KR20080027289A - 돼지 2형 써코바이러스 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 2형 써코바이러스(PCV2)의 ORF3 유전자 및 이의 아폽토시스 작용을 검증한 것을 기초로 한다. 이러한 발견을 통해 PCV2에 대한 약독화 생백신의 개발이 가능하게 되었다.

Description

돼지 2형 써코바이러스 백신{PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 VACCINES}

본 발명은 신규한 돼지 2형 써코바이러스(PCV2)의 생성 및 이 바이러스에 대한 백신을 제공하는 것에 관한 것이다.

본 명세서에서 언급하는 모든 문헌(이하 "인용 문헌") 및 인용 문헌에 인용되어 있거나 참조되어 있는 모든 문헌들을 모든 목적을 위하여 본 발명에서 참조하여 포함시킨다. 본 명세서에 인용된 다양한 문헌들 중 임의의 문헌이 본 발명에 대한 종래 기술임을 의미하는 것은 아니다.

이유후 전신 소모성 증후군( Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome) ( PMWS )

PMWS는 육성돈 및 이유후 돈에서 발병되는 신종 질병으로서, 많은 양돈국에서 최근 유행하고 있어, 세계적으로 양돈 산업에 잠재적인 경제적 타격을 주는 원인이 되고 있다. PMWS는 주로 5 내지 18 주령의 돼지에서 발병하지만, 4 내지 20 주령의 돼지에서도 발병한다는 것이 보고된 바 있다(42). PMWS의 임상적 징후로는 점진적인 체중 감소, 호흡 곤란, 빈호흡, 빈혈증, 설사 및 황달 등이 포함된다. 폐사율은 1% 내지 2%에서 부터 다른 질병과의 합병증이 있는 경우에는 최대 30%까지 다양할 수 있다.

돼지 써코바이러스(PCV)는 원래 돼지 신장 세포 배양물(PK15 ATCC CCL-33)의 오염체로서 동정되었다(47). PCV 비리온은 약 1.76 kb의 단일 가닥 원형 DNA를 가지고 있으며 직경이 17 nm인 20면체로, 엔벨로프는 없다. PCV는, 앵무새 부리-털 질환 바이러스(psittacine beak-feather disease virus), 거위 써코바이러스, 카나리아 써코바이러스 및 비둘기 써코바이러스 등의 다른 동물 써코바이러스가 속해있는 써코비리데 과의 써코바이러스 속으로 분류된다(35, 38, 50, 51, 52). PCV는 2종의 유전형이 알려져 있다. PK15 세포 유래 PCV는 돼지에서는 비병원성인 것으로 알려져 있으며(3, 48), 1형 PCV(PCVl)라고 한다. 혈청학적 조사에 의하면 PCV 1은 돈군에는 광범위하게 존재하지만, 이 PCV1과 관련된 다른 동물의 질병에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 한편, 현재 2형 PCV (PCV2)는 1991년 캐나다에서 발병한 이래(1, 8), 세계적으로 새롭게 출현한 돈질환인 이유후 전신 소모성 증후군(PMWS)과 관련된 주요 감염원인 것으로 받아들여지고 있다(2, 6, 20).

PCV2 및 이의 작용 방식

아폽토시스(apoptosis)는 특정 형태적 변화 및 생화학적 변화가 수반되는 세포의 자기-파괴적인 활성 생리 과정이다(39). 많은 바이러스들은 이들의 자연적인 생명 주기의 일부로 아폽토시스를 유도한다(39). 한편으로, 아폽토시스는 바이러스성 인자에 대한 면역 반응 또는 염증성 반응을 최소화하면서 숙주 세포에서 생산되는 자손 비리온을 방출하고 전파하기 위한 주요 기작 중 하나이다. 또 한편으로, 바이러스 유도성 아폽토시스는 감염된 세포를 의도적으로 파괴하기 위한 다세포 숙주 유기체의 방어 전략 중 하나로 간주할 수 있다. 아폽토시스적인 세포 사멸을 야기하는 대부분의 바이러스들은 세포 사멸 프로그램 과정을 실행하기 위한 캐스파제 캐스케이드의 활성화를 유발시킨다. 선천적으로 PMWS에 걸린 돼지에서 B 세포 고갈 원인이 되는 기전으로 아폽토시스가 제안되었지만(43), 최근 림프구 아폽토시스가 PMWS 림프구성-고갈 병변이 진행하는 데보편적인 현상이 아니라는 상반되는 결과가 보고되었다(24, 37).

PCV1 분리주 또는 PCV2 분리주 내에서 전체 DNA 서열의 상동성은 90% 이상인 반면, PCVl 분리주와 PCV2 분리주 간의 상동성은 68∼76%이다. PCV에 대한 2개의 주요 오픈 리딩 프레임(ORF)이 알려져 있는데, rep 유전자로도 알려진 ORFl은 바이러스의 복제에 관여하는 35.7 kDa의 단백질을 암호화하며(26), cap 유전자로도 알려진 ORF2는 27.8 kDa의 주요 면역원성 캡시드 단백질을 암호화한다(9, 30, 31). 복제효소(replicase) ORFl 및 캡시드 단백질 ORF2 이외에도, 컴퓨터 탐색에 따르면 5 kDa 보다 큰 단백질을 암호화하는 다른 5개의 가능성 있는 ORF가 포함되어 있는 것으로 예측된다(27). 이들 가능한 ORF가 단백질을 발현하는지 발현한다면 발현된 단백질이 바이러스 복제에 필수적인지에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다.

PCV2에 있어서, 상기 5개의 ORF 중 가장 큰 ORF는 길이가 315 bp인 단편으로서, 본 발명에서는 ORF3라 명명하였으며, 공지된 단백질 중 어떠한 것과도 유사성을 나타내지 않았다. 반대로, PCV1에서 상기 ORF3에 상응하는 영역에 위치하는 ORF 단편은 그 길이가 612 bp로서 PCV2의 ORF3보다 훨씬 길다. 또한, PCV2의 ORF3와 PCV1의 이에 상응하는 영역간의 아미노산 동일성은 단지 61.5%이다. 이러한 편차가 PCV2의 병원성과 연관된 것인지는 아직 확인되지 않았다.

PMWS에 걸린 돼지에서 이 질병의 특징 및 조직 병리학적 연구 결과에 따르면, 어떤 조건에서 PCV2는 돼지의 2차 면역결핍을 야기하는 것으로 나타났다. PMWS에 걸린 돼지에서 현미경적 병변에서는 림프성 조직의 마크로파지 침윤과 함께 소포(follicular) 및 소포간 영역의 림프구 결핍이라는 특징이 나타났다. 또한, PCV2와 다른 감염원과의 동시감염으로 상기 질병의 발병률 및 중증도가 증가하였다(2,3)

PMWS는 그 폐사율이 일부 농장에서는 여전히 상당 수준에 이르기 때문에 현재까지도 전세계적으로 양돈 산업에서 주요한 문제가 되고 있다. PCV2에 대한 DNA 백신이나 서브유닛 백신의 개발에 대한 어느 정도 정보가 있지만, 일정 병원체에 대한 약독화, 생백신의 잠재적이고 보호적인 효능은 중요하게 고려되어야만 한다. 상기 질병의 확산을 방지하는데 효과적인 약독화 생백신은 아직 공지된 바가 없다.

최근 공지된 이용가능한 2종의 백신이 존재한다. 그 중 하나는 ORF2 재조합 서브유닛 백신이고 다른 하나는 DNA 백신이다. 이들 두 백신은 PCV2의 복제를 완전하게 억제하는 데 효과적이지만, PCV2에 대해 효과적인 백신으로서 이들의 상업적 가격을 낮출만한 유리한 면은 결여되어 있다. DNA 백신은 돼지에서 체액성 반응 및 세포성 반응을 둘다 유도할 수 있지만 백신의 적절한 투여를 가능하게 하는 적합한 전달 시스템이 부족하다. 이는 PCV2 감염율을 저하시키는 효능이 있었는데, 이러한 효능은 감염 후 3 주후에나 가시화되었다(5). 서브유닛 백신이 PCV2에 대하여 보다 효과적으로 작용하지만, 이는 단지 체역성 면역만을 자극할 수 있다. 배큘로바이러스 시스템을 이용하여 얻은 저농도의 단백질에 의해서도, PCV2에 대해 동물을 면역화시키는데 다수 용량이 요구되며, 따라서 그 효율이 떨어진다는 것을 확인하였다. 또한, PCV2 감염 후 3 주 및 4 주 동안 실험 동물의 성장 지연도 상당히 두드러졌다. 게다가, 두 백신에 대한 1차 접종(prime boost) 프로토콜도 아직까지 결정되지 않았다.

따라서, PMWS를 극복할 수 있는 개선된 백신이 요구되고 있다.

- 본 발명의 요약 -

본 발명은 상기 바이러스에서 ORF3 유전자의 발견 및 이 유전자의 아폽토시스 기능의 검증을 기초로 하다. 이러한 발견으로 PCV2에 대한 약독화 생백신의 개발이 가능하게 되었다.

본 발명의 제1 측면은 면역원성 약독화 PCV2를 제공하며, 여기서 약독화는 적어도 부분적으로 비정상 ORF3의 발현에 기인한 것이다.

본 발명의 제2 측면은 상기 제1 측면에 따른 바이러스의 면역학적 유효량을 포함하는 백신을 제공한다.

본 발명의 제3 측면은 본 발명의 제2 측면에 따른 백신을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 PCV2에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제4 측면은 약물로 사용하기 위한 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스를 제공한다.

본 발명의 제5 측면은 개체에서 PCV2에 대한 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응을 둘다 유도하기 위한 바이러스를 제공한다.

본 발명의 제6 측면은 개체에서 PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약물의 제조에서의 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스의 용도를 제공한다.

본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스를 생산하기 위한 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 제8 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스를 사용한 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 동물에게 바이러스의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제9 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 바이러스의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 바이러스의 생산이 가능하도록 적절한 조건하에서 본 발명의 제7 측면에 따른 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 제10 측면은 아폽토시스를 유도할 수 있는 단백질을 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상기 단백질은 서열 번호 1에 기재된 하기 아미노산 서열을 포함한다.

MVTIPPLVSRWFPVCGFRVCKISSPFAFTTTRWPHNDVYIRLPITLLHFPAHFQKFSQPAEISDKRYRV LLCNGHQTPALQQGTHSSRQVTPLSLRSRSSTFYQ

본 발명의 제11 측면은 본 발명의 제10 측면에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 2에 기재된 하기 서열을 포함한다.

ATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTACCACAACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCAC ATTCTATCAGTAA

본 발명의 제12 측면은 본 발명의 제11 측면에 따른 핵산 분자의 돌연변이형을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자는 이 핵산 분자가 암호화하는 단백질이 비정상적으로 발현되도록 돌연변이된 것이다.

본 발명의 제13 측면은 본 발명의 제12 측면에 따른 핵산 분자가 암호화하는 단백질을 제공한다.

본 발명의 제14 측면은 본 발명의 제11 또는 제12 측면에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터, 바이러스 또는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 제15 측면은 본 발명의 제10 또는 제13 측면에 따른 단백질과 결합할 수 있는 항체를 제공한다.

본 발명의 제16 측면은 본 발명의 제10 또는 제13 측면에 따른 단백질과 결합할 수 있는 항체를 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제17 측면은 본 발명의 핵산 분자, 단백질, 항체, 길항제, 작용제, 바이러스, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 제18 측면은 본 발명의 제10 측면에 따른 단백질의 작용제 또는 길항제를 동정하는 방법을 제공한다.

상기 방법은

(i) 본 발명의 제10 측면에 따른 단백질과 시험용 화합물을 접촉시키고 상기 시험용 화합물이 단백질의 아폽토시스 유도능을 증가 또는 저하시키는지 측정하는 단계: 또는

(ii) 본 발명의 제10 측면에 따른 단백질을 세포 내에서 발현시키고 상기 세포를 시험용 화합물에 노출시켜서 상기 시험용 화합물이 단백질의 아폽토시스 유도능을 증가 또는 저하시키는지 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제19 측면은 본 발명의 제18 측면에 따라 동정된 작용제 또는 길항제를 제공한다.

본 발명의 제20 측면은 이유후 전신 소모성 증후군 유도능에 대하여 하나 이상의 후보 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 방법은

(i) 생물학적 시료와 하나 이상의 후보 분자를 접촉시키는 단계, 및

(ii) 상기 하나 이상의 후보 분자에 의해 생물학적 시료에 유도된 아폽토시스 수준을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 아폽토시스의 수준은 상기 하나 이상의 후보 분자의 이유후 전신 소모성 증후군 유도능을 나타낸다.

일 구체예에서, 상기 방법은 후보 분자가 단백질의 아폽토시스 유도능을 증가 또는 저하시키는지 측정하는 단계를 더 포함한다.

- 용어 정리 -

이 부분에서는 이하 기술하는 단어 및 어구(및 이의 적절한 문법적 변형)의 이해를 돕기 위한 길잡이를 제공하고자 한다.

본 발명에서 사용한 바와 같이, 단수형(영어 관사 "a", "an" 및 "the")으로 기재한 것은 문장 내에서 달리 언급하지 않으면 복수형을 내포하는 것이다. 예를 들어, 용어 "제제"는 이의 혼합물을 포함하여, 복수의 제제도 포함하는 것이다.

본 발명에서 사용하는 용어 "포함하는(comprising)"은 "함유하는(including)"의 의미이다. 본 명세서의 문맥에서, 용어 "포함하는"은 "주로 함유하지만, 반드시 단독으로는 아닌"이라는 의미이다. 단어 "포함하는(comprising)"의 어미 변화, 예컨대 "포함하다(comprise 및 comprises)"는 상응하는 여러 의미들을 갖는다.

본 발명에서 사용하는 용어 "백신(vaccine)"은 동물의 면역계를 자극하기 위해 사용 가능한 제제를 포함한다. 이러한 방식으로, 면역계에 의해 자기 항원으로 인지되지 않는 항원에 대한 면역 보호성이 제공될 수 있다.

용어 "면역화(immunization)"는 개체에게 면역원을 전달하는 과정을 포함한다. 예컨대, 면역화는 동물이 사전에 노출되었던 병원체 또는 항원에 대하여 발생한, 면역화된 동물에서 T-림프구가 병원체를 죽이거나 억제할 수 있는 세포 반응 및/또는 항체를 계속적으로 높은 수준으로 유지시킬 수 있다.

용어 "단백질"은 펩티드 결합에 의하여 함께 연결된 아미노산으로 구성된 중합체를 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여 "폴리펩티드"가 전체 길이 단백질의 일부 예컨대 이의 기능성 또는 활성 단편 등으로 구성될 수 있지만, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용된다. 다르게는 용어 "단백질"은 또한 기능성 변이체로 구성될 수도 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 염기 또는 공지의 유사체 또는 천연 뉴클레오티드 또는 이의 혼합물의 단일 가닥 또는 이중 가닥 중합체를 의미한다.

본 명세서 전반에 걸쳐서, 본 발명의 다양한 측면을 범위 형식으로 개시할 수 있다. 범위 형식으로 설명하는 것은 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범주를 엄격하게 한정하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 따라서, 이러한 범위 내 기재는 상기 범위내 개별적인 수치값을 비롯하여 가능한 모든 하부 범위를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6의 범위로 개시한 것은 구체적으로 이의 하부 범위 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등을 비롯하여 상기 범위 내 개별 숫자, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 개시하는 것으로 간주해야 한다. 이는 범위의 크기에 상관없이 적용된다.

달리 지적하지 않으면, 본 발명에서 사용하는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미로 사용된다.

도 1 (A) 감염성 PCV2 분자 DNA 클론을 구축하는 개략적인 흐름도이다: 완전한 PCV2 게놈을 증폭하기 위해 사용한 프라이머 쌍의 상대적 위치를 화살표로 나타내었다(역방향 프라이머, R-PCVPST1; 전방향 프라이머, F-PCVPST1). PCR로 증폭한 PCV2 게놈 DNA를 PstI 제한 효소로 분해하고 정제하였다. 정제 및 효소 분해한 게놈 DNA를 PstI 효소로 사전분해한 pSK 벡터와 결찰시켜서 PCV2 DNA 클론 분자를 제작하였다. PCV2의 자가 결찰을 위하여 이 DNA 클론을 추가 효소 분해하여 겔 정제하고, 이어서 원형 PCV2 DNA로 PK15 세포를 형질감염시켰다. (B) ORF3 유전자가 결여된 PCV2 돌연변이체를 구축하는 개략적인 설명도이다. (C) PCV2 바이러스주 BJW(유전자 은행 수탁 번호 AY847748)의 유전자 지도를 나타내는 도면이다. 3개의 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열을 각각의 개별 유전자의 뉴클레오티드 위치를 나타내는 nt 좌표로 표시하였다. ORF2 및 ORF3 유전자는 왼쪽 방향으로 전사되고 ORF1은 오른쪽 방향으로 전사된다. PstI 제한 효소의 위치도 또한 표시하였다. (D) RT-PCR을 통해서 PCV2-감염된 세포에서 ORF3 유전자를 분석한 결과를 나타내는 도면이다. PCV2-감염된 세포 또는 모의체-감염된 세포로부터 RNA를 분리하고 cDNA로 역전사시켰다. 이 cDNA를 ORF3 프라이머 쌍으로 증폭시켰다. PCR 반응을 이용하여 PCV2 게놈으로부터 포지티브 단편을 증폭시켰다. (E) ISH를 통하여 PCV2 감염된 PK15 세포로부터 ORF3 RNA를 검출한 결과를 나타내는 도면이다. ORF3 mRNA 발현은 감염 후 24시간(a), 48시간(b), 72시간(c) 및 96시간(d) 후 감염 세포의 핵에서 안티센스 ORF3 DIG-표지된 리보프로브를 사용하여 검출하였다. 또한, 감염 48시간 후 센스 ORF3 DIG-표지된 리보프로브를 사용하여 감염 세포에서의 ORFl mRNA 발현을 검출하였다(e). 모의체 감염된 세포에서는 안티센스 ORF3 리보프로브를 사용하여 어떠한 신호도 검출되지 않았다(f). 스케일 바, 10 ㎛.

도 2는 PCV2 감염된 세포에서 ORF3 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타내는 도면이다. (A) PCV2의 ORF3 단백질에 대하여 발생한 항혈청을 사용하여 PCV2 감염된 PK15 세포를 조사하였다. PCV2 바이러스주 BJW로 감염시킨 후 24시간(b), 48시간(c) 및 72시간(d) 이후에 PK15 세포를 IFA로 염색하였다, 음성 대조구(a)로는 모의체 감염된 PK15 세포를 IFA로 염색한 것을 사용하였다. 상기 세포들을 형광 현미경으로 시각화하고 사진을 찍었다. 상기 감염 세포에서 ORF3 항원은 핵에 위치하였고 이 보다 적은 정도로 세포질에 위치하였다. 스케일 바, 10 ㎛. (B) PCV2 바이러스주 BJW-감염된 PK15 세포의 총 세포 용해물을 15% SDS-PAGE에서 전기영동시키고, 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이동시킨 후, ORF3 항체에 대한 항혈청으로 검출하였다. 감염 후 이 PCV2-감염된 세포에서 ORF3 단백질이 발현되었다.

도 3은 ORF3 단백질 발현을 검출하기 위하여 ORF3-결핍 PCV2 감염된 세포를 IFA 염색한 사진이다. PK15 세포를 재조합 PCV2 바이러스 저장물(A 및 B) 또는 5 계대의 ORF3-결핍 PCV2 바이러스 저장물(D 및 E)을 MOI가 1이 되도록 하여 감염시켰다. 음성 대조구로서 모의체 감염된 PK15 세포를 사용하였다(C 및 F). 감염후 48시간 후, 상기 세포들을 고정시키고 마우스 항-ORF3 혈청(A, D 및 F) 또는 돼지 항-PCV2 혈청(B, C 및 E)으로 면역형광 염색하여 분석하였다. 스케일 바, 10 ㎛.

도 4는 재조합 PCV2 및 야생형 PCV2와 ORF3-결핍 PCV의 복제 동력학을 나타내는 그래프이다. PK15 세포를 표시한 바이러스로 MOI가 1이 되도록 하여 감염키고 표시한 시간 지점에서 회수하여, IFA를 통하여 1 밀리리터 당 TCID₅₀으로 감염 역가를 측정하였다.

도 5는 배양한 PK15 세포에서 PCV2에 의해 아폽토시스가 유도되었음을 확인한 도면이다. (A) DAPI 염색을 통하여 PCV2 감염된 PK15 세포에서 뉴클레오솜 DNA의 단편화를 확인하였다. PCV2 바이러스주 BJW로 감염된 세포를 감염후 48시간(a 및 b) 및 72시간(d 및 e) 후에 각각 PCV2에 대한 돼지 혈청을 사용하여 IFA로 검출하고, DAPI로 염색하였다. 중첩시킨 이미지를 c 및 f에 나타내었다.

도 6은 PCV2로 유도된 아폽토시스 세포를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (A) PCV2 바이러스주 BJW로 감염시킨 PK15 세포를 요오드화 프로피듐 염색하고 유세포 측정하여서 아폽토시스를 측정한 대표적인 그래프이다. 각 패널에, 저이배체(hypodiploid)(아폽토시스) DNA 함량을 갖는 PK15 세포의 비율을 나타내었다(M1). (B)는 (A)에 나타낸 실험을 3회 수행하여 아폽토시스의 평균 비율을 나타낸 그래프이다. (C)는 3회 시험 수행시 표시된 시간 지점에서, 떨어져 나간 세포의 평균 비율을 나타내는 그래프이다.

도 7은 형질감염된 세포에서 ORF3 단백질 단독으로 아폽토시스를 유도하는 것을 확인한 도면이다. (A) GFP-ORF3 플라스미드로 형질감염된 PK15 및 Cos-7 세포에서 24 시간 경에 ORF3의 발현(a 및 b)을 확인하였고, 각각 DAPI 염색하여 뉴클레오솜 DNA가 단편화(b 및 e)된 것을 확인하였다. 중첩된 이미지는 c 및 f에 나타내었다. 스케일 바, 10 ㎜. (B) ORF3 단백질에 의해 유도된 아폽토시스를 정량 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. DAPI 염색을 통한 핵 형태 분석을 통하여 3 회 실험의 평균 아폽토시스 세포 비율을 수치로 나타내었다. (C) (B)에 도시한 3 회 실험시 떨어져 나간 세포들의 평균 비율을 나타내는 그래프이다.

도 8 (A) 3개 실험군에서 서혜부 림프절의 조직 병리학적 실험을 수행한 결과 감염후 7 일 및 14 일 후 음성 대조군 및 mPCV2 군의 배중심에 밀집된 건강한 림프구 개체군을 확인하였다. 한편, 야생형 PCV2에서는 감염후 7 일후에 림프계 세포의 고갈과 함께 조직구의 염증성 침윤 징후가 나타났으며, 감염후 14 일 후에는 상당히 많은 수의 아폽토시스 세포(화살표)가 나타났다. HE, 스케일 바 = 200 ㎛. (B) 음성 대조구의 서혜부 림프절에는 PCV2 항체가 없는 것으로 나타난 반면, 감염후 14 일 후 돌연변이형 PCV2 및 야생형 PVC2에서는 다량의 PCV2 항체가 림프구의 세포질 내에서 확인되었다(진갈색으로 염색됨). 면역조직화학법으로, 메틸 그린으로 대비염색하였다. 스케일 바 = 200 ㎛.

도 9는 PCV2 바이러스 게놈의 서열 정보를 나타내는 도면이다.

도 10은 ORF3의 돌연변이 위치를 나타내는 도면이다. 돌연변이체 27은 Ala 이 중지 코돈으로 바뀌어서 절두형의 26 아미노산 ORF3 단백질이 발현된다. 돌연변이체 52 및 61은 각각 His⁺이 Asp^-로 바뀌고, Glu^-가 Lys⁺으로 바뀌어서 아미노산의 전하가 반전되었다. 돌연변이체 85는 His⁺이 Tyr으로 바뀌어서 양전하를 상실하였다. 상기 돌연변이형 바이러스 게놈들로 PK15 세포를 형질 감염시키고 5일간 성장시켰다. 5일 후, 세포들을 회수하고 3회의 동결-해동법을 수행하여 용해시켰다. 전체 세포 용해물을 이후 새로운 PK15 세포를 감염시키는데 사용하였다.

도 11은 세포 배양 5 계대 후 4 일경에 PCV2 및 돌연변이체로 형질감염된 세포의 아폽토시스로 인하여 세포 사멸이 야기됨을 확인한 결과를 나타내는 도면이다. ORF3의 ATG 출발 코돈의 돌연변이 및 결실로 생성된 돌연변이체, 돌연변이체 27 및 61은 돌연변이체 52, 85 및 PCV2에 대한 세포 사멸율이 70%∼90%인 것과 대조적으로 그 세포 사멸율이 10%였다.

도 12는 ORF3 돌연변이체 27의 DNA 서열을 나타내는 도면이다. 돌연변이 지점은 소문자로 나타내었다.

도 13은 ORF3 돌연변이체 52의 DNA 서열을 나타내는 도면이다. 돌연변이 지점은 소문자로 나타내었다.

도 14는 ORF3 돌연변이체 61의 DNA 서열을 나타내는 도면이다. 돌연변이 지점은 소문자로 나타내었다.

도 15는 ORF3 돌연변이체 85의 DNA 서열을 나타내는 도면이다. 돌연변이 지점은 소문자로 나타내었다.

도 16은 ORF3 이중 돌연변이체 ATG & 27의 DNA 서열을 나타내는 도면이다. 돌연변이 지점은 소문자로 나타내었다.

도 17은 ORF3 이중 돌연변이체 ATG & 61의 DNA 서열을 나타내는 도면이다. 돌연변이 지점은 소문자로 나타내었다.

도 18은 ORF3 삼중 돌연변이체 ATG, 27 & 61의 DNA 서열을 나타내는 도면이다. 돌연변이 지점은 소문자로 나타내었다.

약독화 바이러스

본 발명은 적어도 부분적으로 비정상 ORF3의 발현으로 인하여 약독화된 면역원성 약독화 PCV2 바이러스를 제공한다.

본 발명의 약독화 바이러스는 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성이다. 상기 약독화 바이러스는 이하에 기술하는 바와 같이 야생형 PCV2 바이러스에 의해 수반되는 공격에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물에서 사용할 수 있다.

본 발명의 바이러스는 면역 반응을 유도할 수 있고 감염성인 한편 면역화된 숙주에서 PMWS(또는 PCV2에 의해 유발될 수 있는 기타 임의 질병)의 허용불가한 증상을 일으키지 않도록 충분하게 약독화시킨 것이다. 일 구체예에서, 상기 바이러스는 대부분의 면역화된 개체에 감염 증상을 일으키지 않도록 충분하게 약독화시킨다.

이러한 약독화는 적어도 부분적으로 비정상 ORF3 발현에 기인하는 것이다. 따라서, 본 발명의 바이러스는 아폽토시스 유도능이 저하되거나 결여되어 있다. 일 구체예예서, 약독화는 전체적으로 비정상 ORF3 발현에 의한 것이다.

불명료함을 방지하기 위하여, 본 발명에서 사용하는 용어 "저하된(reduced)"은 문맥에서 분명하게 달리 언급하지 않으면 용어 결여된(absent)을 포함한다.

일 구체예에서, 비정상 ORF3 발현은 정성적이다. 따라서, ORF3로부터 발현되는 단백질은, 예컨대 야생형 ORF3 단백질과 비교하여 기능이 저하되거나 결여될 수 있다.

"기능 저하 또는 결여"에는 ORF3 단백질이 야생형 ORF3 단백질과 비교하여, 아폽토시스 유도능이 저하되거나 결여된 단백질로 암호화되는 결과가 초래되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우가 포함된다.

일 구체예에서, 비정상 ORF3 발현은 정량적이다. 따라서, 야생형, 병원성 PCV2와 비교하여 ORF3로부터의 단백질 발현이 저하되거나 결여될 수 있다.

일 구체예에서, 비정상 ORF3 발현은 정성적이고 정량적일 수 있는데, 즉, ORF3 단백질이 야생형 ORF3 단백질에 비하여 기능이 저하되거나 결여되어 있고 ORF3 단백질의 발현량이 야생형 PCV2 바이러스에 의한 ORF3 단백질 발현량보다 적다.

일 구체예에서, 상기 ORF3 서열에는 돌연변이가 존재한다.

일 구체예에서, 상기 ORF3 서열에는 이중 돌연변이가 존재한다.

일 구체예에서, 상기 ORF3 서열에는 삼중 돌연변이가 존재한다.

일 구체예에서, ORF3 발현에 영향을 미치는 바이러스의 다른 영역(즉, ORF3 이외의 영역)에 돌연변이가 존재한다.

본 발명의 바이러스의 돌연변이(들)는 바이러스 복제는 여전히 일어나도록 존재해야 한다.

일 구체예에서, 상기 돌연변이는 기능성 ORF1은 여전히 생산되도록 존재해야 하는데, 즉, ORF1이 암호화하는 단백질은 이의 복제 역할을 수행할 수 있어야 한다. 다른 구체예에서, ORF3 서열의 돌연변이는 ORF1이 암호화하는 단백질에 어떠한 변화도 일어나지 않도록 존재해야 한다.

일 구체예에서, ORF3의 출발 코돈은 비기능성이 되도록 돌연변이된다. ORF3의 출발 코돈 ATG는, 예컨대 A가 G로 치환되도록 돌연변이시킬 수 있는데, 즉, 출발 코돈 ATG를 GTG로 돌연변이시킨다. 이러한 돌연변이는 유전 코드의 축퇴성(degeneracy)에 의하여, ORF1이 암호화하는 단백질에 어떠한 변화도 일으키지 않는 장점이 있다.

일 구체예에서, ORF3의 알라닌을 중지 코돈으로 치환하여 26개 아미노산으로 이루어진 비기능성 절두형 ORF3 단백질을 생산할 수 있다.

일 구체예에서, 단백질의 알파 영역 내에서 선택한 아미노산의 정전하가 반전되거나 중성화되어서 그 최종 단백질이 폴딩하지 않고 비기능성이 되도록 ORF3의 아미노산 서열을 치환한다. 하나의 돌연변이체에서, 아미노산 61의 글루타민^-을 라이신⁺으로 바꾼다.

이하의 실시예 부분에서 기술하는 바와 같이, 이러한 돌연변이체는 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Strategene)를 사용하여, PCV2 클론의 게놈에 특정 돌연변이를 도입하여 생산한다. 돌연변이체 플라스미드는 제조자의 지침서에 따라서 돌연변이 유발 프라이머 세트로 생성시켰다 (전방향 프라이머 : 5'-GGGATGGTTACCACGGTGAAGTGGTTGTTA-3', 역방향 프라이머 : 5'-TAACAACCACTTCTTCACCGTGGTAACCATCCC-3'). 이 돌연변이[(nt 671) 도 1B에서 두꺼운 글자로 표시함)는 상기 위치에서 ORF1 단백질의 아미노산을 변경시키지는 않았지만, ORF3 단백질의 발현을 중지시킨다.

본 발명에서 사용한 돌연변이의 예로는 중지 코돈의 도입; 재배열; 치환 돌연변이(예를 들어, 미스센스 및 넌센스 돌연변이); 결실 돌연변이(하나 이상의 뉴클레오티드 결실 또는 하나 이상의 코돈 결실); 프레임 시프트 돌연변이; 및 삽입(하나 이상의 뉴클레오티드 삽입 또는 하나 이상의 코돈 삽입) 등이 포함된다. 돌연변이를 도입시키는 방법은 당 분야에서 공지이며 당업자라면 용이하게 수행할 수 있다. 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발법으로 하나 이상의 뉴클레오티드를 부가하거나 결실시키거나 변화시킬 수 있다.

ORF3 기능/발현에 대한 돌연변이의 효과는 예컨대 이하 재료 및 방법에 기술하는 아폽토시스 분석법 등을 이용하여 측정할 수 있다.

일 구체예에서, ORF1 단백질에 대한 돌연변이는 침묵 돌연변이(즉, ORF1 기능에 치명적인 영향이 없는 돌연변이이며 일 구체예에서는 ORF1 기능에 영향이 없는 것이다)이다.

또한, 바이러스에서 ORF3 기능이 비정상적으로 되는 하나 이상의 돌연변이가 존재하는 것 이외에도, 바이러스에 선택적으로 하나 이상의 돌연변이가 더 존재할 수 있다. 예컨대, 이러한 돌연변이는 상기 기술한 임의 유형의 돌연변이, 예컨대 결실 돌연변이일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 바이러스는 PCV2에 대한 면역 반응을 유도하는 능력을 손상시키는 임의 변화를 게놈 내에 포함하지 않는다.

일 구체예에서, 상기 바이러스는 암호화된 ORF2 단백질에 변화를 초래하게 되는 임의 변화를 ORF2 서열 내에 포함하지 않는다.

일 구체예에서, 상기 바이러스는 암호화된 ORF1 단백질에 변화를 변화를 초래하게 되는 임의 변화를 ORF1 서열 내에 포함하지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 PCV2는 비정상 ORF3 발현을 야기하는 하나 이상의 돌연변이가 바이러스 내에 도입된 것을 제외하고는 야생형(병원성) PCV2 바이러스와 다르지 않거나, 또는 실질적으로 다르지 않다.

본 발명의 PCV2 바이러스는 일 구체예에서 단리형으로 제공된다. 단리되었다는 것은 야생형 바이러스의 천연적인 환경이외에서 존재하는 PCV2를 의미하는 것이다. 예를 들어, 상기 바이러스는 세포 배양물 또는 바이러스가 증식할 수 있는 제어된 환경으로 특징되는 기타 인공 배지의 일 성분이거나; 세포 배양 상등물의 일 성분이거나; 약학 조성물의 일 성분이거나; 천연 환경으로부터 부분적으로 또는 완전하게 정제된 것일 수 있다.

상기 설명부는 본 발명의 약독화 바이러스에 관련된 것이며, 상기 중 일부는 또한 본 발명의 핵산 분자 등(이하 참조) 본 발명의 다른 적절한 측면들에 관한 것이기도 하다.

백신

본 발명은 본 발명의 바이러스를 포함하는 백신을 제공한다. 이 조성물은 수의학 또는 약학 분야의 당업자에게 공지인 표준법에 따라서 제조할 수 있다.

본 발명의 백신은 상기 바이러스의 면역학적 유효량을 포함한다. 본 발명에서 기술한 바와 같이 생산한 PCV2의 면역학적 유효량으로 백신 접종한 결과에 따르면, 개체는 적어도 부분적으로 또는 완전하게 PCV2 감염에 면역화되거나, 진행 중인 중간 정도의 PCV2 감염 또는 심각한 PCV2 감염에 내성을 갖게 된다. 본 발명의 바이러스는 체액성 반응 및 세포성 반응을 유도시키는데 사용할 수 있다.

바람직하게, 상기 개체는 PMWS의 모든 역생리학적 증상 또는 영향에 대한 것이 상당하게 저하, 경감 또는 완전하게 예방되는 정도로 보호된다.

실질적으로, 면역학적 유효 용량에 요구되는 정량은 개체의 연령 및 건강 상태, 제형의 성질 및 투여 방식 등의 인자들에 따라서 개체마다 다양할 수 있다. 따라서, 정확한 "유효량"을 특정하는 것은 불가능하다. 그러나, 어떤 주어진 경우에서, 당분야의 당업자라면 일상적인 실험만을 이용하여 적절한 "유효량"을 결정할 수 있을 것이다.

예를 들어, 돼지의 체중, 항원 농도 및 기타 통상의 인자들을 기초로 최소 유효 용량을 확인하기 위하여 활성 항원성 제제의 적절한 용량을 측정하거나 적정하기 위한 방법들은 당분야에서 공지이다. 적절한 면역원성 반응을 유도하는, 조성물(들)의 용량, 이에 존재하는 성분들의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기 등은 혈청의 항체 적정법 등, 예컨대 ELISA 및/또는 혈청중화 분석법 및/또는 돼지 내 백신접종 대항(vaccination challenge) 평가 등의 방법을 통해 측정할 수 있다.

본 발명의 백신은 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 어구 "약학적 허용(pharmaceutically acceptable)"은 생리적으로 내성이고 대체로 알레르기 반응이나 이와 유사한 부적합한 반응, 예컨대 위장 전도, 어지러움 증 등이 일어나지 않는 분자물 및 조성물 등을 의미한다. 유용한 담체는 당분야에서 공지이며, 예컨대 물, 완충제, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신, 히아루론산 등이 포함된다.

본 발명의 일 구체예에서, 백신은 보조제를 포함한다. 상기 보조제는 백신에 대한 개체(예컨대, 돼지)의 면역학적 반응을 증가시키는 물질이다. 적절한 보조제는 이에 제한되는 것은 아니며, 예컨대 수산화알루미늄(alum), 면역자극 복합체(ISCOMS), 비이온성 블록 중합체 또는 공중합체, 사이토카인(예컨대, IL-1, IL-2, IL-7, IFN-α, IFN-β, IFNP-γ 등), 사포닌, 모노인지질 A(MLA), 뮤라밀 디펩티드(MDP) 등이 포함된다. 기타 적합한 보조제로는, 예컨대 황산알루미늄칼륨, 대장균에서 분리한 이열성 또는 내열성 장독소, 콜레라 독소 또는 이의 B 서브유닛, 디프테리아 독소, 파상풍 독소, 백일해 독소, 프로인트 완전 또는 불완전 보조제 등이 포함된다. 독소를 주성분으로 하는 보조제, 예컨대 디프테리아 독소, 파상풍 독소 및 백일해 독소는 사용전에 예컨대 포름알데하이드 등을 처리하여 불활성화시킬 수 있다.

일 구체예에서, 하나 이상의 추가 병원체, 예를 들어 돼지 병원체 예컨대 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아, 악티노바실러스 플루로뉴모니아, 대장균, 보르데텔라 브론키셉티카, 파스퇴렐라 멀토시다, 에리시펠로트릭스 루시오파티아, 가성공수병, 돼지 콜레라, 돼지 인플루엔자 및 돼지 파보바이러스(PPV) 등에서 하나 이상의 면역원을 추가로 포함하는 백신을 제공한다. 상기 추가 병원체 중의 면역원은 본 발명에 따른 바이러스의 게놈 내에 포함시키거나 또는 본 발명에 따른 백신 조성물 내에 개별 부분으로 존재할 수 있다.

본 발명에 따라 생산된 PCV2는 다른 PCV2 바이러스주 등의 바이러스와 조합할 수 있다. 다르게는, 하나의 바이러스에 복수 유형의 보호성 에피토프가 존재하도록 유전자 조작할 수 있다. 이러한 기술은 당분야에서 공지이며 당업자가 용이하게 수행할 수 있다.

본 발명의 백신은 비내 투여, 경피 투여(즉, 전신 흡수를 위해 피부 표면에 또는 피부 표면 위에 적용함), 비경구 투여 등으로 편리하게 투여할 수 있다. 비경구 투여 경로는 예컨대 근육내, 정맥내, 복강내, 피내(즉, 피하 주사하거나 아니면 피하에 위치시킴) 등의 경로가 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 백신은 상기 언급한 경로 중 어느 하나를 통해 투여할 수 있도록 조절할 수 있다.

액상으로 투여하는 경우, 본 발명의 백신은 수용액제, 시럽, 엘릭시르, 팅크제 등의 형태로 제조할 수 있다. 이러한 제형들은 당분야에서 공지이며 적절한 담체 또는 용매계에 항원 및 기타 통상의 첨가제를 용해시켜서 제조한다. 약학적 허용 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 탈염수 또는 증류수; 염수액; 식물성 오일 예컨대 땅콩유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수유, 깨유, 낙화생유 또는 코코넛유; 폴리실록산, 예컨대 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리솔폭산을 비롯한 실리콘유; 휘발성 실리콘; 미네랄유, 예컨대 액상 파라핀, 연성 파라핀 또는 스쿠알란; 셀룰로스 유도체, 예컨대 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스. 카르복시메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스; 저급 알칸올, 예컨대 에탄올 또는 이소프로판올; 저급 알알칸올; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 에컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르 예컨대 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올레에이트; 폴리비닐피리돈; 한천; 카라기난; 트라가칸트 검 또는 아카시아 검, 및 바세린 등이 있다. 대체로, 담체 또는 담체들은 조성물의 10 중량%∼99.9 중량%를 형성하며 당분야에서 공지인 시약들, 예컨대 인산수소나트륨, 인산2수소나트륨, 인산수소칼륨, 인산2수소칼륨, 이의 혼합물 등을 이용한 통상의 방법으로 완충시킬 수 있다.

액상 제형은 또한 기타 표준 공배합체들과 조합된 현탁제 또는 유화제를 포함하는 현탁액 및 에멀션을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 액상 제형은 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 현탁액은 콜로이드 밀을 이용하여 제조할 수 있다. 에멀션은 예를 들어, 호모게나이저를 이용하여 제조할 수 있다.

대체로, 본 발명의 백신은 바이러스 현탁액과 안정화제를 포함한다.

본 발명의 백신은 단독 투여량 또는 반복 투여량으로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신은 단독으로 투여하거나, 하나 이상의 추가 조성물(예를 들어, 다른 돼지 면역원성 조성물 또는 백신 조성물)과 동시에(즉, 같이 동일 시기에) 또는 순차적으로(즉, 다른 시기에) 투여할 수 있다. 조성물을 다른 시기에(즉, 순차적으로) 투여하는 경우, 각 투여는 서로 개별적으로 하거나 시기를 일부 일치시켜서 투여할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 바이러스의 단독 투여량으로 개체를 면역화시킨다.

일 구체예에서, 본 발명의 PCV2를 포함하는 백신 조성물은 PCV2에 감염되기 쉽거나 아니면 PCV2 감염 위험성이 있는 개체에게 투여하여 이 개체의 면역 반응력을 증강시킨다.

상기 백신이 투여되는 개체는 일 구체예에서, 돼지이다. 그러나, 상기 개체는 개체 내 바이러스에 대한 면역 반응을 유도시키는 것이 요구되는 어떠한 동물(예컨대, 포유 동물)도 될 수 있다. 상기 동물은 PCV2 또는 이와 밀접하게 관련된 바이러스에 의해 감염되기 쉬운 동물일 수 있다.

일반적으로 상기 개체가 돼지로 예측될 수 있지만, 다른 유형의 동물에게 본 발명의 백신을 투여하는 것이 요구될 수도 있다. 예를 들어, 돼지용 백신의 개발이나 실제 사용할 목적으로 상기 백신의 성능을 평가하기 위하여 "시험(test)" 동물에게 본 발명의 백신을 투여할 수 있다.

바람직하게, 상기 백신은 PCV2 바이러스에 노출된 적이 없는 개체에게 투여한다.

일 구체예에서, 상기 개체는 이유후 전신 소모성 증후군(PMWS)에 대한 백신 접종이 요구되는 돼지이다.

상기 백신은 성돈을 비롯하여, 자돈 또는 임신한 암컷 돼지에게 투여하는데 유용하다. 임신한 암컷 돼지에 대한 백신 접종을 통해 새로 태어나는 돼지에게 수동 면역력(모계 항체)을 부여하는 것이 가능하게 된다. 일 구체예에서, 상기 돼지는 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1주령 이하이다.

일 구체예에서, 상기 돼지는 내지 1주령 내지 6주령; 2 내지 5주령; 또는 3 내지 4주령인 것이다.

바이러스의 생산

본 발명의 일 측면은 본 발명의 약독화 PCV2를 생산하기 위한 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 바이러스를 생산하는데 광범위하고 다양한 숙주 세포가 유용할 수 있으며 돼지 세포 예컨대 돼지 신장 세포, 예를 들어 PK15 세포를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 약독화 PCV2의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 약독화 PCV2의 생산이 가능하도록 적절한 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 배양 배지에서 약독화 PCV2를 단리하는 단계를 더 포함하고 선택적으로 상기 약독화 PCV를 처리하는 단계를 더 포함한다.

숙주 세포에 적절한 성장 조건은 당분야의 당업자에게 공지이며 당업자가 용이하게 결정할 수 있는데 특히, 적절한 영양 물질 조건을 선택하는 것이 포함된다. 일 구체예에서, 상기 배양 배지는 적어도, 물, 염류, 영양 물질, 필수 아미노산, 비타민 및 항생제를 포함하며, 또한 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다.

아폽토시스 유도가능한 단백질

본 발명의 제10 측면은 아폽토시스 유도가능한 단백질을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 단백질은 서열 번호 1에 기재된 하기 아미노산 서열을 포함한다. MVTIPPLVSRWFPVCGFRVCKISSPFAFTTTRWPHNDVYIRLPITLLHFPAHFQKFSQPAEISDKRYRVLLCNGHQTPALQQGTHSSRQVTPLSLRSRSSTFYQ.

일 구체예에서, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공한다.

본 발명의 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어진 단백질의 기능적 동등물, 변형체, 활성 단편 및 융합 단백질을 포함한다. 확실하게는, 다음의 것들이 본 발명의 범주에 포함된다. 즉, 융합 단백질 및 활성 단편의 기능적 동등물; 융합 단백질 및 기능적 동등물의 활성 단편; 및 기능적 동등물 또는 활성 단편을 포함하는 융합 단백질 등이다.

용어 "단편"은 구성 성분을 암호화하거나 전체 길이 단백질의 구성 성분인 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 폴리펩티드의 측면에서 단편은 전체 길이 단편과 동일하게 정성적인 생물학적 활성을 보유하는 것이다. 본 발명에 따라 사용되는 생물학적 활성 단편은 상응하는 전체 길이 단백질 활성의 약 50% 이상, 보다 구체적으로는 상기 활성의 약 60% 이상, 더욱 구체적으로는 상기 활성의 약 70%이상, 보다 구체적으로는 상기 활성의 약 80% 이상, 보다 구체적으로 상기 활성의 약 90% 이상, 보다 구체적으로 상기 활성의 약 95% 이상을 보유할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "변형체(variant)"는 실질적으로 유사한 분자를 의미한다. 일반적으로 핵산 서열 변형체는 공통으로 정성적 생물학적 활성을 보유한 폴리펩티드를 암호화한다. 일반적으로, 폴리펩티드 서열 변형체도 또한 정성적 생물학적 활성을 공통으로 보유한다. 또한, 이들 폴리펩티드 변형체는 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 82% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.

본 발명의 제8 측면의 기능적 동등물, 활성 단편 및 융합 단백질은 아폽토시스를 유도하는 야생형 ORF3 단백질(서열 번호 1)의 아폽토시스 유도능을 보유한다. 아폽토시스 활성은, 예컨대 이하의 재료 및 방법 부분에서 기술하는 아폽토시스 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 그러나, 당분야의 당업자는 아폽토시스 활성을 분석하기 위한 대안적인 방법이나 추가적인 방법 또는 수단을 고안할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 예컨대 단독 또는 복수의 아미노산 치환(들), 부가(들), 삽입(들) 및/또는 결실(들) 및/또는 화학적 변형 아미노산의 치환들을 포함하는 서열 번호 1의 기능적 동등물을 제공한다. 그러나, 상기에 언급한 바와 같이, 이러한 기능적 동등물은 아폽토시스 유도능을 보유한다.

본 발명의 상기 측면에 따른 기능적으로 동등한 단백질은 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열과의 서열 동일성이 65% 이상이다.

단백질의 서열 동일성을 측정하는 방법은 당업계에서 공지이며 본 발명에서, 서열 동일성은 아미노산 동일성(종종 "하드 상동성(hard homology")이라함)을 기초로 산출한 것임을 당분야의 당업자라면 이해할 수 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 서열 동일성을 산출하는데 사용할 수 있는 BESTFIT 프로그램(예컨대 이의 디폴트 셋팅에 사용함)을 제공한다(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). PILEUP 및 BLAST 알고리즘을 서열 상동성을 산출하거나 서열을 정렬하기 위해 사용할 수 있는데(통상 서열 디폴트 셋팅에 사용), 예컨대 다음의 문헌 [Altschul S. F. (1993) J MoI Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J MoI Biol 215:403]에 기술된 바와 같다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 인터넷을 통한 월드 와이드 웹 사이트, 예컨대 "www.ncbi.nlm.nih.gov/"상의 국립 생명공학 정보 센터에서 공공 입수가능하다. 상기 알고리즘은 우선 데이타베이스 서열에서 동일한 길이의 단어를 정렬하였을 때 일정한 포지티브 값의 한계치 점수 T를 만족하거나 이 점수 T와 일치하는 문제 서열 중 길이 W인 짧은 단어들을 확인하여서 높은 점수의 서열쌍(HSPs)을 확인하는 단계를 포함한다. T는 이웃하는 단어 점수 한계치의 의미이다(Altschul et al, supra). 이러한 초기의 이웃하는 단어의 일치도가 이들을 포함하는 HSPs를 찾기 위헤 탐색을 개시하기 위한 기초 정보로 작용한다. 단어 일치도는 축적된 배열 점수가 증가하는 한 각 서열을 따라서 양 방향으로 확장된다. 확장은 두 가닥에 대해 이루어진다. 상기 BLAST 알고리즘은 두 서열간의 유사성을 통계적으로 분석하여 수행된다. 예컨대, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Nad. Acad. Sci. USA 90: 5873]을 참조한다. BLAST 알고리즘으로 제공되는 유사성 측정법 중 하나는 가장 작은 확률의 합(P(N))으로서, 서로 치환된 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 일치시켜서 확률 값을 제시하는 것이다.

일 구체예에서, 본 발명의 상기 측면에 따른 기능적으로 동등한 단백질은 서열 번호 1에 기재한 단백질 또는 이의 단편과의 서열 동일성이 65% 이상으로 나타난다. 상기 단백질은 서열 동일성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이다.

따라서 본 발명에 따른 기능적으로 동등한 단백질은 돌연변이체(예컨대 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 돌연변이체)를 포함시키고자 한다. 이러한 돌연변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 아미노산 잔기 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산)로 치환된 단백질을 포함할 수 있으며 이러한 치환된 아미노산 잔기(들)는 유전 코드로 암호화되거나 유전 코드로 암호화되지 않는 것일 수도 있다. 통상 이러한 치환은 Ala, VaI, Leu 및 Ile 중에서; Ser 및 Thr 중에서; 산성 잔기 Asp 및 Glu 중에서; Asn 및 Gln 중에서; 염기성 잔기 Lys 및 Arg 중에서; 또는 방향족 잔기 Phe 및 Tyr 중에서 이루어진다.

특히 바람직한 단백질은 몇몇, 즉, 5 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 1 내지 2 또는 단지 1개의 아미노산이 임의 조합으로 치환, 결실 또는 부가된 것이다. 특히 바람직한 것은 단백질의 특성 및 활성을 변경시키지 않는 침묵 치환, 부가 및 결실이다. 또한 이러한 관점에서 바람직한 것은 보존적 치환이다. "돌연변이체" 단백질은 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 단백질을 포함한다.

본 발명의 이러한 범주에 포함되는 것은 또한, 활성 단편이며, 여기서 "활성 단편"은 아폽토시스를 유도하는 야생형 ORF3 단백질(서열 번호 1)의 능력을 보유한 절두형 단백질을 의미한다.

본 발명의 활성 단편은 본 발명의 단백질(예를 들어, 서열 번호 1 또는 이의 기능적 동등물)로부터 적어도 n개의 연속적인 아미노산을 포함한다. n은 통상 50, 75, 85, 90, 95 또는 100 또는 그 이상이다.

일 구체예에서, 상기 활성 단편은 서열 번호 1 또는 이의 기능적 동등물의 서열의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상을 포함한다.

이러한 단편은 "프리-스탠딩(free-standing)", 즉, 다른 아미노산이나 단백질에 융합되거나 일부가 아니거나, 또는 이러한 단편은 이들이 일부분이나 영역을 형성하는 보다 큰 단백질 내에 포함된다. 보다 큰 단백질 내에 포함된 경우, 본 발명의 상기 단편은 일 구체예에서 단일한 연속 영역을 형성한다. 또한, 몇몇 단편들은 단일한 보다 큰 단백질 내에 포함될 수도 있다.

본 발명의 일 구체예에서 펩티드 또는 다른 단백질, 예를 들어, 생활성, 방사성, 효소 또는 형광성의 라벨, 또는 항체 등에 융합된 본 발명의 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

예를 들어, 재조합 생산 중에, 예컨대 단백질에 보다 높은 안정성을 부여하는 서열, 정제에 도움이 되는 서열, 프로-서열, 리더 서열 또는 분비 서열 등을 포함하는 하나 이상의 부가적인 아미노산 서열을 포함하는 것이 대개는 이롭다. 대안적으로 또는 부가적으로, 성숙 단백질을 다른 화합물, 예컨대 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 융합시킬 수도 있다.

본 발명의 제10 측면의 단백질을 암호화하는 핵산 분자

본 발명의 제11 측면은 본 발명의 제10 측면의 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

일 구체예에서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 2에 기재한 서열을 포함하는 핵산 분자 이다.

일 구체예에서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 2에 기재한 서열로 이루어진다.

유전 코드의 축퇴성(degeneracy)의 결과로, 본 발명의 제8 측면의 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 복수성(multitude)으로 인해, 생산된 일부 핵산 분자는 서열 번호 2와 최소의 서열 동일성을 보유할 수 있다는 것을 당분야의 당업자라면 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 가능한 코돈 선택 범위들을 기초로 한 조합들을 선별하여 만들 수 있는 각각의 그리고 모든 가능한 폴리뉴클레오티드 서열의 변형을 고려한다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열 번호 2의 축퇴형을 포함하는 핵산 분자, 즉, 서열 번호 2의 하나 이상의 코돈이 서열 번호 2의 본래 코돈과 동일한 아미노산을 암호화하는 축퇴성 코돈으로 치환된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 핵산 분자는 예를 들어, 클로닝하여 얻거나 또는 합성적으로 생산된 게놈 DNA 및 cDNA을 비롯한 DNA 형태이거나, 예컨대 mRNA 등의 RNA 형태일 수 있다. DNA는 이중 가닥이거나 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥 DNA 또는 RNA는 센스 가닥이라고도 하는, 코딩 가닥일 수 있으며, 또는 안티센스 가닥이라고도 하는 비코딩 가닥일 수 있다.

용어 "핵산 분자"(및 유사 표현으로는 "핵산", "핵산 서열" 등)는 또한, DNA 및 RNA의 유사체, 예컨대 변형 골격을 함유하는 것들을 포함한다.

통상, 본 발명의 핵산 분자는 그 범주 내에 상기 핵산 서열의 기능적 동등물 또는 단편을 포함하는데, 여기서 상기 기능적 동등물 또는 단편은 아폽토시스를 유도하는 야생형 ORF3 단백질의 능력을 보유한 단백질을 암호화한다. 이러한 기능적 동등물 및 단편은 과도한 시도 및 실험없이 분자 생물학적인 표준 방법을 이용하여 확인하고 분리할 수 있다.

기능적 동등물은 서열 번호 2의 서열과 상동성이거나, 또는 아폽토시스 유도능을 보유하는 단백질을 암호화하는 유전 코드의 축퇴성 내에서 상기 서열 번호 2에 상응하는 서열과 상동성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 2에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 아폽토시스 유도능을 보유하는 단백질을 암호화하면서 유전 코드의 축퇴성 내에서 서열 번호 2에 상응하는 뉴클레오티드 서열과의 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 서열을 포함한다.

두 핵산 서열 간의 상동성 정도는 GCG 프로그램 패키지에서 제공되는 GAP과 같은 당분야에서 공지인 컴퓨터 프로그램을 통해 측정할 수 있다(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). DNA 서열 비교에 대하여 다음과 같이 설정한 GAP을 이용할 수 있는데, GAP 작성 패널티(creation penalty)는 5.0로 설정하고 GAP 확장 패널티는 0.3으로 설정한다.

예컨대 GAP 작성 패널티 5 및 GAP 너비 패널티 0.3으로 디폴트 설정하여서, GCG 프로그래 패키지 일부로 이용가능한 파일업 얼라인먼트 소프트웨어를 사용하여 핵산 분자들을 각각 서로에 대하여 정렬시킬 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 또한 그 범주 내에 서열 번호 2로 정의되는 핵산 서열, 또는 유전 코드의 축퇴성 내에서 이에 상응하는 서열과, 저엄격 조건하에서, 보다 바람직하게는 중급 엄격 조건하에서, 보다 더욱 바람직하게는 고엄격 조건하에서 혼성화가능한 기능적 동등물을 포함한다. 저엄격 혼성화 조건은 2×SSC 내 50℃에서 수행하는 혼성화에 해당할 수 있다.

주어진 핵산 분자와 특정 핵산의 혼성화 유무를 확인하기 위해 적절한 실험 조건은 Sambrook 등의 문헌 [1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour, New York]에 기재된 혼성화 방법에 따라서, 실험하고자 하는 핵산에 상응하는 시료를 포함하는 필터를 10분간 5×SSC에 예비 함침시키고, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/mL의 변성 초음파처리 연어 정자 DNA로 이루어진 용액에서 상기 필터를 예비혼성화시킨 후, 10 ng/mL 농도의 ³²P-dCTP-표시된 프로브가 함유된 상기와 동일한 용액 내에서 12시간 동안 대략 45℃의 온도에서 혼성화시키는 것을 포함한다.

이어서 상기 필터를 2×SSC, 0.5% SDS를 이용하여 55℃ 이상(저엄격 조건), 60℃ 이상 (중급 엄격 조건), 65℃ 이상 (중/고 엄격 조건), 70℃ 이상(고엄격 조건) 또는 75℃ 이상(초고 엄격 조건)의 온도에서 30분간 2회 세척한다. 혼성화는 상기 필터를 X-선 필름에 노광시켜서 검출할 수 있다.

또한, 혼성화의 엄격성을 변경하기 위하여 적용할 수 있는 다양한 조건 및 인자들이 존재하며, 이는 당분야의 당업자에게 공지이다. 예컨대, 특정 핵산과 혼성화시키고자 하는 핵산의 길이 및 성질(DNA, RNA, 염기 조성 등); 염류 및 기타 성분의 농도, 예를 들어, 포름아미드, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜 등의 존재 여부; 및 혼성화 및/또는 세척 단계의 온도 변경 등이다.

또한, 일정한 특정 조건하에서 소정의 두 핵산 서열이 혼성화가능한가에 대하여 이론적으로 예측하는 것이 가능하다. 따라서, 상기 기재한 경험적 방법의 대안법으로서, 변형 핵산 서열과 서열 번호 2에서 정의한 핵산 분자, 또는 유전 코드의 축퇴성 내에서 서열 번호 2의 서열에 상응하는 서열의 혼성화 유무에 대한 확인법은 특정 조건, 예컨대 특정 염 농도 및 온도 하에서 기지의 서열을 갖는 2개의 이형성 핵산 서열이 혼성화하게 되는 이론적으로 산출한 T_m(융점)을 기초로 할 수 있다.

이형성 핵산 서열에 대한 융점(T_m(hetero))을 결정하는 방법은, 우선 상동성 핵산 서열에 대한 융점(T_m(homo))을 결정하는 것이 필수적이다. 완전하게 상보적인 두 핵산 가닥(호모듀플렉스 형성) 사이의 융점(T_m(homo))은 문헌 [Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1995]에 요약되어 있는 바와 같이, 다음의 식: T_m(homo) = 81.5℃ + 16.6(logM) + 0.41(%GC) - 0.61(%form)- 500/L에 따라서 결정할 수 있다.

상기 식에서, M은 1가 양이온의 몰농도를 나타낸다. %GC는 서열 중 염기 총수 중 구아닌(G) 및 사이토신(C)의 비율(%)이고, %form은 혼성화 완충액 내의 포름아미드 비율이며, L은 핵산 서열의 길이이다.

상기 식으로 결정된 T_m은 완전하게 상보적인 두 핵산 서열 간의 호모듀플렉스 형성의 T_m(T_m(homo))이다. 2개의 이형성 핵산 서열의 T_m 값에 상기 T_m 값을 조정하기 위하여 두 이형성 서열간 핵산 서열의 1% 상이함은 Tm의 1℃ 저하와 동일한 것으로 간주한다. 따라서, 헤테로듀플렉스 형성에 대한 T_m(hetero)는 확인하고자 하는 유사 서열과 상기 기술한 뉴클레오티드 프로브 사이의 상동성 % 편차를 Tm(homo)에서 감하여 얻는다.

돌연변이형 핵산 분자

본 발명의 제12 측면은 본 발명의 제11 측면에 따른 핵산 분자의 돌연변이형을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자는 본 발명의 제9 측면의 핵산 분자가 암호화하는 단백질의 발현이 비정상적이 되도록 돌연변이된다.

본 발명의 본 측면에 있어서, 상기 "약독화 바이러스" 부분의 관련 부분을 참조하다. 그러나, 강조하건데, 본 발명의 제12 측면의 핵산 분자는 바이러스의 형태로 제공될 뿐만 아니라, 다른 형태, 예컨대 핵산 분자 자체, 벡터 등으로도 제공되며, 따라서 상기 "약독화 바이러스"의 관련 부분에 필요한 변경을 가하여 바이러스 이외의 형태로 본 발명의 제12 측면의 핵산 분자를 제공하는데 적용한다.

"본 발명의 제9 측면의 핵산 분자가 암호화하는 단백질의 비정상적인 발현"에서, 중요한 것은 (i) (본 발명의 제11 측면의 핵산 분자와 비교하여) 돌연변이된 핵산 분자로부터 저하 또는 결여 단백질이 발현되는 경우; 및 (ii) (본 발명의 제11 측면의 핵산 분자가 암호화하는 단백질과 비교하여) 돌연변이된 핵산 분자에 의해 발현되는 단백질의 아폽토시스 기능이 저하 또는 결여된 경우를 포함한다는 것이다.

일 구체예에서, ORF3는 ORF3 단백질의 발현 저하 또는 결여(예컨대, ORF3의 출발 코돈 내 점 돌연변이에 의함)를 야기하는 돌연변이를 포함하거나 또는 최종 ORF3 단백질의 기능 저하 또는 결여, 즉 암호화된 단백질의 아폽토시스 유도능 저하를 야기하는 돌연변이(및 일 구체예에서는 아폽토시스를 유도할 수 없음)가 존재할 수 있다.

본 발명의 제12 측면의 일 구체예에서는 하기 서열 번호 3의 서열 또는 이의 축퇴형 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진 핵산 서열을 제공한다. GTGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTACCACAACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAGTAA. 상기 서열은, ORF3 단백질이 발현되지 않도록 출발 코돈에 점 돌연변이가 있는 ORF3 돌연변이 서열을 나타낸다.

본 발명의 제12 측면의 다른 구체예는 하기 서열 번호 19의 서열 또는 이의 축퇴형 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진 핵산 서열을 제공한다. ATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTtgaTTTACCACAACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAGTAA. 상기 서열은 ORF3 단백질이 절두형으로 발현되도록 아미노산 서열 위치 27에 중지 코돈이 삽입된 점 돌연변이를 갖는 ORF3 돌연변이 서열을 나타낸다.

본 발명의 제12 측면의 또 다른 구체예에서는 하기 서열 번호 21의 서열 또는 이의 축퇴형 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진 핵산 서열을 제공한다. ATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTACCACAACCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCGaAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATTCTATCAGTAA. 상기 서열은 ORF3 단백질의 2차 구조의 입체 형태에 영향을 주도록 아미노산 Glu^-이 Lys⁺으로 바뀌도록 점 돌연변이를 갖는 ORF3 돌연변이 서열을 나타낸다.

본 발명의 돌연변이 핵산 분자가 암호화하는 단백질

상기 언급한 바를 통해서, 일부 경우에 본 발명의 제12 측면의 핵산 분자가 단백질을 암호화하지 않는다는 것을 인지할 수 있다. 그러나, 본 발명의 제12 측면의 핵산 분자가 단백질을 암호화하는 경우, 그러한 단백질을 본 발명의 추가 측면으로 제공한다. 이러한 단백질은 야생형 핵산 서열(서열 번호 2)이 암호화하는 단백질 보다 낮은 수준으로 발현되거나 또는 야생형 단백질(서열 번호 1)에 비하여 기능(아폽토시스 유도능의 관점에서)이 저하되거나 결여된 단백질이다.

다양한 형태의 핵산 분자의 제공

본 발명의 핵산 분자를 다양한 형태로 제공할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 핵산 분자 자체("나(naked) 핵산 분자"); 벡터; 바이러스 또는 숙주 세포 등의 형태로 제공될 수 있다.

벡터는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 포함된다. 본 발명의 벡터는, 예를 들어, 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는데, 여기서 상기 프로모터는 핵산 분자와 작동적으로 연결되어 있으며, 상기 핵산 분자는 전사 터미네이터에 작동적으로 연결되어 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 제11 또는 12 측면에 따른 핵산 서열로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포로 적절한 예로는 당분야의 당업자에게 공지이거나 당분야의 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포를 포함할 수 있다. 진핵 세포의 예로는 포유류(예컨대, 돼지), 진균류(예컨대, 사카로마이세스 세레비지아), 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 원핵 세포는 예를 들어, 대장균이 포함된다.

본 발명의 핵산 분자(이들을 포함하는 다양한 부분, 예컨대 벡터, 바이러스, 숙주 세포 등을 포함)는 본 발명의 단백질을 생산하기 위하여 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 단백질 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 본 발명의 단백질 발현에 적절한 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 단백질은 단백질의 화학 합성으로 생산할 수 있다. 화학 합성은 예를 들어, 고체상 펩티드 합성 등으로 수행할 수 있다. 이러한 방법들은 당분야에서 공지이며 당업자가 용이하게 수행할 수 있다.

본 발명의 단백질 생산은 단백질 정제 과정이 수반될 수 있다. 단백질의 정제 방법은 당분야에서 공지이고 당업자가 용이하게 수행할 수 있다.

항체 및 항체 생성 방법

본 발명의 제15 측면은 본 발명의 제10 또는 제13 측면의 단백질과 결합할 수 있는 항체를 제공한다.

본 발명의 제16 측면은 본 발명의 제10 또는 제13 측면의 단백질과 결합할 수 있는 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 동물(예컨대, 토끼, 기니피그, 설치류 동물 등)을 본 발명의 제10 또는 제13 측면의 단백질로 면역화시키고 이렇게 생성시킨 항체를 회수하는 것을 포함한다.

본 발명의 제15 및 제16 측면의 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호 1에 기재된 서열에 포함된 아미노산 서열과 결합할 수 있다.

본 발명의 항체는 다클론 항체이거나 단일클론 항체 조제물, 단일특이성 항혈청, 인간 항체이거나, 하이브리드 또는 키메라 항체, 예컨대 인간화 항체, 변형 항체(Fab')2 단편, F(ab) 단편, Fv 단편, 단독 도메인 항체, 이량체 또는 3량체 항체 단편 또는 구성체, 미니바디 또는 상기 항원에 결합하는 이들의 기능적 단편일 수 있다.

항체는 당분야의 공지 방법으로 생산할 수 있는데, 예컨대 하기의 문헌들에 개시되어 있는 방법들이다. [미국 특허 제4,011,308호; 제4,722,890호; 제4,016,043호; 제3,876,504호; 제3,770,380호; 및 제4,372,745호]. 또한, 다음의 문헌을 참조한다 [Antibodies-A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)]. 예를 들어, 다클론 항체는 적절한 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 양 또는 염소 등을 목적 항원으로 면역화시켜서 생성시킨다. 면역원성을 증강시키기 위하여, 면역화전에 항체를 담체와 연결시킬 수 있다. 이러한 담체는 당분야의 당업자에게 공지이다. 면역화는 일반적으로 염수, 바람직하게는 플로인트 완전 보조제 등의 보조제에 항원을 혼합 또는 유화시키고, 이 혼합물 또는 유화액을 비경구(대체로, 피하 또는 근육내) 주사하여 수행된다. 상기 동물은 대체로, 바람직하게는 프로인트 불완전 보조제를 사용하여, 염수 내 항원을 1회 이상 주사하고 2 내지 6주 후에 항체가 증가하게 된다. 또한 항체는 당분야의 공지 방법을 사용하여 시험관내 면역화로 생성시킬 수도 있다. 이후, 다클론 항혈청을 면역화 동물로부터 얻는다.

단일클론 항체는 대체로 [Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497]의 방법이나 이의 변형법을 이용하여 제조된다. 통상, 마우스나 래트를 상기 기술한 바와 같이 면역화시킨다. 토끼도 사용할 수 있다. 그러나, 혈청을 추출하기 위하여 상기 동물을 출혈시키기 보다는, 비장(및 선택적으로는 몇몇의 거대 림프절)을 적출하여 단일 세포로 분리시킨다. 필요하다면, 상기 비장 세포의 세포 현탁물을 평판 또는 항원이 고르게 피복된 평판에서 스크리닝할 수 있다(비특이적 부착 세포를 제거한 후). 항원에 특이적인 막-결합 면역글로블린을 발현하는 B-세포가 상기 평판에 결합하면, 나머지 현탁물과 함께 세척되지 않는다. 최종 B-세포 또는 모든 분리된 비장 세포들이 이후 골수종 세포와 융합하도록 유도하여 하이브리도마를 형성시키고, 선별 배지(예컨대, 하이포잔틴, 아미노프테린, 티미딘 배지, "HAT" 등)에서 배양한다. 최종 하이브리도마를 제한 희석하여 평판에 도말하고, 면역화 항원에 특이적으로 결합하는 (그리고 비관련 항체에 결합하지 않는) 항체를 생산하는지 분석한다. 선별된 단일클론 항체 분비 하이브리도마를 이후 시험관내(예컨대, 조직 배양 용기 또는 공동 섬유 반응기 등), 또는 생체내(예컨대, 마우스의 복수)에서 배양한다.

인간화 및 키메라 항체도 본 발명에서 유용하다. 하이브리드(키메라) 항체 분자는 대체로 Winter 등의 문헌 [(1991) Nature 349: 293-299] 및 미국 특허 제4,816,567호에 기재되어 있다. 인간 항체 분자는 대체로, Riechmann 등의 문헌 [(1988) Nature 332:323-327]; Verhoeyan 등 [(1988) Science 239:1534-1536]; 및 영국 특허 공보 제2,276,169호(1994, 9월 21일 공개)에 개시되어 있다.

항체가 어느 분자와 특이적으로 반응하여서 그 분자와 항체가 결합하게 되면 상기 항체는 분자와 "결합가능하다(capable of binding)"라고 한다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 약 10⁵ M^-1 이상, 보다 바람직하게는 약 10⁶ M^-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 10⁷M^-1 이상, 가장 바람직하게는 약 10⁸M^-1 또는 10⁹M^-1 이상의 결합 친화력 또는 결합 화합력을 갖는다. 항체의 결합 친화력은 당분야의 당업자라면, 예컨대 스캣차드 분석법(Scatchard analysis) (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949)) 등으로 용이하게 측정할 수 있다.

본 발명의 부분(moiety)의 단리형 제공

본 발명의 단백질, 핵산 분자 및 항체들을 "단리(isolated)"할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 단리는 그 천연 상태로부터 "인간의 조작으로" 변경되었음을 의미하는 것으로서, 즉, 천연 상태에서 발생한 것이라면, 이의 천연 숙주 또는 환경으로부터 분리되었거나 변화되었음을 의미하는 것이다. 연합되어 있는 불순물을 줄이거나 제거할 수 있다.

본 발명의 다양한 부분들을, 예컨대 백신 조제물 등의 약학 조성물 형태로 제공한다. 따라서, 본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 핵산 분자, 단백질, 항체, 길항제, 작용제, 바이러스, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

약학 조성물 및 백신과 관련하여, 상기 설명한 관련 부분을 참조한다.

작용제 또는 길항제의 스크리닝

본 발명은 본 발명의 단백질의 작용제 또는 길항제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 작용제 및 길항제는 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들어, ORF3 단백질의 길항제는 ORF3 단백질의 아폽토시스 유도능을 저하시켜서 PCV2의 병원성 및 증상을 완화시킬 수 있으므로 PMWS의 치료에서 그 유용성을 확인할 수 있다.

본 발명의 단백질을 임의의 다양한 약물 스크리닝법에서 화합물의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 상기 화합물들은 본 발명의 단백질(예컨대, 본 발명의 제10 또는 제13 측면에 따른 단백질)의 활성을 조절(작용화 또는 길항)할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 시험 화합물을 본 발명의 단백질과 접촉시키는 단계 및 본 발명의 단백질과 시험 화합물의 결합 유무를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 시험 화합물이 본 발명의 단백질의 활성(즉, 아폽토시스 유도능)을 증가 또는 저하시키는지 측정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 단백질의 활성을 증강 또는 저하시키는 지 측정하는 방법은 당분야의 당업자에게 공지이며 예컨대 도킹 실험/소프트웨어 또는 X선 결정학 등이 포함된다.

본 발명의 스크리닝 방법에 사용되는 본 발명의 단백질은 용액 내 유리 상태, 고체 지지체에 고정된 상태, 세포 표면에 함유(bearing)된 상태 또는 세포 내에 위치한 상태일 수 있다.

시험 화합물(즉, 작용제 또는 길항제로의 잠재력이 있는 화합물)은 천연 또는 변형 기질, 효소, 수용체, 유기 소분자 예컨대 최대 2000 Da, 바람직하게는 800 Da 이하의 천연 또는 합성 유기 소분자 등, 펩티드 모방체, 무기 분자, 펩티드, 단백질, 항체, 이들의 구조적 또는 기능적 모방체 등을 포함하는 다양한 형태일 수 있다.

ORF3 단백질의 길항제 또는 작용제를 동정하는 다른 방법은 아폽토시스를 유도할 수 있는 본 발명의 제10 측면의 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계 및 상기 세포를 시험 화합물에 노출시키는 단계 및 상기 시험 화합물이 단백질의 아폽토시스 유도능에 영향을 주는지 측정하여 시험 화합물이 길항 활성 또는 작용 활성을 나타내는지 결정하는 단계를 포함한다.

시험 화합물을 예컨대, 세포, 무세포 조제물, 화학적 라이브러리 또는 천연 산물의 혼합물로부터 단리할 수 있다. 이들 작용제 또는 길항제는 천연 또는 변형 기질, 리간드, 효소, 수용체 또는 구조적 또는 기능적 모방체일 수 있다. 이러한 스크리닝 법에 대해 적합한 리뷰는 예컨대 Coligan 등의 [Current Protocols in Immunology l(2):Chapter 5 (1991)]을 참조한다.

우수한 길항제 또는 작용제로 가장 적절한 화합물은 본 발명의 단백질과 결합하는 분자이다(길항제의 경우는 단백질이 결합시 이 단백질의 생물학적 효과를 유도하지 않는 것임).

다르게, 길항제는 본 발명의 단백질에 대한 수용체와의 경쟁적 결합을 통하여 기능할 수 있다.

다르게, 작용제는 본 발명의 단백질에 대한 수용체와 결합하여 본 발명의 단백질과 수용체 간의 결합 친화력을 증가시켜서 기능할 수 있다.

가능한 길항제로는 본 발명의 단백질과 결합하여 그 활성을 억제하거나 소멸시키는 항체, 단백질, 펩티드 및 유기 소분자 등이 포함된다. 이러한 방식으로, 정상적인 세포 결합 분자와 상기 단백질의 결합이 억제되어서, 상기 단백질의 천연적인 생물학적 활성이 저해된다.

상기 기술한 일 구체예들에서, 상기 단백질을 함유하는 표면과 시험 화합물의 부착은 상기 시험 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 표지를 통해서 간단한 방법으로 검출할 수 있으며 또는 표지된 경쟁 인자와의 경쟁을 포함하는 분석으로 검출할 수 있다.

사용가능한 약물 스크리닝을 위한 다른 방법은 단백질과의 적절한 결합 친화력을 갖는 화합물의 고처리율 스크리닝법을 제공한다. 이 방법에서, 다수의 상이한 시험용 소분자 화합물을 고체 기질 상에서 합성하고, 이어서 이들을 단백질과 반응시키고 세척하는 것이다. 단백질을 고정화하는 방법 중 하나는 비중성화 항체를 사용하는 것이다. 결합한 단백질을 이후 당분야의 공지 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 정제된 단백질을 또한 상기 언급한 약물 스크리닝법에서 사용하기 위해 평판상에 직접 피복시킬 수 있다.

작용제 및 길항제를 동정하기 위하여 인 실리코(In silico) 방법을 사용할 수도 있다. 이후 작용제 및 길항제 부분의 활성은 필요하다면, 실험적으로 확인할 수 있다.

본 발명의 추가 측면에서는 본 발명의 스크리닝 방법으로 동정된 작용제 및 길항제를 제공한다.

본 발명의 특정 측면과 관련되어 본 발명의 일정 부분에 기술하였으며, 이렇게 언급된 내용들이, 당업자라면 본 발명의 다른 측면에도 적용되는 것이고 기술한 내용들이 이러한 의미로 파악된다는 것을 이해할 것이다.

본 발명에 따라서, 당분야의 기술적 범주에서 통상의 분자 생물학, 미생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술 등을 사용할 수 있다.

이러한 기술들은 하기의 문헌들에 완전하게 설명되어 있다. 예컨대 하기 문헌들을 참조한다 : Sambrook 등, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3^rd edition, 2001); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III (Ausubel, R. M., ed. (1999 and updated bimonthly)]; ["Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994)]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-IV [Coligan, J. E., ed. (1999 and updated bimonthly)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Culture of Animal Cells, 4^th edition" [R. I. Freshney, ed. (2000)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1988); Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Harlow, Ed and Lane, David (Cold Spring Harbor Press, 1998); Using Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow, Ed and Lane, David (Cold Spring Harbor Press, 1999).

이하 실시예는 본 발명의 예시적인 구체예들을 제공하기 위한 것이며 이에 본 발명의 범주를 한정해서는 안된다.

본 발명자는 PK15 세포 내에서 PCV2의 증식성 감염 동안, 신규한 바이러스 유전자, ORF3를 발견하였다. 부위 지정 돌연변이 유발법에 의한 ORF3-결핍 PCV2를 감염시킨 결과에 의하면 상기 단백질은 바이러스 복제에 필수적이지 않은 것으로 확인되었다.

ORF3 단독으로 세포를 형질 전환시키면 상기 바이러스 감염 부분에서 기술한 바와 유사한 경로로 아폽토시스가 유도되었다. 이는 ORF3 발현이 없는 감염 세포에서 아폽토시스 활성이 현저하게 감소되는 것으로 더욱 증명되었으며, 상기 단백질이 바이러스에 의해 유도되는 아폽토시스의 유도에서 중요한 역할을 수행함을 시사하며, 바이러스에 의한 발병 과정에 관여함을 의미하는 것이다.

Balb/C 마우스를 ORF3 유전자 발현이 결여된 돌연변이체 PCV2로 감염시킨 후, 야생형 PCV2로 감염된 마우스와 비교하여 상기 마우스에서는 어떠한 병리학적 변화도 관찰되지 않았는데, 이는 상기 돌연변이체 PCV2가 PCV2에 의해 유도된 PMWS에 대한 약독화 생 바이러스로서의 잠재력이 있음을 시사한다.

본 발명에서, 본 발명자들은 배양 중인 세포의 PCV2 감염 세포에서 발현은 되지만 PCV2 복제에는 필수적이지 않음을 확인하기 위하여 ORF3에 대한 특이적 항체를 사용하였다. 또한, 상기 ORF3 단백질은 상기 바이러스 감염 부분에서 기술한 바와 유사한 경로를 이용하여 PCV2 유도 아폽토시스에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 이는 ORF3 발현이 결여된 감염 세포에서 아폽토시스 활성이 상당히 감소한 것으로 확증되었다.

본 발명에서, 상기 돌연변이체 PCV2 접종원을 8주령의 마우스 실험군에 투여하였고, 건강한 마우스를 음성 대조구로 사용하였으며, PCV2 감염 마우스를 양성 대조군으로 사용하였다. 각 실험 마우스에 10⁵ TCID₅₀의 단독 투여량(50%의 조직 배양물 감염 용량)을 투여하였다. 상기 실험 세트는 현미경적 병변 및 치명적인 물리적 영향이 상당하게 보다 적은 정도로 나타났으며, 다른 한편으로는 양성 대조군만큼 풍부하게 PCV2 항원에 대한 세포질 내 표지화가 나타났다.

재료 및 방법

바이러스 및 세포

5% CO₂ 습식 배양기 내 37℃에서 PCV가 없는 영구 PK15 세포주를 5% 가열 불활성화 소태아 혈청(FBS), 5% L-글루타민, 100 U/mL 페니실린 G 및 100 ㎕/ml 스트렙토마이신이 보충된 최소 필수 배지(MEM, Gibco)에서 유지시켰다. 일시적 발현 분석에 사용하기 위한 Cos-7 세포를 10% FBS가 보충된 둘베코 변형 배지(DMEM, Gibco)에서 유지시켰다. 본 실험에서 사용하는 PCV2 바이러스주 BJW는 중국 북부 지역에서 천연적으로 발생한 PMWS를 앓고 있는 돼지의 신장 조직 시료에서 최초로 분리된 것이다. 상기 신장 조직을 처리하고 PK15 세포에 접종하였으며 이의 게놈 서열을 유전자 은행에 기탁하였다(수탁 번호 AY847748).

ORF3에 대해 생성된 항체

도 1A에 도시한 바와 같이, ORF3 유전자를 비롯하여 ORF1 및 ORF2를 PCV2 바이러스주 BJW의 유전자 지도에 표시하였다. ORF3 전체 길이를 암호화하는 DNA를 PQE30에 클로닝하고 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) BL21 세포를 형질전환시켰다. IPTG(이소프로필-β-D-티오칼락토피라노시드)을 사용하여 상기 세포들에서 ORF3 발현을 유도시키고 4시간 동안 37℃에서 성장시켰다. His-태그 융합 단백질을 정제하고, 그 제조물을 마우스에 주입하여 다클론 항체를 생성시켰다. 4회 주입 후, 상기 마우스를 혈액을 채취하여 혈청의 ORF3 반응성을 시험하였다. 상기 항체는 ORF3 발현 구성체로 형질감염되거나 PCV2로 감염된 PK15 세포에서 발현된 ORF3에 대해 특이적인 반응성을 나타내었다.

PCV2 돌연변이체 및 플라스미드의 구축

PCV2 분리 바이러스주 BJW의 서열에 따라서 전방향 프라이머 F-PCVPST (5'-TGCACTGCAGTAAAGAAGGCAACTTAC-3') 및 역방향 프라이머 R-PCVPST (5'-TGCACTGCAGTATTCTTTATTCTGCTG-3')의 PCR 프라이머 쌍을 설계하였다. 상기 프라이머쌍으로 고유한 PstI 제한 효소 부위를 포함하는 중첩 영역과 함께 완전한 PCV2 게놈을 증폭시켰다(도 1A 및 1C). 간략하게, QIAamp DNA Minikit(Qiagen)를 사용하여, 천연적으로 발생한 PMWS를 앓고 있는 돼지의 신장 조직 시료에서 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 다음의 조건으로 PCR(Perkin-Elmer)을 통해 증폭시켰다: 94℃에서 5분간 초기 효소 활성화 단계, 이후 94℃에서 1분간 35사이클의 변성 단계, 48℃에서 1분간 어닐링 단계, 72℃에서 2분간 확장 단계 및 72℃에서 10분간 최종 확장 단계. 예상되는 크기의 PCR 산물을 겔 전기영동으로 분리하고 PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다.

PCV2 게놈을 포함하는 분자 DNA 클론을 구축하기 위하여, 상기 PCR 산물을 pBlueScript SK(pSK) 벡터에 클로닝하였다. PCV2 게놈 특이적 프라이머와 함께 M13 전방향 및 역방향 유니버설 프라이머를 사용하고 ABI Prism Dye terminator cycle sequencing kit(PE Biosystems)를 이용하여 상기 클론의 양 가닥에 대한 서열을 분석하였다.

QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Strategene)를 사용하여 상기 클로닝된 PCV2 게놈에 특정 돌연변이를 도입하였다. 제조자의 설명서에 따라서, 다음의 돌연변이 유발 프라이머 세트를 사용하여 돌연변이체 플라스미드를 생성하였다 (전방향 프라이머: 5'- GGGATGGTTACCACGGTGAAGTGGTTGTTA-3', 전방향 프라이머: 5'-TAACAACCACTTCTTCACCGTGGTAACCATCCC-3'). 상기 돌연변이(nt 671)는 이탤릭체의 굵은 글자로 표시하였고(도 1B), 이 돌연변이는 상기 부위에서 ORF1 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. PCV2 게놈을 pSK 플라스미드로부터 절단하고 결찰시켜서 고리화시킨 후, 이 결찰 DNA 혼합물로 대략 60∼80%의 군집도로 성장한 PK15 세포를 형질감염시켰다.

재조합 진핵 세포 발현 플라스미드를 제조하기 위하여, ORFl, ORF2 및 ORF3 유전자의 코딩 서열을 PCV2 게놈으로부터 증폭하였다. 다음의 프라이머를 사용하여 상기 각각의 유전자를 증폭시켰다. GFP-ORF1(5): 5'-CCGCTCGAGCTATGCCCAGCAAGAAGAATGG-3' 및 GFP-ORF1(3): 5'-CGGGGTACCTCAGTAATTTATTTCATATG-3', GFP-ORF2(5):5'-CCCAAGCTTCGATGACGTACCCAAGGAGGCG-3' 및 GFP-ORF2(3): 5'-CGGGGTACCTTATGGTTTAAGTGGGGGGTC-3', GFP-ORF3(5):5'- CCCAAGCTTCGATGGTAACCATCCCACCACTTG-3' 및 GFP-ORF3(3): 5'- CGGGGTACCTTACTTATCGAGTGTGGAGCTC-3'. ORF1의 XhoI/KpnI 단편 및 ORF2와 ORF3의 각 HindIII/KpnI 단편을 진핵 세포 발현 벡터인 pEGFP(Clontech)의 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터 하류의 상기 제한 효소에 상응하는 부위에 직접 클로닝하여서 각각 GFP-ORFl, GFP-ORF2 및 GFP-ORF3를 얻었다. PCR 증폭에 의하여 어떠한 오류도 도입되지 않았음을 확인하기 위하여 상기 클론들을 서열 분석하였다.

형질 감염 및 감염

게놈 형질감염을 위해서, 각각 재조합 PCV2(rPCV2) 또는 돌연변이체 PCV2(rPCV2ORF3Δ)를 생성시키기 위하여 PstI-효소 분해한 PCV2 또는 ORF3-결핍 PCV2를 상응하는 게놈 클론으로부터 얻고, 겔 정제하여 형질감염 전에 T4 DNA 리가제(BioLab) 존재하에서 밤새 16℃에서 재고리화시켰다. 이전에 기술된 바와 같이 형질감염 이후 24시에 300 mM D-글루코사민으로 세포를 추가 처리하였다(49). 감염 시험을 위해, 게놈-형질감염된 세포에 대하여 3회의 연속 동결-해동 사이클을 수행하였다. 전체 용해물을 회수하고 PCV가 없는 PK15 세포를 감염시키는데 사용하였다. 감염시킨 후 이들 세포에 대하여 상기 기술한 바와 같이 글루코사민을 처리하고 IFA를 통해 분석하였다. GFP-ORFl, GFP-ORF2 및 GFP-ORF3 구성체의 시험관내 발현에 대하여 PK15 세포를 사용하여 일시적 발현 실험으로 시험하였다. LipofectaminePlus(GIBCO/BRL, USA)를 사용하여, 제조자의 프로토콜에 따라서, 25×25 mm 플라스크에서 성장시킨 세포를 GFP 벡터 단독, GFP-ORFl, GFP-ORF2 또는 GFP-ORF3 (플라스크 당 2 ㎍의 플라스미드)로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간 후, 마우스 항-ORFl, 항-ORF2 (Liu 및 Kwang, 개인 자료) 또는 ORF3 다클론 항체를 사용한 면역블랏팅 분석을 통하여 ORFl, ORF2 ORF3의 발현을 검증하였다.

RT-PCR

Trizol RNA 추출 시약(Invitrogen)을 이용하여, ORF3 유전자에 대한 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 사용하기 위한 총 세포 RNA를 바이러스 감염된 PK15 세포로부터 준비하였다. 상기 RNA 시료를 DNase I으로 60 분간 37℃에서 항온 처리하여 임의의 오염된 바이러스 DNA를 제거하였다. 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머는 각각 R671 : 5'-ATGGTAACC ATCCCACCACTTG-3' 및 F357: 5'- TTACTGATAGAATGTGGAGC-3'을 사용하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 접두어(F 또는 R)는 프라이머의 방향성을 표시하는 것이다. F는 nt 0에서 nt 1767로의 전방향을 나타내는 반면, R은 nt 1767에서 nt 0으로의 역방향을 나타낸다. RT-PCR은 AMV Reverse Transcriptase kit (Roche) 및 Expand High Fidelity PCR kit (Roche)를 사용하여 수행하였고 PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 사진을 찍었다.

발생 부위(In situ) 혼성화(ISH)

이하에 기술한 바와 같이 ISH를 수행하였다. 간략하게, 야생형 PCV2 또는 돌연변이체 PCV2로 MOI가 1 TCID₅₀ (50% 조직 배양-감염성 용량)에서 80% 군집도의 세포들이 감염될 때까지 챔버 슬라이드(IWAKI)에서 PK15 세포를 성장시켰다. 감염 후 24 시간 후, 48 시간 후, 72 시간 후 및 96 시간 후에 상기 슬라이드 PBS로 세척하고, 30 분간 실온(RT)에서 PBS 내 4% 파라포름알데하이드 용액에서 고정시키고, 건조시켰다. 0.1 M 트리에탄올아민, 0.2 N HCl 및 0.5% 무수 아세트산에서 아세틸화시킨 후, 혼성화 용액 (50% 포름아미드; 5×SSC; 50 ㎍의 연어 정자 DNA/mL)에서 2시간 동안 60℃에서 예비혼성화시키고, 이후 밤새 60℃에서 1 ㎍/mL 농도의 딕옥시제닌(DIG)-표지된 RNA 프로프와 함께 혼성화시켰다. 세척한 후, 상기 슬라이드를 항-형광-AP(Roche)(완충액 [10% 태아 소 혈청; 100 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl, pH 7.5]에 1:5,000으로 희석한 것 150 ㎕)와 밤새 4℃에서 항온 반응시켰다. 상기 슬라이드를 세척하고, NBT-BCIP 혼합물로 항온 반응시키고, 현미경하에서 조사하기 위하여 고정시켰다.

KpnI으로 선형화시킨, ORF3의 cDNA를 포함하는 pSK 플라스미드로부터 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 시험관 내 전사시켜서 센스 리보프로브를 합성하였다. 안티센스 리보프로브는, 다음의 프라이머 쌍(전방향 프라이머: 5'-ATGGTAACCATCCCACCATTGTTTCTAGGTGGTTTCCAG-3', 역방향 프라이머: 5'-TAATACGACTCACTATAGGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGG-3', T7 프로모터는 밑줄로 표시함)을 사용하여 ORF3 단편을 증폭하고 T7 RNA 중합효소로 전사시켜 합성하였다. 두 RNA 프로브는 NTP-DIG label mix (Roche)를 사용하여 표지화하였다.

PCV2의 복제 분석

PCV2의 성장 특성을 분석하기 위하여, 군집한 PK15 세포를 1 TCID₅₀의 MOI로 야생형, 재조합, 또는 돌연변이체 PCV2 바이러스 저장물(PK15 세포에서 3 계대 후 생성됨)로 감염시켰다. 감염된 세포 배양물을 다른 시간 간격에서 상기 세포로부터 회수하고 3회의 동결-해동법을 수행하여 투명화시켰다. 상기 세포 배양물에 존재하는 감염 바이러스의 역가는 이전에 기술된 바와 같이 PK15 세포에 대한 IFA를 통하여 측정하였다(14).

아폽토시스 분석

감염 후 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간에 챔버 슬라이드(IWAKI) 상에서 성장한 PK15 세포를 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고 돼지 항-PCV2 혈청 및 FITC-접합 항체로 염색하였다. 형질 감염 동안, GFP-ORFl, GFP-ORF2 또는 GFP-ORF3 플라스미드로 형질감염된 PK15 또는 Cos-7 세포를 각각 형질 감염 후 24시 및 48시에 4% PFA로 고정시켰다. 이후, 상기 슬라이드를 37℃에서 30분간 1 ㎍/mL 농도의 DAPI(2,4-디아미디노-2-페닐인돌)과 항온 반응시키고 Plan-Novofluar 6×/1.4 오일 대물렌즈를 사용하는 LSM 510 META 공촛점 레이저 주사 현미경(Zeiss, Germany) 하에서 관찰하였다.

감염 후 상이한 시간 간격으로 감염된 PK15 세포(2∼3×10⁶)를 회수하고 10분간 4℃에서 1,000×g에서 원심분리하였다. 펠렛을 PBS로 세척하고 2.5% 글루타르알데하이드에 고정시켰다. 이후, 상기 세포를 1% S₂O₄ Q에 후고정시키고 EPON-812에 삽입시켰다. 초박부를 절단하고 Hitachi H-700 전자 현미경 하에서 관찰하였다.

75×75 mm 플라스크에서 성장시킨 PK15 세포를 야생형 PCV2로 감염시켰다. 후속 처리, 부유화 및 트립신-분리한 세포를 모아서 빙냉 PBS로 2회 세척하고 70% 냉 에탄올에 고정시킨 후, PBS로 2회 세척하였다. 원심분리한 후, 세포 펠렛을 PBS에서 요오드화 프로피듐(50 ㎍/mL)으로 염색하고 45분간 RNase A (100 ㎍/mL)를 처리하였다. PK15 세포의 DNA 함량을 FACS(Fluorescent Activated Cell Sorting) (FACSort, Becton Dickinson)를 통해 분석하였다. 10,000 이상의 경우들에 대하여 분석하였으며, 서브-G₁ 집단의 세포 비율을 산출하였다. 막대 그래프의 원점에서 세포 잔해물의 응집체들은 서브-G₁ 세포 분석에서 제외시켰다. 각 실험에서, 모의 감염 PK15 세포를 대조구로 사용하여 PCV2로 감염된 세포와 비교하였다.

야생형 PCV2로 감염된 세포 또는 GFP-ORFl, GFP-ORF2 또는 GFP-ORF3 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 부착 세포 및 미부착 세포를 개별적으로 회수하고 10 분간 200×g에서 침강시키고, 빙냉 PBS로 세척하였으며, 4% PFA에 고정시키고, 1 ㎍/mL DAPI로 염색시켜서 형광 현미경으로 관찰하였다. 최소 300 세포/시료를 아폽토시스 변화(핵이 다수의 개별 단편으로 단편화되는 변화)에 대하여 점수화 하였다.

간접 형광 분석(IFA)

감염을 위하여, 챔버 슬라이드(IWAKI)에서 성장시킨 PK15 세포를 야생형, 재조합 또는 돌연변이체 PCV2와 60분간 37℃에서 MOI는 1 TCID_5O로 하여 배양시키고 배양 동안 MEM을 부가하였다. 37℃에서 배양시킨 후, 감염 후 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간 후에 세포를 PBS로 세척하고, RT에서 30분간 PBS 중의 4% PFA로 고정시켰다. 고정 후, 상기 세포를 RT에서 1시간 동안 3% BSA가 포함된 PBS-T로 블록킹시켰다. 1차 항체인, 마우스 항-ORF3 다클론 항체 또는 돼지 항-PCV2 항체를 1% BSA가 포함된 PBS-T로 희석하고 1시간 동안 37℃에서 항온 반응시켰다. PBS로 세척한 후, 세포를 1% BSA를 포함하는 PBS-T에 희석한 토끼 항-마우스 또는 항-돼지 FITC-접합 항체(Sigma)와 1시간 동안 37℃에서 항온 반응시켰다. 상기 세포를 PBS로 3회 세척하고, dH₂O로 린스하였으며 건조시키고 형광 고정 매질에 정착시켜서 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다.

웨스턴 블랏 분석

야생형 PCV2-감염된 PK15 세포의 전체 세포 용해물을 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)으로 분리하고 반건조 이동 세포(Bio-Rad Trans-Blot SD)가 포함된 니트로셀룰로스(NC) 멤브레인(Stratagene)에서 블랏팅하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위하여 상기 멤브레인을 5% 탈지유가 함유된 블록킹 완충액 TBST(20 mM Tris-HCl [pH 7.4], 15OmM NaCl, 0.1% Tween-20)에서 2시간 동안 RT에서 블록킹하였고, 이어서 2시간 동안 RT에서 마우스 항-ORF3 항체와 항온 반응시켰다. 이후, 상기 멤브레인을 TBST로 3회 세척하고, 블록킹 완충액에 희석(1:2,000)된 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 2차 항체(DAKO)와 1시간 동안 RT에서 항온 반응시켰다. 세척한 후, 상기 멤브레인을 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(Pierce, Rockford, 111., USA) 기질(20 mL 0.1 M pH 7.4 Tris-HCl, 20 mg DAB, 및 6.8 ㎕ H₂O₂)과 반응시키고, 이어서 증류수로 반응을 중지시켰다.

면역화 및 생백신의 투여량

본 실험에서, TCID₅₀ 약화 돌연변이체 PCV2 세포를 비강 및 복강 경로를 통하여 Balb/c 백색 마우스의 각 실험군에 투여하였다.

병리학적 및 면역 조직화학적 실험

상기 모든 동물에 대하여 선택 장기의 검시를 수행하였다. 폐, 간 및 림프절 시료를 수집하고 4% DEPC-처리한 인산 완충 파라포름알데하이드에 액침 고정시켰다. 고정된 시료를 탈수시키고, 파라핀 왁스에 삽입시켰으며, 6 ㎛로 절개하고, 해마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색하였다. 모든 시료에서 체위 저하 또는 현미경적 병변에 대한 임의 징후에 대해 평가하였다. 림프계 장기에 대하여 또한 림프계 세포의 고갈, 조직구 세포에 의한 침윤 및/또는 다핵성 세포의 존재에 대해 평가하였다.

아비딘-바이오틴-퍼옥시다제 방법을 면역 조직 화학 시험을 위해 사용하였다. 5 ㎛ 로 절개한 조직을 실란 피복된 슬라이스에 위치시켰다. 내인성 퍼옥시다제 활성은 1% 트리톤을 함유한 인산 완충 염수 내 3% H₂O₂로 상기 슬라이드를 10분간 함침시켜서 억제하였다. 5% 정상 마우스 혈청을 사용하여 실온에서 1시간 동안 블록킹을 수행하였다. 이후 상기 절개부를 PBS-트리톤에 1:100으로 희석시킨, 돼지에서 생성된 정제 PCV2 1차 항체와 실온에서 밤새 항온 반응시켰다. 바이오틴화된 항-돼지 및 퍼옥시다제-접합 아비딘을 1:200 희석시켜서 실온에서 1시간 동안 상기 슬라이드에 적용하였다. 다음으로 상기 절개부를 5분간 디아미노벤지딘(DAB)-과산화수소 용액에서 항온 처리하고, 1% 메틸 그린으로 대비염색시킨 후, 탈수시키고 Permount(Fisher Scientific Inc.)로 고정시켜서 현미경으로 관찰하였다.

실시예 1 : PCV2 감염된 세포에서 신규한 바이러스 단백질 ORF3의 동정

감염된 PK15 세포 및 모의 감염된 PK15 세포의 전체 세포 핵산을 역전사(RT)-PCR로 분석하였다. 증폭 산물을 아가로스 겔 전기 영동으로 분리하였다(도 1D). 표시한 시간점에서 PCV2로 감염된 세포로부터 분리한 RNA를 사용하여 315-bp 단편의 ORF3 유전자를 증폭시켰는데, 이는 PCV2 감염된 세포에서 ORF3 유전자가 전사 수준에서 발현된다는 것을 시사하는 것이다. PCV2 감염된 PK15 세포를 더욱 분석하여 ORF3 mRNA의 상대 분포를 측정하였다. 도 1E(패널 a-d)에 도시한 바와 같이, 표시한 시간점에서 안티센스 리보프로프를 사용하여 PCV2 감염된 세포 내에서 ORF3 mRNA 신호가 검출되었고, 감염된 세포의 핵에 주로 존재하고 있는 것을 관찰하였다. 흥미롭게도, 센스 ORF3 리보프로브를 이용하여서도 감염 세포에서 상기 mRNA 신호가 검출되었다(도 1E, 패널 e). 이러한 관찰 결과는 전체 ORF3 유전자가 PCV2 전체 게놈 내에서 반대 방향으로 ORF1 유전자와 완전하게 중첩되어 있기 때문에(도 1C) ORF1 mRNA 신호가 검출된 것으로 설명할 수 있다. 또한, PCV2에 감염되지 않은 대조구 세포에서는 어떠한 신호도 검출되지 않았다(도 1E, 패널 f). 상기 결과는 또한 ORF3 mRNA를 PCV2-감염된 세포에서 검출할 수 있고 이것이 핵 내에 존재한다는 것을 의미한다.

ORF3 유전자를 E. coli 벡터 PQE30에 클로닝하고 발현시켰다(결과는 도시하지 않음). 이 재조합 단백질은 항-히스티딘 단일클론 항체를 사용한 웨스턴 블랏으로 추가 확인하였고(결과는 도시하지 않음), 이하의 실험에서 사용된 단백질 ORF3에 대한 단일특이적 항체의 생산을 위하여 제조하였다.

PCV2 감염된 PK15 세포에서 ORF3 단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여, 세포를 상기 재료 및 방법에 기술한 바와 같이 PCV2(바이러스주 BJW)로 감염시켰다. 항-ORF3 마우스 다클론 항체를 직접 면역 형광 실험법에 사용하여 PCV2-감염된 PK15 세포에서 ORF3의 발현 및 위치화를 측정하였다. ORF3를 발현하는 세포군은 감염후 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간 후(도 2A, 패널 b-d, 다른 결과는 도시하지 않음)에 PCV2로 감염되 세포에서 검출할 수 있었다. ORF3 단백질은 감염된 세포의 핵에 주로 위치하였고 보다 적은 정도로 세포질에 위치하였다. 도 2A(패널 c)에 도시한 바와 같이, ORF3 단백질은 감염 후 48 시간 후에 감염 세포에서 최대로 발현되었다. 모의 감염된 세포에서는 어떠한 유의적인 염색도 관찰되지 않았는데(도 2A, 패널 a), 이는 상기 마우스 항체가 ORF3에 특이적임을 의미하는 것이다. 표시된 감염 후 시간점에서 PK15 세포에서 총 단백질을 더욱 회수하고 웨스턴 블랏을 수행하였다(도 2B). 마우스 항-ORF3 항체를 사용하여, 감염 후 24 시간 후 PCV2 감염된 세포에서 희미하지만, 분명하게 식별가능한 신호로 상기 단백질이 검출되었다. 밴드의 세기는 이후 상당하게 증가하였지만 감염후 72 시간 후에는 감소하였다. 모의 감염된 세포에서는 어떠한 시그날도 검출되지 않았다(도 2B). 동시에, 상기 결과들은, PCV2-감염된 세포에서 전사 및 번역 단계에서 ORF3가 발현되므로 상기 ORF3를 신규한 바이러스 단백질로 간주할 수 있다는 것을 보여준다.

PCV의 게놈 내에서 2개의 주요 오픈 리딩 프레임이 확인되었다. cap 유전자 ORF2는 주요 구조 단백질인 바이러스 캡시드를 암호화한다. 다른 유전자는 rep 유전자(ORF1)로서, 바이러스 복제에 필수적인 2개의 Rep 이소폼인 Rep 및 Rep'의 합성을 지정한다(9, 25). 또한, PCV2의 6개의 추가 RNA(3종의 Rep-연합 RNA, Rep3a, Rep3b 및 Rep3c, 그리고 3종의 NS-연합된 RNA, NS515, NS672 및 NSO)가 돼지 신장 세포에서의 증식성 감염 동안 검출되었는데(9, 10), 이는 이들 전사 유닛들이 바이러스 단백질 합성 또는 DNA 복제에 어떠한 영향도 주지 않는다는 것을 시사한다. NS515, NS672, 및 NSO는 Rep 프로모터의 하류에 있는 ORF1 내부의 상이한 3개의 프로모터로부터 전사되는 것으로 여겨지고 있으며(9), 어떠한 단백질 또는 기능성 단백질도 암호화하지 않는 듯하다. 동정된 9종의 PCV2-특이적 RNA 중에서, ORF2 RNA만이 상보적 DNA 가닥으로부터 전사되어서 바이러스 캡시드 단백질 ORF2를 암호화한다. 본 실험에서, 본 발명자들은 PCV2 감염된 PK15 세포에서 게놈의 상보적 DNA가닥으로부터 전사되는 신규한 바이러스 RNA를 검출하였고 이것이 배양 세포에서 PCV2 유도 아폽토시스와 관련되는 신규한 바이러스 단백질(여기서는 ORF3라 함)을 암호화하는 것을 더욱 증명하였다.

이 신규 전사체 ORF3 RNA는 PCV2 감염 세포에서 RT-PCR을 통해 용이하게 검출되었고(도 1D), ISH 분석을 이용하여서 감염 세포의 핵에서 더욱 검출되었다. 또한, ORF3 항원에 대하여 특이적인 항체를 사용하여, 본 발명자들은 면역형광법을 수행하여서 상기 단백질이 PCV2로 감염된 PK15 세포에서 발현되고(도 2A), 감염 세포의 핵에 주로 위치하며 보다 낮은 정도로 세포질에 위치한다는 것을(도 2A) 확인하였다. 감염된 세포에서 상기 단백질의 발현은 또한 웨스턴 블랏으로도 검출할 수 있었다(도 2B). 20종 이상의 지리적으로 상이한 PCV2 분리주의 서열 분석(유전자 은행의 데이타베이스에서 입수함)을 통하여, 상기 ORF3 단백질은 아미노산 수준에서 94.5% 이상의 동일성을 가지며, 실험 PCV2 바이러스주 내에서 매우 보존적이라는 것을 확인하였다. 그러나, PCV1 바이러스주의 상응하는 영역은 상이한 것으로 나타났고 아미노산 서열 동일성은 단지 61.5%였다. PCV1 바이러스는 천연적으로 비병원성이므로 돼지에서 어떠한 병리학적 병변을 야기하지 않기때문에(3, 48), 이들 잔기는 상기 바이러스의 병원성에서 작용할 수 있다.

실시예 2 :ORF3는 바이러스 복제에 필수적이지 않다

기술한 바와 같이, ORF3 유전자의 출발 코돈 ATG르 GTG로 점 돌연변이시켜 출발 코돈을 결실시켜서 ORF3 유전자가 결여된 PCV2 돌연변이체를 생성하였다(도 1B). 바이러스 복제에서 ORF3 단백질의 기능을 연구하기 위하여, PK15 세포를 야생형 PCV2 또는 돌연변이체 PCV2 감염성 클론 DNA로 형질 감염시켰다. 예상한 바대로 야생형 PCV2 DNA는 재조합 PCV2(rPCV2)를 생성시킨 한편, 돌연변이체 PCV2 DNA로 형질 감염된 PK15 세포도 돌연변이체 생바이러스(rPCV2ORF3Δ)를 생성하였다. 상기 돌연변이체 바이러스는 PK15 세포에서 3 계대를 지나면서 바이러스 역가가 증가하였다. 이후, 감염된 세포 및 모의 감염된 세포의 전체 세포 핵산을 RT-PCR로 분석하였다. 반응 산물을 아가로스 겔 전기 영동으로 분리하였다(결과는 도시하지 않음). 야생형 PCV2-감염된 세포에서 나타나는 바와 같이 돌연변이체 PCV2-감염된 세포에서 분리한 RNA를 이용하여 315bp 단편이 증폭되었는데, 이는 ORF3 유전자의 출발 코돈에 발생한 점 돌연변이가 이의 전사에 영향을 주지 않는다는 것을 의미하며 더 나아가서는 ORF3 전사의 출발 부위가 상류에 위치한다는 것을 시사하는 것이다. 모의 감염된 PK15 세포를 이용해서는 어떠한 PCR 산물도 얻지 못하였다. RT-PCR 산물의 서열 분석으로 생성된 PCV2 돌연변이체에 목적하는 변화가 존재함을 확인하였다(결과는 도시하지 않음). 또한, 안티센스 ORF3 리보프로브를 사용하여 돌연변이체 PCV2 감염된 세포의 핵에서 ORF3 유전자의 mRNA 신호를 검출하였다(결과는 도시하지 않음).

ORF3 단백질의 발현을 검출하기 위하여, PK15 세포를 회수한 바이러스로 감염시키고 ORF3 특이적 항혈청을 이용한 IFA를 통해 분석하였다. 도 3은 재조합 또는 돌연변이체 PCV2 감염된 세포를 면역 형광 염색한 결과를 나타낸다. rPCV2 바이러스로 감염된 세포는 ORF3 단백질을 발현하였고 양성의 면역 형광 신호가 나타났다(도 3A). 그러나, 돌연변이체 rPCV2ORF3Δ 바이러스로 감염된 세포는 어떠한 형광 신호도 나타내지 못하였는데(도 3D), 이는 12 계대 이후에도 ORF3 단백질 발현이 존재하지 않는다는 것을 의미한다(결과는 도시하지 않음). 이와 달리, 항-PCV2 돼지 혈청으로 돌연변이체 PCV2를 비롯한 재조합 PCV2로 감염된 세포의 핵에서 바이러스 항원이 쉽게 검출되었다(도 3B 및 E). 모의 감염 세포에서는 항-ORF3 마우스 혈청(도 3C) 또는 항-PCV2 돼지 혈청(도 3F)을 이용하여 어떠한 형광 신호도 검출되지 않았다.

야생형, 재조합 및 ORF3-결핍 PCV2의 복제 동력학을 측정하기 위하여, PK15 세포를 각각의 상기 바이러스로 감염시키고 감염 후 5 일후 IFA 분석을 통해 바이러스 역가를 측정하였다. 도 4A는 감염후 상이한 시간 지점에서의 각 바이러스의 성장 곡선을 나타내는 그래프이다(TCID₅₀/밀리리터로 표시함). 감염 후 각 시간 지점에서의 TCID₅₀에 의하면 돌연변이체 바이러스(ORF3 단백질의 발현이 결여됨)는 모바이러스 PCV2 또는 회수된 재조합 PCV2(rPCV2) 바이러스에 비하여 어느 정도 보다 느리게 복제되는 것으로 나타났다. 감염 후 36 시간 후, ORF3-결핍 PCV2 바이러스는 모바이러스 PCV2 또는 회수한 rPCV2 바이러스에 비하여 역가가 각각 대략 33배 또는 31배 낮은 것으로 나타났다. 그러나, 감염 후 72 시간 후, ORF3-결핍 PCV2 바이러스는 그 역가가 10^5.5 TCID₅₀/mL에 도달하였는데, 이는 모바이러스 PCV2(10^5.8 TCID₅₀/mL) 및 회수한 rPCV2 바이러스(105.6 TCID₅₀/mL)의 역가와 유사한 것이었다. 이러한 결과들에 따르면 ORF3 단백질은 세포 배양시 복제에 필수적이지 않다는 것을 의미한다.

ORF3 결여시, PCV2의 시험관 내 복제가 지연되었다(도 4). 그러나, 최대 역가는 야생형 바이러스 복제 이후에 확인된 역가 만큼 높게 나타났다. 복제 지연은 생체내 약독화로 해석되며, 이는 백신으로 가능성있는 바이러스주가 만들어진 것으로 판단할 수 있다. PCV2에서, ORF3 단백질은 주요한 면역원성 캡시드 단백질인 것으로 여겨져 왔으며(9, 30, 31), 배큘로바이러스에서 발현된 재조합 ORF2를 접종한 돼지(5) 또는 ORF2 유래 DNA 백신을 주사한 돼지(5, 19)에 대한 보호 반응을 자극할 수 있었다. 비병원성 PCV1 게놈 골격에 클로닝된 PCV2의 ORF2 유전자를 포함하는 키메라 PCV1-2 바이러스는 또한 가벼운 정도의 병원성을 나타내면서 PCV2에 대한 강력한 면역 반응을 유도할 수 있었으며(5), 이는 PCV2의 ORF2 단백질이 우수한 숙주 보호 면역원이라는 것을 의미한다. ORF2 단백질의 면역 우성 에피토프는 아마도 아미노산 잔기 47 내지 84, 165 내지 200 내 및 단백질의 마지막 4 아미노산에 위치하는 것으로 추가 확인되었다(22). 이는 ORF3 단백질에 의해 유도된 항체는 숙주에 대한 보호 면역 반응에 관여하지 않을 것이라는 것을 의미한다.

또한, ORF3 단백질이 결여된 PCV2 돌연변이는 동물에서 상응하는 항체를 유도하지 못하였으며 야생형 PCV2처럼 적절한 면역 반응을 유도할 것으로 기대할 수 있다.

실시예 3 : PCV2 감염은 배양 세포에서 아폽토시스를 유도한다

감염의 후기 단계 동안 PK15 세포내 PCV2 복제로 인해 세포 변성 효과(CPE), 예컨대 원형화, 배양 플라스크에서 감염 세포의 분리, 세포 용해 및 사멸 등이 야기된다. PCV2 감염 세포가 사멸되는 기전은 아직 완전하게 밝혀지지 않았다. 배양 세포에서 PCV2 감염으로 아폽시스가 유도되는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 1 TCID_5O의 MOI로 PK15 세포에 야생형 PCV2를 접종하고, 감염후 표시된 상이한 시간점에서 DAPI 염색으로 아폽토시스에 대해 분석하고 IFA를 통해 PCV2 바이러스 항원에 대하여 분석하였다. 완전한 상태의 핵이 고르게 염색되었지만, 아폽토시스 핵은 대체로 단편화되었고 DNA의 단편화 및 응축으로 인해 불규칙적이거나 약하게 DNA가 염색되는 것으로 나타났다(45). 도 5A에는 감염 후 48 시간 후(상층 패널) 및 72 시간 후(하층 패널), PCV2 감염된 세포에서 염색질의 응축 및 단편화를 가시화하여 나타낸 도면이다. 반대로, 모의 감염 세포에서는 감염 후 어떠한 분명한 핵 형태 변화도 관찰되지 않았다(결과는 도시하지 않음).

감염 및 모의 감염된 PK15 세포의 초미세 구조적 특성에 대하여 분석하였다. 감염 후 48 시간 후, PCV2로 감염된 세포는 전형적인 프로그램 세포 사멸 특징, 예컨대 염색질의 밀도 및 분포 변화, 즉 초승달 형태의 덩어리로 주변부로 응집되고, 핵 시스터나가 팽창되는 것이 관찰되었다(도 5B, 패널 b). 감염 후 72 시간 후, 세포는 전형적인 아폽토시스 세포 사멸 마커 예컨대 핵 분할 및 세포질 전위 등, 아폽토시스 바디 형성의 근원이 되는 마커들이 나타났다(도 5B, 패널 c). 96 시간 후, 세포는 핵 단편화가 더욱 일어나서, 아폽토시스 바디가 광범위하게 분포하여 나타났다(결과는 도시하지 않음). 반대로, 모의 감염 세포는 초미세 구조 수준에서 검출가능한 변화가 나타나지 않았다(도 5B, 패널 a).

요오드화 프로피듐(PI) 염색하고 고정시킨 PK15 세포의 유세포 분석으로 저이배체 세포의 비율을 측정하여 PCV2로 유도된 아폽토시스를 평가하였다. 아폽토시스 세포는 정상 세포에 비하여 DNA 함량이 낮으며 이들의 존재는 낮은 형광도의 저이배체 피크의 출현으로 구별가능하다. 모의 감염 세포에서, PI 염색한 세포의 FACS 분석을 기준으로 ∼1%의 세포가 저이배체 세포였다(도 6A). 그러나 상기 저이배체 세포는 감염 후 72 시간 후에 상당히 증가하고 그 이후에는 감소하였다(도 6A 및 결과 도시하지 않음). PCV2에 의한 아폽토시스의 유도를 또한 재료 및 방법에 기술한 DAPI 염색법을 통한 핵 형태 분석을 통해 수치화하였다. 염색된 세포의 관찰을 통하여 아폽토시스 세포가 유세포 분석에서 기술한 바와 같이 감염 후 유사한 양태(도 6B)를 나타내는 것을 확인하였다. 도 6C에 도시한 바와 같이, 모의 감염 배양물에 비하여 접종 배양물에서 보다 많은 세포가 배양 플라스크에서 떨어져 나갔고 기저 상태(substratum)로 들어갔다.

바이러스 유도 세포 사멸은 바이러스 감염에 의한 발병 과정에서 중요한 역할을 한다. 아폽토시스는 숙주의 면역계를 피하면서 이웃 세포에 자손을 퍼트리는데 있어서 중요한 단계로 판단되며(46), DNA 손상으로 생성되거나 바이러스 병원체가 감염된 비정상 세포를 제거하는 기능을 한다(39). 많은 바이러스들은 그들의 복제 주기 동안 직접적으로 또는 간접적으로 아폽토시스를 억제하거나 유도시키는 것으로 확인되었다(39). 써코비리데 과에서, 닭 빈혈증 바이러스(CAV)는 감염 후 흉선 세포 및 세포계에서 아폽토시스를 유도하는데, CAV가 암호화하는 VP3 단백질, 아폽틴은 다양한 배양된 형질 전환 세포주에서 아폽토시스를 촉발시킨다. PCV2는, 이에 감염된 돼지의 B 림프구에서 아폽토시스를 유도하여 선택적인 B 림프구 고갈이 수반되며(43), 또한 PCV2 감염된 마우스 모델의 림프계 조직의 조직구 세포에서 아폽토시스를 촉발시킨다(21). 그러나, 최근에 정상 대조구와 비교하여서 천연적으로 감염된 돼지에서 캐스파제-3 활성이 유의하게 자극되지 않으며 림프구 아폽토시스가 유의하게 유도되지 않는다는 상반된 결과가 보고되었으며(24, 37), 림프계 조직 고갈은 림프계 조직의 증식 활성 감소와 주로 관련되었다고 제시하였다. 그러나, 본 발명자들은 여기서 DAPI 염색, 전자 현미경 관찰 및 유세포 분석을 이용하여 배양되는 PK15 세포에서 PCV2가 아폽토시스를 유도할 수 있다는 것을 증명하였다. DAPI 염색에 따르면 DNA 단편화 및 응축으로 야기되는 불규칙적이거나 약한 DNA 염색(도 5A)이 확인되었고, 이는 전자 현미경 관찰하에서의 형태 변화와 일치하는 것이며, 전자 현미경 관찰 결과에는 광범위한 염색질 응축과 아폽토시스 바디의 출현 등이 포함된다. DAPI 염색 측정으로 확인한 아폽토시스 세포(도 6B) 및 유세포 측정법으로 분석한 저이배체 세포(도 6A)는 PCV2 감염 이후 모의 감염 대조구에 비하여 유의하게 증가하였다. PCV2로 감염된 이후 떨어지고 기층으로 부유한 세포가 40%인 반면, 모의 감염 대조구에서의 부유 세포는 5% 미만이었다(도 6C). 배양 세포주에서 개별 바이러스 단백질을 발현시켜서, 본 발명자들은 ORF3 유전자가 암호화하는 신규한 바이러스 단백질이 PCV2 감염 동안 아폽토시스를 유도하는데 기여한다는 추가적인 증거를 제공하였다.

실시예 4 : ORF3 단백질 단독으로 아폽토시스를 유도한다

PCV2 감염에 대한 증식 허용 세포주인 PK15 세포에서 PCV2 감염으로 아폽토시스가 유도되는 것을 확증한 후, 본 발명자들은 아폽토시스 유도의 원인이 되는 PCV2 암호화 단백질(바이러스가 암호화하는 프로아폽토시스성 단백질)을 스크리닝하고자 하였다. ORFl, ORF2 및 ORF3 유전자를 인간 사이토메가로바이러스 프로모터 제어하의 포유 동물 발현 벡터 pEGFP-Cl에 클로닝하였다. 상기 플라스미드로 PK15 및 Cos-7 세포를 형질 감염시키고, 각 단백질의 발현을 형광 현미경하에서 직접 관찰하고 마우스 항-ORFl, ORP2 또는 ORF3 항체로 면역 블랏 분석하여 더욱 확인하였다(결과는 도시하지 않음). 단백질 ORFl, ORF2 또는 ORF3는 감염 세포에서 나타난 바와 유사하게 형질 감염된 핵 영역에 위치하였다(결과는 도시하지 않음). 개별 구성체로 세포를 형질감염시킨 후, 감염 후 24 시간 후 및 48 시간 후에 세포들을 DAPI로 염색하였다. 도 7A에 도시한 바와 같이, 형질 감염 후 24 시간 후 핵 DAPI 염색을 통하여 ORF3 발현 PK15 세포(상부 패널) 및 Cos-7 세포(하부 패널)에서 아폽토시스의 전형적인 특징인 염색질 응축 및 단편화가 나타났다. 이와 달리, ORF1 또는 ORF2 형질 감염된 세포에서는 어떠한 분명한 핵 형태 변화도 관찰되지 않았다(결과는 도시하지 않음). 또한, GFP 양성 세포내에서 단편화 또는 응축된 핵을 갖는 세포의 수 및 총 GFP 양성 세포를 계측하였으며, 사멸 세포의 비율을 계산하였다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, 형질 감염된 PK15 세포 내에서 GFP 융합 구성체로서 발현되는 ORF3 단백질의 발현으로 형질 감염 후 24 시간 후 및 48 시간 후에 사멸 세포가 각각 10% 및 25% 유도되었다. ORF3 단백질은 또한 Cos-7 세포를 형질 감염시켰을 시 상기 시간점에서 12% 및 28%의 세포 사멸을 야기하였다(결과는 도시하지 않음). 형질 감염된 PK15(도 7B) 또는 Cos-7 세포(결과는 도시하지 않음)에 관계없이, 이 스크리닝 실험에서는 대조구에 비하여 ORF1 및 ORF2 단백질의 발현으로는 유의한 세포 사멸이 발생하지 않았다. 반대로, GFP 단독으로는, PK15 및 Cos-7 세포를 형질 감염 시 상기 형질 감염 후 표시한 시간 지점에서 4% 미만으로 세포 사멸이 유도되었다(도 7B 및 결과 도시하지 않음). 또한, ORF1 또는 ORF2 형질 감염된 세포와 GFP 단독 형질 감염 대조구(도 7C 및 도시하지 않음)에서 보다 ORF3 형질 감염된 PK15(도 7C) 및 Cos-7 세포(도시하지 않음)에서 보다 많은 세포들이 배양 플라스크에서 떨어졌고 기저 상태로 들어갔다.

PK15 세포에서 rPCV2ORF3Δ의 아폽토시스 효과를 확인하기 위하여, MOI는 1 TCID_5O으로 하여 상기 세포를 돌연변이체 바이러스로 감염시키고, 상이한 시간 간격으로 세포를 회수한 후, 캐스파제-3 활성을 분석하였다. 감염후 돌연변이체 바이러스에 의해 유도된 아폽토시스 활성은 야생형 PCV2 바이러스에 의해 생성된 것보다 상당하게 낮았다(도 9C). 모의 감염 세포에서는 어떠한 감지가능한 정도로 아폽토시스가 검출되지 않았다(도 9C). 상기 결과는 ORF3 단백질 발현의 결여로 인하여 PCV2 유도 세포 사멸이 상당히 감소하였음을 의미한다.

돼지를 PCV2로 감염시킨 결과 림프계 조직의 마이로파지 침윤과 함께 소포 영역 및 소포간 영역의 림프구 고갈이 발생하고 면역 억제가 수반되었다(42). ORF2는 PCV2의 주요 캡시드 단백질로 여겨왔으며, 배큘로바이러스 발현계에서 발현된 후 바이러스 유사 입자를 형성할 수 있었는데(31), 이로부터 PCV2의 다른 바이러스 단백질은 비리온 조립에 필수적이지 않은 비구조적 단백질인 것으로 추측할 수 있다. 또한, VIDO R1 세포에 PCV2를 접종했을 때 감염 후기 단계에서 상기 ORF2 단백질이 높은 수준으로 발현되는 것으로 확인되었다(23). 본 발명자들이 확인한 바에 의해서도, PCV2 감염된 PK15 세포에서 감염후 72 시간 내지 96 시간 이후에 ORF2 단백질 발현이 최고에 도달하였다(결과는 도시하지 않음). 본 실험에서, ORF3는 PCV2 감염된 세포에서 감염 후 48 시간 경에 전사 및 번역 수준이 둘다 높게 발현되는 것으로 확인되었으며(도 1 및 2), 이러한 결과로 ORF3도 역시 PCV2의 비구조적 단백질일 것으로 생각된다. 동물 바이러스의 비구조 단백질은 바이러스 복제 및/또는 발병 과정에서 중요한 역할을 한다. 면역 억제성 바이러스에서, CAV의 비구조 단백질 VP3은 림프아 T 세포(lymphoblastoid T cell)에서 아폽토시스를 발생시키고 발병 과정에 관여한다(34). 닭의 전염성 낭병 바이러스(chicken infectious bursal disease virus)의 비구조 단백질 VP5는 바이러스 복제에는 필수적이지 않지만(29), 이의 아폽토시스 활성을 통해 바이러스의 발병 과정에 관여하는 것으로 확인되었다(53). 본 발명자들의 연구에서, 본 발명자들은 PCV2의 ORF3 단백질이 시험관 내 바이러스 복제에는 필요하지 않으며, ORF3 단백질 발현의 결여로 인하여 PCV2 유도 아폽토시스 활성이 상당히 저하되는 것을 확인하였다. 본 발명자들의 결과는 또한 ORF3 단백질 단독 발현으로 PCV2 감염된 세포에서와 유사하게 개시 인자 캐스파제-8이 활성화되고 이후 이펙터 캐스파제-3 경로가 활성화되어 형질 감염 세포에 아폽토시스가 유도된다는 것을 보여준다. 동시에, ORF3 단백질은 이의 아폽토시스 활성으로 바이러스의 발병 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 면역계 세포에서의 아폽토시스 유도는 바이러스에 의해 유도되는 면역 억제의 필수 조건 중 하나이므로(12), PCV2 감염에 대해 가능한 생백신 바이러스주로서 ORF3-결실 돌연변이체를 이용하는 것이 용이할 수 있다. 그러나, 이러한 ORF3 단백질-결핍 바이러스의 이용으로 돼지의 면역 억제가 야기되는지 여부는 더욱 확인해 봐야한다.

실시예 5 : 병리학적 및 면역 조직화학적 실험

본 실험에서, 8주령 balb/C 마우스로 이루어진 한 군을 ORF3-결핍 PCV2 돌연변이체(mPCV2)로 감염시키고, 다른 군은 야생형 PCV2로 감염시켰다. 정상적으로 건강한 마우스를 본 실험의 음성 대조군으로 사용하였다. 감염후 7 및 14 일 후 상기 마우스의 사후 검시를 수행하였다. 림프절 시료를 4% 인산 완충 파라포름알데하이드에 고정시켰다. 조직병리학적 실험을 위하여 상기 조직을 탈수시키고 해마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색하였다. 이후 PCV2 단백질 발현의 확인을 위하여 일련의 절개부를 면역 조직 화학법으로 염색하였다.

감염 후 7 일 및 14 일 후 모든 음성 대조군 마우스 및 돌연변이체 PCV2 감염 마우스에서는 어떠한 체위 저하 징후도 나타나지 않거나 미세한 징후만이 나타났으나, 감염 후 14 일에 서혜부 림프절이 약간 확장되었다. 야생형 PCV2 감염 마우스에서는, 감염 후 7 일경, 간에 약간의 변색과 서혜부 림프절이 약간 확장된 것이 관찰되었다. 야생형으로 감염된 대부분의 마우스에서는 감염 후 14 일경, 간 및 비허탈 폐의 상당한 변색과 장간막 림프절 및 서혜부 림프절이 상당히 확장된 것으로 관찰되었다. 도 8A에 의하면, 3개 실험군의 서혜부 림프절에 대한 조직 병리학적 실험 결과, 감염 후 7 일 및 14 일경에 음성 대조군 및 mPCV2 군의 배중심에서 건강하고 조밀하게 군집된 림프구가 확인되었다. 반면 야생형 PCV2는 감염 후 7 일에 약간의 림프구 고갈 징후가 나타났으며, 상이한 야생형 PCV2 감염된 마우스에서는 감염 후 14일 경에 다양한 정도의 림프구 고갈과 상당히 많은 수의 아폽토시스 세포가 관찰되었다(화살표).

돌연변이체 PCV2 감염 마우스 및 야생형 감염 마우스 둘 다에서 PCV2 항원이 검출되었다. 모든 조직 검사에서, 림프구 및 마크로파지의 세포질 내에서 가장 풍부하게 PCV2 항원의 면역표지가 나타났다. 그러나, 상기 면역 표지는 돌연변이체 PCV2 감염 마우스와 비교하여 야생형 PCV2 감염 마우스에서는 감염 후 14 일에는 그 강도가 상당히 낮았다(도 8B에 도시함).

낮은 수준의 림프구 고갈과 높은 수준의 PCV2 항원 축적뿐만 아니라, 현미경적 병변과 체위 저하가 없는 것으로 돌연변이체 PCV2의 복제능 및 보호 효능을 확인하였다. 이러한 결과로 또한 상기 돌연변이체가 PCV2 유도 PMWS에 대해 효과적인 백신을 생산하기 위해 적합한 후보가 될 수 있다는 가능성을 증명하였다.

본 발명의 약독화 생백신 mPCV2는 실험 마우스에서 체액성 반응 및 세포성 반응 둘다를 유도할 수 있었다. 병독성 저하뿐만 아니라 바이러스 복제에 대해 어떠한 효과도 없으며, 따라서 PCV2에 대하여 연속적인 보호 효능을 제공하고 백신 산업화에도 최상의 후보물이 될 수 있다.

실시예 6 : 아폽토시스-결핍 PCV2 돌연변이체의 생성

아폽토시스 결핍 바이러스가 생성되는 ORF3 출발 코돈 내 점 돌연변이의 작용은 상기에서 논의하였다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 출발 코돈 돌연변이 이외의 ORF3의 기능적 변이가능한 부위를 동정하였다.

ORF3는 반대 방향으로 ORF1 내에 위치한다. ORF1이 바이러스 복제에 필수적인 복제 효소를 암호화하기 때문에, ORF1의 단백질 전사 기능을 보존하는 것이 필요하다. 따라서, ORF3 돌연변이체 생성을 위하여 ORF1 내의 중복(redundant) 코돈을 선택하였다.

비정상 ORF3 발현이 일어나도록 하기 위하여, 본 발명자들은 단백질의 최종 2차 구조에 영향을 주도록 아미노산 서열의 정전하 패턴을 변화시키는 전략을 선택하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 서열 내 특정 위치에서 특정 아미노산의 전하를 중성으로 만들거나 전하를 반전시켰다. 이러한 방식으로, 단백질 기능을 손상시키게 된다. 이 실험에서 부위 지정 돌연변이 유발법을 사용하여 상기 언급한 돌연변이를 바이러스 게놈 내에 도입시켰다.

5개의 돌연변이체를 설계하고 이들을 돌연변이된 아미노산 번호에 따라 명명하였다. 돌연변이체 27은 서열 번호 19에 나타낸 바와 같이 알라닌을 중지 코돈으로 변경하였다. 결과적으로 이 돌연변이체는 절두형의 26개 아미노산 ORF3 단백질을 발현한다.

다른 돌연변이들은 상기 언급한 바와 같이 단백질의 입체 형태를 변경시켜서 ORF3 단백질의 기능을 변화시켰다. 단백질의 입체 형태를 변경시키기 위하여, 단백질 내 하전 아미노산을 돌연변이 표적으로 삼았다. ORF3 단백질의 알파-나선형 영역에는 많은 하전 아미노산이 존재하므로 돌연변이 표적으로 적합하다. 돌연변이체 52 및 61는, 상기 아미노산 전하를 반전시켜 이 단백질의 알파 영역이 폴딩되지 않도록 하여 단백질의 2차 구조를 변경시켰다. 돌연변이체 52에서는, 서열 번호 20에 도시한 바와 같이 뉴클레오티드 서열을 변화시켜서 아미노산 His⁺를 Asp^-로 바꾸었다. 돌연변이체 61에서는, 서열 번호 21에 도시한 바와 같이 뉴클레오티드 서열을 변화시켜서 아미노산 Glu^-을 Lys⁺으로 바꾸었다. 돌연변이체 85에서는, 서열 번호 22에 도시한 바와 같이 뉴클레오티드 서열을 변화시켜서 His⁺를 Tyr로 바꾸어서 양성 전하가 중성 전하로 변경되되록 하였다. 그 결과, 돌연변이체 85의 2차 구조는 단백질의 코일 영역 중 하나가 개방되는 변화가 일어나게 되었다.

아미노산 50 내지 아미노산 62가 결실된 돌연변이체 결실 50-62는 대조구로서의 역할을 한다. 상기 기술한 바와 같이, 돌연변이 부위가 ORF1의 중복 코돈에 존재하기 때문에, 생성된 돌연변이체들은 ORF1의 아미노산 서열에는 영향을 주지 않으므로 복제 효소의 전사에는 어떠한 영향도 없게 된다. 도 10을 참조한다.

돌연변이된 바이러스 게놈으로 PK15 세포를 형질 감염시키고 5일간 성장시켰다. 5일 후, 상기 세포들을 회수하고 3회 동결-해동법으로 용해시켰다. 전세포 용해물을 이어서 신선한 PK15 세포를 감염시키기 위하여 사용하였다. 세포 배양의 5차 계대시, 야생형 PCV2와 돌연변이체 52 및 85는 세포 사멸이 나타나기 시작하였다. 야생형 PCV2, 돌연변이체 52 또는 돌연변이체 85로 감염된 PK15 세포에서 약 70% 내지 90%의 세포 사멸이 관찰되었다. 이와 달리, ORF3의 ATG 출발 코돈의 결실 돌연변이를 통해 생성된 돌연변이체, 돌연변이체 61 또는 돌연변이체 27은 모두 세포 사멸이 상당히 감소된 것으로 나타났다(약 10%). 도 11을 참조한다.

아폽토시스 비율이 낮은 이들 돌연변이체들은 약독화 생백신의 생산에 적합하다. 따라서, 본 발명자들은 핵산 수준에서 특정 아미노산에서 입체 형태를 변경시키면, 백신 제조를 위한 약독화 생백신을 생산하기에 적합한 돌연변이체를 제조할 수 있음을 확인하였다.

또한, 이러한 돌연변이들을 2중 돌연변이 또는 3중 돌연변이로 조합하여 상기 바이러스가 야생형 병독성 형태로 복귀될 확률을 낮추는 것이 가능하다. 예를 들어, 서열 번호 23에 도시한 바와 같이 ATG 돌연변이와 돌연변이체 27을 조합하거나, 서열 번호 24에 도시한 바와 같이 ATG 돌연변이를 돌연변이체 61과 조합하는 것이 가능하다. 상기 돌연변이들은 서열 번호 25에 도시한 바와 같이 돌연변이체 61, 돌연변이체 27 및 ATG 돌연변이체로 이루어진 3중 돌연변이로 조합할 수도 있다.

상기 개시한 바를 읽은 후 본 발명의 의도 및 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명을 다양하게 변형 및 조절할 수 있다는 것은 당분야의 당업자에게는 자명하며 이러한 모든 본 발명의 변형 및 조절 형태를 이하 첨부한 청구항의 범주에 포함시키고자 한다.

<참조 문헌>

SEQUENCE LISTING <110> Temasek Life Sciences Laboratory Limited <120> Porcine Circovirus Type 2 Vaccines <130> 10925SG12 <160> 25 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 104 <212> PRT <213> PCV2 <400> 1 Met Val Thr Ile Pro Pro Leu Val Ser Arg Trp Phe Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Phe Arg Val Cys Lys Ile Ser Ser Pro Phe Ala Phe Thr Thr Thr Arg 20 25 30 Trp Pro His Asn Asp Val Tyr Ile Arg Leu Pro Ile Thr Leu Leu His 35 40 45 Phe Pro Ala His Phe Gln Lys Phe Ser Gln Pro Ala Glu Ile Ser Asp 50 55 60 Lys Arg Tyr Arg Val Leu Leu Cys Asn Gly His Gln Thr Pro Ala Leu 65 70 75 80 Gln Gln Gly Thr His Ser Ser Arg Gln Val Thr Pro Leu Ser Leu Arg 85 90 95 Ser Arg Ser Ser Thr Phe Tyr Gln 100 <210> 2 <211> 315 <212> DNA <213> PCV2 <400> 2 atggtaacca tcccaccact tgtttctagg tggtttccag tatgtggttt ccgggtctgc 60 aaaattagca gcccatttgc ttttaccaca accaggtggc cccacaatga cgtgtacatt 120 cgtcttccaa tcacgcttct gcattttccc gctcactttc aaaagttcag ccagcccgcg 180 gaaatttctg acaaacgtta cagggtgctg ctctgcaacg gtcaccagac 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Claims (43)

1. 적어도 부분적으로 비정상 ORF3의 발현으로 인하여 약독화된 면역원성 약독화 PCV2 바이러스.
2. 제1항에 있어서, 상기 ORF3로부터 발현되는 단백질은 기능이 저하되거나 결여된 것인 바이러스.
3. 제1항에 있어서, 상기 ORF3 단백질의 발현이 저하되거나 결여된 것인 바이러스.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스의 ORF3에 하나 이상의 돌연변이가 존재하고, 이때 ORF3 내 돌연변이는 ORF1이 암호화하는 단백질에 어떠한 변화도 야기하지 않는 것인 바이러스.
5. 제4항에 있어서, 상기 ORF3의 출발 코돈은 비기능성이 되도록 하고, ORF1이 암호화하는 단백질에는 어떠한 변화도 야기되지 않도록 상기 ORF3의 출발 코돈을 돌연변이시킨 바이러스.
6. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이는 ORF3에 삽입된 중지 코돈을 포함하는 것인 바이러스.
7. 제6항에 있어서, 상기 ORF3에 삽입된 중지 코돈은 서열 번호 19에 기재된 바와 같은 것인 바이러스.
8. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이는 서열 번호 21에 기재된 바와 같은 ORF3의 알파-나선형 영역의 돌연변이를 포함하는 것인 바이러스.
9. 제4항에 있어서, ORF3에 2 이상의 돌연변이를 포함하는 바이러스.
10. 제9항에 있어서, 상기 2 이상의 돌연변이는 출발 코돈, Ala27중지 및 Glu61Lys의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바이러스.
11. 제4항에 있어서, 출발 코돈의 돌연변이, 및 서열 번호 19에 기재된 바와 같은 중지 코돈의 삽입 또는 서열 번호 21에 기재된 바와 같은 알파-나선형 영역의 돌연변이로부터 선택된 제2 돌연변이로 이루어진 2개의 돌연변이를 포함하는 것인 바이러스.
12. 제11항에 있어서, 상기 ORF3는 서열 번호 23 또는 서열 번호 24에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 바이러스.
13. 제4항에 있어서, 출발 코돈의 돌연변이, 서열 번호 19에 기재된 바와 같은 중지 코돈의 삽입 및 서열 번호 21에 기재된 바와 같은 알파-나선형 영역의 돌연변이를 포함하는 바이러스.
14. 제13항에 있어서, 상기 ORF3는 서열 번호 25에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 바이러스.
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 바이러스의 면역학적 유효량을 포함하는 백신.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 바이러스의 면역학적 유효량과 약학적 허용 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제를 함께 포함하는 약학 조성물.
17. 제15항의 백신을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 PCV2에 대한 면역 반응의 유도 방법.
18. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물, 바람직하게는 개체에서 PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약물에 사용하기 위한 바이러스.
19. 개체에서 PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약물의 제조에서의 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 바이러스의 용도.
20. 제16항, 제18항 및 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 개체는 돼지인 것인 방법, 바이러스 또는 용도.
21. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 바이러스를 생산하기 위한 숙주 세포.
22. 동물의 질병 예방 또는 치료 방법으로서, 상기 동물에게 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 바이러스의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 방법.
24. 제22항에 있어서, 상기 질병은 이유후 전신 소모성 증후군인 방법.
25. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 바이러스의 생산 방법으로서, 상기 바이러스의 생산이 가능하도록 적합한 조건하에서 제21항에 따른 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하는 방법.
26. 제22항에 있어서, 배양 배지로부터 바이러스를 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
27. 아폽토시스를 유도할 수 있으며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
28. 아폽토시스를 유도할 수 있으며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 서열 동일성이 65% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상인 단백질.
29. 아폽토시스를 유도할 수 있으며, 제27항 또는 제28항에 따른 단백질의 활성 단편인 단백질.
30. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질 형태로 제공되는 단백질.
31. 제27항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
32. 제31항에 있어서, 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함하거나, 유전 코드의 축퇴성(degeneration) 내에서 서열 번호 2에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자.
33. 제31항에 있어서, 서열 번호 2에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 유전 코드의 축퇴성 내에서 상기 서열에 상응하는 서열과의 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 서열을 포함하는 핵산 분자.
34. 제31항에 있어서, 서열 번호 2에서 정의한 핵산 서열 또는 유전 코드의 축퇴성 내에서 상기 서열에 상응하는 서열과 고엄격 조건하에서 혼성화할 수 있는 핵산 분자.
35. 제32항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 따른 핵산 분자의 돌연변이형을 포함하는 핵산 분자로서, 제32항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 따른 핵산이 암호화하는 단백질이 비정상적으로 발현되도록 돌연변이된 핵산 분자.
36. 제35항에 있어서, 서열 번호 3에 기재된 핵산 서열 또는 이의 축퇴형 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
37. 제36항에 따른 핵산 분자가 암호화하는 단백질.
38. 제33항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터, 바이러스 또는 숙주 세포.
39. 제27항 내지 제30항 및 제37항 중 어느 한 항에 따른 단백질과 결합할 수 있는 항체.
40. 제39항에 따른 항체의 생성 방법으로서, 제27항 내지 제30항 및 제37항 중 어느 하나의 항에 따른 단백질을 동물에게 투여하는 단계 및 상기 동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
41. 제27항 내지 제30항 및 제37항 중 어느 하나의 항에 따른 단백질의 작용제 또는 길항제의 동정 방법으로서, 시험용 화합물이 상기 단백질의 아포토시스 유도능을 증가 또는 저하시키는지 측정하는 단계를 포함하는 방법.
42. 이유후 전신 소모성 증후군의 유도능에 대하여 하나 이상의 후보 분자를 스크리닝하는 방법으로서,

    (a) 생물학적 시료와 하나 이상의 후보 분자를 접촉시키는 단계; 및

    (b) 상기 하나 이상의 후보 분자에 의해 생물학적 시료에 유도된 아폽토시스의 수준을 분석하는 단계를 포함하고,

    여기서, 아폽토시스의 수준은 하나 이상의 후보 분자의 이유후 전신 소모성 증후군의 유도능을 나타내는 것인 방법.
43. 후보 분자가 단백질의 아폽토시스 유도능을 증가 또는 저하시키는지 측정하는 단계를 포함하는 제42항에 따른 단백질의 작용제 또는 길항제의 동정 방법.