CN101954074A - 表达pcv-2免疫原基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达PCV-2免疫原基因的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗及其制备方法和应用。具体地说涉及一种口服减毒鼠伤寒沙门氏菌，所述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌带有SEQ ID NO.1所示的序列，该重组细菌能表达PCV-2衣壳蛋白ORF2。将所述减毒鼠伤寒沙门氏菌接种LB培养基中培养18h，调整细菌浓度为10¹⁰CFU/ml，制得一种安全、有效的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗，用于预防猪圆环病毒病。

Description

表达PCV-2免疫原基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗及其制备方法 

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种表达PCV-2免疫原基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗及其制备方法。 

背景技术

猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是圆环病毒属的代表种，它是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，是目前兽医学上发现的最小的动物病毒。 

PCV可分为两个血清型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1对猪无致病性，为非致病性PCV，PCV-2对猪有致病性，可引起PMWS(断奶仔猪多系统衰竭综合征)，又称PMWS相关PCV。1991年加拿大首次爆发该病，随后世界上许多国家和地区都有该病的报道，目前我国的很多猪场均有该病存在，给我国的养猪业造成严重的经济损失。 

通过对PCV基因组分析，发现PCV-1和PCV-2均可能含有11个开放阅读框(0RF)。PCV各阅读框中，ORF1和ORF2为主要阅读框，现已证实ORF1编码是与病毒复制相关的Rep蛋白，而PCV-2的ORF2基因编码病毒核衣壳蛋白(Cap)，是PCV-2主要的结构蛋白，也是中和抗体识别的主要靶蛋白，既可诱导体液免疫，又可诱导细胞免疫。Liu等将ORF2基因连接到MBP-His(8)-tag基因3’端，在细菌中表达ORF2融合蛋白，发现该融合蛋白可被抗PCV-2多克隆抗体和PCV-2感染猪血清识别，表明ORF2蛋白与PCV-2的免疫反应性有关。Truong等用从实验性感染猪制备的PCV-2抗 血清，建立ELISA方法，发现PCV2-ORF2编码蛋白具有与抗原性相关的线性表位，其中从69-83和117-131残基的两个抗原表位对PCV-2来说具型有特异性，ORF2抗原表位可以作为PCV-2感染的血清学标志以检测PCV-2抗体效价。 

PCV-2是目前严重威胁养猪业发展的一种重要的病毒。目前对PCV-2的控制目前尚无疫苗。因此发展新型疫苗来控制PCV-2已是当务之急。 

减毒鼠伤寒沙门氏菌能通过粘附、侵袭、定居在肠道相关淋巴组织，有效地刺激机体产生粘膜、细胞和体液免疫应答，是携带抗原的良好载体和天然粘膜免疫佐剂，越来越广泛地应用于疫苗接种。根据共同粘膜免疫理论，以减毒伤寒沙门氏菌为载体制成的口服疫苗可在口腔、乳腺、生殖道、泪腺等粘膜部位诱发较强的粘膜免疫，且口服接种的方式安全。特别是近来利用不以抗生素作为选择压力的载体-宿主平衡致死系统构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗已显示出良好的应用前景。 

发明内容

本发明提供一种以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的PCV-2口服减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗，可作为预防PRRS感染的口服活载体亚单位疫苗。 

本发明提供的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗，其包含PCV-2结构蛋白ORF2，其中，上述的抗原亚单位ORF2来源于PCV-2陕西分离株。 

本发明还提供一种上述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的制备方法，步骤包括： 

1)制备ORF2基因。制备方法为：用PCR方法扩增了PCV-2陕西株ORF2基因，并将其克隆到pGEM-T easy载体，构建了pGEM-T-ORF2质粒； 

2)将上述的ORF2基因，插入到原核表达载体pYA3341的Ptrc启动子下游，构建含PCV-2的ORF2基因的重组表达质粒pYA3341-ORF2； 

3)将上述重组表达质粒pYA3341-ORF2转入第一中间宿主菌内进扩 增，所述的第一中间宿主菌株优选为大肠杆菌X6212； 

4)将上述重组表达质粒pYA3341-ORF2转入第二中间宿主菌内进行甲基化修饰，获得经甲基化修饰的重组质粒DNA。作为优选，所述第二中间宿主菌株优选为减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730； 

5)步骤4)中鉴定正确的甲基化修饰的重组质粒DNA转化终宿主菌株。将步骤4得到的甲基化修饰的重组质粒DNA通过电转化方法转化终宿主菌株中，诱导表达，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗。终宿主菌株优选为减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550，其中所述的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550优选为asd基因缺陷型菌株。 

此外，上述制备方法还包括如下鉴定步骤： 

6)鉴定步骤5)中得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗中ORF2的表达； 

7)通过Westem免疫印迹检测，检测步骤5)中得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗中ORF2的免疫原性； 

8)重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗攻毒保护实验； 

9)在有、无选择压力的情况下进行体外传代培养，鉴定重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗稳定性。 

具体地说，本发明提供一种制备猪圆环病毒重组活载体疫苗的方法：重组表达质粒转化终末宿主菌X4550后，培养18h，离心收集菌体，测定重组菌的CFU，调整重组菌的浓度使其达到10¹⁰CFU/ml。可通过口服免疫或加强免疫，口服免疫具体可为：约1×10¹⁰CFU/只/次，每次间隔1～2周；加强免疫具体可为：口服免疫2～4次后间隔一定时间口服加强免疫一次，这里所述的一定时问视生物体的情况而定，可以为一周或一个月等。上述的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550优选为asd基因缺陷型菌株。 

综上所述，本发明采用平衡-致死系统构建了表达PCV-2ORF2蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗株，并且构建的疫苗株无论有无选择压 力均能稳定地在体外传代培养，通过口服疫苗菌株免疫方案免疫小鼠和猪后证明该疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护效果。 

本发明的优点和积极效果为： 

1)成功构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体pYA3341-ORF2，可在宿主菌中表达PCV-2含有病毒中和表位的主要结构蛋白ORF2。本发明的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗具有下述优点：可以口服，免疫者易于接受；能够快速产生抗体，且产生的抗体水平较高；所表达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序；价格低廉；易于生产、储存和运输；可以避免现有技术中表达系统表达目的蛋白分离纯化的繁琐过程和缺陷：例如费时费力，代价昂贵，不能大规模应用于目的蛋白的规模化生产等。 

2)本发明利用鼠伤寒沙门氏菌是肠道菌得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌可刺激小鼠产生有效的体液免疫和细胞免疫，尤其有效地激发粘膜免疫应答； 

3)该载体-宿主平衡致死系统表达的ORF2蛋白可与PCV-2抗体发生特异性反应。 

4)本发明得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。 

5)本发明得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌具有很好的体外遗传稳定性，经多次传代后外源基因不丢失。 

6)本发明所使用的目的基因为PCV-2(血清2型，自陕西分离)国内分离株，从而构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌可作为我国预防PRRS的口服活载体疫苗。 

7)将ORF2基因克隆入原核表达载体而不是真核表达载体，降低了操作难度，提高了表达水平，制备方法易于大规模生产。 

附图说明

图1是重组表达质粒pYA3341-ORF2构建流程图； 

图2是PCV-2ORF2基因的克隆；图2中标号说明：M为DNA分子量标准(Marker)，泳道1为PCV-2ORF2基因PCR结果(大约570bp)。 

图3是重组表达质粒pYA3341-ORF2经双酶切获得目的基因，表明重组表达质粒构建成功；图3中标号说明：M为DNA分子量标准(Marker)，泳道1为PCV-2ORF2基因PCR结果，泳道2为重组表达质粒pYA3341-ORF2经双酶切获得目的基因-ORF2鉴定结果，泳道3为表达质粒pYA3341经双酶切鉴定结果； 

图4是重组表达质粒pYA3341-ORF2PCR鉴定；图4中标号说明：M为DNA分子量标准(Marker)；泳道1为重组质粒pYA3341-ORF2PCR鉴定结果； 

图5是重组蛋白ORF2的表达的SDS-PAGE分析；图5中标号说明：M为蛋白分子量标准；泳道1为重组鼠伤寒沙门氏菌pYA3341蛋白分析，无23ku的ORF2蛋白表达；泳道2为重组鼠伤寒沙门氏菌pYA3341-ORF2蛋白分析，表达了23ku的ORF2蛋白； 

图6是重组ORF2蛋白的Western blot分析；图6中标号说明：泳道1为同PCV-2阳性血清反应的重组鼠伤寒沙门氏菌pYA3341-ORF2表达的ORF2蛋白，2为重组鼠伤寒沙门氏菌pYA3341表达的蛋白与PCV-2阳性血清不反应(负对照)； 

图7小鼠脾脏、肠系膜淋巴结、回肠末端免疫荧光检测结果，其中7A为小鼠脾脏阴性对照(×200)，7B为免疫后小鼠脾脏免疫荧光检测(×200)，7C为小鼠肠系膜淋巴结阴性对照(×200)，7D为免疫后小鼠肠系膜淋巴结免疫荧光检测(×200)，7E为小鼠回肠末端阴性对照(×200)，7F为免疫后小鼠回肠末端免疫荧光检测(×200)； 

图8重组菌的生长曲线； 

图9免疫小鼠血清抗体水平； 

图10免疫猪血清抗体水平。 

具体实施方式

本发明利用pYA3341的载体-宿主平衡致死系统表达PCV-2ORF2保护性抗原，构建以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的PCV-2疫苗，并通过动物实验观察重组载体疫苗的免疫原性及免疫保护性，为发展新型的PCV-2疫苗提供实验依据。 

本发明用PCR方法扩增了PCV-2陕西株ORF2基因(具体序列见SEQID NO.1)，并将其克隆到pGEM-T easy载体，构建了pGEM-T-ORF2质粒。酶切pGEM-T-ORF2质粒，回收ORF2基因。将回收的ORF2插入到表达载体pYA3341的Ptrc启动子下游，构建含PCV-2的ORF2的重组表达质粒pYA3341-ORF2；将构建的重组表达质粒转入宿主-载体平衡致死表达系统感受态大肠杆菌X6212内，使其进行大量克隆，并用萘啶酮酸进行营养筛选。筛选后的重组质粒再次转入宿主-载体平衡致死表达系统的中间宿主菌沙门氏菌X3730甲基化修饰，同样用萘啶酮酸进行营养筛选。筛选的经甲基化修饰的重组质粒最后转入宿主-载体平衡致死表达系统的终末宿主菌沙门氏菌X4550，萘啶酮酸进行营养筛选。重组表达质粒分别经聚合酶链式反应(PCR)、酶切鉴定、免疫蛋白印记(western blot)试验进行检测，筛选获得阳性重组表达质粒菌株；将筛选的阳性重组表达质粒菌株分别免疫BALB/c小鼠和猪并进行了免疫学指标的检测。 

本发明所用的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550具有如下特征：其为asd基因缺陷型细菌，由于asd基因是DAP(二氨基庚二酸，革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分)生物合成途径中必需的酶，该基因的缺失可导致该突变株在无外源性DAP存在的条件下溶菌死亡，从而高效减毒。减毒鼠伤寒沙门氏菌能表达外源抗原，在哺乳动物中经口、鼻、直肠等粘膜途径免疫能诱导强大而特异的免疫反应。能够定居在宿主小肠和肠相关淋巴组织，不致病并且能稳定表达外源基因。所表达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序。 

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅以举例的方式提供，用于对本发明中的制备方法进行详细描述，以便更容易地理解本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。 

下面叙述本发明的具体实施方法： 

实施例1、PCV-2陕西株ORF2基因的克隆 

1.1引物的设计 

根据发表的PCV-2GX株(GenBank：EF675237)的基因组序列，设计1对特异性引物(P1/P2)。上游引物P1：5′-CCG GAATTCGCATGaatggcatcttc-3′5′端加上EcoR I酶切位点，下游引物P2：5′-ACGGTCGAC AAGTGGGGGGTCTTTAAG-3′，5′端加上Sal I酶切位点。预期扩增片断为570bp，含有去掉N端核定位区基因的完整的ORF2基因。1.2病毒基因组的提取 

1.2病毒基因组的提取 

取出-80℃保存的PCV-2细胞毒，按照宝生物工程(大连)有限公司的病毒DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA。PCR反应体系如下：10×PCRBuffer 5μL、dNTPs 4μL、P1/P2各1μL、rTaq 1μL、病毒DNA 3μL、加水至50μL。反应程序：95℃变性5min；94℃ 1min，56℃ 45s，72℃ 1.5min，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后取10μL PCR产物加入适量6×Loading Buffer于0.8％琼脂糖凝胶电泳，分析扩增产物。 

1.3PCR产物的纯化与回收 

参照上海生工UNIQ-10胶回收试剂盒说明书回收目的基因。 

2.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(氯化钙法) 

以无菌接种环刮取冻存于-80℃冰箱的大肠杆菌DH5α菌种，划线接种于不含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板，37℃培养16h左右。挑取单一菌 落，接种到100ml LB培养基中，37℃、250r/min振摇培养到OD600＝0.4～0.6，在无菌条件下将细菌培养液转移到两个无菌并以冰预冷的聚丙烯离心管中(以下操作均需无菌)，冰浴10min，使培养物冷却到0℃；4℃、2000r/min离心10min，弃上清，以10ml用冰预冷的75mmol/L CaCl2、10mmol/L(pH6.5)溶液重悬沉淀，冰浴10min，4℃，2000r/min离心10min，弃上清，以2ml用冰预冷的，含15％v/v、)甘油的75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris·Cl(pH6.5)溶液重悬每管沉淀，用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管200μl；标明菌株、体积和日期，置-80℃冰箱冻存备用。 

3.ORF2基因片段与pGEM-T easy载体的连接反应 

取0.5μg pGEM-T载体，加3～5倍摩尔量的ORF2DNA片段，2μl 5×连接缓冲液加水定容至10μl，最后加入1Weiss单位T4DNA连接酶，混匀并离心，16℃连接1～4h，取7μl连接反应液转化上述E.coli DH5α感受态细胞。 

4.转化 

将适量连接产物DNA(体积：质粒＜1μl，连接产物＜10μl，DNA＜50ng)加入200μl上述感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃水浴热冲击90s，冰浴冷却2min；加入200μl 37℃预热的LB培养基，37℃ 150r/min振摇培养50min；取培养液涂布于含Amp(50μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养14～16h后，得到转化菌落。 

5.质粒的提取(碱裂解法) 

挑取单个上述转化菌落，接种到2ml含50μg/ml Amp的LB培养液(下同)中，37℃ 250r/min振摇培养12～16h；将1.5ml转入微量离心管中，12000r/min离心30s，弃上清。以200μl冰预冷的溶液I(50rnmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)重悬沉淀，加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，颠倒数次混匀， 加入200μl用冰预冷的溶液III(3mol KAc，5mol/L冰乙酸)，颠倒混匀，4℃ 12000r/min离心10min，取上清，分别用等量饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次；加2倍体积冷无水乙醇，混合均匀，置-20℃ 30min，4℃ 12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤抽干。以20μl含终浓度20μg/ml RNA酶(无DNA酶)的TE(10mmol/L Tri s·HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0，下同)溶解沉淀，并于37℃水浴中作用30min，琼脂糖凝胶电泳检查或-20℃保存。 

6.重组质粒pGEMT-ORF2的酶切鉴定 

将1.0μg质粒DNA与适量水混匀，使其总体积为18μl，分别加入2～3单位EcoR I和Sal I限制性内切酶及1μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度水浴2～3h，琼脂糖凝胶电泳检查。酶切结果均与预计完全相同者，即为目的重组质粒。完全酶切后，-20℃保存，以备进一步鉴定或回收片段之用。 

7.携带PCV-2ORF2基因重组表达载体质粒的构建 

用EcoRI和SalI双酶切pGEMT-ORF2质粒，回收ORF2基因，将其插入到同样经过EcoRI和SalI双酶切的表达载体pYA3341，进行连接反应，构建含有ORF2基因的表达载体pYA3341-ORF2。具体构建过程如下： 

7.1制备“NA”LB平板 

将高压蒸汽灭菌后的LB液体培养基(含1.5％琼脂粉)置超净台内，待其温度冷却至50℃左右时加入萘啶酮酸(NA)至终浓度为20μg/mL混匀后立即铺制平板。 

7.2大肠杆菌X6212感受态细胞的制备(氯化钙法) 

同大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备方法。 

7.3ORF2基因片段与pYA3341载体的连接反应 

取0.5μg pYA3341载体，加3～5倍摩尔量的ORF2DNA片段，2μl 5×连接缓冲液加水定容至10μl，最后加入1Weiss单位T4DNA连接酶，混匀 并离心，16℃连接1～4h，取7μl连接反应液转化上述大肠杆菌X6212感受态细胞。 

7.4转化 

过程与步骤4相同。取培养液涂布于含NA(20μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养14～16h后，得到转化菌落。 

7.5质粒的提取(碱裂解法) 

同步骤5方法 

7.6重组质粒pYA3341-ORF2的酶切鉴定 

将1.0μg质粒DNA与适量水混匀，使其总体积为18μl，分别加入2～3单位EcoR I和Sal I限制性内切酶及1μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度水浴2～3h，琼脂糖凝胶电泳检查。酶切结果均与预计完全相同者，即为目的重组质粒。完全酶切后，-20℃保存，备用。 

8.甲基化修饰 

8.1中间宿主菌X3730感受态的制备 

采用电转化法制备减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730感受态细胞，整个过程要求在无菌条件下完成。具体实验步骤如下： 

(1)从-80℃冰箱取出减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730，手握解冻，用无菌铂丝直接蘸取X3730菌种在LB平板(含50μg/ml DAP)表面划线接种，37℃恒温倒置培养16～18h； 

(2)挑取1个直径约为2～3mm的单菌落接种至4ml LB培养液(含50μg/mlDAP)中，37℃，230r/min恒温振荡培养过夜； 

(3)按1∶100比例将培养物接种至50ml LB培养液(含50μg/ml DAP)中，37℃、230r/min恒温振荡培养2～3h； 

(4)取出100～200μl培养物检测OD600，当OD600介于0.8～1.0之间时，将培养物置于冰浴中10min，使培养物冷却到0℃； 

(5)4℃，5000r/min离心10min收集菌体，弃去培养液； 

(6)用2～5ml 10％的灭菌甘油洗涤后离心，重复3次，用10％的灭菌甘油悬浮细菌，使细菌数约2×1010个/ml，100～150μl/管分装，标明菌株、体积和日期，置-80℃冰箱冻存备用。 

8.2pYA3341-ORF2转化X3730感受态 

(1)取2～3μl pYA3341-ORF2加入到X3730感受态细菌中，混匀； 

(2)将混合液立即转移到预冷的0.2cm电转化杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放入电转仪样品槽中； 

(3)转化条件：Cuvette Gap 0.2cm，Voltage 2.5kV，Field Strengh 12.5kV/cm，Capacitor 25Uf，Resistor 200Ω，Time Constant 4.5～5.0msec； 

(4)电击后，马上取出电转杯，迅速加入37℃预热的SOC培养基中(含50μg/ml DAP)，并将菌液转移到无菌的eppendorf管中； 

(5)37℃、120r/min振摇培养45～60min，取100～150μl菌液涂布于LB固体培养基(含20μg/ml NA)表面，将平板正放于37℃培养箱中，待培养液完全被吸收后，倒置培养16～18h； 

(6)从筛选出的含有重组质粒pYA3341-ORF2的阳性菌X3730中提取出质粒。 

8.3获得甲基化的重组质粒pYA3341-ORF2阳性重组菌的鉴定 

因重组沙门菌中质粒拷贝数较低，利用PCR法进行鉴定，将PCR鉴定正确的重组子电转入终宿主菌x4550中，方法同前，并经PCR方法和双酶切鉴定，具体方法同前述方法。 

9.构建口服活载体疫苗菌株 

9.1终末宿主菌X4550感受态细胞的制备(电转化法) 

同8.1方法中间宿主菌X3730制备方法 

9.2甲基化重组质粒pYA3341-ORF2转化X4550 

中间宿主菌X3730的转化方法同8.2方法。同法构建空质粒菌X4550 (pYA3341)作为阴性对照。 

9.3阳性重组菌的鉴定 

因重组沙门菌中质粒拷贝数较低，利用PCR法进行鉴定，将PCR鉴定正确的重组子电转入终宿主菌x4550中，方法同前，并经PCR方法和双酶切鉴定，具体方法同前述方法。 

10.重组工程菌的诱导 

将重组工程菌接种于3ml LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20ml LB培养液中，37℃摇床培养(200r/分钟)待OD₆₀₀＝0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L开始诱导，于诱导后4小时取样并测定其OD600值，同时作空载体菌诱导对照。 

实施例2、SDS-PAGE检测PCV-2ORF2蛋白的表达 

重组菌X4550(pYA3341-ORF2)和空质粒菌X4550(pYA3341)分别接种于含20μg/ml NA的LB液体培养基中37℃振摇18h后，离心弃上清，收集菌体，加0.01M(pH7.2)PBS溶液重悬菌体后，加5×蛋白上样Buffer，煮沸15min，离心收集上清，于12％凝胶进行SDS-PAGE电泳。配制SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，待凝胶完全聚合后，拔出上样梳，用阴级缓冲液清洗上样孔并用滤纸吸干孔内水分。待测样本与蛋白分子量标准同时上样，当考马斯亮蓝到达凝胶底部时停止电泳。凝胶于固定液中固定30～60分钟，考马斯亮蓝加热至60℃染色20分钟，脱色液脱色至背景无色。UVP扫描分析电泳结果。 

实验结果发现，SDS-PAGE电泳显示ORF2基因在重组沙门氏菌X4550中有较高水平的表达，有分子质量约为23ku的目的蛋白条带出现，与预期的去掉信号肽ORF2蛋白分子量一致，而对照组菌未出现该蛋白条带(图5)。该实验结果证明了重组沙门氏菌X4550(pYA3341-ORF2)中能够表达ORF2蛋白。 

实施例3、Western免疫印迹检测ORF2蛋白的免疫反应性 

按照上述方法先进行SDS-PAGE电泳，经SDS-PAGE分离蛋白后，将其电转移至PVDF膜上。5％脱脂奶粉或3％牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tri s Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)37℃封闭2h，洗涤缓冲液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗涤3次，每次10～15min，将猪抗PCV-2阳性血清用封闭缓冲液稀释(1∶300)覆盖膜上，室温感作2h，洗涤3～5次，辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(1∶2000)室温感作2h，洗涤3～5次后，每次10～15min，最后用蒸馏水清洗一次，夹出PVDF膜稍晾干，配制ECL(enhanced chemiluminescence)工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒。然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒到数分钟，显影定影后蛋白质条带可清晰显示在X光胶片上。 

Western blot结果显示，在23ku处位置上有相应的蛋白条带(图6)，证明了重组沙门氏菌X4550(pYA3341-ORF2)中表达的ORF2蛋白能很好地与PCV-2阳性血清特异性结合。 

实施例4、重组菌体外稳定性试验 

将37℃振荡培养过夜的菌体按10％接种于含50μg/ml DAP的LB培养基中，继续培养12h，将上述培养物再按10％量接种于含50μg/ml DAP的LB液体中培养12h，如此连续培养四代至50h，相当于菌体传代100代。将培养物稀释10⁶倍，取100μl稀释液涂含50μg/ml DAP的LB琼脂平板，过夜培养后，随机挑选100个单菌落，转种在DAP-的LB琼脂平板上，如果质粒丢失，细菌不会在DAP-的LB琼脂平板上生长，以此测定重组质粒的稳定性。随机挑取20个菌落重培养，且进行PCR和酶切鉴定，以确定外源基因在鼠伤寒沙门氏菌宿主表达的稳定性。 

稳定性分析结果显示，两种重组菌中有选择压力组的各100个菌株，在不含DAP的平皿上生长的菌落数都为100个。各随机挑取20个菌落提取质粒，显示100％含有重组质粒。在无选择压力组，重组X4550 (pYA3341-ORF2)和X4550(pYA3341)菌传代后所挑取的100个菌落，在不含DAP的平皿上仅分别生长86和84个菌落，表明DAP非依赖性细菌占86％和84％。从中随机挑取20个菌落提取质粒，显示分别有16和15个含有重组质粒，DAP非依赖性细菌重组质粒的阳性率分别为80％和75％。 

上述实验结果说明依赖asd基因的宿主质粒平衡致死系统保护的重组减毒沙门氏菌质粒在体外不丢失，在体外能稳定传代。 

实施例5、重组菌生长曲线的测定 

挑取单克隆X4550(pYA3341-ORF2)和X4550(pYA3341)分别接种于含20μg/ml NA的LB液体培养基中，37℃振荡培养10h后，取50μl接种于5ml含20μg/ml LB液体培养基中，37℃振荡培养，每隔1h测定OD600值，绘制两种菌的生长曲线。 

重组菌生长曲线的测定结果如图8，从图8可以看出两种重组菌在接种3h后细菌呈对数生长，在12h以后OD600nm值开始稳定。 

重组菌生长曲线的测定结果表明，两种菌的生长状态基本一致，即表示在减毒鼠伤寒沙门氏菌中转入重组质粒，不影响该菌的生长。 

实施例6、重组菌的安全性试验 

重组菌的安全性，通过BALB/c小鼠口服不同剂量来确定。取BALB/c 小鼠各27只，分为3组，其中2组分别口服两种重组菌1×10¹²cfu/只，阴性对照组口服等体积PBS溶液，观察小鼠口服菌株后的反应及成活率。 

试验结果，BALB/c小鼠口服重组菌X4550(pYA3341-ORF2)和X4550(pYA3341)1.0×10¹²cfu 30d后，存活率仍为100％。与PBS对照组相比较，体重变化无明显差别，且无活动异常等不良反应。由此可见，重组菌株对小鼠是安全的。 

实施例7、重组疫苗株口服免疫后在小鼠脾、肠系膜淋巴结、回肠末端定植的检测 

重组菌经LB培养液培养后，用灭菌生理盐水洗涤1次，重悬于灭菌生理盐水中，以每只5×10⁹CFU活菌液口服免疫BALB/c雌性小鼠。免疫后随机分为6组，每组5只，于免疫后第2、7、14、21、28和35日各取1组，无菌取小肠、肠系膜淋巴结和脾脏，研磨后分别涂于含20μg/ml萘啶酮酸的LB平板上，37℃培养18h，菌落计数，统计分析。取疫苗免疫后的小鼠脾、肠系膜淋巴结和回肠末端进行沙门氏菌免疫荧光检测。 

实验结果表明，口服免疫后第2日，肠系膜淋巴结和脾脏定居的重组菌尚较少，随后渐增多，至第28日肠系膜淋巴结测不到定居的重组疫苗菌，脾脏于第35日也测不到重组疫苗菌(参见表1)。由此可见，该重组疫苗能较持续在体内存活28天左右，这有利于持久刺激机体的免疫应答。免疫荧光染色结果表明，重组菌X4550(pYA3341-ORF2)免疫组小鼠脾脏、肠系膜淋巴结和小肠可以看到较强的荧光，重组菌X4550(pYA3341)免疫组小鼠脾脏、肠系膜淋巴结和小肠切片没有荧光(图7)，该现象证明重组菌定居在小鼠脾脏、肠系膜淋巴结和小肠中，并表达出ORF2蛋白。 

表1重组菌X4550(pYA3341-ORF2)口服免疫后在不同组织内的定居 

实施例8、重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYA3341-ORF2)小鼠免疫试验 

1、免疫小鼠 

BALB/c雌性小鼠15只，体重18～20g，随机分3组，采取口服免疫方式。小鼠口服接种前，禁食过夜，禁水4～6h。先用10％的NaHCO3溶液100μl灌胃以中和胃酸，30min后分别灌胃免疫X4550(pYA3341-ORF2)菌液、X4550(pYA3341)菌液及PBS各100μl(1×10⁹cfu/100μl菌液)，上述3组均免疫二次，间隔14天。 

2、T淋巴细胞增值试验 

(1)脾细胞的制备：颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于盛有RPMI1640培养基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，1500r/min，离心5min，弃上清。用Hank’s液离心洗细胞两次，重悬于含10％NBS的RPMI1640培养液中，计数，调至2×10⁶个/ml备用。 

(2)在96孔板中每孔加入淋巴细胞悬液100μl，对应孔中分别加入特异性刺激原ConA(10μg/ml)100μl作为阳性对照组、20μg/ml纯化PCV-2特异性刺激原100μl为试验组以及1640培养基100μl为非刺激抗原孔，不同刺激原重复3个孔；一只加200μl 1640培养基无淋巴细胞的孔作为本底。 

(3)68h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，避光培养4h；每孔吸弃100μl培养液，再加入DMSO 100μl，10min内用酶联免疫检测仪630nm 测定个孔OD值。 

(4)结果计算：SI＝(特异刺激原的平均OD值-本底值)/(非刺激原的平均OD值-本底值) 

实验结果，以刺激组A值/未刺激组A值表示各组的刺激指数(SI，表3)，将平均值记入表2，SPSS软件分析结果显示，X4550(pYA3341-ORF2)免疫组的SI值与PBS组和X4550(pYA3341)免疫组均有显著性差异(P＜0.05)。 

该结果证明X4550(pYA3341-ORF2)疫苗株能诱导动物体产生细胞免疫应答，具有良好的细胞免疫效果。 

表2T淋巴细胞增殖反应刺激指数 

3、ELISA测定免疫小鼠血清中抗PCV-2IgG抗体 

ELISA试剂盒中的包被抗原为灭活的PCV-2全病毒，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体。在酶联免疫仪492nm/630nm测量各孔OD值，以P/N＞2.1判为阳性。 

小鼠口服免疫后各组抗体水平结果统计分析见图9。结果显示，口服免疫X4550(pYA3341-ORF2)小鼠在免疫后产生抗ORF2特异抗体，且抗体水平逐步上升，在二免后4周抗体水平达到最高，抗体效价可达到1∶1200左右，二免后6周抗体水有所下降。X4550(pYA3341)免疫对照组和PBS非免疫对照组的抗体水平没有明显的变化。 

上述结果证明X4550(pYA3341-ORF2)疫苗株能诱导动物体产生相应的抗体，具有非常好的免疫效果。 

4、血清中和试验 

采用常规间接免疫荧光法测定血清抗体中和活性。固定病毒稀释血清，PCV-2用200个TCID₅₀/50μL，血清作连续2倍倍比稀释。同时设定阴性、阳性血清以及正常细胞对照。中和试验的结果以血清中和病毒后，不产生荧光的血清最高稀释度作为该份血清的中和抗体效价。 

试验结果表明，重组菌X4550(pYA3341-ORF2)免疫小鼠的血清中和滴度为1∶64，重组菌X4550(pYA3341)免疫组和PBS空白组小鼠血清没有中和活性，各个血清中和活性结果见表3。 

表3血清抗体的中和活性检测结果 

实施例9、重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYA3341-ORF2)免疫猪试验1重组菌X4550(pYA3341-ORF2)和X4550(pYA3341)的大量制备 

挑取1个的单菌落接种至4ml LB液体培养基(含20μg/ml NA)中，37℃、230r/min恒温振荡培养过夜；各按1∶100比例将培养物接种至50ml LB液体培养基(含20μg/ml NA)中，37℃、230r/min恒温振荡培养3～4h；各按1∶100比例将培养物接种至1000ml LB液体培养基(含20μg/ml NA)中， 37℃、230r/min恒温振荡培养15～16h；4℃，5000r/min离心10min收集菌体，弃去培养液；用100ml灭菌PBS重悬沉淀，使细菌数约10¹⁰cfu/ml。2实验动物的分组与口服接种 

将试验猪随机分为三组，每组5头，各组实验猪口服免疫，免疫方法如下：猪口服接种前，禁食过夜，禁水4～6h，免疫前先用10％的NaHCO3溶液100ml灌胃以中和胃酸，30min后分别灌胃免疫大量制备的X4550(pYA3341-ORF2)菌液、X4550(pYA3341)菌液和PBS各50ml(1～2×10¹¹cfu/50ml菌液)，2次免疫时间间隔14天。 

18.3实验猪血清中抗PCV-2ORF2抗体水平的检测 

间接ELISA法测定血清抗体的OD₄₉₀值。ELISA试剂盒中的包被抗原为灭活的PCV-2全病毒，二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体(1∶3000稀释)。分别于每次免疫后2周自前腔静脉采血并分离血清。用间接ELISA方法检测实验猪血清抗ORF2抗体效价，以待检猪血清OD₄₉₀/阴性血清OD₄₉₀平均值≥2.1(P/N＞2.1)判定为阳性，同组不同个体之间取几何均数为本组实验猪抗体的平均效价。 

猪口服免疫后各组抗体水平结果统计分析见图9。结果显示，口服免疫X4550(pYA3341-ORF2)猪在免疫后产生抗ORF2特异抗体，且抗体水平逐步上升，在二免后4周抗体水平达到最高，抗体效价可达到1∶250左右，二免后6周抗体水有所下降。X4550(pYA3341)免疫对照组和PBS非免疫对照组的抗体水平没有明显的变化。 

该实验结果证明X4550(pYA3341-ORF2)疫苗株能有效刺激诱导猪体产生相应的抗体，具有良好的免疫效果。 

3试验猪攻毒途径和剂量及攻毒后体温变化 

于二免后6周对猪鼻内接种PCV-2SX株(1×10^5.5TCID₅₀/0.1mL)，剂量为每头猪5mL。攻毒后每天观察猪的食欲、精神、消化、呼吸等临床表现，每两天测量直肠温度，观察攻毒后动物体温的变化。 

攻毒结果表明，攻毒8天后，PBS免疫对照组有4头对照猪的体温升到41℃以上，分别达到41.4℃、41.6℃、41.5℃和41.7℃，X4550(pYA3341)组有3头猪体温达到41.5℃、41.5℃、41.6℃和41.7℃，14天以后两组猪的体温都消退到40℃以下。X4550(pYA3341-ORF2)免疫组的猪整个过程中体温变化幅度不大。 

结论：X4550(pYA3341-ORF2)免疫组猪能抵抗PCV-2野毒的攻击，体温表现正常。 

4攻毒后免疫猪病毒血症的检测 

于攻毒前0天及攻毒后1、2、3、4、5、6周，采集各组猪的前腔静脉血，分离血清，按照1.2所述方法提取病毒RNA，用1.2所述方法针对PCV-2SX株ORF2的引物对进行RT-PCR，检测血清中的PCV-2核酸。 

试验结果见表4，RT-PCR检测血清中的病毒血症，攻毒后1周在各免疫组和对照组的血清中皆可检到PCV-2核酸，X4550(pYA3341-ORF2)免疫组PCV-2检出率为27％，X4550(pYA3341)免疫组和PBS免疫组PCV-2检出 率分别为80％和83％，X4550(pYA3341-ORF2)免疫组的PCV-2检出率明显低于这两个对照组。 

结论：X4550(pYA3341)免疫组攻毒后病毒血症阳性率滴于对照组，说明病毒在这些免疫动物体内存活数量少，表明X4550(pYA3341-ORF2)沙门氏菌具有良好的免疫保护作用。 

表4感染猪病毒血症的PCR检测结果 

总结 

获得的重组菌X4550(pYA3341-ORF2)提取基因组后进行PCR扩增，得预期大小的目的片段。酶切鉴定和测序确证及Western blot检测均为阳性结果，说明构建的重组表达载体pYA3341-ORF2可表达PCV-2糖蛋白ORF2囊膜蛋白。重组表达载体pYA3341-ORF2可在减毒鼠伤寒沙门氏菌的终末宿主菌X4550中表达，且经体外特性试验证实重组表达质粒pYA3341-ORF2具有良好的体外遗传稳定性；重组菌X4550(pYA3341-ORF2)具有良好的生长特性及安全性。将重组菌X4550(pYA3341-ORF2)大量扩增后进行小鼠免疫实验，可在免疫小鼠血清中检测到抗PCV-2的抗体，表明重组菌X4550(pYA3341-ORF2)刺激小鼠机体产生了特异性体液免疫。免疫小鼠淋巴细胞增殖试验结果均显示小鼠产生了特异性细胞免疫。在本属动物猪 体内检测的各种免疫学指标和小鼠检测指标相似。研究结果表明，本发明所构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是一种安全、有效的口服活载体疫苗，具有开发成为用于预防猪圆环病毒病的疫苗的良好前景。 

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。 

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>西北农林科技大学

<120>表达PCV-2免疫原基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗及其制备方法

<130>1

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>570

<212>DNA

<213>猪圆环病毒2型SX株去掉N端核定位区ORF2基因(Porcine circovirus type2 SX straindeleting N-terminal nuclear localization region ORF2 gene)

<400>1

aatggcatct tcaacacccg cctctcccgc accttcggat atactatcaa gcgaaccaca    60

gtcaaaacgc cctcctgggc ggtggacatg atgagattca atattaatga ctttcttccc    120

ccaggagggg gctcaaaccc ccgctctgtg ccctttgaat actacagaat aagaaaggtt    180

aaggttgaat tctggccctg ctccccgatc acccagggtg acaggggagt gggctccagt    240

gctgttattc tagatgataa ctttgtaaca aaggccacag ccctcactat gacccctatg    300

taaactactc ctcccgccat accataaccc agcccttctc ctaccactcc cgctacttta    360

cccccaaacc tgttcttgat tccactattg attacttcca accaaataac aaaaggaatc    420

agctttggct gaggctacaa acctctgcaa atgtggacca cgtaggcctc ggcactgcgt    480

tcgaaaacag tatatacgac caggactaca atatccgtgt aaccatgtat gtacaattca    540

gagaatttaa tcttaaagac cccccactta                                     570

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成的扩增PCV-2去掉N端核定位区ORF2基因的上游引物序列(The syntheticupstream primer amplifying PCV-2 deleting N-terminal nuclear localization region ORF2 gene)

<400>1

ccggaattcgcatgaatggcatcttc

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成的扩增PCV-2去掉N端核定位区ORF2基因的下游引物序列(The syntheticdownstream primer amplifying PCV-2deleting N-terminal nuclear localization region ORF2 gene)

<400>1

acggtcgacaagtggggggtctttaag

Claims (8)

1.一种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗，其特征在于包含PCV-2ORF2抗原亚单位，且所述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌带有如SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗，其特征在于所述的抗原亚单位来源于分离陕西株PCV-2。

3.一种在动物体内产生PCV-2免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求1-2中任一项所述的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗以口服接种的方式给予动物。

4.根据权利要求3所述的在动物体内产生PCV-2免疫应答的方法，其特征在于所述的动物为人工养殖猪或野猪。

5.根据权利要求4所述的在动物体内产生PCV-2免疫应答的方法，其特征在于所述的人工养殖猪或野猪为断奶仔猪。

6.权利要求1所述的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗在制备预防或治疗猪圆环病毒病的药物中的应用。

7.一种权利要求1所述的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)通过PCR方法获得PCV-2ORF2基因；

2)ORF2基因与原核表达载体pYA3341连接，得到重组表达质粒pYA3341-ORF2。

3)重组表达质粒转化第一中间宿主菌株，获得重组子；

4)重组子转化第二中间宿主菌株，鉴定阳性重组子；

5)步骤4)中鉴定正确的阳性重组子转化终宿主菌株；

6)诱导表达，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤5)中所述的终宿主菌株为asd基因缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550。

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