CN1860230B - 赋予对黄单胞菌引起的细菌性黑枯病的抗性的来自水稻的核酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供了植物、植物细胞和制备转基因植物或植物细胞的方法，其中所述植物或细胞对细菌性黑枯病具有抗性。本发明提供了包含SEQID NO：1或其片段的分离的核酸序列，当其被转染进植物中时为植物提供对细菌性黑枯病的抗性。

Description

赋予对黄单胞菌引起的细菌性黑枯病的抗性的来自水稻的核酸

技术领域

本发明主要涉及植物分子生物学和遗传学以及在植物中赋予对细菌性疾病的抗性的核酸和方法。

本申请中用于阐明本发明的背景或提供关于实施的补充细节的出版物和其他材料通过引用被合并到本发明中，且为便于参考被列入参考文献中。

背景技术

在植物与病原体的相互作用的协同进化过程中已经发展出来的一种重要的植物防御机制是所谓的基因对基因的相互作用模型(Flor，1P71)。按照这一模型的简单构成，植物抗性(R)基因编码由来自病原体的无毒(Avr)基因所产生的分子信号的特异性受体。然后，继发信号传导途径将所述信号运送到一组引发宿主防御的下游基因(Dangl，2001)。R基因介导的防御典型地涉及快速、局部坏死，或感染部位的过敏反应(HR)，且在局部形成限制病原体的生长的抗菌化合物和蛋白质(Greenberg，1997)。

已经从双子叶植物已经克隆和表征了众多的R基因(hulbert等，2001)。然而，从对人类的食物供应和家畜的饲料供应有重要贡献的谷物中仅克隆到几个R基因，其部分原因在于这些农作物中的绝大多数具有复杂的基因组。在水稻(Oryza sativa)中，第一个被克隆的R基因是Xa21细菌性黑枯病R基因，其编码一种具有推定的胞外受体和胞质激酶结构域的蛋白质(Song et al.1995；US专利5,859,339)。三个其它的水稻R基因，即Xal细菌性黑枯病R基因(Yoshmura et al.，1998)和两个稻瘟病R基因，即Pi-b(Wang et al.，1999)和Pi-ta(Bryan et al.，2000；US专利6,479,731 B1)，编码具有核苷酸结合位点的推定的胞质受体蛋白。在酵母双杂交系统和体外结合试验中，Pita蛋白还都显示出与AVR-Pi-ta蛋白的特异性物理互作(Jia et al.，2000)。

黄单胞菌引起的细菌性黑枯(BB)病几乎影响所有的农作物，并导致全世界范围的广泛的作物损失。在水稻中，由水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv oryzae(Xoo))引起的细菌性黑枯病已经成为水稻中最为严重的疾病之一，影响了整个亚洲、澳大利亚北部、非洲大陆、美国南部和拉丁美洲的灌溉和雨水灌溉的低地生态系统的产量。由于该疾病导致的产量损失的范围在20-30％(Ou，1985)。迄今为止，对水稻细菌性黑枯病的最好控制是品种抗性的使用。已经鉴定到了超过20个抗细菌性黑枯病的R基因(Kinoshita 1995；Lin et al.，1996；Zhang etal.，1998；Khush et al.，1999；Gao et al.，2001)，并已经克隆了2个R基因，Xa21和Xal。Xa21起源于野生型种非洲长花药野生稻(Oryzalongistaminata)，并在转基因植物中赋予对多个Xoo分离株的抗性(Wanget al.，1996)，而Xal赋予对日本Xoo的小种1菌株的高水平小种特异性抗性(Yoshmura et al.，1998)。

从栽培水稻(O.sativa ov)IR31917-45-3-2(IR31917)和野生水稻种小粒稻(Oryza minuta)Acc.101141(Amante-Bordeos et al.，1992)的杂种的BC2植物(植物78-1)鉴定到一个新的抗BB位点。这一报道也表明单一基因或紧密连锁基因赋予对来自菲律宾的BB病原体的Xoo菌株PXO99(小种6)的小种特异性抗性。

发明内容

在一个实施方式中，本发明提供了对编码抗性基因Xa31的基因的克隆和表征，所述基因赋予对细菌性黑枯病的抗性。在一个优选的实施方式中，所述抗性是对由黄单胞菌引起的细菌性黑枯病的抗性。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO：1的核酸的组合物，其中所述序列赋予被所述核酸转染的植物对细菌性黑枯病的抗性。在其它实施方式中，本发明提供了与SEQ ID NO：1基本同源的变体或在严格条件下与所述序列杂交的核酸，并且所述核酸赋予被所述核酸转染的植物对细菌性黑枯病的抗性。在另一个实施方式中，本发明提供了一种核酸，其包含SEQ ID NO：1的至少100个连续碱基对并赋予被所述核酸转染的植物对细菌性黑枯病的抗性。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，该方法包括将SEQ ID NO：1的核酸转染到所述植物中，或将所述核酸转染到植物细胞中，并从所述植物细胞生长出植物，其中所述核酸当被转染到对细菌性黑枯病没有抗性的植物中时赋予该植物对细菌性黑枯病的抗性。在另一个实施方式中，制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法包括将SEQ ID NO：1的至少100个碱基对的核酸片段转染到所述植物中，其中所述片段当被转染到对细菌性黑枯病没有抗性的植物中时赋予该植物对细菌性黑枯病的抗性。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含一种或多种选自以下一组的核酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52，其中当所述一种或多种核酸被转染到对细菌性黑枯病没有抗性的植物中时赋予该植物对细菌性黑枯病的抗性。在其它实施方式中，本发明提供了一种或多种与所述核酸基本同源的变体。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，该方法包括将选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ IDNO：52构成的组的至少一种核酸转染到所述植物中，或转染到对细菌性黑枯病没有抗性的植物细胞中，并从其生长出植物。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，该方法包括用SEQ ID NO：1的至少100个连续碱基对的片段转染植物，所述片段赋予对细菌性黑枯病没有抗性的植物对细菌性黑枯病的抗性。在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，该方法包括用SEQ ID NO：1的至少100个连续碱基对的片段转染植物细胞，并从所述植物细胞生长出植物，所述片段赋予对细菌性黑枯病的抗性。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种包含一种分离的核酸或所述分离的核酸的基本同源的变体的组合物，所述分离的核酸编码如SEQID NO：5所示的多肽或其片段。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，该方法包括在所述植物中表达编码SEQ ID NO：5的核酸。

在其它实施方式中，本发明提供了制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，包括将本发明的一种或多种核酸转染到植物细胞中，并从所述细胞生长出植物。

在其它实施方式中，本发明提供了载体(其在一个优选的实施方式中为表达载体)、细胞(其在一个优选的实施方式中为植物细胞)和/或植物，其中任一个可以包含本发明的核酸。在其它实施方式中，所述载体、细胞和植物可以包含片段或基本同源的序列，所述片段或基本同源的序列将在严格条件下与所述序列杂交且当被转染到对细菌性黑枯病没有抗性的植物中时赋予该植物对细菌性黑枯病的抗性。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种转基因植物，其中所述植物由SEQ ID NO：1的核酸所转染，且其中所述植物对细菌性黑枯病具有抗性。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种转基因植物，其中所述植物由编码SEQ ID NO：5的多肽的核酸所转染，其中所述多肽在所述植物中被表达。在另一个实施方式中，本发明提供了一种由编码所述多肽的核酸转化的细胞，其中所述多肽在所述细胞中被表达。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，该方法包括用包含SEQ ID NO：1的一个或多个调节区域的核酸转染所述植物。在一个实施方式中，本发明提供了一种制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，该方法包括用包含SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52中一种或多种的核酸转染所述植物。在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备对细菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，该方法包括用可操纵地连接于一种异源基因的选自以下一组的核酸转染所述植物：SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52。

附图说明

图1表示Xa31对水稻黄单胞菌水稻致病变种菌株PXO99在不同遗传背景下的反应。

图2表示在不同的发育阶段，Xa31对水稻黄单胞菌水稻致病变种菌株PXO99和T7174的抗性。

图3表示Xa31-连锁标记AM1-TAIL和AM2-TAIL的图谱。

图4A和4B表示Xa31基因座的遗传和物理图谱。

图5A和5B表示二元载体pC1300和在Xa31互补研究中构建体插入物的重叠。

图6A和6B表示Xa31基因组克隆的重叠群。

图7表示T0代Xa31转化体的表型。

图8表示T1代Xa31转化体的表型。

图9表示Xa31基因的抗性(IBB31)和易感型(IR24)等位基因的TATA盒区域的启动子的比较。

本发明的实施方式详述

在一个实施方式中，本发明提供了编码SEQ ID NO：5的多肽的分离的核酸。在另一个实施方式中，本发明提供了一种选自以下一组的分离的核酸：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52。在另一个实施方式中，本发明提供了用本发明的一种或多种核酸转化的植物或植物细胞，其中所述核酸在细胞中的存在为所述植物或细胞提供了对细菌性黑枯病的抗性。本发明证明了用如SEQ ID NO：1中所述的核酸转染植物(或转染植物细胞并从其生长出植物)生成了对细菌性黑枯病具有抗性的植物。这些结果还证明了选自以下一组的一种或多种核酸的某些组合：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：51和SEQ IDNO：52，以及编码SEQ ID NO：5的核酸，是赋予植物对细菌性黑枯病的抗性的原因。在另一个实施方式中，本发明提供了一种调节细菌性黑枯病抗性的表型的表达的分离的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ IDNO：52中的一种或多种，且其中所述核酸可以任选地被可操纵地连接于一种编码异源多肽的核酸。在另一个实施方式中，本发明提供了一种表达载体，其中所述载体包含一种编码如本申请所述的多肽的核酸。如本领域技术人员所公知的那样，异源蛋白或肽可以包括来自水稻或其它植物的R基因的蛋白质或防御基因的蛋白质。非限制性实例可以包括水稻细菌性黑枯病R蛋白Xa1、Xa2或防御蛋白例如来自水稻的PR1。

一旦将核酸克隆到表达载体中，可以使用传统的转化方法将其导入植物细胞中。术语“植物细胞”意指包括任何衍生自植物包括未分化的组织例如愈伤组织和悬浮培养物，以及植物种子、花粉或植物胚芽的细胞。适于转化的植物组织包括叶组织、根组织、分裂组织、原生质体、下胚轴、子叶、盾片、苗端、根、未成熟胚芽、花粉和花粉囊。一些可在转化植物和植物细胞中应用的方法的非限制性实例在以下被提供。

一种多核苷酸或核酸如果处于其天然状态，或当通过本领域技术人员所熟知的方法被操纵时，被认为“编码”了一种多肽，其可以被转录和/或翻译以生成mRNA和/或多肽或其片段。

一种“分离的”或“基本纯的”核酸(例如RNA、DNA或一种混合的聚合体)或多肽基本上分离自其它天然伴随着天然的人类序列或蛋白质的细胞成分，例如核糖体、聚合酶、许多其它的基因组序列和蛋白质。该术语包含已经从其天然存在的环境中被提取出的核酸序列或蛋白质，并包括重组体或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。本发明预见了包含分离的Xa31核酸的核酸。

如可以被本领域技术人员容易地理解的那样，本发明的多核苷酸组合物包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式，并且可以进行化学或生物化学修饰或可以包含非天然的或衍生核苷碱基。这些修饰包括，例如，标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰例如不带电的连键(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电的连键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂部分(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素)螯合、烷基化和修饰性连键(例如，α端基异构核酸等)。还包括合成分子，其模仿多肽通过氢键和其它化学作用与指定序列相结合的能力。一些分子是本领域中已知的，包括，例如在分子主链中肽键取代了磷酸键的分子。本发明的多核苷酸可以是分离的或基本纯的。

本发明提供了包含Xa31基因的重组核酸。该重组构建体可以在宿主细胞中自主复制。或者，该重组构建体可以被整合到宿主细胞的染色体DNA中。这样的重组多核苷酸包括基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，根据其来源或操纵，所述多核苷酸1)不与其在天然状态下结合的多核苷酸的全部或部分结合；2)被连接到不同于其在天然状态下连接的多核苷酸的多核苷酸上；或3)在自然界中不存在。

因此，本发明提供了非天然存在的重组核酸。尽管可以使用所描述的序列，所述序列通常例如通过缺失、取代或插入被改变。

本发明提供了野生型和突变体Xa31多肽或其片段的“蛋白质修饰或片段”，其基本上与一级结构序列同源，但其包括例如体内或体外的化学和生化修饰或其掺入了稀有氨基酸。如将被本领域技术人员容易地理解的那样，这种修饰包括，例如，乙酰化作用、羧化作用、磷酸化、糖基化、遍在蛋白化作用、标记例如用放射性核素，和各种酶修饰。多种用于标记多肽的方法和有益于这一目的的取代基或标记为本领域普通技术人员所熟知，包括放射性同位素例如³²P、与标记的抗配体(例如抗体)结合的配体、荧光团、化学发光剂、酶和可用做标记配体的特异性结合对成员的抗配体。标记的选择取决于所需的灵敏度，与引物结合的容易程度、稳定性要求和可利用的仪器。

除基本全长的蛋白质外，本发明还提供了所述多肽的生物学活性片段。重要的生物学活性包括配体结合、免疫学活性和蛋白质的其它生物学活性特征。本文所用术语“多肽”指全长蛋白质和作为多肽片段的该蛋白质的一部分两者。

多肽“片段”、“部分”或“区段”是一段至少约5-7个连续氨基酸的氨基酸残基，通常至少约7-9个连续氨基酸，典型地至少约9-13个连续氨基酸，最优选至少约20-30个或更多个连续氨基酸。

本发明还提供了融合多肽，其包含Xa31多肽及其片段和本领域中已知的其它蛋白质的多肽或片段。同源多肽可以是两个或两个以上的多肽序列间的的融合体，或Xa31的序列与一相关的蛋白质间的融合体。同样地，可以构建异源融合体，其将展示衍生蛋白质的特性或活性的组合。例如，配体结合或其它结构域可以在不同的新的融合多肽或片段之间“交换”。这种同源或异源融合多肽可以展示，例如，改变的结合强度或特异性，并且可以包括，例如配偶体如免疫球蛋白、细菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-内酰胺酶、α-淀粉酶、乙醇脱氢酶和酵母α交配因子。

如下述，融合蛋白典型地将通过重组核酸方法制备，或可以被化学合成。用于合成多肽的技术为本领域普通技术人员所熟知。

其它蛋白质修饰包括氨基酸取代。取代突变体典型地包含在该蛋白质内的一个或多个位点有一个氨基酸互换为另一个氨基酸，并且可以被设计成调节该多肽的一个或多个特性，例如对蛋白酶剪切的稳定性，而不丢失其它功能或特性。氨基酸取代可以基于所涉及到的残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性特性上的相似性进行。优选的取代是保守取代，即一个氨基酸被一个具有相似形状和电荷的氨基酸所取代。保守取代是被领域普通技术人员所熟知的，并且典型地包括但不限于在以下基团中的取代：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸和酪氨酸、苯丙氨酸。

某些氨基酸可以被蛋白质结构中的其它氨基酸所取代而不产生可测量的与例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点或与多肽相互作用的蛋白质上的结合位点等结构相互结合的能力的损失。由于是该相互作用的能力和蛋白质的特性限定了蛋白质的生物学功能活性，可以在蛋白质序列及其潜在的DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，仍然获得了具有相似特性的蛋白质。在进行这些改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。疏水氨基酸指数在赋予某一蛋白质相互作用的生物学功能方面的重要性在本领域中被普遍了解。或者，类似氨基酸的取代可以基于亲水性有效地进行。亲水性在赋予某一蛋白质相互作用的生物学功能方面的重要性在本领域中被普遍了解(参见，例如US专利4,554,101)。疏水指数或亲水性在设计多肽中的用途在US专利5,691,198中被进一步讨论。

“重组核酸”是一种非天然存在的核酸，或一种通过将序列的两个分离的区段通过人工结合而制备到的核酸。这一人工结合通常是通过化学合成或通过例如遗传工程学技术对核酸的分离的区段进行人工操纵完成。这一短语还意指包括除去了其正常调节表达限制因子的基因，因为在这中情形中由于存在所述基因的多个拷贝或上调启动子或增强信号，增加的mRNA或蛋白质半衰期等等而使基因产物被过表达。

“调节序列”指影响基因表达(包括基因的转录和信使RNA的翻译、剪切、稳定性等)的那些序列。

本发明的大量多核苷酸可以通过用编码突变体或野生型Xa31蛋白的核苷酸序列转化合适的宿主细胞而制备。编码所述肽或所需片段的天然的或合成的多核苷酸片段可以被插入能够导入原核或真核细胞并在其中进行复制的重组多核苷酸构建体(载体)通常为DNA结构中。通常，所述载体将适于在单细胞宿主中例如酵母或细菌中进行复制，但是也可以用于导入培养的哺乳动物或植物或其它真核细胞系中(整合或不整合到基因组中)。最常用的原核宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，不过也可以使用其它原核生物，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或假单胞杆菌属(Pseudomonas)。哺乳动物或其它真核宿主细胞，例如酵母、丝状真菌、植物、昆虫，或两栖动物或鸟类的细胞，也有益于制备本发明的蛋白质。如在相关技术中所已知的那样，调节多核苷酸表达可以导致对由所述多核苷酸所编码的多肽的调节。

本发明还提供了与本发明的多肽特异性结合的抗体。使用本领域普通技术人员所熟知的技术，所述多肽可以被用做在动物中诱导抗体应答的抗原，且所产生的抗体可用于筛选对本发明的多肽具有特异性的抗体。本发明还提供了多克隆和/或单克隆抗体及其片段，及其免疫结合等价物，其能与Xa31多肽及其片段或来自Xa31区域的多核苷酸序列特异性结合。术语“抗体”被用于指均质分子实体，或一种混合物例如由众多不同的分子实体构成的血清制品。可以在肽合成仪中合成制备多肽，并将其连接到载体分子(例如匙孔血蓝蛋白)上并在几个月的时间内将其注射到兔体内。检测兔血清对Xa31多肽或片段的免疫反应性。可以通过用蛋白多肽、融合蛋白或其片段注射小鼠制备单克隆抗体。将通过ELISA对单克隆抗体进行筛选并检测其与Xa31多肽的特异性免疫反应性。抗体也可以包含单链或多聚体重组抗体或其片段。

载体将包括一种合适的启动子和其它必需的在所选择的宿主中有功能的载体序列。如在本领域中所熟知的那样，其可以包括那些与Xa31核酸和蛋白表达天然相关的合适序列，且可以包括任选的或额外的调节序列，所述调节序列被可操纵地连接于重组Xa31基因以控制Xa31基因表达。许多有用的载体在本领域中是已知的，且可以获自例如Stratagene、New England BioLabs、Promega Biotech以及其它厂商。启动子例如trp、lac和噬菌体启动子、tRNA启动子和糖酵解酶启动子可以被用于原核宿主中。有用的酵母启动子包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖酵解酶例如烯醇酶或甘油醛-3-磷酸脱氢酶、负责麦芽糖和半乳糖利用的酶等的启动子区域。“可操纵地连接”是指一种并列，其中所描述的成分处于这样一种关系中，即使得它们以所预期的方式起作用。例如，如果一种启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子被可操纵地连接于所述编码序列。

表达和克隆载体优选含有选择标记基因。典型的标记基因编码这样的蛋白质，其a)赋予对抗生素或其它毒性物质，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤等的抗性；b)补充营养缺陷；或c)补充不能从复合培养基获得的关键养分；例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。适当的正确的可选择标记的选择将取决于宿主细胞，不同宿主细胞的合适的标记是本领域普通技术人员所熟知的。

含有感兴趣的核酸的载体可以在体外被转录，所得到的RNA通过众所周知的方法例如通过注射被导入宿主细胞中，或者所述载体可以通过本领域普通技术人员所熟知的方法直接导入宿主细胞中，所用方法根据细胞宿主的种类而不同，包括点穿孔，利用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质进行转染，微粒轰击，脂质转染法，感染(其中所述载体是一种感染性制剂，例如一种慢病毒基因组)，和其它的方法。通过本领域中已知的方法，尤其是上述的方法，将多核苷酸导入宿主细胞中在本申请中将被称为“转化”。上述已经导入了核酸的细胞还包括这些细胞的后代。

使用标记对克隆进行选择，这取决于载体构建的方式。所述标记可以位于相同或不同的DNA分子上，优选相同的DNA分子。在原核宿主中，可以例如通过对氨苄青霉素、四环素或其它抗生素的抗性对转化体进行选择。基于温度敏感性的特定产物的制备也可以被用做合适的标记。

用本发明的多核苷酸转化的原核或真核细胞不仅有用于制备本发明的核酸和多肽，而且还有用于例如研究Xa31多肽的特性。用本发明的多核苷酸转化的植物细胞还有用于生长表达本发明的多核苷酸和多肽的植物。本发明的核苷也可以被转化到已经经历了一定生长的植物中。

植物表达载体可以包括(1)位于5′和3′调节序列的转录控制下的克隆的植物基因，和(2)显性的选择标记。如果需要，这样的植物表达载体也可以含有启动子调节区域(例如，赋予诱导型或组成型、环境或发育调节型、或细胞或组织特异性/选择性表达的区域)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。也可以使用植物启动子片段，这将指导Xa31在所产生的植物的所有组织中表达。这样的启动子在本申请中被称做“组成型”启动子，且在绝大多数环境条件下和发育或细胞分化状态具有活性。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区域、衍生自根癌农杆菌的T-DNA的1′-或2′-启动子、遍在蛋白1启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、Nos启动子、pEmu启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)启动子和GRP1-8启动子。

或者，所述植物启动子可以知道本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或可以处于更精确的环境或发育控制下。这样的启动子在本申请中被称为“诱导型”启动子。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件包括病原体攻击、厌氧条件或光的存在。诱导型启动子的例子有Adhl启动子，其可以被缺氧或冷应激诱导；Hsp70启动子，其可以被热应激所诱导；和PPDK启动子，其可以被光所诱导。

处于发育控制下的启动子的例子包括仅起始转录的启动子，或在某些组织例如叶、根、果实、种子或花中优先的启动子。典型的启动子包括花粉囊特异性启动子5126(US专利5,689,049和5,689,051)、glob-1启动子和γ-玉米蛋白启动子。启动子的操作可以根据其在基因组中的位置而不同。因此，诱导型启动子在某些位置变成完全或部分组成型。

异源和非异源(即内源)启动子都可以被用于指导Xa31基因的表达。这些启动子也可以被用于，例如，重组表达盒中以促使反义核酸的表达降低、增加，或改变Xa31蛋白在所需组织中的浓度和/或组成。因此，在一些实施方式中，核酸构建体将包含一个在植物细胞中，例如玉米(Zeamays)或烟草中，有功能的启动子，其被可操纵地连接于到Xa31。在这些实施方式中有用的启动子包括促进Xa31的表达的内源启动子。

与电穿孔方法相类似的方法是在其中所需基因和原生质体被混合，并用聚乙二醇(″PEG″)处理该混合物，从而将所述基因导入所述原生质体中。这一方法与电穿孔方法的区别在于用PEG替代了电脉冲(Zhang W.et al.，1988，Datta et al.，1990和Christou et al.，1991)。

其它方法包括1)用核酸培养种子或胚芽(Topfer R.et al.，1989，Ledoux et al.，1974)，2)花粉管的处理(Luo et al.，1988)，3)脂质体方法(Caboche，1990)和4)显微注射方法(Neuhaus G.et al.，1987)。

用于从被转化的植物细胞再生植物的已知方法可以被用于制备本发明的转基因植物。通常，外植体、愈伤组织或悬浮培养物可以被暴露于适当的化学环境(例如细胞分裂素和植物生长素)，因此新生的细胞可以分化并可以导致生成胚芽，所述胚芽然后再生成为根和茎。

本发明通过以下非限制性实施例被进一步阐明。

实施例

实施例1赋予成体对多种Xoo菌株的抗性的疾病抗性基因Xa31

由于含有Xa31基因的BC₂后代是栽培水稻(O.sativa ov)IR31917-45-3-2(IR31917)和野生水稻种小粒稻(O.minuta)Acc.101141(Amante-Bordeos et al.，1992)的种间杂种，使用重复回交从野生型水稻除去不需要的性状。在戴维斯，加利福尼亚大学，从78-1-5BC2F3#169和IR24间的杂种选择一株具有较少的不需要的农艺性状的高抗性植物作为花粉供体与易感型栽培种CO39杂交(结果未出版)。可能是由于在CO39或其它两个在先前的回交中使用的栽培种(IR31917-45-3-2和IR24)中存在的其它干扰Xa31的遗传因子，杂交后代中的疾病抗性存在很大的变化。为了简化Xa31胚质的遗传背景，本申请发明人从后代中选择抗性F3植物作为雄体分别与同时存在的易感型栽培种IR24和CO39回交。简单地说，进行10代回交以将Xa31转移到IR24遗传背景中，BC10F3植物中的一株被指定为Xa31近等基因系IRBB31。同时，进行7代回交以将Xa31转移到CO39遗传背景中。对于Xa31基因座的遗传图谱，回交系的863株抗性植物(Xa31xa31)，来自隔离群体的1245株易感型植物(xa31xa31)和261株抗性植物(Xa31Xa31或Xa31xa31)被用于遗传连锁分析。在这一图谱群体中总共分析了3875个配子。

为了监测在回交植物中Xa31基因的存在并确认Xa31作为单独的显性基因座的遗传特性，本申请发明人评估了各个世代的植物与Xoo菌株PXO99的疾病反应。在一个试验中分别检测了IR24遗传背景的BC2F1植物、208株抗性植物和253株易感型植物(1∶1分离，λ²＝0.019，p＞0.80，n＝1)。在另一个试验中，观察了IR24遗传背景的BC10F2植物、232株抗性植物，并对47株易感型植物进行了评分(3∶1分离，λ²＝0.118，0.5＜P＜0.80，n＝1)。在后一个试验中，本申请发明人检测了所有具有两个紧密连锁的侧翼标记的植物的基因型。抗性植物的纯合子(Xa31Xa31)和杂合子(Xa31xa31)之间在损害长度上没有差别，抗性植物的平均损害长度(Xa31Xa31或Xa31xa31)仅为0.30±0.2cm，而易感型植物(xa31xa31)的平均损害长度为23.8±5.8cm(图1)。这两个试验的结果强有力地表明抗性是由一个单一的显性基因座所控制，这与先前的研究相一致(Amante-Bordeos et al.1992)。为了检查Xa31是否在CO39遗传背景中显示出相似的遗传性能，用PXO99接种38株来自与CO39回交的BC7的BC₇F₂植物。3株Xa31纯合子植物(Xa31Xa31)具有抗性(损害长度＝1.6±1.4cm)，而12株隐性纯合子(xa31xa31)对PXO99是易感的(损害长度＝22.6±5.8cm)(图1)。但是，23株杂合子(Xa31xa31)在疾病表型上与中等抗性(3.0cm＜损害长度≤6.0cm)合中等易感(6.0cm＜损害长度≤9.0cm)至完全易感(损害长度＞9.0cm)显示出与巨大的差异。这些植物的平均损害长度为13.5±7.0cm(图1)。尽管杂合子的平均损害长度显示出他们对PXO99是易感的，本申请发明人仍然可以通过比较具有不同基因型的植物的平均损害长度而得出一个大体的结论，即Xa31赋予半显性抗性或在CO39遗传背景中对抗性显示出剂量效应。当Xa31被用于标记辅助育种程序时，Xa31作半显性R基因的遗传特性也在中国杂交水稻的5个亲本系中被观察到。这些结果表明当植物的抗性基因座为杂合时，Xa31的表达可以被一些遗传背景中的其它遗传因子影响。图1表示Xa31对水稻黄单胞菌水稻致病变种PXO99菌株在不同遗传背景下的反应。各植物的基因型通过Xa31侧翼标记M3623和3612EST2被检测。标准差(SD)未标出。

首先用纯合子BC2F3植物检测Xa31在IR24遗传背景下的抗性光谱(数据未显示)，然后通过用收集自全世界11个国家的35株Xoo菌株进行接种IRBB31植物进行确认。IRBB21，Xa21的近等基因系，在本研究中被用作疾病评估的抗性对照(Wang et al.1996)。表1概括了损害长度和疾病反应的表型。简单地说，在被检测的35株Xoo菌株中，Xa31赋予对27株菌株的高水平抗性，和对3株菌株(HB17、JW89011和PXO71)的中等抗性，并显示出对5株菌株(1947、C4、ZHE173、K202和2)易感。Xa31和Xa21共享被检测的不相容菌株的绝大多数。Xa31赋予对A3842的抗性和对JW89011的中等抗性，而Xa21显示出对这两株菌株中等易感型或易感型表型。Xa31和Xa21都不赋予对非洲菌株1947的抗性。在绝大多数Xa31或Xa21与Xoo病原体的不相容反应中，Xa31植物相对于Xa21植物损害长度更短。在本研究中所测定的Xa21的不相容反应(表1中的R和MR)中观察到的损害比在先前的研究中观察到的损害更长(Wang et al.1996)，这可以被部分归因于在本研究中所使用的更高的接种温度(参见材料和方法)。菌株A3842和泰国2被检测到与先前的研究中的Xa21不相容(Wang et al.1996)，但在本研究中是相容的。在绝大多数Xa31与Xoo菌株的不相容反应中，在切割区域接种3-4天后观察到褐色损害。褐色损害在显示出高抗性表型、接种两周后的平均损害长度小于0.5cm的那些叶子的感染部位更为明显。针对病原体的褐变反应也在Xa3与其不相容的Xoo菌株间的相互作用中被观察到(Kaku and Ogawa2000)。在Xa21与其不相容的Xoo菌株间相互作用的早期阶段观察到褐变反应。Xa31和Xa21针对细菌的褐变反应之间的区别表明这两个基因的抗性机制可能在分子水平上不同和/或通过不同的信号传导途径发挥功能。

用两个不同的Xoo菌株，PXO99和T7174，对Xa31在不同发育阶段对细菌性黑枯病的反应进行评估。PXO99是菲律宾小种6的一个代表性的菌株，而T7174是日本小种1的一个代表性的菌株(Song et al.1995；Yoshimura et al.1998)。每周用细菌性黑枯病病原体接种IR24和IRBB31，从两周龄植物开始直至7周龄植物。仅有主茎(从幼苗阶段至活性分蘖阶段)或各分蘖(活性分蘖阶段后)的1-2个年幼的完全展开叶被选择用于接种。从幼苗阶段(4-5周之前)至成体植物，IR24对这两株Xoo菌株高度易感(图2)。但是，如果病原体是在孕穗期(8周后，在新加坡IR24的生活周期约为95天)后被接种到IR24植物上，则发现细菌性黑枯病的发展程度降低了(数据未显示)。IRBB31对这两株Xoo菌株直至4周龄仍是易感的，尽管相对与IR24其具有更短的损害。IRBB31对细菌性黑枯病病原体的抗性在4周龄后急剧增加，并在5周龄达到几乎完全抗性。因此，Xa31所赋予的抗性可以被发育调节，并且似乎是在植物生长的后期才被激活或诱导。在其它的研究中也观察到了对细菌性黑枯病的抗性的发育调节(Goel and Gupta 1990；Ogawa 1993；Century et al.1999)。分子研究也证明了Xa21基因转录本的表达与Xa21疾病抗性的表达无关(Century et al.1999)。图2表示Xa31在不同发育阶段对水稻黄单胞菌水稻致病变种菌株PXO99和T7174的抗性。损害长度用平均数表示。不包括标准差(SD)。反应被标出。

表1.Xa31和Xa21在IR24遗传背景中对不同的Xoo菌株的抗性光谱的比较^a

^a用水稻黄单胞菌水稻致病变种接种6周龄植物。对于每一菌株，至少接种来自4株个体植物的16张叶。损害长度是16张被感染叶的平均值。标出了平均数的标准差。

^b损害长度(cm)。

^c标准差。

^d R，抗性，0cm＜损害长度≤3.0cm；MR，中等抗性，3.0cm＜损害长度≤6.0cm；MS，中等易感，6.0cm＜损害长度≤9.0cm；S，易感，损害长度＞9.0cm。

实施例2与Xa31基因座连锁的分子标记的鉴定和遗传作图

将RAPD(Willians et al.1990)和AFLP(Vos et al.1995)技术两者都被用于筛选与Xa31连锁的标记。为了在BSA和RAPD产物的个体筛选中检测到更多的多态性，本申请发明人将[³³P-α]dCTP添加到PCR混合物中用于标记RAPD产物，并在4.5％的聚丙烯酰胺测序凝胶上分离所述RAPD产物。对于每一引物，可以检测到大小在100bp-1500bp范围内的约20-50个条带。总共，筛选了1200个随机引物(Operon Technologies)，144个引物被发现检测到了抗性和易感池之间的多态性。然而，在用个体DNA样本对RAPD产物进行确认后，仅发现随机引物BE05可以重复地检测抗性和易感个体之间的多态性条带(数据未显示)。该多态性条带被命名为RM2，是与抗性等位基因相关的多态性DNA。由于一些未知的理由，RM2在所有与渐渗现象有关的亲本(小粒稻Acc.101141、IR31917-45-3-2、IR24和CO39)的BE05-RAPD产物中是不可检测的。RM2被成功地从干燥的聚丙烯酰胺凝胶上克隆到pGEM-T载体(Promega，Wisc.)中，其DNA序列被揭示为336bp长。然后将RM2展开在对应的RFLP探针中用于与Xa31作图群体的连锁分析。DAN杂交揭示RM2在培育水稻基因组中有至少4个拷贝，其中一个对于任一亲本都是非亲代的拷贝被连接到Xa31基因座上(数据未显示)。为了精确测定RM2和Xa31之间的遗传距离，用RM2对来自Xa31作图群体的1110个配子组成的837株植物进行筛选，鉴定到20个RM2重组体。因此，确认了RM2距离Xa31基因座1.8cM(图4B)。为了鉴定RM2和Xa31之间的标记，或位于RM2的另一侧对应于Xa31基因座的标记，本申请发明人用来自6个Xa31分离群的个体DNA样本进行了AFLP分析，所述分离群衍生自最初的6个可获自IR24遗传背景的RM2重组体。也用来自CO39遗传背景中的Xa31分离群的个体DNA样本进行平行试验(参见材料和方法)。全部64对EcoRI和MseI引物的组合被用于筛选个体之间的多态性。2对EcoRI和MseI引物的组合，E-AT/M-CAA和E-AT/M-CTA，被发现检测到了个体之间的多态性。这两个多态性条带被分别命名为AM1和AM2。在两个试验中，AM1在所有抗性个体中都是可检测的，但在易感个体中都是不可检测的(数据未显示)。AM2在来自CO39分离群的抗性个体中以及衍生自两个RM2重组体的6个抗性个体中被检测到(数据未显示)，这表明AM2已经补偿了6个RM2重组体中的2个，并被推测定位于RM2和Xa31之间。从所述两个遗传背景中克隆到的AM1、AM1(130bp)或AM2(212bp)证实是相同的。

由于AM1和AM2都太短不能用做RFLP分析的探针，且AM2含有一些重复序列，本申请发明人于是使用TAIL-PCR来获得两个推定AFLP标记的侧翼序列。使用嵌套引物A1F3和任意的简并引物AD3分离到了一个1059bp的DNA片段。该1059bp的片段在水稻基因组中仅有一个拷贝，当用限制性酶HaeII或AvaI消化时在抗性等位基因和易感等位基因之间显示出多态性。将该1059bp的片段命名为AM1-TAIL。类似地，使用嵌套引物A2F3和AD3扩增到了一个1238bp的DNA片段。但是，只有1081bp和1238bp的DNA片段在水稻基因组中显示出拷贝。然后用引物AM2-TAIL-F和AM2-TAIL-R(表2)从TAIL-PCR产物扩增到被命名为AM2-TAIL的1081bp的DNA片段。当用限制性酶SpeI或XbaI消化时，AM2-TAIL在抗性和易感等位基因之间显示出多态性。

通过对作图群体中Xa31基因座的两个标记的遗传连锁分析测定AM1-TAIL或AM2-TALL到Xa31的遗传距离。总的而言，通过AM1-TAIL从由3875个配子组成的全部2369个个体鉴定到了12个重组体。AM1-TAIL和Xa31之间的遗传距离为0.31cM(图4B)。通过AM2-TAIL从由642个有用配子组成的354个个体鉴定到了7个重组体。同时，从20个RM2重组体独立地鉴定到10个重组体。因此，在AM2-TAIL基因座获得了17个重组体，AM2-TAIL和Xa31基因座之间的遗传距离被估算为0.97cM(从1752(1110+642)个配子鉴定到17个重组体)(图4B)。由于AM1-TAIL和AM2-TAIL两者都能补偿彼此全部重组体(数据未显示)，这两个标记应该在Xa31基因座的侧翼(图4B)。图4A和图4B显示了高分辨遗传图谱以及在水稻染色体6的长臂上的Xa31的同线基因座的RGP(A)和在本研究中所产生的Xa31基因座(B)的BAC重叠群。相应于其在水稻染色体6上的遗传位置给出以cM计的遗传距离。RGP的BAC序列的登录号被标记在每个BAC上。RGP BAC插入物的重叠没有按规定比例绘制。遗传图谱中的重组体和配子的数目被标注在每个标记下。BAC出入物之间的重叠和每一BAC插入物的大小在B中是按规定比例绘制。垂直的虚线标志着相应标记的相对位置。包含Xa31基因座的98kb区域被指出。

实施例3将AM1-TAIL和AM2-TAIL整合到水稻连锁图谱中

AM1-TAIL和AM2-TAIL被用于将Xa31绘制在水稻连锁图谱上。为了这一目的，将来自DH作图群体的两亲本(IR64和Azucena)的基因组DNA(Huang et al.1994)用30种不同的限制性酶进行消化，并使用AM1-TAIL和AM2-TAIL作为RFLP探针进行印迹对多态性进行亲本调查。两个标记对所检测的30种限制性酶中的至少一种都显示出可检测的多态性。这两个标记被粗略地绘制在水稻染色体6的长臂上，标记RG424和RG162之间，以AM1-TAIL为远侧标记，以AM2-TAIL为近侧标记(图3)。AM1-TAIL和AM2-TAIL之间的遗传距离为2.1cM(图3)，其与获自Xa31遗传作图群体的1.28cM(0.31cM+0.97cM)的遗传距离(图4B)相当。RG424和AM2-TAIL之间的遗传距离为34.4cM，AM1-TAIL和RG162之间的遗传距离为12.0cM(图3)。在康奈尔(Cornell)图谱上，RG424(于染色体6上，70.4cM)和RG162(于染色体6上，104.6cM)之间的遗传间隔为34.2cM，这基本上覆盖了染色体6的长臂的一半(McCouch et al.2001)。图3显示了使用MAPMAKER2.0将与Xa31连锁的标记，AM1-TAIL和AM2-TAIL，绘制到水稻遗传连锁图谱中(Landeret Al.，1987)。AM1-TAIL(箭头标记)和AM2-TAIL(箭头标记)被绘制到水稻染色体6上。该图谱上的其它标记是来自S.McCouch(康奈尔大学)的RFLP标记。左侧的数字分别表示重组片段和遗传距离(cM)。用3.0的LOD记分域值测定标记最可能的图谱顺序，以Kosambi单位报道了所有的图距(cM)。

实施例4与Xa31连锁的标记在水稻基因组上的定位和精细遗传作图

由于日本水稻(O.sativa cv.Nipponbare)的染色体6的基因组序列可以从RGP站点获得且AM1-TAIL和AM2-TAIL两者在水稻基因组中都是单拷贝的，于是本申请发明人通过将这两个标记定位于水稻基因组序列上对Xa31基因座进行了精细作图。首先，本申请发明人用这两个标记对水稻的未完成的高通量基因组序列(Unfinished High ThroughputGenomic Sequences，htgs)进行BLAST分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.html)。AM1-TAIL可以从染色体6找到RGP PAC克隆P0486H12的AP003615的序列(对于AM1-TAIL上的位置19-1026，相同性＝999/1008(99％))。AM2-TAIL挑出了AP004571(RGP PAC克隆P0652A05)、AP004372(Monsando BAC克隆OJ1378E04)、AP003941(Monsando BAC克隆OJ111_E06)和AP003617(RGP PAC克隆P0502A05)(对于AM2-TAIL上的位置161-575，相同性＝412/416(99％)；对于AM2-TAIL上的位置589-1081，相同性＝462/494(93％))。序列分析表明后4个BAC或PAC克隆在染色体6上的AM2-TAIL基因座上重叠的克隆(数据未显示)。然后，本申请发明人从RGP站点下载了基因组序列以及AM1-TAIL和AM2-TAIL两侧的遗传标记。如图4A中所示，产生了Xa31基因座的遗传图谱和物理BAC/PAC重叠群。在RGP BAC/PAC重叠群上介于AM1-TAIL和AM2-TAIL之间的物理大小为480kb。为了确认该遗传图谱，选择了一个RGP标记，R674(由RGP的T Sasaki馈赠)，用于连锁分析。两个作图群体，一个含有32个抗性BC4F1个体，另一个含有37个抗性BC2F2个体(包括3个AM2-TAIL重组体)，被用于RFLP分析。杂交结果表明R674的与抗性相关的等位基因总是与抗性个体共分离，除与AM2-TAIL共享的3个重组体外。与RM2和AM2-TAIL重组体的连锁分析也显示有19个重组体被定位于R674基因座，其中17个重组体为与AM2-TAIL所共享，还有两个交换体(重组体)存在于R674和AM2-TAIL之间的20kb(RGP物理距离)区域中。

通过AM1-TAIL和AM2-TAIL鉴定到的重组体和介于它们之间的可获得的RGP的基因组序列使得本申请发明人能够基于RGP遗传和物理图谱对Xa31基因座进行更精细的遗传和物理作图。为了达到这些目标，本申请发明人基于可从Genbank获得的EST(表达序列标签)信息和水稻基因组中该区域的独特序列设计了标记。从Nipponbare扩增到推定的标记，并在Xa31亲本中调查多态性。试用了超过30个推定的标记，最终选择了4个标记和图2中所示的引物用于Xa31的精细遗传作图。标记3612EST2补偿了12个AM1-TAIL重组体中的11个，M3623补偿了17个AM2-TAIL重组体中的16个。通过RFLP分析对作图群体进行筛选，本申请发明人进一步确认了这两个标记被紧密地连接于Xa31。M3623是最近侧的标记，而3612EST2是最近的远侧标记，因为这两个Xa31侧翼标记可以补偿彼此的重组体。分别通过近侧标记M3623和远侧标记3612EST2，两个重组体，24-2-2-943和24-10-3-2-147，被鉴定为离Xa31基因座最近(数据未显示)。这两个重组体最终分别通过两个EST标记3623EST1和3623EST3(表2)所补偿，所述标记定位在M3623和3612EST2之间的间隔中(图4A)。与Xa31基因座最紧密连接的RGP标记是近侧标记C12560S和远侧标记S12715，其侧翼有0.9cM的遗传间隔(图4A)。

总之，Xa31被作图至到M3623和3612EST2之间的0.052cM(从3875个配子鉴定到2个重组体)的间隔，在该基因座具有强烈的重组抑制，且在Nipponbare的基因组上的该合成区域的物理大小为146kb。

表2.在本研究中研制的分子标记列表

^a揭示与抗性相关的等位基因和与易感相关的等位基因之间的多态性的限制性核酸内切酶。

^b NA，不可利用。RAPD或TAIL-PCR产物被克隆到pGEM-T载体中间，插入物被M13引物扩增并被用做RFLP探针。

^c除操纵子引物BE05外的DNA片段。

^d除AD3引物外的DNA片段。

^ePCR产物被用做RFLP探针。

^f用于筛选BAC文库的探针。

实施例5Xa31物理重叠群的产生、精细遗传和物理作图

为了最终克隆Xa31基因，用50kb的平均插入物大小构建了5x-水稻-基因组-覆盖BAC文库。为了生成用于BAC文库筛选的新标记，基于AP003623的RGP序列设计了推定的在水稻基因组中具有单拷贝的1184bp的DNA片段，称为193M1(图4)，并通过PCR从Nipponabre扩增。通过来自Xa31BAC文库的191M1鉴定到3个BAC克隆，181F14(～120kb)、33M09(～37kb)和99N23(～34kb)。来自那些BAC克隆的插入物的BAC末端通过TAIL-PCR被分离(Liu et al.1998)。显示33M09和99N23两者的BAC指纹包含在181F14中，且那两个BAC在进一步研究中被废弃。为了在水稻染色体上步移，通过181F14F-末端鉴定到了5个BAC克隆，43L18、13O02、88K09、105N12和133J22；且只有一个克隆43L18被选择BAC指纹后用于进一步的研究。在另一个筛选试验中，EST标记3623EST3(表2和图4A)挑选了43L18和另一个BAC克隆109L05。因此，产生了含有181F14(～120kb)、43L18(116,495bp)和109L05(～120kb)的Xa31 BAC插入物的重叠群(图4B)。为了获得更多的分子标记，并在DNA水平上洞察Xa31基因座，通过Shotgun测序策略对43L18和部分109L05完全测序。总共，1,950,406bp的重叠DNA片段被测序，且它们被比对到包括来自43L18的1160,495bp的158,425bp共有序列中。

为了进一步确认Xa31基因定位于测序区域中。衍生自BAC末端和Short-gun克隆的分子标记被用于与Xa31作图群体的连锁分析。通过位于Xa31基因座的近侧的BAC末端标记43L18-R从1640个配子中鉴定到3个重组体。通过位于Xa31基因座的远侧的Short-gun标记A1047从3875个配子中鉴定到10个重组体，且这10个重组体为AM1-TAIL所共享。通过BAC末端标记43L18-F未从作图群体鉴定到重组体。Short-gun标记M3623+10K可以补偿M3623唯一的重组体。Xa31基因座的分子标记的物理排列示于图4B中。在实施例4中，Xa31基因被作图于M3623和3612EST2之间的间隔。在本研究中，所述间隔的物理大小被揭示为IRBB31中的98kb(图4B)。

实施例6Xa31基因组克隆的遗传补偿和分离

对M3623和3612EST1之间的98kb间隔的基因预测表明在该间隔中存在10个推定的开放读框(ORF)(数据未显示)。然而，所述开放读框中没有读框编码具有富亮氨酸重复(LRR)的蛋白质、核苷酸结合位点(NBS)和/或激酶受体结构域这些在许多R蛋白中的保守结构域。因此，通过将Xa31的基因组克隆导入易感水稻品种例如Taipei 309或Nipponbare中，并在转基因植物中寻找抗性表型，Xa31基因的分离将依赖于遗传补偿。

包含在BAC克隆43L18和109L05中的Xa31基因座的158,425bp基因组DNA被亚克隆到二元载体pC1300(CAMBIA)中(图5A)用于Taipei309的农杆菌介导的转化。制得了18个二元构建体，并将其用于水稻转化(图5B)。在该结构中的插入物的大小范围为从10kb-25kb。插入物之间的重叠区域的大小范围为从4Kb-12kb，平均大小为约8kb。在制备二元构建体中，也考虑了用该158,425bp序列对水稻EST进行Blast搜索和基因预测的结果。一种经改良的方法被用于通过农杆菌制备转基因植物(Yin et al.，2000)。根据Kaufman et al(1997)所描述的方法评价转化体对Xoo菌株对于PXO99的抗性。仅有健康且发育良好的转基因植物被用于疾病评估。表3概述了用所述18个二元构建体获得的转化体的疾病评估的结果。5个pC9913的转化体、4个pC14615的转化体和36个pC17561的转化体显示出对Xoo PXO99的抗性(R)或中等抗性(MR)(表3和图7)。PC14615、pC9913和pC17561在重叠区域具有5198bp(SEQ ID NO：1)的24190bp的重叠群中拥有插入物(图6A)。

转化体1-3的纯合子T2转基因植物被用于对不同的Xoo菌株的疾病评估。表5概述了用来自11个国家的Xoo菌株进行疾病评估的结果。Xa31转基因赋予对31个Xoo菌株的高抗性和对3个Xoo菌株的中等抗性，并显示出对一个Xoo菌株中等易感。非常有意思地发现Taipei 309遗传背景中的Xa31转基因提供了对5株能感染于IR24遗传背景中的IRBB31(Xa31Xa31)植物的Xa31相容性菌株(1947、C4、ZHE173、K202和2)增强的抗性。仍有待研究的由Taipei 309遗传背景中的Xa31转基因所赋予的这一增强的抗性是否是由Xa31转基因的过表达，或其它存在于Taipei 309中的可以特异性地修饰Xa31抗性的遗传因子所导致。

pC11909的60个独立转化体中仅有1个被测定在T0世代对PXO99具有抗性且该转化体的抗性表型可以被遗传到下一世代(T1)(数据未显示)。由于pC11909中的插入物与所述5198bp片段(SEQ ID NO：1)没有重叠区域，如果抗性基因型是由pC11909中拥有的转基因产生的或抗性表型是由于T-DNA插入或组织培养过程中转座子或反转录转座子的转座产生的，则在Xa31基因座可能存在其它的功能性元件。对该转化体的进一步的遗传表征正在进行中。

概而言之，在转基因植物中的对Xa31表型的遗传补偿强有力地表明Xa31基因定位于所述3个亚克隆构建体的插入物的5198bp(SEQ ID NO：1)重叠区域中。

图5A和5B显示了二元载体pC1300和在Xa31补偿研究中构建体插入物的重叠。图5A是具有限制性消化位点的二元载体pC1300(CAMBIA、堪培拉，澳大利亚)的图。用合适的单一的或两种限制性酶消化BAC43L18和109L05并将其亚克隆到pC1300的T-DNA的多克隆位点以生成用于经农杆菌AGL1.B转化水稻的二元构建体。亚克隆Xa31基因座的重叠群。通过Sequencher3.0所产生的插入物的重叠被按规定的比例显示。包括了M3623、A1047和Xa31基因座的基因组DNA。

图6A显示了在二元构建体pC17561、pC14615、pC9913、pC7023和cDNA 1中的插入物的重叠群。用表明转录的方向的箭头指示cDNA片段。图6B显示了5198bp片段的限制性图谱。长垂直线在该5198bp片段的侧翼，垂直的虚线标记了Nsi I和AvrII的相对位置。两个通过Sequencher3.0产生的图谱都按规定的比例显示。所有的R和MR转化体含有至少一个拷贝的通过Southern分析所揭示的T-DNA插入(数据未显示)。在T1和T2世代中确认了pC9913的转化体的抗性表型(表4和5，图8)。为pC9913的亚克隆之一的另一构建体pC7023也可以产生9株抗性T0植物(表3)。

图7显示了T0世代的Xa31转化体的表型。使用OD₆₀₀的光密度为0.5的细菌悬浮液，用Xoo菌株PXO99接种8周龄的水稻植物。使用叶剪切方法接种单株植物的至少5片完全展开的叶(Kauffman et al.1973)。被接种的植物被保持在温室中，接种14天后测量损害长度(DAI)。Taipei309(pC1300)，用对照组二元载体pC1300转基因的Taipei 309的T0植物；1-3(pC9913)，用pC9913转基因的Taipei 309的T0植物；IRBB31，在IR24遗传背景中的Xa31近等位基因系(NIL)；39(pC17561)，用pC17561转基因的Taipei 309的T0植物。

图8显示了T1世代的Xa31转化体的表型。使用OD₆₀₀的光密度为0.5的细菌悬浮液，用Xoo菌株PXO99接种8周龄的水稻植物。使用叶剪切方法接种单株植物的至少5片完全展开的叶(Kauffman et al.1973)。被接种的植物被保持在温室中，接种14天后测量损害长度(DAI)。IRBB31，在IR24遗传背景中的Xa31近等位基因系(NIL)；用对照组二元载体pC1300转基因的Taipei 309的T1植物；1-3/T1，用pC9913转基因的Taipei 309的T1植物。

表3转基因T0植物的疾病评估

¹用于补偿研究的构建体。

²R，抗性，损害长度≤3.0cm；MR，中等抗性，3.0cm＜损害长度≤6.0cm；

S，易感，损害长度＞9.0cm。

³pC1300作为载体对照组被用于水稻转化。

⁴在T1和T2世代中确认抗性表型。

表4用Xoo PXO99接种的转基因T1植物的表型

¹R，抗性，损害长度＜3.0cm。

²MR，中等抗性，3.0cm＜损害长度≤6.0cm。

³S，易感，损害长度＞9.0cm。

表5在转基因植物中赋予对多种Xoo菌株的抗性的Xa31基因

^a用水稻黄单胞菌水稻致病变种接种6周龄植物。对于每一菌株，至少接种来自4个个体植物的16片叶。损害长度为16片被感染叶的平均值。平均值的标准差被标出。

^b转化体1-3的纯合子转基因T3植物被用于疾病评估。

^c损害长度(cm)。

^d标准差。

^e R，抗性，0cm≤损害长度≤3.0cm；MR，中等抗性，3.0cm＜损害长度≤6.0cm；MS，中等易感，6.0cm＜损害长度≤9.0cmS；S，易感，损害长度＞9.0cm。

实施例7Xa31候选基因的cDNA克隆的分离和相应的来自IR24的Xa31的隐性等位基因的分离

为了分离Xa31候选基因的cDNA，制备了Xa31cDNA文库用于从实施例6的5198bp的片段(SEQ ID NO：1)筛选表达基因。在IR24中，Xa31的隐性等位基因的基因组克隆也通过使用衍生自抗性等位基因的序列的引物进行PCR而被分离。PCR产物的DNA序列比对显示从敏感型菌株IR24分离到了一个5131bp(SEQ ID NO：2)的重叠群。这一5131bp的基因组克隆对应于几乎全长的来自IRBB31的5198bp(SEQ ID NO：1)的片段。

为了进一步分离Xa31 cDNA克隆，将所述5198bp的片段的亚克隆用做探针对Xa31 cDNA文库进行筛选。从该cDNA文库分离到了一个带有20-nt的poly(A)的343bp的部分cDNA。为了获得全长的cDNA序列，通过5′-RACE从Xa31转基因植物分离到了一个363bp的cDNA片段。该363bp的cDNA片段含有一个与543bp的poly(A)cDNA重叠的313bp的区域。因此，推定的全长cDNA 1为593bp(SEQ ID NO：3)，其通过3′-RACE对全长cDNA 1的扩增进行确认(表6和7)。比较cDNA 1与其基因组克隆，在转录区中没有观察到内含子。在cDNA 1中仅存在1个推定的ORF，其编码一种具有113个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：5)。通过5′和3′RACE从IR24分离衍生自Xa31隐性等位基因的cDNA 1的同源物，cDNA 3(SEQ ID NO：4)(表6和7)。cDNA 1和cDNA 3几乎完全相同，除cDNA1较cDNA3具有更长的polyA尾巴外。

使用cDNA 1(SEQ ID NO：3)的dsDNA作为探针进行的Northern分析表明在Xa31基因座的转录物(cDNA 1或cDNA 3)在不用Xoo病原体接种的IRBB31和IR24中都是检测不到的(数据未显示)。可以在IRBB31和IR24两者中检测到3个3DPI的痕量的转录物，几乎没有差别(数据未显示)。

通过筛选cDNA文库以及进行5′或3′RACE来分离cDNA的努力未能在该5198bp(SEQ ID NO：1)的基因组区域内鉴定到除cDNA 1(SEQID NO：3)外的任何其它的表达区域。

BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/indcx.html)搜索表明在所述113个氨基酸(SEQ ID NO：5)内没有检测到推定的保守结构域。所发现的仅有的相似性是SEQ IDNO：5的113个氨基酸的序列在其C-末端(62-113)显示出与大鼠或人神经内分泌转换酶1(NEC1)前体(EC3.4.21.93)的信号和前肽区域有36.8％或38.2％的相同性(数据未显示)。

Xa31基因的IRBB31(抗性)和IR24(易感)等位基因的转录物是相同的。但是，在5′调节区观察到了两个等位基因(SEQ ID NO：49、SEQID NO：51和图9)间的单核苷酸多态性(SNP)的差异和缺失。在IR24等位基因的启动子中的推定的TATA盒的20bp上游鉴定到了两个25bp的串联重复，但仅在IRBB31等位基因的该区域发现该25bp元件的一个拷贝。此外，如果与IRBB31等位基因相比较，在IR24等位基因的推定的TATA盒的3′端检测到3个核苷酸的缺失。GFP标签研究表明IRBB31和IR24等位基因的功能性末端是相同的(SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：51)(数据未显示)。图9显示了在Xa31候选基因(部分)的(IBB31)抗性和(IR24)易感等位基因的TATA盒区域的启动子的比较。掺入缺口(用″-″表示)以得到两个序列的最大比对。序列下的圆点表示在IRBB31和IR24等位基因间的差异。转录的起始位点在序列下被标记为+1。113个氨基酸的第一个密码子用黑体标示。第一个25bp重复用斜体的大写字母突出，第二个25bp重复用斜体小写字母表示。推定的TATA盒被下划线标出。

总之，所述5198bp的基因组克隆(SEQ ID NO：1)、cDNA 1(SEQ IDNO：3)、cDNA 3(SEQ ID NO：4)和113AA(SEQ ID NO：5)被断定为是Xa31候选基因的基因组克隆、cDNA克隆和推导的多肽。Xa31候选基因的编码区在抗性和易感等位基因间是相同的。Xa31基因编码一种新的蛋白质，在其C-末端显示出与大鼠或人NEC1蛋白的相似性。对Xa31候选基因的表达的调节可能在于对编码区的5′上游或3′下游的调节。

表6用于通过5′RACE和3′RACE分离推定的Xa31(xa31)cDNA片段的引物^a

^a引物序列列于表7中。

^b SMART II A^TM寡核苷酸，5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGA

GTACGCGGG3′(SEQ ID NO：18)，被添加到5′RACE分析中第一链合成的反应物中。

表7表6中所列引物的DNA序列

常规材料和方法

植物材料和生长：从国际水稻研究组织(International Rice ResearchInstitute，IRRI)获得78-1-5BC2F3和IR24F1的杂种种子(R.NelsonandG.Khush)。78-1-5BC2F3的植物衍生自从栽培水稻IR31917-45-3-2和野生水稻种小粒稻Acc.101141之间形成的杂种(Amante-Bordeos et al.，1992)。通过用Xoo菌株PXO99接种对F1植物的疾病抗性进行评估，选择来自回交78-1-5-#169的高抗性植物进行等基因系的进一步回交。双倍体(DH)做图群体、野生型种小粒稻Acc.101141和其它在本研究中所使用的栽培种，即CO39、IR24和IRBB21由来自IRRJ的N.Huang和H.Leung馈赠。水稻栽培种Taipei 309由中国科学院遗传和发育研究所，北京，中国的W.Tian馈赠。水稻植物，包括用Xoo菌株接种的那些水稻植物，在新加坡于26℃(夜晚)至32℃(白天)的温度生长在温室中。

Xoo菌株和细菌黑枯病接种：Xoo菌株C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7由中国农业科学院(CAAS)的Qi Zhang馈赠。其它在本研究中所使用的Xoo分离物由堪萨斯州立大学的J.E.Lech馈赠。用Kauffman et al(1973)所描述的叶剪切方法进行细菌黑枯病接种。简单地说，Xoo菌株被生长在PSA培养基(10g/l蛋白胨、10g/l蔗糖、1g/l谷氨酸、16g/l细菌用琼脂，pH7.0)中2-3天。以OD600为0.5的光密度，将细菌细胞悬浮在灭菌水中。通过使用被浸泡在接种体中的剪刀从叶的顶部剪切5-6cm，将该细菌细胞悬浮液施用给每一分蘖的两片最嫩的完全展开的叶。接种后两周测量损害长度(LL)。疾病症状被归类为抗性(R，LL≤3.0cm)、中等抗性(MR，3.0cm＜LL≤6.0cm)、中等易感(MS，6.0cm＜LL≤9.0cm)和易感(S，LL＞9.0cm)(Amante-Bordeos et al.1992)。

DNA提取和Southern杂交：从如Dellaporta et al(1984)所描述的嫩叶提取水稻基因组DNA。用一种适当的限制性酶消化约2μg的水稻DNA，并通过电泳在0.65-0.8％的琼脂糖凝胶中分级。使用标准的程序(Sambrook et al，1989)进行Southern杂交。用Amersham Biosciences的Rediprime^TMII进行探针标记和信号检测。“严格杂交条件”是指(1)使用低离子强度和用于洗涤的高温，例如于50℃，0.015M NaCl/0.0015Msodium tatratc/0.1％十二烷基硫酸钠，或(2)在杂交过程中使用变性剂如甲酰胺，例如于42℃使用50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲溶液(pH6.5)，与750mMNaCl、75mM柠檬酸钠。另一个例子是于42℃使用50％甲酰胺、5×SC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt’s溶液、超声波降解的鲑精DNA(50mu g/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸盐；于42℃在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。或者，“严格杂交条件”是指其中与R.anatipestifer OmpA基因具有超过约80％的同源性，优选超过约90％的同源性，最优选超过约95％的同源性的核酸将与该基因杂交的条件。所述核酸可以被标记，例如，使用上述任何一类型的标记，或任选地可以使用与检测核酸相结合的标记的报道核酸。此外，可以使用本领域中已知的其它标记技术。随机扩增多态DNA(RAPD)分析：分别选择来自IR24遗传背景的Xa31分离群体的10株抗性F₂植物和10株易感F₂植物制备抗性池和易感池用于批量隔离分析(bulk segregant analysis，BSA)(Michelmore et al.1991)。将来自每一个体植物的等量的基因组DNA(10ng/μl)混合形成池。约10ng的池DNA被用于各RAPD(Williams et al.1990)反应。由操纵子技术(Alameda，Calif.)获得随机引物。按以下温度温育该反应混合物：94℃，120秒；继以40个循环的94℃，60秒；37℃，45秒；和72℃，90秒。在72℃温育5分钟后终止PCR。约0.1μl的[³²P-α]dCTP(3000Ci/mmol，AmershamBiosciences)被添加到各个反应混合物中用于标记PCR产物。将所述PCR产物变性，然后使用来自Bio-Rad(Hercules，Calif.)的Sequi-Gen测序细胞在4.5％的聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。将干燥的凝胶在Biomax XR胶卷(Eastman Kodak，Rochester，NY)上曝光2-3天。用包括在所述池中的20个单独的DNA样本进一步检测揭示池间的多态性的引物。来自小粒稻Acc.101141、IR31917-45-3-2和CO39的DNA样本也被进行单独的RAPD分析测试。

扩增限制性片段多肽(AFLP)分析：来自4组植物的DNA样本被用于AFLP(Vos et al.1995)分析。组R1和S1由来自CO39遗传背景中的F₂分离群的18株抗性或易感个体植物组成。组R2和S2含有来自IR24遗传背景中的6个RM2(RAPD maker 2，也参见结构部分)重组分离群的18株抗性或易感植物。根据AFLP^TM分析系统II的指导手册和AFLP小基因组引物试剂盒(GIBCO BRL)进行AFLP分析。通过使用E-0/M+C引物对获得了AFLP预扩增产物。为了选择性扩增，[³²P-γ]ATP标记的EcoRI引物与MseI引物被联合利用。全部64对EcoRI和MseI引物的组合被用于筛选所述4组的个体植物间的多态性。将扩增到的DNA片段变性，然后使用来自Bio-Rad的Sequi-Gen测序细胞在4.5％的聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。干燥的凝胶在Biomax XR胶卷上曝光2-3天。

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)根据Liu et al(1995)进行TAIL-PCR并进行一个小的修饰，即在次反应中进行15个超旋回，在三级反应中进行30个严格性降低的循环。任意简并引物是：AD1，NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT(SEQ ID NO：31)；AD2，NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA(SEQ ID NO：32)；AD3，(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA(SEQ ID NO：33)；AD4，NGTA(G/C)A(G/C)(A/T)GTNA(A/T)CAA(SEQ ID NO：34)；AD5，AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG(SEQ ID NO：35)；AD6，(G/C)TTGNTA(G/C)TNCTNTGC(SEQ ID NO：36)。BAG载体上的嵌套引物为：BACF1ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：37)；BACF2，GTAATACGACTCACTATAGGGCGA(SEQ ID NO：38)；BACF3，GAGTCGACCTGCAGGCATGCA(SEQ ID NO：39)；BACR1，CTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG(SEQ ID NO：40)；BACR2，GAGCGGATAACAATTTCACACAGGA(SEQ ID NO：41)；BACR3，TTAGGTGAGACTATAGAATACTCA(SEQ ID NO：42)(Liu et al.1998)。用于AM1-TAIL的嵌套引物为：A1F1(5’TAACAACATGAGAATTACTAATCCG 3’)(SEQ ID NO：43)、A1F2(5’CATGTATCCAAGTTCGTAGCTAG 3’)(SEQ ID NO：44)和A1F3(5’TTGGTTTTTTTGAATGAAGGGTATAT 3’)(SEQ ID NO：45)；用于AM1-TAIL的嵌套引物为：A2F1(5’AATTCATGCCCACAAGTACAGTAC3’)(SEQ ID NO：46)、A2F2(5’CTGAAACACAGGAAAAATCCCGTT3’)(SEQ ID NO：47)和A2F3(5’TGCATAGGCCCTGTTTAGTTCTAA 3’)(SEQ ID NO：48)。

Xa31连锁标记在水稻连锁图谱上的作图：将一个标准的作图群体用于Xa31连锁标记在水稻遗传连锁图谱上的作图。该群体由111个从印度品种IR64和日本品种Azucena间的杂种发育而来的双倍体(DH)品系组成(Huang et al，1994)。在DH作图群体中构建的遗传连锁图谱含有271个DNA标记。使用Mapmaker程序(Macintosh version 2.0)测定在本研究中所鉴定到的标记的连锁群或染色体定位(Lander et al.1987)。用3.0的LOD记分域值测定标记最可能的图谱顺序，以Kosambi单位报道了所有的图距(cM)。

BAC文库构建：根据Wang，et al.，(1995).Construction of a ricebacterial artificial chromosome library and identification of clones linked tothe Xa-21 disease resistance locus.The Plant J 7：525-533.中所详述的方案构建Xa31的细菌人工染色体(BAC)文库。简单地说，将Xa31纯合子植物(IR24BC2F2-13-552(Xa31/Xa31))在温室中生长7-10天。高分子量(HMW)核DNA被分离并被埋植到低熔点琼脂糖栓塞中用于通过HindIII进行部分消化。然后使用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)装置(CHEFMapper II，Bio-Rad)对部分消化的HMW DNA进行大小分级。通过从低熔点琼脂糖凝胶进行电洗脱(Strong et a1.，1997)回收大小分级的DNA(100-300kb)，并将其连接到经HindIII消化并去磷酸化的BAC载体pIndigoBAC-5上(EPICENTRE，Madison，WI53713，USA)。用Cell-Porator系统(GIBCO-BRL)将连接混合物经电穿孔进入大肠杆菌DH10B细胞中。人工挑选BAC克隆，并将其排列在每孔中有60μl冷冻培养基的384孔平板中。于37℃培养BAC克隆14-16小时，并储存于-80℃冰箱中。该BAC文库由约50,000个克隆组成，所述克隆具有大小范围在30-150kb、平均大小为50kb的插入物。这一文库的范围至少相当于水稻基因组的5倍。

BACDNA的测序使用shotgun方法对BAC质粒测序。通过在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳纯化BAC DNA，并通过电洗脱进行回收(Strong etal.，1997)。通过超声波降解对纯化的DNA进行剪切，然后在1％的琼脂糖凝胶中进行分级。使用凝胶提取试剂盒(QIAGEN)回收大小分级的DNA(1-1.5kb)。通过T4DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段对DNA片段的末端进行修饰。将被修饰的DNA片段克隆到pBluescript KS(+)(Stratagene)的EcoR V位点以生成shotgun文库。使用ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Applied Biosystems，Foster City，USA)和带有制造商提供的数据采集软件(PE Applied Biosystem)的ABI Prism 310遗传分析仪，用具有M13正向和反向引物的插入物的两末端对Shotgun质粒进行测序。

DNA序列分析：可公开获得的日本水稻的BAC(细菌人工染色体)或PAC(P1人工染色体，Baba et al.2000)序列是自水稻基因组序列计划(RGP)站点

(http://rgp.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/statusdb/stattable.pl？chr＝6&lab＝RGP)以及其它可利用的基因数据库中下载的。将DNA序列进行比对并使用

Sequencher 3.0程序进行分析。序列比对使用Pairwise BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html)进行。

CDNA文库构建：为了获得病原体诱导的以及组成型mRNA，用菲律宾Xoo菌株PXO99接种含有纯合Xa31基因的6周龄植物。在接种后第1、3、5和7天(DAI)采集3克5cm叶尖，并用

试剂(GIBCOBRL)建池用于RNA分离。用来自STRATAGENE的Uni-ZAp XR插入载体和试剂盒构建eDNA文库。该eDNA文库含有5.2×10⁶pu。

cDNA末端的快速扩增(RACE)：总RNA从用

试剂(GIBCOBRL)接种6天后(6DAI)的IRBB31、IR24和Xa31转基因植物的叶组织分离。5’和3’的eDNA末端的快速扩增都用获自CLONTECH的SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒进行。用于第一链cDNA合成、5’RACE和3’RACE、以及嵌合PCR(使用5’RACE或3’RACE产物作为模板进行第二轮PCR)的引物列于表6和表7中。

转化：农杆菌介导的Taipei 309或Nipponbare的转化根据如Yin et al.(2000)所描述的方法进行。简单地说，将旺盛生长的衍生自成熟胚芽的盾片的成胚愈伤组织与隐藏了二元构建体的根癌农杆菌(Atumefaciens)菌株AGL1共培养。共培养后，于26℃，将水稻组织在含有250mg/l头孢噻肟、200mg/l氨苄青霉素、2mg/l 2，4-D和50mg/l潮霉素的NB₀培养基中于黑暗中培养3-4周。在新鲜的选择培养基上对潮霉素抗性愈伤组织进行亚克隆2周，然后将其转移到含有1mg/l 6-BA、2mg/lNAA、5mg/l ABA和50mg/l潮霉素的NB₀培养基中培养3周。简单地，显示出潮霉素抗性的白色成胚愈伤组织被转移到含有2mg/l 6-BA、1mg/lIAA、1mg/l NAA、1mg/l KT和50mg/l潮霉素的NB₀培养基中；并于26℃，以14小时光照(约2000lux)和10小时黑暗的周期再生。再生的植物随后被移植到罐中的土壤中，并在温室中生长。

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Claims (7)

1.一种分离的核酸，其编码由SEQ ID NO：5所示氨基酸序列组成的多肽。

2.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸选自以下一组：

i)由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的核酸；

ii)由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列组成的核酸；和

iii)由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列组成的核酸；

3.一种载体，其包含权利要求1或2的分离的核酸。

4.权利要求3的载体，其还包含可操纵地连接于所述核酸的植物功能性启动子。

5.权利要求4的载体，其中所述启动子选自由组织特异性启动子、组成型启动子和诱导型启动子组成的组。

6.一种植物细胞，其由权利要求1或2的核酸所转化。

7.一种植物细胞，其由权利要求3-5中任一项的载体所转化。

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