものではないが、類似の特性(たとえば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など)を有するものによるアミノ酸の置換が含まれる。類似の特性を有するアミノ酸は、当技術分野においてよく知られている。たとえば、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンは、親水性−塩基性アミノ酸であり、互換性である可能性がある。同様に、疎水性アミノ酸のイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、またはバリンと置換することができる。そのような変化は、見かけの分子量、あるいはタンパク質またはポリペプチドの等電点にほとんど、またはまったく影響を及ぼさないことが予期される。保存として指示された以外のアミノ酸はタンパク質または酵素中で異なっている可能性があり、そのため類似の機能を有する任意の2つのタンパク質の、タンパク質またはアミノ酸配列の類似性パーセントは多様であり、MEGALIGNアルゴリズムに基づくCluster Methodなどによるアライメント・スキームによって求めた類似性は、たとえば70%から99%であることができる。「機能保存的変異体」はさらに、BLASTまたはFASTAアルゴリズムによって求めたアミノ酸同一性が、少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、もっとも好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%であって、比較される天然または親タンパク質または酵素と同一の、または実質的に類似の特性または機能を有するポリペプチドまたは酵素を含む。
【0054】
本明細書では、すべての文法形態および綴りの変形形態の「相同性(homologous)」という用語は、スーパーファミリー由来のタンパク質(たとえば、免疫グロブリン・スーパーファミリー)、および異なる種由来の相同性タンパク質(たとえば、ミオシン軽鎖など)を含む、「共通の進化学的起源」を有するタンパク質間の関係を指す(Reeck等、Cell 50:667、1987)。そのようなタンパク質(およびそれらのエンコード遺伝子)は、類似性パーセントまたは保存位置における特定の残基またはモチーフの存在という点において、それらの配列類似性によって表される配列相同性を有する。
【0055】
したがって、すべての文法形態の「配列類似性」という用語は、共通の進化学的起源を共有していても、共有していなくてもよいタンパク質の核酸またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度を指す(上述のReeck等を参照のこと)。しかしながら、慣例的な使用、および本出願において、「高度に」などの副詞によって修飾されているとき、「相同性」という用語は、配列類似性を指すことができ、共通の進化学的起源に関連しても、関連していなくてもよい。
【0056】
特定の実施形態において、BLAST、FASTA、DNAStriderなどの配列比較アルゴリズムによって求められたDNA配列の定義された長さに渡るヌクレオチドの一致が、少なくとも約80%、もっとも好ましくは少なくとも約90または95%であるとき、2つのDNA配列は、「実質的に相同性」、または「実質的に類似性」である。そのような配列の例は、本発明の特定の遺伝子の対立遺伝子、または種変異体である。実質的に相同性である配列は、たとえば特定のシステムに関して定義された厳格な条件下で、配列データバンクで入手可能な標準的なソフトウェアを用いて、またはサザン・ハイブリダイゼーション実験において、配列を比較することによって同定できる。
【0057】
同様に、特定の実施形態において、80%を超えるアミノ酸が同一であるとき、または約90%を超えるアミノ酸が類似している(機能的に同一である)とき、2つのアミノ酸配列は、「実質的に相同性」、または「実質的に類似性」である。好ましくは、類似性または相同性配列は、たとえばGCG(Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package、バージョン7、Madison、Wisconsin)パイルアップ・プログラム、または上記の任意のプログラム(BLAST、FASTAなど)を用いるアライメントによって同定される。
【0058】
核酸分子の1本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、他の核酸分子とアニール可能なとき、その核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAなどの別の核酸分子と「ハイブリダイゼーション可能」である(上述のSambrook等を参照)。温度およびイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同性核酸の予備スクリーニングの場合、Tm(融解温度)55℃に対応するストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件を用いることができ、たとえば、5×SSC、0.1%SDS、0.25%乳、ホルムアミド非含有、または30%ホルムアミド、5×SSC、0.5%SDSである。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに対応し、たとえば、40%ホルムアミド、5×または6×SSCである。ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件は、最高温度のTmに対応し、たとえば、50%ホルムアミド、5×または6×SSCである。SCCは、0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸Naである。ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含有していることを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間の誤対合も可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、および相補性の程度に応じて決まり、変数は当分野においてよく知られている。2つのヌクレオチド配列の類似性または相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するTm値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性(より高いTmに対応する)は、以下の順序で減少する。RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。ヌクレオチドが100を超える長さのハイブリッドの場合、Tmを算出するための等式がすでに得られている(上述のSambrook等、9.50〜9.51を参照のこと)。短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、誤対合の位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(上述のSambrook等、11.7〜11.8を参照のこと)。ハイブリダイゼーション可能な核酸の最短の長さは、少なくとも約10のヌクレオチド、好ましくは約15のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約20のヌクレオチドの長さである。
【0059】
特定の実施形態において、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、Tm55℃を指し、上述の条件を用いる。好ましい実施形態において、Tmは60℃であり、より好ましい実施形態において、Tmは65℃である。特定の実施形態において、「高いストリンジェンシー」は、0.2×SSC中68℃、50%ホルムアミド、4×SSC中42℃のハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件、またはこれら2つのいずれかの条件下で認められるものと同等のハイブリダイゼーションレベルが得られる条件下を指す。
【0060】
本明細書では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般にヌクレオチドが少なくとも10、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも20で、好ましくはヌクレオチドが100以下の核酸を指し、遺伝子、mRNA、cDNA、または他の対象となる核酸をエンコードするゲノムDNA分子、cDNA分子、またはmRNA分子とハイブリダイゼーション可能である。オリゴヌクレオチドは、たとえば32P−ヌクレオチド、またはビオチンなどの標識が共有的にコンジュゲートしているヌクレオチドで標識することができる。一実施形態において、標識ヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。他の実施形態において、オリゴヌクレオチド(1つまたは両方が標識されていてよい)は、遺伝子の全長またはフラグメントをクローニングするため、またはそのタンパク質をエンコードする核酸の存在を検出するためのPCRプライマーとして用いることができる。さらなる実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、DNA分子と共に3重らせんを形成することができる。一般にオリゴヌクレオチドは、合成によって、好ましくは核酸合成装置で調製される。したがって、オリゴヌクレオチドは、非天然ホスホエステルアナログボンド、たとえばチオエステルボンドなどを用いて調製することができる。
【0061】
PCVのクローニングおよび発現
本発明は、7種のブタ・シルコウイルス(PCV)株のクローン化、および配列決定に成功した。1960年代終わりに単離され(本明細書ではCT−PCV7と称する)、2型の先天性振せん(CT)を有する新生ブタを起源とする1種のウイルス株、CTを示すブタから得た2種の新しいPCV単離株(本明細書ではCT−PCV−P5、およびCT−PCV−P6と称する)、および離乳後多臓器性発育不全症候群(PMWS)の徴候を示すブタから得た4種のPCV株(本明細書ではPMWS−PCV−P1、PMWS−PCV−P2、PMWS−PCV−P3、およびPMWS−PCV−P4と称する)である。
【0062】
PMWS−PCV単離株は、互いに約99%のヌクレオチド配列同一性を生じることが見出された。さらに、1990年代終わりの新しいCT−PCV単離株、および1960年代終わりの古いCT−PCV単離株はCT A2型を有する新生ブタを起源としたが、それらはわずか72%のヌクレオチド配列同一性を共有した。2種の新しいCT−PCVのゲノムは、2型のPMWS−PCV単離株と高い配列相同性を共有する。他方、CT−PCV−7株は、1型のPK−15−PCV変株に非常に近いことが見出された。
【0063】
したがって本発明の主題は、PCVから単離された核酸であって、その核酸は、配列番号1から配列番号7からなる群から選択された配列を含む。
【0064】
本発明の他の主題は、PCVから単離された核酸であって、配列番号1から配列番号7からなる群から選択された配列と同一の配列を有する。
【0065】
本発明の核酸配列は、生物試料中のPCV核酸の存在を検出するためのプローブまたはプライマーを設計するのに有用である可能性がある。そのようなプローブまたはプライマーは、より詳細にはオリゴヌクレオチドの形態であることができ、ストリンジェンシーの高い条件下でPCV核酸配列に特異的にハイブリダイズする。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも約20の塩基を含み、配列番号1から配列番号7の20個の連続塩基に見出される配列、またはそれらの相補鎖を有する。
【0066】
11種のオープン・リーディング・フレーム(ORF)配列が決定され、それを実施例の表2および4に示す。対応するポリペプチド配列も、図4から14に示す。
【0067】
したがって、本発明はさらに、その核酸が任意の配列番号1から配列番号7の配列の、任意のORF1からORF11によってコードされたアミノ酸配列からなる群から選択された配列を有するシルコウイルス・ポリペプチドをコードする配列を含む、PCV由来の核酸を提供する。より詳細には、本発明の核酸は、任意の配列番号1から配列番号7の配列の、任意のORF1からORF11から選択された配列を含む。これらの中で、ORF1、2、3、または4が特に興味深い。
【0068】
本発明は、保存的配列、すなわち記載された配列、またはその配列によってエンコードされたポリペプチドの機能性または株特異性を変化しない配列を包含する。これらの配列はまた、「機能保存的変異体」とも呼ばれる。「配列保存的変異体」と呼ばれる、コードの縮重によって異なる配列も包含される。
【0069】
本発明はさらに、ストリンジェンシーの高い条件下で上記の配列とハイブリダイズすることができ、かつ/または本発明の株と非常に高い相同性を有するという点において同等の配列を包含する。
【0070】
任意のこれらの核酸配列を含むクローニング・ベクターも、本発明の一部である。そのようなベクターの調製は、当分野の技術者によく知られており、上述の定義に記載されている。
【0071】
これらの核酸配列およびそのフラグメントは、適切な発現ベクターの助力によって、in vitroまたはin vivoでのポリペプチドの発現に有利に用いることができる。
【0072】
これらのベクターは、より詳細には、発現制御配列と有効に結合した、任意の配列番号1から配列番号7の配列の任意のORF1からORF11からなる群から選択された配列を含む。
【0073】
本発明のベクターは、宿主細胞をトランスフェクトするために用いることができ、これも本発明の一部である。ベクターは当分野で知られている方法、たとえば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション(リソーム融合)、遺伝子銃、またはDNAベクター・トランスポータの使用によって所望の宿主細胞に導入される(たとえばWu等、J.Biol.Chem.267:963−967、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.263:14621−14624、1988、Hartmut等、カナダ特許出願第2012311号、1990年3月15日出願を参照されたい)。
【0074】
本発明はさらに、PCVタンパク質を産生する方法を提供し、その方法は、シルコウイルス・タンパク質をコードする核酸の発現を生じる条件下で、上に定義したように発現ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞を培養することを含む。大腸菌、またはバキュロウイルスは、この目的のために用いることのできる発現系である(米国特許第4745051号)。コード配列は、バキュロウイルスゲノム(たとえば、baculovirus Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV)に組み込むことができ、次いで後者を昆虫細胞、たとえばSpodoptera frugiperda Sf9(寄託番号ATCC CRL 1711)上で増殖できる。
【0075】
より一般的には、本発明は、in vivo、in vitro、またはex vivoでのPCVポリペプチドまたはタンパク質の発現を対象とする。これらの様々な目的に関して、当分野の技術者は、以下に記載する任意の適切な発現系を選択することができる。
【0076】
発現系
多様な宿主/発現ベクターの組合せ(すなわち、発現系)を、本発明のポリペプチドの発現に用いることができる。有用な発現ベクターは、たとえば、染色体、非染色体、および合成DNA配列のセグメントからなることができる。適切なベクターには、SV40の誘導体、および既知の細菌プラスミド、たとえば大腸菌プラスミドcolE1、pCR1、pBR322、pMal−C2、pET、pGEX(Smith等、Gene 67:31−40、1988)、pMB9およびその誘導体、プラスミド、たとえばRP4など;グラム陽性ベクター、たとえばStrep.gardoniiなど;ファージDNA、たとえばファージ1の多数の誘導体、たとえばNM989、および他のファージDNA、たとえばM13、および糸状1本鎖ファージDNA;酵母プラスミド、たとえば2μプラスミドまたはその誘導体など;真核細胞に有用なベクター、たとえば昆虫または哺乳動物細胞に有用なベクター;プラスミドおよびファージDNAの組合せから誘導されたベクター、たとえばファージDNAまたは他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミドなどが含まれる。
【0077】
タンパク質またはポリペプチドの発現は、当分野で知られる任意のプロモータ/エンハンサ因子によって制御することができるが、これらの調節因子は、発現のために選択された宿主において機能性でなければならない。遺伝子発現を制御するために用いることのできるプロモータには、これに制限されるものではないが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ、SV40初期プロモータ領域(Benoist、およびChambon、1981、Nature 290:304−310)、ラウス肉腫ウイルスの3’側長末端反復に含有されたプロモータ(Yamamoto等、Cell 22:787−797、1980)、ヘルペスチミジンキナーゼ・プロモータ(Wagner等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441−1445、1981)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster等、Nature 296:39−42、1982);原核生物発現ベクター、たとえばb−ラクタマーゼ・プロモータ(Villa−Komaroff等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727−3731、1978)、またはtacプロモータ(DeBoer等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21−25、1983);さらに「Useful proteins from recombinant bacteria」、Scientific American、242:74−94、1980を参照のこと;酵母または他の真菌のプロモータ因子、たとえばGal4プロモータ、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモータ、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモータ、アルカリホスファターゼプロモータなど;造血組織特異性を示す制御部位、特に骨髄性細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御部位(Mogram等、Nature 315:338−340、1985、Kollias等、Cell 46:89−94、1986)、造血幹細胞分化因子プロモータ、エリトロポイエチン受容体プロモータ(Maouche等、Blood、15:2557、1991)など、および粘膜上皮細胞特異性を示す制御部位が含まれる。
【0078】
特にin vitro細胞アッセイ、およびin vivoまたはex vivoワクチン接種に好ましいベクターは、ウイルス・ベクター、たとえばレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および望ましい細胞親和性を備えた他の組換えウイルスなどである。したがって、免疫原性ポリペプチドをエンコードするベクターは、ウイルス・ベクターを用いて、またはDNAの直接導入によって、in vivo、ex vivo、またはin vitroで導入することができる。標的組織における発現は、ウイルス・ベクターまたは受容体リガンドなどを用いてトランスジェニック・ベクターを特定の細胞に向けることによって、または組織特異性プロモータを用いて、あるいはその両方によって実施することができる。標的遺伝子送達は、1995年10月公開の国際特許公開WO95/28494に記載されている。
【0079】
in vivoまたはex vivoでの標的化およびワクチン接種手順に一般に用いられるウイルス・ベクターは、DNAをベースとするベクター、およびレトロウイルス・ベクターである。ウイルス・ベクターを構成する方法、および用いる方法は、当分野で知られている(Miller、およびRosman、Bio Techniques、7:980−990、1992を参照のこと)。好ましくは、ウイルス・ベクターは複製欠損であり、すなわち標的細胞において自律的に複製することができない。好ましくは、この複製欠損ウイルスは最小ウイルスであり、すなわちウイルス粒子を産生するためにゲノムを包膜するのに必要なゲノムの配列のみを保持している。
【0080】
DNAウイルス・ベクターには、弱毒または欠損DNAウイルスが含まれ、たとえば、これに限定されるものではないが、単純疱疹ウイルス(HSV)、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス(AAV)、ワクシニアウイルスなどである。特定のベクターの例には、これに限定されるものではないが、欠損ヘルペスウイルス1(HSV1)ベクター(Kaplitt等、Molec.Cell.Neurosci.2:320−330、1991、国際特許公開WO94/21807、1994年9月29日公開、国際特許公開WO92/05263、1994年4月2日公開)、弱毒アデノウイルス・ベクター、たとえばStratford−Perricaudet等によって記載されているベクターなど(J.Clin.Invest.90:626−630、1992、さらにLa Salle等、Science 259:988−990、1993を参照のこと)、および欠損アデノ関連性ウイルス・ベクター(Samulski等、J.Virol.61:3096−3101、1987、Samulski等、J.Virol.63:3822−3828、1989、Lebkowski等、Mol.Cell.Biol.8:3988−3996、1988)が含まれる。
【0081】
多数の会社が商業的にウイルス・ベクターを製造しており、これに限定されるものではないが、Avigen,Inc.(Alameda、CA、AAVベクター)、Cell Genesys(Foster City、CA、レトロウイルス、アデノウイルス、AAVベクター、およびレンチウイルス・ベクター)、Clontech(レトロウイルス、およびバキュロウイルスベクター)、Genovo,Inc.(Sharon Hill、PA、アデノウイルス、およびAAVベクター)、Genvec(アデノウイルス・ベクター)、IntroGene(Leiden、Netherlands、アデノウイル・スベクター)、Molecular Medicine(レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、およびヘルペスウイルス・ベクター)、Norgen(アデノウイルス・ベクター)、Oxford BioMedica(Oxford、英国、レンチウイルス・ベクター)、およびTransgene(Strasbourg、フランス、アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルス・ベクター)が含まれる。
【0082】
アデノウイルス・ベクター。アデノウイルスは、本発明の核酸を多様な細胞型に有効に送達するために修飾することのできる真核生物DNAウイルスである。アデノウイルスの様々な血清型が存在する。これらの血清型において、本発明の範囲内で、2型または5型ヒト・アデノウイルス(Ad2またはAd5)、あるいは動物起源のアデノウイルス(WO94/26914参照)を用いることが好ましい。本発明の範囲内で用いることのできるそのような動物起源アデノウイルスには、イヌ、ウシ、マウス(例Mav1、Beard等、Virology 75(1990)81)、ヒツジ、ブタ、鳥類、およびサル(例SAV)起源のアデノウイルスが含まれる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌ・アデノウイルスであり、より好ましくはCAV2アデノウイルスである(たとえば、Manhattan、またはA26/61株(ATCCVR−800))。種々の複製欠損アデノウイルス、および最小アデノウイルス・ベクターが記載されている(WO94/26914、WO95/02697、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697、WO96/22378)。本発明による複製欠損組換えアデノウイルスは、当分野の技術者に知られている任意の技法で調製することができる(Levrero等、Gene 101:195、1991、EP185573、Graham、EMBO J.3:2917、1984、Graham等、J.Gen.Virol.36:59、1977)。組換えアデノウイルスは、標準的な分子生物学技法を用いて回収、および精製され、それらは当分野の技術者によく知られている。
【0083】
アデノ関連性ウイルス。アデノ関連性ウイルス(AAV)は、安定な部位特異的な方式で、それらが感染する細胞のゲノムに組み込まれることのできる比較的小さなサイズのDNAウイルスである。アデノ関連性ウイルスは、細胞増殖、形態、または分化への影響を誘発することなく広範囲の細胞に感染することができ、ヒトの病理には関係していないと考えられる。AAVゲノムはクローン化され、配列決定され、特性付けされている。in vitroおよびin vivoで遺伝子を伝達するためにAAVから誘導されたベクターを用いることが記載されている(WO91/18088、WO93/09239、US4797368、US5139941、EP488528を参照のこと)。本発明による複製欠損組換えAAVは、2つのAAV逆位末端反復(ITR)領域に脇を固められた対象となる核酸配列を含有するプラスミド、およびAAV包膜遺伝子(repおよびcap遺伝子)を有するプラスミドを、ヒト・ヘルパー・ウイルス(たとえば、アデノウイルス)に感染している細胞系に共トランスフェクションすることによって調製できる。その後、産生されたAAV組換え型を標準的な技法によって精製する。
【0084】
レトロウイルス・ベクター。他の実施形態において、たとえば、Anderson他、米国特許第5399346号、Mann等、Cell 33:153、1983、Temin他、米国特許第4650764号、Temin他、米国特許第4980289号、Markowitz等、J.Virol.62:1120、1988、Temin他、米国特許第5124263号、EP453242、EP178220、Bernstein等、Genet.Eng.7(1985)235、McCormick、BioTechnology 3(1985)689、Dougherty他による1995年3月16日公開の国際特許公開WO95/07358、およびKuo等、Blood 82:845、1993に記載されているように、遺伝子をレトロウイルス・ベクターに導入することができる。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組込みウイルスである。レトロウイルス・ゲノムは、2つのLTR、包膜配列、3つのコード領域(gag、pol、およびenv)を含む。組換えレトロウイルス・ベクターにおいて、gag、pol、およびenv遺伝子は一般に、全体的または部分的に除去され、対象となる異種核酸配列と置き換えられる。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス、たとえばHIV、MoMuLV(マウスモロニー白血病ウイルス)、MSV(マウスモロニー肉腫ウイルス)、HaSV(ハーベイ肉腫ウイルス)、SNV(脾臓壊死ウイルス)、RSV(ラウス肉腫ウイルス)、およびフレンドウイルスなどから構成することができる。適切なパッケージング細胞系統は従来技術に記載されており、特に細胞系PA317(US4861719)、PsiCRIP細胞系(WO90/02806)、およびGP+envAm−12細胞系(WO89/07150)である。さらに、組換えレトロウイルス・ベクターは、転写活性を抑制するためのLTP内の修飾、ならびにgag遺伝子の一部を含むことのできる延長包膜配列を含有することができる(Bender等、J.Virol.61:1639、1987)。組換えレトロウイルス・ベクターは、当分野の技術者に知られている標準的な技法によって精製される。
【0085】
レトロウイルス・ベクターはまた、DNAウイルスによって導入されることができ、それにより1サイクルのレトロウイルス複製が可能となり、トランスフェクション効率が増幅される(WO95/22617、WO95/26411、WO96/39036、WO97/19182を参照のこと)。
【0086】
レンチウイルス・ベクター。他の実施形態において、脳、網膜、筋肉、肝臓、および血液を含むいくつかの組織型で、導入遺伝子を直接送達し、持続発現させるための因子としてレンチウイルス・ベクターを用いることができる。このベクターは、それらの組織において分裂および非分裂細胞を有効に形質導入し、対象となる遺伝子の長期発現を維持することができる。概説として、Naldini、Curr.Opin.Biotechnol.、9:457−63、1998、さらにZufferey等、J.Virol.、72:9873−80、1998を参照されたい。レンチウイルス・パッケージング細胞系は入手可能であり、当分野で一般に知られている。これらは、遺伝子治療のための高力価レンチウイルス・ベクターの産生を促進する。例としては、テトラサイクリン誘導VSV−Gシュードタイプ・レンチウイルス・パッケージング細胞系であり、これは少なくとも3から4日間、106IU/mlを超える力価でウイルス粒子を産生することができる(Kafri等、J.Virol.、73:576−584、1999)。in vitroおよびin vivoで非分裂細胞を有効に形質導入するための必要に応じて、誘導細胞系によって産生されたベクターを濃縮することができる。
【0087】
非ウイルス・ベクター。他の実施形態において、ベクターは、naked DNAとしてリポフェクションによって、または他のトランスフェクション促進剤(ペプチド、ポリマーなど)を用いてin vivoで導入することができる。マーカをエンコードする遺伝子のin vivoトランスフェクションのリポソームを調製するために、合成カチオン脂質を用いることができる(Felgner等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413−7417、1987、FelgnerおよびRingold、Science 337:387−388、1989、Mackey等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8027−8031、1988参照、Ulmer等、Science 259:1745−1748、1993)。核酸を伝達するのに有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開WO95/18863、およびWO96/17823、ならびに米国特許第5459127号に記載されている。脂質は、標的化のために他の分子と化学的に結合することができる(上記のMackey等を参照のこと)。標的化ペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質、たとえば抗体、または非ペプチド分子などは、化学的にリポソームと結合することができる。
【0088】
他の分子も、in vivoでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用であり、たとえばカチオンオリゴペプチド(たとえば、国際特許公開WO95/21931)、DNA結合タンパク質から誘導されたペプチド(たとえば、国際特許公開WO96/25508)、またはカチオンポリマー(たとえば、国際特許公開WO95/21931)などである。
【0089】
さらに、in vivoでnaked DNAプラスミドとしてベクターを導入することも可能である。遺伝子治療に用いるnaked DNAベクターは、当分野で知られている方法、たとえばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用(弾道トランスフェクション)、またはDNAベクター・トランスポータの使用によって所望の宿主細胞に導入することができる(たとえばWu等、J.Biol.Chem.267:963−967、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.263:14621−14624、1988、Hartmut等、カナダ特許出願第2012311号、1990年3月15日出願、Williams等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2726−2730、1991を参照されたい)。受容体媒介DNA送達法も用いることができる(Curiel等、Hum.Gene Ther.3:147−154、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.262:4429−4432、1987)。米国特許第5580859号および第5589466号は、トランスフェクション促進剤を含まない外因性DNA配列の哺乳動物における送達を開示している。最近、比較的低電圧で効率の高い、電気伝達と呼ばれるin vivoのDNA伝達技法が記載された(Mir等、C.P.Acad.Sci.、321:893、1998、WO99/01157、WO99/01158、WO99/01175)。
【0090】
PCVポリペプチドの精製
そのようにして産生されたポリペプチドは回収し、好ましくは精製することができる。精製方法は当分野でよく知られている。精製方法には、これに限定されるものではないが、分取ディスク・ゲル電気泳動および等電点電気泳動;アフィニティ、HPLC、逆相HPLC、ゲル濾過またはサイズ排除、イオン交換、および分配クロマトグラフィ;沈降および塩析クロマトグラフィ;抽出、および向流分配が含まれる。目的によっては、タンパク質が精製を促進する追加の配列標識を含有するような組換え系でポリペプチドを生成することが好ましく、これに限定されるものではないが、たとえばポリヒスチジン配列、またはFLAGおよびGSTなどの抗体と特異的に結合する配列などである。次いでこのポリペプチドを、適切な固相マトリクスのクロマトグラフィによって、宿主細胞の粗溶解産物から精製することができる。別法として、タンパク質に対して、またはそれから誘導されたペプチドに対して産生された抗体を、精製試薬として用いることができる。
【0091】
抗PCV抗体
そのような抗体には、これに限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリが含まれる。
【0092】
PCVポリペプチド、あるいはその誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体を産生するために、当分野で知られる様々な手順を用いることができる。抗体の産生のために、抗原性ポリペプチドを注入することによって種々の動物を免疫化することができ、これに限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。好ましくは、免疫化動物は、抗体に対するアレルギー反応を回避するために、受動免疫法においてその抗体を受容する動物と同一の種である。
【0093】
PCVポリペプチドに対するモノクローナル抗体を調製するために、培養において連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いることができる。これらの技法には、これに限定されるものではないが、KohlerおよびMilsteinによって最初に開発されたハイブリドーマ技法(Nature 256:495−497、1975)、ならびにトリオーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozbor等、Immunology Today 4:72、1983、Cote等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026−2030、1983)、およびヒト・モノクローナル抗体を産生するためのEBV−ハイブリドーマ技法(Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、77−96頁、1985)が含まれる。本発明のさらなる実施形態では、モノクローナル抗体は、無菌動物において産生することができる(国際特許公開WO89/12690、1989年12月28日公開)。
【0094】
本発明によれば、単鎖抗体を産生するために記載された技法(Hustonの米国特許第5476786号および第5132405号、米国特許第4946778号)を、PCVポリペプチド特異単鎖抗体を産生するために適合させることができる。さらに、これらの遺伝子は、in vivoでの発現のために送達することができる。本発明のさらなる実施形態は、Fab発現ライブラリを構成するために記載された技法(Huse等、Science 246:1275−1281、1989)を用い、PCVポリペプチド、あるいはその誘導体または類似体に対する所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定を可能にする。
【0095】
抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、知られている技法によって産生することができる。たとえば、そのようなフラグメントには、これに限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生することのできるF(ab’)2フラグメント、F(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって産生することのできるFab’フラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって産生できるFabフラグメントが含まれる。
【0096】
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当分野で知られている技法によって達成することができ、たとえばラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(たとえば、金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる)、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ(たとえば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどである。一実施形態において、抗体結合は、1次抗体における標識を検出することにより検出することができる。他の実施形態において1次抗体は2次抗体または試薬の1次抗体との結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、2次抗体は標識される。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が当分野で知られており、それらは本発明の範囲内である。
【0097】
PCVのin vitroでの培養
本発明はさらに、ブタ・シルコウイルス株を培養する方法に関し、その方法は、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含む核酸を、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス粒子の産生をもたらす条件下で、適切な宿主細胞に導入することを含む。
【0098】
任意の型の非感染細胞、好ましくはブタ細胞(たとえば、Sus scrofa、またはTayassu tajacu由来の細胞)、より好ましくは神経誘導ブタ細胞(たとえば、グリア細胞)、ブタ腎細胞(たとえば、PK−15細胞)、またはブタ・マクロファージ細胞は、本発明のPCV核酸(たとえば、1本鎖、好ましくは2本鎖ゲノムDNA、あるいはPCVゲノムDNAを含む1つまたは複数のプラスミド)を細胞に導入することによって感染させることができる。宿主細胞系の感染またはトランスフェクションは、当分野で一般に知られている技法であり、当分野の技術を有する任意の実施者によって行うことができる。たとえば、実施例1は、PCVDNAを用いてPK−15細胞をトランスフェクトする手順を含む(クローン化PCVDNAのトランスフェクションおよびPCVの検出を参照されたい)。
【0099】
感染後、感染細胞系の1つまたは複数のクローンを選択し、増殖させることができる。選択されたクローンの細胞を貯蔵(たとえば、凍結)し、マスター細胞バンクとして用いることができ、そこから試料を取り、複数の使用細胞系を産生するために用いることができる。ワクチンの生成のために用いられ、かつウイルスタンパク質源として用いられるウイルス粒子は、この使用細胞系から得ることができる。詳細には、使用細胞系は、凍結マスター細胞系の試料を融解し、培養においてその細胞を増殖することによって産生することができ、その増殖細胞培養の細胞を使用細胞系として用いる。たとえば、マスター細胞系を融解し、多量の細胞を産生するために、Nunc Cell Factory(Nalge Nunc International、Rochester、NY)で増殖することができる。
【0100】
ウイルス粒子は、当分野の技術者に一般に知られている方法によって、使用細胞系から得ることができる。たとえば、使用細胞系の培養上澄み中のウイルス粒子を採取し、濾過し、精製して(たとえば、勾配遠心分離によって)、ワクチン生成に用いることができる。
【0101】
先天性振せんの診断
ブタ・シルコウイルスと先天性振せん(CT)とが関連するという証拠によって、本発明者等は、ブタまたはその子孫における先天性振せん(CT)の病因を診断する方法を提供することができ、その方法は、そのブタがブタ・シルコウイルスに感染しているかどうかを判別することを含む。
【0102】
本明細書では、「診断」という用語は、進行の任意の病期にある疾患の同定を指し、さらに胎児または新生子ブタがその疾患を発現する素因、または雌ブタが胎児にその疾患を伝染する素因を判別することを含む。
【0103】
本発明の診断方法は、1型または2型の任意のPCV株を検出することを含むことができる。2種の型間のPCV株の再分配を図3に示す。1型のPCV株には、より詳細には、PK−15PCV、または配列番号7の核酸配列を含むいわゆる「CT−PCV−7」株が含まれる。2型のPCV株には、より詳細には、配列番号1から配列番号6の任意の核酸配列を含む株が含まれる。PMWSに関連するPCV株(PMWS−PCV)も、この標的PCV株に含まれる。
【0104】
本発明の診断方法は、たとえば国際出願WO99/18214に概説されているとおり、当分野の技術者によく知られている標準的な技法で実施することができる。
【0105】
第1の実施形態において、感染の判別は、試験ブタの生物試料中のPCV核酸の存在を検出することを包含できる。
【0106】
第2の実施形態において、感染の判別は、試験ブタの生物試料中のPCVポリペプチドの存在を検出することを包含できる。
【0107】
第3の実施形態において、感染の判別は、試験ブタの生物試料中のPCVポリペプチドに対する抗体の存在を検出することによって行うことができる。
【0108】
生物試料は任意の種類であることができ、流体試料(血液、血漿、血清、脳脊髄液など)、あるいは器官または組織試料(神経節、肝臓など)を含む。より詳細には死後診断のために、中枢神経系から得た細胞または細胞抽出物を用いることができる。
【0109】
しかしながら、好ましい試験試料および方法は、農場において獣医師または動物飼育者によって容易に実施できるものである。したがって、ウエスタンブロット、免疫蛍光検査法、ELISA、または免疫クロマトグラフィは、これらの応用例に非常によく適合する。
【0110】
ELISAアッセイでは、本発明のポリペプチド、またはそのエピトープ・フラグメントを、選択された表面上、たとえばポリスチレンのマイクロタイタ・プレートのウェルなどタンパク質を結合することのできる表面上に固定する。不完全に吸着されたポリペプチドを洗浄によって除去した後、試験試料に対して抗原性が中性であることが知られているウシ血清アルブミン(BSA)溶液などの非特異タンパク質を、選択された表面に結合することができる。これによって固定化表面の非特異吸着部位が遮断され、したがって抗血清の表面への非特異結合によって起こるバックグラウンドが低減される。次いで固定化表面を、免疫複合体(抗原/抗体)が形成されるようなやり方で、試験される臨床材料または生物材料などの試料と接触させる。これには、試料を、BSA溶液、ウシ・ガンマグロブリン(BGG)、および/またはリン酸緩衝食塩水(PBS)/Tweenなどの希釈剤で希釈することを含むことができる。その後、2から4時間、約25℃から37℃程度の温度で、試料をインキュベートする。インキュベーションに続いて、試料に接触した表面を洗浄して、非免疫複合体化材料を除去する。洗浄手順には、PBS/Tween、またはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄することを含むことができる。試験試料と結合ポリペプチドとの間の特異的免疫複合体の形成、その後の洗浄に続いて、第1の抗体に対して特異性を有する第2の抗体にその免疫複合体を供することによって、免疫複合体形成の発生を判別し、さらにはその量まで求めることができる。検出手段を提供するために、第2の抗体は、たとえば適切な色素形成基質と共にインキュベートすることによって発色を生じる酵素活性など、関連した活性を有することができる。次いで、たとえば可視スペクトル分光計を用いて発色の程度を測定することによって、定量化を行うことができる。
【0111】
免疫クロマトグラフィ技法に関して、当分野の技術者は、F.Zurk等のClin.Chem.31/7、1141−1150(1985)、ならびに特許および特許出願WO88/08534、WO91/12528、EP291176、EP299428、EP291194、EP284232、US5120643、US5030558、US5266497、US4740468、US5266497、US4855240、US5451504、US5141850、US5232835、US5238652に詳細な情報を見出すことができる。
【0112】
別法には、生物試料中のPCV核酸の存在を検出するために、オリゴヌクレオチドなどの核酸配列を用いることが含まれる。
【0113】
この目的のために、当分野の技術者は、溶液ハイブリダイゼーションにおいて、および固相法を用いる実施形態において、ハイブリダイゼーション・プローブを用いることができる。固相法を含む実施形態において、選択されたマトリクスまたは表面に試料を吸着させるか、あるいは付着させる。次いで、固定1本鎖核酸を、選択されたプローブと共に特異ハイブリダイゼーションに供する。
【0114】
他の実施形態において、当分野の技術者は、生物試料に潜在的に存在する標的PCV核酸を特異的に増幅するために、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)などの増幅技法において、オリゴヌクレオチド・プライマーを用いることができる。そのようなプライマーの例を、実施例1の表1に示す。
【0115】
先天性振せんの予防および治療
本発明は、先天性振せんを予防または治療するための、ワクチン接種、または受動免疫化を企図する。本発明の抗原性または免疫原性組成物は、ブタ・シルコウイルスによる感染からブタまたはその子孫を防御するために、広く適用可能である。本明細書では、「防御する」という用語は、PCV感染および先天性振せんの治療または予防を意味する。したがって、この種の感染に対して感受性である任意の動物にワクチン接種することができる。ブタは任意の年齢で治療することができ、新生子ブタを含む。雌ブタの治療は、胎児を防御するために特に有用である。
【0116】
本発明は、より詳細には、シルコウイルス抗原、獣医学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤、さらに通例は獣医学的に許容されるアジュバントを含む抗原性または免疫原性組成物に関する。
【0117】
免疫原性組成物は、免疫応答を誘導し、その必要はないが防御的であり得る。ワクチン組成物は、防御反応を誘導する。したがって、「免疫原性組成物」という用語は、ワクチン組成物を含む(前者は防御的組成物であり得る)。
【0118】
本発明の主題はさらに、先天性振せんに対する免疫化またはワクチン接種の方法であって、ブタ・シルコウイルスに対する免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む。この免疫化またはワクチン接種の方法は、特に以下に定義されるワクチンを用いる。
【0119】
したがって本発明の主題は、先天性振せん(CT)に対する抗原性製剤であり、少なくとも1種のブタ・シルコウイルス(PCV)抗原を含む。この抗原は、弱毒化生全PCV、不活性化全PCV、サブユニット抗原、組換え生ベクター、またはDNAベクターからなることができる。
【0120】
全PCVワクチン
本発明の主題は、単離ブタ・シルコウイルス株であり、配列番号1から配列番号7の任意の配列の、任意のORF1からORF11からなる群から選択された核酸配列を含むゲノムを有する。これらの配列を承知する当分野の技術者は、ビリオンの精製製剤を得ることができる。
【0121】
これらのウイルスは、先天性振せんに対してブタにワクチン接種するための抗原性組成物に用いることができる。この目的のために、以下に記載するとおり、当分野の技術者によく知られている標準的な技法によって、ウイルス粒子を弱毒化、不活性化、または不活化することができる。
【0122】
シルコウイルス抗原性製剤を生成するために、細胞、特に細胞系、たとえばPK/15細胞における継代後、シルコウイルスを得ることができる。場合によって標準的な技法で精製した、培養上澄みまたは抽出物を抗原性製剤として用いることができる。
【0123】
弱毒化抗原性製剤、および弱毒化免疫原性組成物またはワクチンというコンテクストにおいて、弱毒化は、慣例的な方法によって行うことができ、たとえば細胞での継代、好ましくはブタ細胞での継代、PK/15など、特に細胞系での継代による(たとえば継代50から150、特に100程度)。これらの免疫原性組成物およびワクチンは一般に、獣医学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤、場合によってはさらに獣医学的に許容されるアジュバント、ならびに場合によっては凍結乾燥安定剤を含む。
【0124】
これらの抗原性製剤、免疫原性組成物、およびワクチンは、好ましくは、TCID50 103から107の対象弱毒化ウイルスを含むことになる。
【0125】
それらは、不活性化全抗原をベースとする抗原性製剤、免疫原性組成物およびワクチンであることができる。不活性化免疫原性組成物およびワクチンはさらに、獣医学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤、場合によってはさらに獣医学的に許容されるアジュバントを含む。
【0126】
本発明によるシルコウイルスは、存在する可能性のある分画と共に、当分野の技術者に知られている技法によって不活性化される。不活性化は、好ましくは、化学的経路によって、たとえばホルムアルデヒド(ホルマリン)、パラホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、またはエチレンイミン、あるいはその誘導体などの化学薬剤に抗原を暴露することによって行われる。本発明において不活性化の好ましい方法は、化学薬剤、特にエチレンイミン、またはβ−プロピオラクトンへの暴露であろう。
【0127】
抗原性製剤、免疫原性組成物、およびワクチンは、好ましくは、TCID50が105から108の当該不活性化全ウイルスを含むことになる。
【0128】
好ましくは、本発明による弱毒化または不活性化抗原性製剤、ならびに弱毒化または不活性化免疫原性組成物およびワクチンにはアジュバントが補足され、有利には、当分野の技術者によく知られる技法に従って、エマルジョン、たとえば油中水型、または水中油型の形態で提供される。有効成分に慣例的なアジュバント化合物を組み込むことで、アジュバントの特性を得ることも可能である。
【0129】
用いることのできるアジュバントのなかで、例として挙げることができるのは、水酸化アルミニウム、サポニン(たとえば、QuillajaサポニンまたはQuilA、Vaccine Design、The Subunit and Adjuvant Approach、1995、Michael F.Powel、Mark J.Newman編、Plennum Press、New York、London、210頁を参照のこと)、Avridine.RTM.(Vaccine Design 148頁)、DDA(臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Vaccine Design 157頁)、ポリホスファゼン(Vaccine Design 204頁)、あるいは鉱油をベースとする水中油型エマルジョン、スクアレン(たとえば、SPTエマルジョン、Vaccine Design 147頁)、スクアレン(たとえば、MF59、Vaccine Design 183頁)、または代謝可能な油をベースとする油中水型エマルジョン(好ましくはWO94/20071による)、ならびに米国特許第5422109号に記載のエマルジョンである。アジュバントの組合せ、たとえばエマルジョンと組み合わせたAvridine.RTM.またはDDAを選択することも可能である。
【0130】
凍結乾燥安定剤として、例として挙げることができるのは、SPGA(Bovarnik等、J.Bacteriology 59、509、950)、炭水化物、たとえばソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、またはグルコースなど、タンパク質、たとえばアルブミン、またはカゼインなど、これらの化合物の誘導体、または緩衝剤、たとえばアルカリ金属リン酸塩などである。
【0131】
サブユニットおよびベクター・ワクチン
本明細書では、「サブユニット抗原」という用語は、抗原性PCVポリペプチド、またはその抗原性フラグメントを指す。「サブユニットまたはポリペプチド・ワクチン」という用語は、免疫原性ポリペプチド、および通例はアジュバントを含むワクチンを指す。
【0132】
「ベクター・ワクチン」は、「組換え生ベクター」、または「DNAベクター」を含む。
【0133】
本明細書では、「組換え生ベクター」という用語は、in vivoまたはex vivoワクチン接種のための抗原性または免疫原性ポリペプチドを発現するために用いられるベクターを指す。好ましいベクターは、DNAをベースとするベクター、およびレトロウイルス・ベクターなどのウイルス・ベクターである。適切な生ベクターとして、好ましく用いることができるのは、当分野の技術者によく知られている技法に従って、好ましくはブタにおいて増殖することができ、ブタに対して非病原性の(天然に非病原性であるか、あるいはそのようにされた)生ウイルスである。特に用いることができるのは、パルボウイルス(US6217883)、ブタ・ヘルペスウイルス、たとえばアウエスキー病ウイルスなど、ブタ・アデノウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリ・ポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ブタ痘ウイルスである。DNAベクターも、ベクターとして用いることができる(WO90/11092、WO93/19813、WO94/21797、WO95/20660)。一般に、ベクターはin vivoで投与されるが、適切な抗原呈示細胞、たとえば樹状細胞などのex vivo形質導入、その形質導入細胞のin vivo投与も企図される。
【0134】
他の実施形態において、ベクターは、naked DNAとして、または他のトランスフェクション促進剤(ペプチド、ポリマーなど)と共にリポフェクションによってin vivoで導入されることのできるDNA分子の形態であることができる。この実施形態は、本明細書において「DNAベクター」技術と呼ばれる。in vivoトランスフェクションのためのリポソームを調製するために、合成カチオン脂質を用いることができる(Felgner等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413−7417、1987、FelgnerおよびRingold、Science 337:387−388、1989、Mackey等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8027−8031、1988参照、Ulmer等、Science 259:1745−1748、1993)。核酸の伝達に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開WO95/18863、およびWO96/17823、ならびに米国特許第5459127号に記載されている。脂質は、標的化のために他の分子と化学的に結合することができる(上記のMackey等を参照のこと)。標的ペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質、たとえば抗体、または非ペプチド分子などは、化学的にリポソームと結合することができる。他の分子も、in vivoでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用であり、たとえばカチオンオリゴペプチド(たとえば、国際特許公開WO95/21931)、DNA結合タンパク質から誘導されたペプチド(たとえば、国際特許公開WO96/25508)、またはカチオンポリマー(たとえば、国際特許公開WO95/21931)などである。さらに、in vivoでnaked DNAプラスミドとしてベクターを導入することも可能である。遺伝子治療に用いるnaked DNAベクターは、当分野で知られている方法、たとえばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用(弾道トランスフェクション)、またはDNAベクター・トランスポータの使用によって所望の宿主細胞に導入することができる(たとえばWu等、J.Biol.Chem.267:963−967、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.263:14621−14624、1988、Hartmut等、カナダ特許出願第2012311号、1990年3月15日出願、Williams等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2726−2730、1991を参照されたい)。受容体媒介DNA送達法も用いることができる(Curiel等、Hum.Gene Ther.3:147−154、1992、WuおよびWu、J.Biol.Chem.262:4429−4432、1987)。米国特許第5580859号および第5589466号は、トランスフェクション促進剤を含まない外因性DNA配列の哺乳動物における送達を開示している。最近、比較的低電圧で効率の高い、電気伝達と呼ばれるin vivoのDNA伝達技法が記載された(Mir等、C.P.Acad.Sci.、321:891、1998、WO99/01157、WO99/01158、WO99/01175)。
【0135】
ワクチン接種方法
先天性振せんに対して対象にワクチン接種するために、種々の方法を用いることができる。ポリペプチド・ワクチン製剤は、皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、真皮下(s.d.)、真皮内(i.d.)によって、または抗原呈示細胞へのex vivo投与、それに続く細胞の対象への投与によって送達することができる。
【0136】
同様に、たとえば遺伝子銃または直接注入などによる、naked DNAおよびRNA送達など、上に記載した任意の遺伝子送達方法を、対象にベクター・ワクチンを投与するために用いることができる。
【0137】
ワクチン接種の有効性は、免疫刺激分子、たとえば免疫刺激または免疫増強活性サイトカイン、リンホカイン、またはケモカインを、そのワクチン、特にベクター・ワクチンと併用投与することによって増強することができる。たとえば、サイトカインまたはサイトカイン遺伝子、たとえばインターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13、顆粒球マクロファージ(GM)コロニー刺激因子(CSF)、マクロファージ炎症因子など、ならびにいくつかの主要共刺激分子またはその遺伝子(たとえば、B7.1、B7.2)を用いることができる。
【0138】
粘膜ワクチン接種。感染は多くの場合粘膜を経て起こるので、粘膜ワクチン方法は多くの病原性細菌に関して特に有効である。したがって、ポリペプチド、およびDNAワクチンの両方に関して粘膜ワクチン接種方法が企図される。粘膜はワクチンの局所送達によって標的とされることができる一方、種々の方法が免疫原性タンパク質を粘膜に送達するために用いられてきた(これらの方法には、たとえばベクター標的タンパク質として特定の粘膜標的タンパク質を用いることによって、または粘膜標的タンパク質との混合剤でワクチン・ベクターを送達することによってDNAワクチンを送達することも含む)。
【0139】
たとえば特定の実施形態において、免疫原性ポリペプチドまたはベクター・ワクチンを、コレラ毒素B、またはコレラ毒素A/Bキメラなどのコレラ毒素との混合剤で、あるいはコレラ毒素との複合体またはキメラfustionタンパク質として、投与することができる(Hajishengallis等、J Immunol.、154:4322−32、1995、JoblingおよびHolmes、Infect Immun、60:4915−24、1992)。コレラ毒素Bサブユニットの使用に基づく粘膜ワクチンは、これまでに記載されている(LebensおよびHolmgren、Dev Biol Stand 82:215−27、1994)。他の実施形態において、易熱性エンテロトキシン(LT)との混合剤を、粘膜ワクチン接種のために調製することができる。
【0140】
他の粘膜免疫化方法には、免疫原をマイクロカプセルに被包すること(米国特許第5075109号、第5820883号、および第5853763号)、および免疫増強活性膜様担体を用いること(WO98/0558)が含まれる。経口投与された免疫原の免疫原性は、赤血球(rbc)、またはrbcゴーストを用いることによって(米国特許第5643577号)、またはブルータング抗原を用いることによって(米国特許第5690938号)増強することができる。標的化免疫原の全身投与も、粘膜免疫化をもたらすことができる(米国特許第5518725号を参照)。
【0141】
粘膜組織での発現のために遺伝子を送達するために、キメラ・ライノウイルス(米国特許第5714374号)、アデノウイルスの使用、または核酸の特異標的化(WO97/05267)など、種々の方法を用いることができる。
【0142】
受動免疫化
上に記載した能動免疫化ワクチン接種方法に加えて、本発明はさらに、好ましくはPCV抗原に対して産生されたPCV抗原反応性抗体による受動免疫化を企図する。受動免疫化は、宿主の免疫機構が応答できる以前の初期感染または確立感染に対して特に有効である。
【0143】
受動免疫化に用いる抗体源の1つは、感染宿主と同一種の罹患動物の回復期血清から得られる。したがって、たとえば、好ましくはPCVポリペプチドに対する親和精製によってブタ血清から抗体を単離し、新しく感染したブタを受動的に免疫化するために用いることができる。
【0144】
別法として、抗体を免疫原性ポリペプチドに対して産生することができ、すなわちワクチン方法を、受動免疫化の抗体を産生するためにも用いることができる。
【0145】
本発明の抗PCV抗体は、交叉反応性であることができ、たとえば種々のPCV株を認識することができる。ポリクローナル抗体は、交叉反応性である可能性が高い。
【0146】
先天性振せんに対する防御免疫のイムノアッセイ
他の実施形態において、本発明の免疫原性ポリペプチドは、ブタの先天性振せんに対する防御抗体を検出するためのイムノアッセイに用いることができる。本発明の発見に基づいて、高力価のPCV抗原との(特異的な)抗体反応性は、その個体がPCVによる感染から、したがって先天性振せんから防御されている可能性を示す。PCV抗原との低い、または検出されない抗体反応性は、その個体が感染から防御されていない可能性を示す。
【0147】
本発明のイムノアッセイは、たとえば回復期血清など、PCV感染に暴露された対象において抗体レベルを検出するために用いることができる。このイムノアッセイはさらに、未知の状態の対象において抗体を検出するために用いることもできる。そのような対象の高レベルの抗体力価は、PCVへの事前暴露、および防御免疫性の可能性を示す。最後に、このイムノアッセイは、本発明のワクチンの有効性を評価するために用いることができる。
【0148】
上述の任意のイムノアッセイ方式を、本発明のイムノアッセイに用いることができる。好ましくは、PCVポリペプチドを固相に吸着させ、血清(好ましくは段階希釈中)を固相に接触させ、たとえば血清中の抗体に特異的な標識抗体を用いて抗体結合を検出するELISAアッセイを用いる。別法として、血清試料中の抗PCV抗体が、たとえば上述のとおり調製されたPCVポリペプチドに特異的な標識抗体に対して固相ポリペプチドへの結合を競合する、競合ELISA方式を用いることができる。さらなる別法においては、ポリペプチドを標識し、そのポリペプチドに特異的な抗体を、固相支持体に吸着させる。生物試料(たとえば、血清)中に抗体が存在すると、ポリペプチドに対する競合が生じ、標識の吸着抗体への結合を妨げることになる。さらに、以下に記載する都合のよいクロマトグラフィ・イムノアッセイ方式を用いることができる。
【0149】
ここに記載したイムノアッセイは、血清における抗PCV抗体の存在を試験することに関しているが、抗体を提供する任意の生物試料を試験することができ、これらに限定することなく、血液、血清、血漿、組織試料、リンパ、粘膜分泌物、痰、滑液、および他の炎症性流体などが含まれる。
【0150】
キット
イムノアッセイを実施するための構成要素は、都合よくキット形態で提供することができる。もっとも基本的な実施形態において、本発明のキットは、PCVポリペプチド、および試験される対象の抗体に特異的な標識抗体などの抗体検出剤を提供する。それぞれの量を予め測定して、規定数のアッセイを提供することができる。
【0151】
さらなる実施形態において、このキットは、プレートなどの、好ましくはプラスチック、またはタンパク質の非特異結合を回避するように処理された材料のアッセイ容器を含む。本明細書では、容器という用語はもっとも広範な意味を有し、すなわち材料または試薬を保持するための任意の入れ物である。この容器は、ガラス、プラスチック、セラミック、金属などから製造することができる。
【0152】
さらなる実施形態において、このキットは、PCVポリペプチド、またはPCVポリペプチドに特異的な抗体いずれか1種の試薬が不可逆的に結合した、免疫クロマトグラフィ膜または支持体を含む。免疫クロマトグラフィ・アッセイに関して当分野で知られている多くの方法および装置を、本発明において用いることができる。上述のとおり、免疫クロマトグラフィ・アッセイは、実験室の機器が利用できない野外条件下で特に有用である。そのようなアッセイの例は、米国特許第5248619号、第5451504号、第5500375号、第5624809号、および第5658801号に記載されている。
【0153】
本発明のキットは、好ましくは、包装、および、たとえば包装上の、または包装に挿入された使用説明書を含む。
【0154】
複合法
複合免疫化またはワクチン接種プログラムに関して、ブタ・シルコウイルスに対する免疫化またはワクチン接種を、他のブタ病原体、特にPMWS症候群に関連する病原体に対する免疫化またはワクチン接種と組み合わせることも可能である。したがって、本発明による免疫原性組成物またはワクチンは、パルボウイルス(US6217883)から、PRRS(ブタ繁殖呼吸障害症候群)、および/またはMycoplasma hyopneumoniae、および/または大腸菌、および/または萎縮性鼻炎、および/または仮性狂犬病(アウエスキー病)ウイルス、および/またはブタ・インフルエンザ、および/またはアクチノバチルス胸膜肺炎、および/またはブタ・コレラ、およびそれらの組合せから選択された別のブタ病原体に対応する別の価を含むことができる。好ましくは、本発明による免疫化またはワクチン接種プログラム、およびワクチンは、シルコウイルスに対する免疫化またはワクチン接種と、PRRS(WO93/07898、WO94/18311、FR−A−2709966、C.Charreyre等、Proceedings of the 15.sup.th.IPVS Congress、Birmingham、England、7月5−9、1998、139頁)、および/またはMycoplasma hyopneumoniae(EP−A−597852、EP−A−550477、EP−A571648、O.Martinon等、157、284、285頁、およびG.Reynaud等、150頁、すべてProceedings of the 15.sup.th.IPVS Congress)、および/またはブタ・インフルエンザと組み合わせられる。したがって、本明細書に記載のとおり、ブタ・シルコウイルスに対する免疫原性組成物またはワクチンと組み合わせるために、任意の適切な形態の免疫原性組成物またはワクチン、特に任意の市販のワクチンを用いることが可能である。
【0155】
したがって、本発明の主題はさらに、多価免疫原性組成物およびワクチン、多ワクチンキット、およびそのような複合免疫化またはワクチン接種プログラムの使用を可能にする複合免疫化またはワクチン接種方法である。
【0156】
本発明は以下の実施例を参照することによってよりよく理解されるであろうが、実施例は例示のために示されるものであって、本発明を限定するものではない。
【0157】
【実施例】
実施例I:ブタの先天性振せんに関連するブタ・シルコウイルスの配列分析
方法
PCV感染組織試料および細胞系:PCVに感染したブタを、米国インディアナ州の農場から得た。ブタは最初に、PMWSまたはCTいずれかの徴候によって、続いて組織切片の顕微鏡検査によって識別した。組織中のPCVの存在は、さらにPCV特異オリゴヌクレオチド・プローブを用いるin situハイブリダイゼーション、PCVに対する抗血清を用いる間接蛍光抗体アッセイ(IFA)、およびPCVに特異的なプライマーを用いるPCRによって確認した。PMWSの徴候を示すブタから採取した4種のPCV単離株は、PMWS−PCV−P1、PMWS−PCV−P2、PMWS−PCV−P3、およびPMWS−PCV−P4と命名した。CTの徴候を示すブタから採取した2種のPCV単離株は、CT−PCV−P5、およびCT−PCV−P6と命名した。
【0158】
歴史上重要なPCV単離株を単離するために、PCV混入細胞系(PCNS)を、CTの徴候を示すブタの脳から誘導した。妊娠した雌ブタに、CTブタ腎細胞から得た細胞培養上澄みを実験的に接種した(GustafsonおよびKanitz、1974)。PCNS細胞を、10%FetalCloneIII(HyClone,Inc.)を含有するイーグル最小必須培地(EMEM)[Life Technologies,Inc.]中で増殖した。細胞を採取し、PCV特異オリゴヌクレオチド・プローブを用いるin situハイブリダイゼーション、電子顕微鏡検査(EM)、およびPCV特異プライマーを用いるPCRによって、PCVに関して試験した。このPCV単離株は、CT−PCV−P7と命名した。
【0159】
DNA単離およびPCR:細胞が培地で浮動を開始したときに、EMEMで増殖させたPCNS細胞を採取した。細胞ペレットを、SDSプロナーゼ(10mMのTris、pH7.4、10mMのEDTA、および0.5%のSDS中プロナーゼ500μg/ml)で溶解し、一晩37℃でインキュベートした。全細胞DNAを、フェノールの抽出、続いてエタノールの沈殿によって単離した。
【0160】
PMWS−PCV−P1、P2、P3、P4、およびCT−PCV−P6のリンパ節、ならびにCT−PCV−P5の肝臓を、ティシュマイザ(tissumizer)を用い、続いて音波破砕機を用いる音波破砕によってEMEM中で均質化した。組織ホモジネートを、等量のSDS−プロナーゼ(20mMのTris、pH7.4、20mMのEDTA、および1%のSDS中プロナーゼ1mg/ml)と共に、一晩37℃でインキュベートした。フェノール抽出、およびエタノール沈殿によって、全細胞DNAを得た。全PCVゲノムを増幅するための2対のプライマーと共にVent DNAポリメラーゼ(New England BioLab)を用いるPCRに、このDNAをテンプレートとして用いた。PMWS−PCV−P1、P2、およびP3、CT−PCV−P5、およびP6に対して、PCV2−1およびPCV2−2と、PCV2−3およびPCV2−4のプライマー・セットを用いた(表1)。PMWS−PCV−P4に対しては、PCV2−1およびPCV2−2と、PCV4−1およびPCV4−2のプライマー・セットを用いた(表1)。CT−PCV−P7に対しては、PCV1−3およびPCV1−4と、PCV7−1およびPCV7−2のプライマー・セットを用いた(表1)。PCR産物を、1%アガロース・ゲルで分析し、UVトランスイルミネータで視覚化した。
【表1】
【0161】
PCR産物のクローニング:PCR産物を、T4DNAリガーゼ(New England BioLab)を用いる平滑末端ライゲーションによって、pUC18のSmaI部位にクローン化した。PMWS−PCV−P1、−P2、および−P3の全ゲノムを構成するために、PCV2−1および2プライマーで増幅したnt1076−679のPCR産物、PCV2−3および4プライマーで増幅したnt7−1657のPCR産物を含有するpUC18を、StuIおよびKpnIを用いて消化した。PCV2−1および2で増幅したPCR産物を含有するpUC18の4kbのStuI−KpnIフラグメントを用いて、PCV2−3および4で増幅したPCR産物を含有するpUC18の1.3kbのStuI−KpnIフラグメントを挿入し、ヌクレオチド1076−1768、および1−1657のPCVゲノムを含有するpUC18を生じた。結果として生じたPMWS−PCV−P1、−P2、または−P3いずれかのゲノムを含有するプラスミドを、それぞれ、pPCV−P1、pPCV−P2、およびpPCV−P3と命名した。これらのプラスミドをSacII135で消化して、完全PCVゲノムの線形化形態を産生した。同様に、他のPCV株から得たPCR産物も、平滑末端ライゲーションによって、pUC18のSmaI部位でクローン化した。プラスミドDNAを、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配中、等密度遠心分離によって精製した(Sambrook等、Molecular cloning:A laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989)。
【0162】
クローンPCVDNAのトランスフェクションおよびPCVの検出:PCVDNA(PPCV−P1、−P2、および−P3)の全ゲノムを含有するプラスミドをSacIIで消化して、2つのフラグメント、全PCVゲノムDNA、pUC18とPCVDNAの一部、を生じた。6ウェル・プレート中のPCVを含まないPK−15細胞の半融合単一層を、リポフェクチン媒介トランスフェクション・プロトコル(Life Technologies,Inc.)を用いて、1μgのライゲートしたPCVゲノムでトランスフェクトした。細胞を3回継代した。3回目の継代後、細胞を採取し、サイトスピンし、アセトンで固定した。ウサギで作製したPMWS−PCVに対するポリクローナル抗体を(MorozovおよびPaul、Iowa State University、Ames、Iowa)、IFAに用いた。EMのために、細胞ペレットに水を加え、細胞内容物を5分間10000rpmで遠心分離した。上澄みを集め、40分間20000rpmで遠心分離した。細胞ペレットを、3%リンタングステン酸、および1%ウシ血清アルブミンを含有する水に再懸濁した。試料を、炭素被覆グリッド上で霧状にし、Philips201電子顕微鏡で検査した。
【0163】
DNA配列決定および配列分析:PCVDNAを含有するプラスミドを、ユニバーサル・プライマーおよびリバース・プライマーを用いて配列決定した。その後、DNAの両株を、応用Biosystems373A自動配列装置を用いて、プライマー・ウォーキングによって配列決定した。7種のPCV単離株(PMW−PCV−P1、−P2、−P3、−P4、およびCT−PCV−P5、−P6、および−P7)の全ゲノムを、GCG配列分析ソフトウェア(Wisconsin package)を用いて分析した。
【0164】
系統発生の算出:ClustalWプログラムによって、配列アライメントを得た。系統発生の算出を、PHYLIPプログラム・パッケージ、バージョン3.572cによって行った(Felsenstein、Cladistics 5:164−166、1989)。最大節約分析のために、ProtparsまたはDNAparsプログラムを用いた。距離分析のために、Protdist(DayhoffPAM001マトリクス)またはDNAdist(Kimura2パラメータ)、続いてFitch(全体的な再配列を伴う)を適用した。ブートストラップ分析の間、上記の算出をSeqboot(100データ・セット)によって進め、続いてConsensusプログラムによって、コンセンサス系統樹を得た。最後に、Tree Viewプログラムによって結果を視覚化した(Page、Computer Applications in the Biosciences 12:357−358、1996)。応用した方法のより詳細な説明は他に発表されている(HarrachおよびBenko、Adenovirus Methods and Protocols Methods in Molecular Medicine、21:309−339、1998)。
【0165】
結果
PCVを含まないPK−15細胞のPCVDNAによるトランスフェクション。最初に、PMWSに関連する3種のPCV単離株(PMWS−PCV−P1、−P2、および−P3)の全ゲノムを、2組のプライマーを用いてPCRによって増幅した。PCR産生フラグメントを用いて、PCVゲノムを含有するプラスミド(pPCV−P1、−P2、および−P3)を構成した。これらのプラスミドをSacIIで消化して、完全PCVゲノムの線状形態を得た。クローンPCVゲノムが感染しているかどうかを試験するために、SacII消化再ライゲート、または非ライゲートpPCV−P1、−P2、および−P3を用いて、PCVを含まないPK−15細胞をトランスフェクトした。3回の継代後に細胞を採取し、IFAによってPCV抗原の存在を分析した。IFAによって、SacII消化再ライゲートPCVDNAでトランスフェクトしたいくつかの細胞はPCV抗原に対して陽性であり、それに対して、SacII消化非ライゲートPCVDNAでトランスフェクトした細胞はPCV抗原に対して陰性であった。PCVDNAによるトランスフェクションがPCVビリオンの産生をもたらすのかどうかをさらに確認するために、PCVDNAでトランスフェクトしたPK−15細胞をEMによって分析した。直径約17nmの小さい球状ウイルスが認められた。PCVDNAでトランスフェクトした細胞におけるPCV抗原の検出、およびウイルス粒子の観察は、クローン全長環状PCVDNAが、ウイルスの複製、およびウイルス粒子の産生をもたらすことを示した。PCRによって増幅されたこの全長PCVゲノムは感染性であったので、本発明者等はPCR技法を用いて、他のPCV野外株のゲノムを増幅した。
【0166】
PMWS−PCVと、旧および新CT−PCV単離株の配列比較。本発明者等は、PMWSに関連する4種のPCV単離株(PMWS−PCV−P1、−P2、−P3、および−P4)、1990年代終わりのCTに関連する2種のPCV単離株(CT−PCV−P5、および−P6)、および1960年代終わりのCTに関連する1種のPCV単離株(CT−PCV−P7)の全ゲノムを配列決定した。これらの単離の配列を、以前に記載されたPMWS−PCV単離株(Hamel等、1998)、およびPK−15−PCV単離株(Meehan等、Journal of General Virology 78:221−227、1997)の配列と比較した。PMWS−PCV−P1、−P2、および−P4のゲノムは1768ヌクレオチド(nt)の長さであり、それに対してPMWS−PCV−P3は、820と825ntとの間で6ntが欠失しているため、他のPMWS−PCV単離株よりも6ヌクレオチド短かった(図1)。本発明のすべてのPMWS−PCV単離株は、互いに全体で99%のnt配列同一性を有した。PMWS−PCV−P1の各ORFの配向、および相対的長さを示す(図2A)。PMWS−PCVのゲノムにおける各ORFのコーディング鎖、アミノ酸数、および位置を表に示す(表2)。
【表2】
【0167】
ORF1のアミノ酸配列は、これらのすべてのPMWS−PCV単離株の間で高度に相同性であった(アミノ酸レベルで約99%の相同性)。これらのPMWS−PCV単離株のいくつかのORFにおいて認められたアミノ酸残基の変化を表に示す(表3)。ORF2は、ORF1と比較してPMWS−PCVの間でアミノ酸変化が多かったが、それでも約97%の相同性を有した。オープン・リーディング・フレーム3、4、7、および8は、PMWS−PCV単離株の間で同一であり、他のORFでは少数のみが変化していた(表3)。
【表3】
【0168】
PMWS−PCV−P4のORF、およびPMWS−PCV−P3のORF10は、本発明の他のPMWS−PCV単離株の対応するORFと比べて、それぞれアミノ酸54個、および26個長かった。
【0169】
1990年代終わりに単離された2種の新しいCT−PCV単離株(CT−PCV−P5、および−P6)は、1768ntの長さであった(図2)。これらのCT−PCVは、約99%のnt配列同一性を有した。興味深いことに、新しいCT−PCV単離株はさらに、新しいPMWS−PCV単離株と、約99%のnt配列同一性を示した。PMWS−PCV−P1とCT−PCV−P5のゲノムは同一であった。PMWS−PCVおよび新しいCT−PCVのゲノムは共に11の潜在ORFをエンコードする。PMWS−PCV−P1のORFと比較した新しいCT−PCVの種々のORFにおけるアミノ酸変化を表に示す(表3)。
【0170】
古いCT−PCV(CT−PCV−P7)のゲノムは、1759ヌクレオチドの長さであった(図1)。CT−PCV−P7のゲノムも、11の潜在ORFをエンコードした。各ORFの配向、相対的長さを図2Bに示す。
【0171】
CT−PCV−P7の各ORFのアミノ酸数、および位置を示す(表4)。
【表4】
【0172】
CT−PCV−P7のゲノムは、PMWS−PCV、および両方の新しいCT−PCVとわずか約72%のnt配列同一性を有したが、驚くことにPK−15−PCVと約98%のnt配列同一性を共有した。CT−PCV−P7のすべてのORFのアミノ酸配列も、PK−15−PCVのORFと高度に相同性であった。PK−15−PCVのORFと比較したCT−PCV−P7の種々のORFにおけるアミノ酸変化を表に示す(表3)。
【0173】
Meehan等、J Gen Virol 78:221−227、1997は、PK−15−PCVのステム・ループ構造の先端にノナヌクレオチド配列の存在を認めており、これは植物のナノウイルスおよびジェミニウイルスで述べられたものと類似していた。本発明のすべてのPCV単離株は、ステム・ループ構造およびノナヌクレオチド(A/TAGTATTAC)を保存しており、これはローリング・サークル型DNA複製の起点を表す(Mankerts等、Journal of Virology 71:2562−2566、1997、Journal of General Virology 79:381−384、1998)。以前にHamel等(1998)によって報告されている潜在的なグリコシル化部位(N−X−T、またはN−X−S、Xは任意のアミノ酸)は、6位でアミノ酸残基「N」が「D」と置き換わっているCT−PCV−P7のORF6を除いて、本発明のすべてのPCV単離株で保存された。
【0174】
系統発生分析:複製関連タンパク質(ORF1/レプリカーゼ/rep/coat/P35.8タンパク質)、およびタンパク質P27.9(ORF2)などの個々のタンパク質の推定アミノ酸配列、または完全ゲノムのヌクレオチド配列を系統発生分析に用いたとき、距離マトリクスおよび最節約分析は共に、かなり類似したトポロジーを有する2つの別個の集団を生じた。株間の相違は適度なものであり、距離マトリクス分析がより一貫性のあるデータを与えると考えられたので(HarrachおよびBenko、Adenovirus Methods and Protocols Methods in Molecular Medicine、21:309−339、1998)、本発明者等は研究結果を完全ゲノムの距離マトリクス分析によって示すことを選択した(図3)。
【0175】
種々のブタおよびウシ・シルコウイルスゲノムに関する距離マトリクス分析のもっとも明白な結果は、単離株の2集団への明確な単離であった(図3)。検査したゲノムの数は(7つの新しい配列を含む)29であり、単離株の起源は地理的に遠い地域に及んだが、中間の遺伝子型は見つからなかった。
【0176】
小さいほうの集団(1型)は、PK−15細胞系の異なる系統由来の単離株、および異なる病理学的実体(PMWSおよびCT)から単離された2種のシルコウイルス株(PMWSアクセッション番号AF012107、およびCT−PCV−P7)を含有した。他方のかなり大きい集団(2型)は、PMWSを有するブタ由来の21種、2種の新しいCT単離株(CT−PCV−P5および−6)、およびウシ単離株(AF109397)を含む残りの24種の単離株を含有した。この系統樹に基づいて考えると、シルコウイルス株の遺伝的関係は、その病原性能と直接関連していないように思われる。
【0177】
考察
本研究の目的は、CTに関連するPCVの遺伝的変異性を求めることであった。PMWS−PCV単離株は、互いに約99%のnt配列同一性を有し、さらに英国、カナダ、フランス、および米国で単離されたPMWS−関連PCVと96%のnt同一性を有し(Meehan等、Journal of General Virology 79:2171−2179、1998、Morozov等、Journal of Clinical Microbiology 9:2535−2541、1998、Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998、Mankertz等、Virus Research、6665−77、2000)、種々のPMWS−PCV単離株はその起源の場所にかかわらず相同性が高いことを示している。
【0178】
1990年代終わりの新しいCT−PCV単離株、および1960年代終わりの古いCT−PCV単離株は、CTA2型を有する新生ブタを起源としたが、それらはわずか72%のnt配列同一性を共有した。2種の新しいCT−PCVのゲノムは、PMWSPCVの新しい単離株とかなり類似しており、それに対して古いCT−PCV単離株は、PK−15−PCV変株に非常に近かった。広範な系統発生算出に基づいて、異なるPCV単離株を、2つのグループに分けることができる。PK−15−PCV変株、本発明の古いCT−PCV−P7、および単一の特性決定されていないPMWS単離株(AF012107)は、PCV1型(PCV1)を構成し、残りの20種の新しいPMWS−PCV、および2種の新しいCT−PCV野外単離株(CT−PCV−P5および−P6)は、PCV2型(PCV2)を構成する。PK−15−PCVおよび4種のPMWS関連PCV単離株の配列分析に基づいて、PK−15−PCVをPCV1、PMWS−PCV単離株をPCV2と分類する予備案が提示された(Meehan等、1998)。
【0179】
PK−15−PCV(PCV1単離株)は、離乳ブタの接種実験において臨床的に非病原性であったが(Tischer等、Archives of Virology 91:271−276、1986、Allan等、Veterinary Microbiology 44:49−64、1995)、それに対してCT−PCV−P7単離株(同じくPCV1)は1960年代終わりにCTを有する新生ブタから得られたものであり、妊娠70日で妊娠雌ブタに接種したとき、子孫に先天性振せんを引き起こすようである(Kanitz、博士論文、Purdue University、1972)。PK−15−PCVもCTの原因となり得るのか、あるいはCT−PCV−P7が離乳ブタにおいて病原性であるのかどうかは明らかでない。年齢、感染経路、および/またはいくつかの他の要因が、PCV1およびPCV2の病原性および臨床的発現を決定する可能性がある。新しいCT−PCVおよびPMWS−PCV株の間に約99%のnt配列同一性が存在することは、最近のPMWSおよびCTの発生がPCVの同一の型(すなわち、PCV2)に関連していることを示唆している。PMWSを有するブタの報告された年齢は6−12週であるのに対して(Ellis等、Canadian Veterinary Journal 39:44−51、1998、Kiupel等、Indiana.Veterinary Pathology 35:303−307、1998、Rosell等、Journal of Comparative Pathology 120:59−78、1999)、CTは新生ブタの疾患である(Stevenson等、Journal of Veterinary Diagnostic Investigations、印刷中)。PCVによって起こる症候群の型の決定には、年齢が重要な役割を果たしているようである。最近、自然発生のCTを有する新生ブタの脳および脊髄の多数のニューロンにおいて、PCV2DNAの存在が実証された。胎児の発育中、神経細胞分裂が排他的に起こる。PCVはその複製に細胞分裂を必要とするので、胎児発育中が、PCVにとって神経組織内で複製し、CTの徴候に至ることのできる唯一の期間である可能性がある(Tischer等、Archives of Virology 96:39−57、1987)。PCV2を無菌ブタに接種したとき、接種後35日までに病変が発現するが、PMWSの典型的な臨床疾患ではない。しかしながら、PCV2をブタ・パルボウイルスまたはブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスと共に接種したとき、PCVの複製は増強され、PMWSが再現される(Allan等、Journal of Comparative Pathology 121:1−11、1999)。他のウイルスは、PCV標的細胞の分裂を直接または間接的に引き起こすことによって、PCV複製を強化する可能性がある。
【0180】
PCV1は、最初に1960年代および70年代に同定され(Tischer等、Zentrablatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten, und Hygiene−Erste Abteilung Originale−ReiheA:Medizinische Mikrobiologie und Parasitologie 226:153−167、1974、Meehan等、Journal of General Virology 78:221−227、1997、本研究)、それに対してPCV2は、1990年代終わりに同定された(Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998、Meehan等、Journal of General Virology 79:2171−2179、1998、Mankertz等、Virus Research、6665−77、2000)。配列分析に基づいて、PCV2はPCV1に由来する可能性があると考えられる。しかしながら、2種の型の間に大きな系統発生距離があること、および中間体が完全に欠けていると思われることは、2種の型の間の直接的な最近の関係に矛盾する。これらの発見は、蔓延したPCV感染(たとえば、ワクチン媒介疾患)の起源としてのPK−15細胞系の役割を支持しない。2型PCVの集団には、単一のウシ起源シルコウイルス単離株が含まれる。シルコウイルス感染がどのようにウシに広がったのかはわかっていない。この単一ウシ単離株とPCV2との間の高い類似性に基づいて考えると、この2種の異なるPCV系統が、アデノウイルスの場合に見られるように(RussellおよびBenko、Encyclopedia of Virology、14−21頁、1999)、ブタおよびウシ宿主において以前に、同時に進化したという魅力的な推測は否定される。しかしながら、そのようなPCV1およびPCV2株の進化は、2種以上のまだ同定されていない宿主種で発生した可能性はある。
【0181】
実施例II:自然発生先天性振せんを有するブタにおけるブタ・シルコウイルスの組織分布および遺伝子タイピング
材料および方法
研究計画:2日齢未満のブタを、CTA2型と一致する疾患が発生した米国中西部の4つの農場から選択した。各農場から、CTを有するブタ2−4頭(n=13)、および臨床的に正常なブタ1−2頭(n=6)を、Purdue Animal Disease Diagnostic Laboratory、Lafayette、INに移送し、ペントバルビタールで安楽死させた。死体解剖検査を行い、試験のために組織を採取した。大脳、小脳、脳橋、脊髄分節C1、C4、C7、T3、T6、T9、T12、L2、L5、およびS2、肺、肝臓、腎臓、脾臓、扁桃、腸間膜および鼡径リンパ節の試料を、試験のために、中性緩衝ホルマリン中に採取するか、または−20℃で凍結した。
【0182】
組織病理学およびin situハイブリダイゼーション:慣例的な方法によって、組織を室温で24時間固定し、次いでパラフィンに包埋し、薄片にして、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。すべての組織を、顕微鏡的病変に関して評価した。前に記載したとおり、PCV1およびPCV2の両方でハイブリダイズすることが知られているPCVオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、in situハイブリダイゼーションを行った(Kiupel等、Eur J Vet Pathol.、1999、Rossell等、Encyclopedia of Virology、14−21頁、1999)。PCV特異オリゴヌクレオチドをジゴキシゲニンで3’末端標識した(Boehringer Mannheim Biochemica、Indianapolis、IN)。脱パラフィン化し、0.25%のペプシンを用いて105℃で8分間、続いて37℃で10分間タンパク質酵素消化を行い、オートメーション・バッファで洗浄、100%のホルムアミドを用いて105℃で5分間プレハイブリダイゼーションした後、市販のワークステーション(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)を用いて、プローブ濃度5μl/mlで、105℃で5分間、および37℃で60分間、ハイブリダイゼーションを行った。食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液で高ストリンジェンシーの洗浄を行い、プローブと標的の結合を確実にした。アルカリホスファターゼとコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体からなる検出系(希釈1:500)(Boehringer Mannheim Biochemica、Indianapolis、IN)を37℃で45分間適用し、基質「NBT/X−Phos」(ニトロブルー・テトラゾリウム5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート)(Boehringer Mannheim Biochemica、Indianapolis、IN)を適用した。連続切片上で、45分、90分、および180分間、不溶性青色ホルマザンに色素還元した。対照は、PCV1感染PK−15細胞(Stevenson等、Veterinary Pathology 36:368−378、1999)、PCV2−感染ブタ(Kiupel等、Indiana.Veterinary Pathology 35:303−307、1998)およびPCVを持たないノイバイオート・ブタの脳、脊髄、およびリンパ組織のドット・ブロット・スライドを含んだ。スライドを、プローブを用いずにハイブリダイゼーション溶液でインキュベートし、陰性試薬対照として用いた。
【0183】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試験:PCVの遺伝子型を1型または2型として求めるために、すべてのブタから得た小脳および肝臓試料のPCR試験を行った。対照は、in situハイブリダイゼーション試験と同じものを用いた。組織を、ティシュマイザーを用い、等量のTE(10mMのTris−HCl、1mMのEDTA、pH7.5)中で均質化した。標準的なプロトコルを用いて、全細胞DNAを抽出した(Sambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、1989)。PCV(Meehan等、Journal of General Virology 78:221−227、1997)、またはPCV2(Hamel等、Journal of Virology 72:5262−5267、1998)に対して特異性となるようにプライマー・セットを設計し、VentDNAポリメラーゼ(New England Biolab,Inc.、Beverly、MA)を用いてPCRによってPCV配列を増幅するためにそれを用いた。PCR増幅DNA試料を、電気泳動によって1%アガロース・ゲル上で分析し、予期されるサイズの帯を、UVトランスイルミネーターで視覚化した。PCR成果物の特異性は、配列分析によって確認した。
【0184】
凍結切片間接免疫蛍光抗体試験:前にin situハイブリダイゼーションによってPCVに関して陽性を試験した肝臓および小脳の試料を、各群1頭のブタから選択した。PCV特異抗原の存在を確認するために、間接蛍光抗体試験を行った。凍結組織切片を調製し、間接蛍光抗体試験は、1:500希釈のウサギで作製した精製PCV2に対して作られた市販のポリクローナル抗体(MorozovおよびPaul、Iowa State University、Ames、IA)、および1:250希釈のフルオレセイン・コンジュゲート・マウス抗ウサギIgGを用いて、慣例的な方法で行った。
【0185】
他の因子の試験:仮性狂犬病ウイルス(NYSL、AMES、IA)、ブタ・インフルエンザウイルス(NYSL、AMES、IA)、ブタ・ロタウイルス(NYSL、AMES、IA)、ブタ血球凝集性脳炎ウイルス(NYSL、AMES、IA)、ブタ・パルボウイルス(American Bioresearch、Sevierville、TN)、および伝染性胃腸炎ウイルス(American Bioresearch、Sevierville、TN)を含む、他のブタ・ウイルス因子に関して、間接免疫蛍光を用いる慣例試験を、Purdue Animal Disease Diagnostic Laboratory、Lafayette INで市販の診断用試薬を用いて行った。血清、脾臓、および肺の試料を、ブタ繁殖呼吸障害症候群(PRRS)ウイルスに関して、ブタ1次肺胞マクロファージ細胞培養物中、ウイルス単離によって試験した。脳、脾臓、および扁桃の試料を、仮性狂犬病ウイルスに関して、直接蛍光抗体試験およびブタ鼻甲介細胞中ウイルス単離によって試験した。脳、脾臓、および扁桃の試料を、細胞変性ウイルスに関して、ブタ鼻甲介およびブタ精巣細胞中で試験した。
【0186】
結果
CTが発生した4つの農場はすべて、外部の供給源から更新用の種蓄を購入していた。種蓄の供給源は各農場で異なっており、いずれの農場も共通の遺伝を共有していなかった。ブタが屠殺齢まで維持された3つの農場では、最近のPMWS歴はなかった。試験に用いるために選択されたCTを有するブタはすべて、生後48時間以下で、中程度から重篤な振せんを伴い、ブタが自発的運動を試みたときにもっとも重篤であった。ブタが安静なときは、振せんが部分的に弱まった。年齢を対応させた臨床的に正常な対照ブタとして選択されたブタはすべて、CTブタのいないリフター(lifter)を起源とした。試験に選択されたブタはすべて敏捷で、活発であり、他の点では臨床的に正常であった。
【0187】
いずれのCTブタまたは正常ブタにおいても、肉眼的病変、または顕微鏡的病変はなかった。PRRSウイルス、仮性狂犬病ウイルス、および他の細胞変性ウイルスに関するすべての試験は陰性であった。PCVは、in situハイブリダイゼーション、PCR、およびIFA試験によって、CTブタ13頭中13頭、臨床的正常ブタ6頭中5頭の組織で実証された。CTブタおよび臨床的正常ブタの両方で、もっとも一般的にPCVに感染していた組織は、中枢神経組織および肝臓であった。in situハイブリダイゼーションは、PCV陽性ブタにおいて、CTブタの12/13および臨床的正常ブタの5/6の中枢神経組織、CTブタの11/13および臨床的正常ブタの2/6の肝臓、ならびにより低い割合でCTブタおよび臨床的正常ブタ5/6のすべての他の組織で、PCVを実証した。形態学的にマクロファージの典型である分散細胞の少数が、肝臓および他の非神経組織において陽性であった。PCV核酸は、陽性のマクロファージの細胞質のほとんど、陽性マクロファージの少数の核にのみ存在した。CTブタおよび臨床的正常ブタの両方の中枢神経組織に、他の組織より多くのPCV陽性細胞が存在した。脳および脊髄の陽性細胞は、主として大ニューロンであり、陽性小ニューロンはそれよりも少なく、陽性稀突起神経膠細胞は希少であった。大脳および骨髄の核において大ニューロンが陽性であり、小脳のプルキンエ細胞が陽性であり、脊髄灰白質の大ニューロン、特に下位運動ニューロンが陽性であった。マクロファージと同様に、陽性ニューロンは一般に、細胞質にのみPCV核酸を有し、核には希少であった。
【0188】
中枢神経系のPCV感染細胞は、臨床的に正常なブタよりもCTブタにおいて、数が多く、より広範に分布していた(表5)。一般に、CTブタは、脳および脊髄に広範に分布した多数の陽性大ニューロンを有した。臨床的に正常なブタは、脳および脊髄に多焦点に分布した、より少数のPCV陽性大ニューロンを有した。
【表5】
【0189】
各群1頭のブタから得た小脳および肝臓の凍結切片の間接蛍光抗体試験によって、in situハイブリダイゼーション試験の結果が確認された。PCV特異抗原は、in situハイブリダイゼーションのPCV特異核酸とほぼ同じ数および細胞型で、同じ細胞位置において実証された。すべてのブタから得た小脳および肝臓のPCR試験は、4つすべての農場のすべての陽性ブタにおいて、PCV2特異配列の増幅を実証したが、PCV1特異配列は実証されなかった。
【0190】
考察
CTA2型の発生中に、臨床的に正常なブタ、およびCTブタの両方が、1−2日齢でPCV2に感染していた。両方とも、先天的にウイルスに感染していたと思われる。PCV2は、すべての感染ブタで広範囲に分布しており、もっとも一般的には中枢神経組織に存在していた。
【0191】
しかしながら、臨床的に正常なブタと比較したとき、分布がより広範で、感染細胞の割合が高いために、CTブタの脳および脊髄により多くのPCV感染細胞が存在した。もっとも一般的な感染細胞は、脳および脊髄の大ニューロン、ならびに非神経組織のマクロファージであった。稀突起神経膠細胞はほとんど感染していなかった。
【0192】
CTブタが脳および脊髄において先天的にミエリンを欠損していることは、以前の研究で実証されている(Christensen、Nord Veterinaermed 8:921−943、1956)。他の研究は、年齢および遺伝的に対応する正常な対照ブタと比較して、CTブタが不相応に低いセレブロシド、および高いコレステロールからなる異常に未熟なミエリンを有することを実証した(Patterson、J.Neurochem 26:481−485、1976)。稀突起神経膠細胞がCNSにおいてPCVに感染する主要な細胞であって、それがミエリン合成の減少および異常の原因であろうというのが、本研究以前の仮説であった。脳および脊髄において多数のPCV感染ニューロンが見つかったことは驚くべきことであり、さらにこのことがミエリン欠損は別にして、あるいはミエリン欠損に加えて、CTの重要な原因である可能性がある。以前の研究は、CTブタにおけるミエリン欠損の程度は変化し、振せんの重篤度とは密接に関連していないことを実証した(Fletcher、J.Am Vet Med Assoc 29(12):2255−2262、1968)。この発見は、ミエリン異常は、単独ではCTの原因となり得ないことを示唆している。一研究において、CTおよび対照ブタの神経系で、大脳除去、片側迷路摘出、腰仙根の片側神経根切断、および胸髄離断を含む外科的切除が行われ、手術後神経学的検査によって振せんの原因が脊髄レベルに位置することが確認された。他の研究によって、CTブタにおける脊髄反射は、単シナプス過剰興奮性であることが判明した(Stromberg、Am J Vet Res 20:319−323、1959)。脊髄の運動ニューロンのPCV感染が機能に直接影響を及ぼし、運動ニューロンをより興奮性にし、それによって脊髄反射弓に影響を与えている可能性がある。
【0193】
PCV2感染稀突起神経膠細胞が少数であることは、PCV2感染稀突起神経膠細胞の機能障害をCTA2型におけるミエリン欠損の原因とする仮説を支持しない。しかしながら、本発明者等はこれらのブタにおいてミエリン欠損を確認しておらず、そのため存在しなかったことも考えられる。さらに、これらのブタにおいて、以前にPCV誘発の稀突起神経膠細胞の喪失および除去があった可能性も排除できない。PMWSを有するブタにおけるPCV2感染に伴う肉芽腫性炎症性反応は、これらのCTブタのいずれのPCV2感染組織においても認められなかった。炎症が見られない理由は明らかではないが、胎内でのPCV感染は免疫耐性を誘導する可能性がある。
【0194】
実施例III:PCV2の先天性伝播
方法
ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)にセロネガティブである、健康状態の高い民間のブタ農場から入手した8頭の多経産妊娠雌ブタを、帝王切開/初乳非投与(CD/CD)ブタを産生するために用いた。すべての雌ブタを、妊娠後90日より前にPurdue Universityの隔離室に移し、妊娠第94日に、4頭の雌ブタに、組織培養適合PCV2(PMWS−PCV−P4)1.0ml(107TCID50/ml)を筋肉内および鼻腔内接種した。妊娠第114日に、4頭のPCV接種雌ブタ、および4頭の非PCV接種雌ブタに帝王切開手術を行い、続いて安楽死をさせて、先天的にPCV2にされた暴露CD/CDブタ(C+ブタ)、および先天的にPCV2を伴わないCD/CDブタ(C−ブタ)を産生した。雌ブタの死体解剖検査を行い、種々のブタ・ウイルスに関して試験をするために、血清、脳、脊髄、肝臓、肺、脾臓、気管気管支リンパ節、および鼡径リンパ節の試料を採取した。各同腹子から3頭のブタを生後3日に安楽死させた。残りの新生ブタは、PMWSの病変を産生するための実験に用いた。安楽死させたブタ、および帝王切開後の最初の2週間の間に死亡したブタの完全な死体解剖検査を行った。各ブタから脳、脊髄、肝臓、肺、腎臓、脾臓、扁桃、骨髄、胸腺、気管気管支リンパ節、および鼡径リンパ節の試料を採取し、−20℃で保存するか、あるいは中性緩衝ホルマリンに保存(血清および血液以外)した。組織病理学、およびPCVin situハイブリダイゼーションをすべての組織で行い、顕微鏡的病変、およびPCV分布を評価した。選択したプール試料でPCV2PCRを行った。
【0195】
結果
帝王切開後、最初の2週の間に、4頭のC+雌ブタ由来の15頭が死亡し、さらに3頭を安楽死させた。最初の3日間で死亡した4頭のブタ、さらに死産であった1頭の子ブタは、ドーム形状の頭を有し、小さく、虚弱で、環境に順応することが困難であった。11頭のC+ブタはすべて活力に欠け、数頭は細菌性敗血症によって死亡した。全体として、C−ブタに比べて、C+ブタは活力に欠け、生後2週間まで生育することができなかった。研究の最初の3週間の間に死体解剖を行った19頭のC+ブタにおいて、PMWSに特徴的な肉眼的病変は同定されなかった。
【0196】
顕微鏡的には、最初の3週で死亡した8頭のC+ブタは、重篤な間質性肺炎を有し、細菌性敗血症を示した。これらのブタにおいて他の顕微鏡的病変は見られなかった。3週齢の間に死亡した5頭のC+ブタから得たリンパ節の切片、1頭のブタの肝臓の切片、2頭の肺の切片、および1頭のブタの心臓の切片は、in situハイブリダイゼーションによってPCV2が疑われた。個々のブタから得た脾臓、扁桃、気管支、および腸間膜リンパ節を含むリンパ組織のプールは、19頭のC+ブタの7頭で、PCVによってPCV2に陽性であった。すべてのC+ブタの肺、脾臓、および気管支リンパ節の試料は、および仮性狂犬病ウイルス(PRV)、ブタ・インフルエンザウイルス(SIV)、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ブタ・パルボウイルス(PPV)、または伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)に関して、ウイルス単離およびFA試験によって陰性であった。3週齢の間に出血した3頭のC+ブタの利用可能な血液試料は、PCV2、およびPPVに対して血清学的に陰性であった。このPCV2接種材料は、PPVが混入していることがわかった。
【0197】
考察
これらの結果は、PCV2が、感染した雌ブタからその同腹子に伝播され得ることを示唆した。PCV2単独で、または補助因子との組合せで、先天的に伝播することが可能であった。
【0198】
実施例IV:ウサギにおけるPCV特異抗体の作製
PMWS−PCV−P1 ORF1(314R)、PMWS−PCV−P1 ORF2カルボキシ領域(129R)、CT−PCV−P6 ORF3(104R)、CT−PCV−P6 ORF4(59R)、CT−PCV−P7 ORF2(カルボキシ部)を代表するオープン・リーディング・フレーム(ORF)を、適切なプライマーを用いてPCRによって増幅した。PCR産物を、ヒスチジンカセットに融合した異種挿入物の発現を駆動する細菌発現および精製ベクターpET30aに挿入した。細菌におけるPCVタンパク質の発現は非常に効率がよく、これらのORFが機能タンパク質をコードする可能性を有することを示唆した。融合タンパク質としてPCV特異タンパク質をNi++アフィニティ・クロマトグラフィによって精製した。これらの精製タンパク質を、ウサギを免疫化して抗体を作製するために用いた。
【0199】
実施例V:PCV2抗体をスクリーニングするためのELISAの発展
本発明者等は、細菌性発現PMWS−PCV−P1 ORF2カルボキシ部精製タンパク質を用いてプレートを被覆することによって、PCV2に対する抗体を検出するためにブタ血清をスクリーニングするELISAアッセイをより詳細に発展させた。
【0200】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。さらに上記の説明および添付の図面から、本明細書に記載したものに加えて本発明の様々な変更が当分野の技術者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の請求の範囲に含まれるものとする。
【0201】
さらに、すべての値が近似値であり、説明のために提供されたものであることが理解される。
【0202】
本明細書において引用したすべての特許、特許出願、刊行物、および他の資料は、その全体を参照により本明細書の一部とする。
【0203】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】
PMWS−PCV−P1、P2、P3、P4、およびCT−PCV−P5、P6、P7のヌクレオチド配列の比較を示す図である。
−は同一のヌクレオチドを表す。
・は欠失ヌクレオチドを表す。
PMWS−PCV、およびPK−15−PCVのヌクレオチド配列は、それぞれHamel等、1998、およびMeehan等、1997から採用した。
【図2】
PMWS−PCV−P1(図2A)、およびCT−PCV−P7(図2B)の11種のORFの概略図である。PMWS−PCV−P1、およびCT−PCV−P7のゲノムの大きさは、それぞれヌクレオチド1768、および1759である。矢印の方向は、各ORFの配向を表す。
【図3】
ブタおよびウシ・シルコウイルス単離株の全ゲノムの距離マトリクス分析を示す図である。枝の長さは、単離株の系統発生距離に比例する。線は2つの配列間の10%の差異を表す。無根系統樹、1型株(CT−P7、PMWS−AF012107、およびPK−15細胞系由来株)はアウトグループとして用いた。ブートストラップ値(100データセット)を示す(全長アラインメントによって得られた系統樹トポロジーが確認されなかったPCV2−Bの場合を除く)。ウイルス株は、原因疾患(既知の場合)、および株名(得られる場合。得られない場合は、アクセッション番号、または提示された制限酵素フラグメンテーションの型)によって表す。株(本発明のもの以外)、およびそのGenBankアクセッション番号は以下のとおりである。PK−15細胞系由来株:PK−ISA(U49186)、PK−15B(Y09921)、PK−15C(AF071879)、PMWS株:PMWS−AF012107、P/48121(Imp.1011 48121、AF055393)、P/ISU−31(AJ223185)、P/48285(Imp.1011 48285、AF055394)、P/AF027217、P/ISUVDL(ISUVDL98−15237、AF147751)、(Imp.999(AF055391)、P/Imp.1010(Imp.1010−Stoon、AF055392)、疾患の記載のない株:Tainan(AF166528)、MLTW98(AF154679)、B9(AF086834)、9741(AF086835)、412450(AF085695)、M226(AF086836)、制限酵素フラグメンテーション・パターンの型名を有する株:PCV2−B(AF112862)、PCV2−C(AF109398)、PCV2−D(AF117753)、PCV2−E(AF109399)、ウシ・シルコウイルス:Bovine CV(AF109397)。
【図4】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム1(ORF1)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図5】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム2(ORF2)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図6】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム3(ORF3)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図7】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム4(ORF4)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図8】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム5(ORF5)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図9】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム6(ORF6)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図10】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム7(ORF7)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図11】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム8(ORF8)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図12】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム9(ORF9)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図13】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム10(ORF10)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図14】
本発明のPMWS−およびCT−PCV単離株のオープン・リーディング・フレーム11(ORF11)をPWMS−PCVおよびPK−15−PCVの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
Claims (33)
- ブタ・シルコウイルス(PCV)から単離された核酸であって、配列番号1から配列番号7からなる群から選択された配列と同一の配列を有する核酸。
- 請求項1に記載の単離された核酸を含む核酸。
- ブタ・シルコウイルス(PCV)から単離された核酸であって、配列番号1から配列番号7の任意の配列の任意のORF1からORF11によってコードされた配列からなる群から選択された配列を有する、シルコウイルス・ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
- 配列番号1から配列番号7の任意の配列のORF1からORF11の配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する請求項3に記載の核酸。
- 発現調節配列と機能的に結合された請求項3に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項5に記載の発現ベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
- 請求項5に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- PCVタンパク質を産生する方法であって、シルコウイルスタンパク質をコードする核酸の発現をもたらす条件下で、請求項7に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
- PCVタンパク質が、配列番号1から配列番号7の任意の配列によって付加された配列の、任意のORF1からORF11によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項8に記載の方法。
- ブタ・シルコウイルス(PCV)から単離されたポリペプチドであって、配列番号1から配列番号7の任意の配列の任意のORF1からORF11によってコードされた配列からなる群から選択された配列を有するポリペプチド。
- 請求項10に記載の単離されたポリペプチドおよびアジュバントを含むワクチン。
- 単離されたブタ・シルコウイルス株であって、配列番号1から配列番号6の配列からなる群から選択された配列を含むゲノムを有する単離された株。
- 弱毒化、不活化、または死滅化された請求項12に記載のブタ・シルコウイルス。
- 請求項13に記載のブタ・シルコウイルスおよびアジュバントを含むワクチン。
- ブタにおいて先天性振せんの病因を診断する方法であって、そのブタが、ブタ・シルコウイルス株1型または2型に感染しているかどうかを判別することを含む方法。
- ブタ・シルコウイルスが、配列番号1から配列番号6の配列からなる群から選択された配列を含むゲノムを有する請求項15に記載の方法。
- ブタにおいて先天性振せんの病因を診断する方法であって、そのブタが、配列番号1から配列番号6の配列からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス株に感染しているかどうかを判別することを含む方法。
- 感染の判別が、ブタから得た生物試料中のPCV核酸の存在を検出することによって行われる請求項17に記載の方法。
- 配列番号1から配列番号6の20個の連続塩基に見出される配列、またはその相補配列を有する少なくとも約20塩基のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む請求項18に記載の方法。
- 感染の判別が、ブタから得た生物試料中のPCVポリペプチドの存在を検出することによって行われる請求項17に記載の方法。
- 配列番号1から配列番号6の任意の配列の任意のORF1からORF11によってコードされた配列からなる群から選択された配列を有するポリペプチドを特異的に結合する抗体の結合を検出することを含む請求項20に記載の方法。
- 感染の判別が、ブタから得た生物試料中のPCVポリペプチドに対する抗体の存在を検出することによって行われる請求項17に記載の方法。
- 請求項10に記載のポリペプチドに対する抗体。
- ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、1型または2型PCV株の免疫原性ポリペプチド、およびアジュバントを含む免疫防御量のワクチンを投与することを含む方法。
- PCVポリペプチドが、配列番号1から配列番号6の任意の配列の任意のORF1からORF11によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項24に記載の方法。
- ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、配列番号1から配列番号6の任意の配列の任意のORF1からORF11によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する免疫原性ポリペプチド、およびアジュバントを含む免疫防御量のワクチンを投与することを含む方法。
- ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、1型または2型PCV株の免疫原性ポリペプチドをコードする免疫防御量のPCV核酸を、薬学的に許容される担体と共に投与することを含む方法。
- PCVポリペプチドが、配列番号1から配列番号6の任意の配列の任意のORF1からORF11によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項27に記載の方法。
- ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、配列番号1から配列番号6の任意の配列の任意のORF1からORF11によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する免疫原性ポリペプチドをコードする免疫防御量のPCV核酸を、薬学的に許容される担体と共に投与することを含む方法。
- ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、免疫防御量の請求項23に記載の抗体を投与することを含む方法。
- ブタ・シルコウイルス株を培養する方法であって、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含む核酸を、配列番号1から配列番号6からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス粒子の産生をもたらす条件下で、適切な宿主細胞に導入することを含む方法。
- 宿主細胞がPK−15細胞である請求項31に記載の方法。
- 核酸がクローン化された2本鎖DNAの形態で導入される請求項31に記載の方法。
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