CN112014561B

CN112014561B - 猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒

Info

Publication number: CN112014561B
Application number: CN202010914249.9A
Authority: CN
Inventors: 李向东; 刘金彪; 陈昌海; 范娟
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-09-03
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2040-09-03
Also published as: CN112014561A

Abstract

本发明涉及猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒，属于免疫检测技术领域。本发明提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述应用制备得到的试剂盒检测特异性好，通量高，具有重要的临床使用价值，且检测快速，精准，能够实现猪场中PCV4的流行病学检测，也可以用于疫苗免疫后猪血清中PCV4抗体的评价。

Description

猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)是一种基因组为环状、单链的DNA病毒，根据基因组特征，目前已发现PCV1、PCV2、PCV3和PCV4四种基因型。其中，PCV1可在猪群中检出，但不致病；PCV2是引起猪断奶后衰竭综合症的主要病原；PCV3是一种与母猪皮炎综合征和繁殖障碍相关的病毒；最新发现的猪圆环病毒4型(PCV4)可能引起猪呼吸道、消化道等多种疾病，且可能与猪皮炎与肾病综合征密切相关。目前，该病毒已在我国多省份均有报道，临床检测主要依靠普通PCR、实时荧光PCR等核酸检测方法为主。

目前，该病毒尚未成功分离，且无商品化疫苗进行免疫，因此，血清学检测为阳性即可判断PCV4感染。但目前缺少一种该病毒的现场快速、精准检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒。本发明所述应用制备得到的试剂盒检测特异性好，通量高，具有重要的临床使用价值，且检测快速，精准，能够实现猪场中PCV4的流行病学检测，也可以用于疫苗免疫后猪血清中PCV4抗体的评价。

本发明提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测疫苗免疫后猪血清中猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备诊断猪圆环病毒4型疾病的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：包被猪圆环病毒4型特异性抗原的ELISA酶标板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、封闭液、洗涤液、酶标二抗液、显色液和反应终止液；所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

优选的是，所述阴性对照包括猪圆环病毒4型抗体阴性的猪血清，所述阳性对照包括猪圆环病毒4型抗体阳性的猪血清。

优选的是，所述试剂盒中，当猪圆环病毒4型特异性抗原包被的质量浓度为10μg/mL时，若OD₄₅₀>0.34，判定结果为阳性。

本发明提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用。本发明所述应用检测特异性好，不与其它猪圆环病毒包括PCV1、PCV2和PCV3存在血清学交叉反应，可用于临床血清样品中PCV4的抗体检测，能够快速、特异、高通量地用于PCV4血清学检测，具有良好的临床应用价值；而且本发明应用相关的试剂盒可用于大规模临床血清样品中PCV4抗体的检测，具有特异性好、灵敏度高、检测时间短、通量高等技术优势，具有重要的临床实用价值和广阔的市场应用前景。

具体实施方式

本发明提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(GHYDFKLKDFIPKGPGTIVNLYSLPFA)。本发明所述猪圆环病毒4型特异的抗原为PCV4特异性氨基酸序列，与其它猪圆环病毒包括PCV1、PCV2、PCV3不存在血清学交叉反应。具体的，本发明优选体外合成上述PCV4特异性氨基酸序列用于包被抗原的制备，进而得到的试剂盒能够实现血清样品中PCV4特异性抗体的间接ELISA检测。

本发明还提供了一种检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：包被猪圆环病毒4型特异性抗原的ELISA酶标板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、封闭液、洗涤液、酶标二抗液、显色液和反应终止液；所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。在本发明中，所述试剂盒优选还包括ELISA包被液，所述ELISA包被液能够有效活化抗原，充分暴露抗体识别的抗原决定簇，所述ELISA包被液的制备方法包括：NaCO₃1.59g，NaHCO₃2.93g溶于1L蒸馏水中，调节pH＝9.6。在本发明中，所述洗涤液的制备方法优选包括：取NaCl8g，KH₂PO₄0.25g，Na₂HPO₄2.13g，KCl0.2g和吐温-200.5mL，用去离子水定容至1L，调节pH值为7.4。在本发明中，所述封闭液的制备方法优选包括：取BSA0.5g，酪蛋白0.025g定溶于10mL洗涤液中。在本发明中，所述显色液(底物显色液)优选包括A液：柠檬酸21g溶于1L去离子水中，B液：磷酸氢二钠71.6g溶于1L去离子水中；使用前取4.86mLA液、5.14mLB液，加入邻苯二胺10mg混匀后加入37.5μl30％H₂O₂。在本发明中，所述反应终止液的制备方法优选包括在177.8mL的蒸馏水中加入22.2mL浓硫酸混匀。

在本发明中，所述阴性对照包括猪圆环病毒4型抗体阴性的猪血清，所述阳性对照包括猪圆环病毒4型抗体阳性的猪血清。

在本发明中，所述试剂盒中，当猪圆环病毒4型特异性抗原包被的质量浓度为10μg/mL时，若OD₄₅₀>0.34，判定结果为阳性。

下面结合具体实施例对本发明所述的猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

PCV4型特异性抗原的筛选与制备

1PCV4型特异性抗原的筛选。

通过比对不同圆环病毒基因型氨基酸序列，筛选到GHYDFKLKDFIPKGPGTIVNLYSLPFA氨基酸序列，该肽段与PCV1、PCV2、PCV3氨基酸同源序列最低，具有良好的抗原反应原性。

2PCV4间接ELISA方法的初步建立

2.1抗原包被浓度的确定

将PCV4抗原用包被液稀释至蛋白含量分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，加至96孔酶标板中，每孔加100μL，4℃放置过夜。次日，甩掉孔内液体，用300μL洗涤液洗涤2次，每次3分钟，拍干。

2.2封闭

在酶标板中加入封闭液，每孔100μL，37℃作用30分钟。

2.3加一抗

弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，加入1:200倍稀释的PCV4阴性、阳性血清样品，每孔100μL，37℃作用30分钟。

2.4加酶标二抗

弃去一抗，用洗涤液洗涤3次，加入1:5000倍稀释的酶标二抗(酶标记的兔抗猪二抗(Sigma公司))，每孔100μL，37℃作用30分钟。

2.5显色及判定

弃去二抗，用洗涤液洗涤3次，加入底物显色液，每孔100μL，37℃避光作用10分钟，加入50μL终止液终止反应。使用酶标仪读取OD₄₅₀数值。

2.6结果

当抗原包被为10μg/mL时，阴性孔平均值为0.106，根据临界值(Cut-off)＝阴性样本OD₄₅₀平均值+3×标准差＝0.106+3×0.078＝0.34，建立判定标准为OD₄₅₀>0.34为阳性。使用该标准，临床中PCV4阳性样品OD₄₅₀均大于0.34。

ELISA包被液：

NaCO₃1.59g

NaHCO₃2.93g

溶于1L蒸馏水中，调节pH＝9.6

ELISA洗涤液：

用去离子水定容至1L，调节PH值为7.4。

封闭液：

BSA 0.5g

酪蛋白 0.025g

定溶于10mL样品洗涤液中。

底物显色液：

A液：柠檬酸21g溶于1L去离子水中。

B液：磷酸氢二钠71.6g溶于1L去离子水中。

使用前取4.86mLA液、5.14mLB液，加入邻苯二胺10mg混匀后加入37.5μl30％H₂O₂。

终止液：

在177.8mL的蒸馏水中加入22.2mL浓硫酸混匀。

3 PCV4型特异性抗原特异性验证

取猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、PCV1、PCV2、PCV3阳性血清，使用建立的ELISA方法进行检测，结果均为阴性，OD₄₅₀见表1。结果表明该ELISA方法均有良好的特异性。

表1 PCV4型特异性抗原特异性验证结果

阳性血清	CSFV	PRRSV	JEV	PRV	PPV	PCV1	PCV2	PCV3	PCV4
										OD<sub>450</sub>	0.105	0.094	0.073	0.064	0.088	0.101	0.098	0.075	0.918
结果判定	-	-	-	-	-	-	-	-	+

4 PCV4间接ELISA试剂盒

基于上述所建立的ELISA方法，组装成PCV4间接ELISA试剂盒，试剂盒组分包括：包被PCV4型特异性抗原的ELISA酶标板、阴性对照(PCV4抗体阴性的猪血清)、阳性对照(PCV4抗体阳性的猪血清)、样品稀释液、封闭液、洗涤液、酶标二抗液、显色液和反应终止液。样品检测操作步骤按2.2-2.6进行。

实施例2

PCV4间接ELISA方法与PCV4实时荧光PCR方法比对

目的是为了验证PCV4间接ELISA方法与PCV4实时荧光PCR方法对临床样品检测的符合率。取经PCV4实时荧光PCR方法检测为阳性的临床血清样本10份、阴性样品10份，使用PCV4间接ELISA试剂盒进行检测，结果与实时荧光PCR方法检测结果符合率为100％，如表2所示。

表2 PCV4间接ELISA方法与PCV4实时荧光PCR方法比对结果

实施例3

PCV4间接ELISA试剂盒对临床血清样品的检测

实验室分别从江苏、河南、广东、广西、安徽、浙江、福建、河北等省份猪场收集93份猪血清用于PCV4间接ELISA试剂盒进行评价，检测结果(表3)为10份血清为阳性，阳性率为10.75％，表明我国部分猪群已感染PCV4。

表3临床血清样品的检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Gly His Tyr Asp Phe Lys Leu Lys Asp Phe Ile Pro Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Thr Ile Val Asn Leu Tyr Ser Leu Pro Phe Ala

20 25

Claims

1.猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测疫苗免疫后猪血清中猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.猪圆环病毒4型特异的抗原在制备诊断猪圆环病毒4型疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被猪圆环病毒4型特异的抗原的ELISA酶标板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、封闭液、洗涤液、酶标二抗液、显色液和反应终止液；所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照包括猪圆环病毒4型抗体阴性的猪血清，所述阳性对照包括猪圆环病毒4型抗体阳性的猪血清。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，当猪圆环病毒4型特异的抗原包被的质量浓度为10μg/mL时，若OD₄₅₀>0.34，判定结果为阳性。