JP2008536499A

JP2008536499A - ブタサーコウイルス産生アッセイ

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Publication number: JP2008536499A
Application number: JP2008506739A
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Inventors: パトリスアリベルト; リオネルピエールキュピヤルド; ジャンレイエス
Original assignee: Merial Ltd
Current assignee: Merial Ltd
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2006-04-13
Publication date: 2008-09-11
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Also published as: US20060246425A1; CR9511A; WO2006113435A3; CN101194165B; PL1869471T3; PT1869471T; ES2589928T3; BRPI0607540B1; US7476507B2; RS55085B1; MX2007012786A; CN101194165A; BRPI0607540A2; EP1869471A2; CA2604691A1; KR101369656B1; JP5408998B2; HRP20161132T1; KR20070120603A; US20080241821A1

Abstract

本発明は、サーコウイルスに感染した宿主動物宿主細胞の培養物のウイルス価を決定するための方法を提供する。本発明のＦＡＣＳに基づく方法は、細胞培養培地上清中の宿主細胞、及び固体支持体に接着している細胞の生存率を決定することを含む。ウイルス抗原ＯＲＦ１及びＯＲＦ２を発現した細胞の割合を検出し測定することによって、培養宿主細胞のウイルス量を決定し得る。ウイルス収量は、例えば宿主細胞が無血清培地に移送されてから５〜７日で上清の細胞中の両方の抗原を検出及び測定することによって確定し得る。本発明の方法は、迅速な定量的データをもたらすことができる。これによって、インキュベーション期間に亘るウイルス産生の繰り返しのインプロセスモニタリング及び最も適切な収穫時点の即時の選択が可能となる。

Description

関連出願
本出願は、その内容が参照により本明細書中に明確に組み込まれている、２００５年４月１３日に出願した米国仮出願第６０／６７０，８９２号の優先権を主張するものである。

参照による組込み
該文献中又はその手続遂行において引用された全ての文献（「出願引用文献」）、出願引用文献中で引用され又は参照された全ての文献、本明細書において引用され又は参照された全ての文献（「本明細書における引用文献」）、及び本明細書における引用文献中で引用され又は参照された全ての文献は、本明細書において、若しくは本明細書において参照により組み込まれている任意の文献において記載されている任意の製品の、メーカーによる任意の取扱い説明書、説明書、製品規格、及び製品シートと共に、参照により本明細書中に組み込まれており、本発明の実施において使用され得る。

本発明は、蛍光抗体細胞選別による分析を用いたバッチインキュベーション産生プロセスにおける、ウイルス収量のインプロセスモニタリングの方法に関する。本発明はさらに、血清成分が欠乏している場合がある培地中のサーコウイルス感染細胞培養物のインプロセスモニタリングと収穫の方法に関する。

離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）は、最近認知された幼ブタの疾患である。カナダ、米国及びフランスで検出されたＰＭＷＳ症候群は、体重の漸減によって、並びに頻呼吸、呼吸困難及び黄疸などの症状によって、臨床的に特徴付けられる。病理学的な見地からは、リンパ球又は肉芽腫性浸潤、リンパ節症、及びよりまれではあるが、肝炎、及びリンパ球性又は肉芽腫性腎炎によって顕在化する（Clark E. G. (1997) Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 499-501、La Semaine Veterinaire No. 26, supplement to La Semaine Veterinaire 1996 (834)、La Semaine Veterinaire 1997 (857): 54、Nayar et al. (1997) Can.Vet. J. 38:385-387）。この疾患の治療及び予防は、現在のところない。しかし、いくつかの一連の証拠は、ブタサーコウイルスがＰＭＷＳの病原体であることを示唆する（Ellis et al. (1998) Can.Vet. J. 39:44-51）。サーコウイルスは、ＰＭＷＳのブタから回収されており、ブタサーコウイルスに対する抗体が、この疾患を有するブタにおいて示されている。

様々な植物種及び動物種に見出され、一般にサーコウイルスと呼ばれるサーコウイルス科（Circoviridae）と称されるウイルスのファミリーは、環状一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）を含有し、１７〜２３．５ｎｍの平均直径を有する、丸く、エンベロープを持たないビリオンとして特徴付けられる。サーコウイルスのｓｓＤＮＡゲノムは、公知の最も小さなウイルスＤＮＡレプリコンを表す。ＷＯ９９／４５９５６において開示されているように、The Sixth Report of the International Committee for the Taxonomy of Virusesによると、このファミリーのメンバーとして少なくとも６種類のウイルスが同定されている（Lukert et al. 1995, The Circoviridae, pp. 166-168. In Murphy, et al. (eds.) Virus Taxonomy, Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Arch. Virol. 10 Supp1.）。

このファミリーに含まれる動物ウイルスは、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、嘴羽毛病ウイルス（ＢＦＤＶ）、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、及びハトサーコウイルスである。ＰＣＶは、最初はブタ腎細胞培養物から単離された。ＰＣＶは、細胞核内で複製され、大きな核内封入体を生成する。Murphy et al. (1999, Circoviridae p. 357-361, Veterinary Virology, 3rd ed. Academic Press, San Diego)を参照されたい。２種類のＰＣＶであるＰＣＶタイプ１（ＰＣＶ１）及びＰＣＶタイプ２（ＰＣＶ２）が、現在認識されている。ブタ腎臓の連続細胞系ＰＫ−１５（ＡＴＣＣＣＣＬ３１）の持続汚染物質として単離されたＰＣＶ１は、細胞培養物中に検出可能な細胞変性効果をもたらさず、実験感染後のブタに臨床疾患を発生させない（Allan G. (1995) Vet. Microbiol 44: 49-64、Tischer et al. (1982) Nature 295:64-66及びTischer et al. (1986) Arch. Virol 91:271-276を参照されたい）。

何人かの著者がごく最近になって、ＰＣＶ株には病原性があり、ＰＭＷＳ症候群と関連する可能性があると考えた（Nayar et al. (1997) Can.Vet. J. 38: 385-387及びClark E. G. (1997) Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 499-501）。Nayarらは、ＰＣＲ技術を用いてＰＭＷＳ症候群を有するブタ中にＰＣＶのＤＮＡを検出した。ＰＣＶ２は、ＰＣＶ１と対照的に、離乳ブタにおける離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）と、密接に関連付けられる（Allan et al. (1998) Eur. J. Vet. Diagn. Investig. 10:3-10、Ellis et al. (1998) Can.Vet. J. 39:44-51及びMorozov et al. (1998), J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541を参照されたい）。

ＰＣＶ１のヌクレオチド配列は、Mankertz et al. (1997) J. Virol. 71:2562-2566及びMeehan et al. (1997) J. Gen. Virol. 78:221-227に開示されており、ＰＣＶ２のヌクレオチド配列は、Hamel et al. (1998) J. Virol. 72:5262-5267、Mankertz et al. (2000) Virus Res. 66:65-77及びMeehan et al. (1998) J. Gen. Virol. 79:2171-2179に開示されている。ＰＣＶ２株は、ＷＯ００／０１４０９に開示されており、European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porten Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdomに預託されており、アクセッション番号Ｖ９７１００２１９、アクセッション番号Ｖ９７００２１８、アクセッション番号Ｖ９７１００２１７、アクセッション番号Ｖ９８０１１６０８、及びアクセッション番号Ｖ９８０１１６０９が含まれる。ＷＯ００／７７２１６もまた、ＰＣＶ２について開示している。

１３個ものオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、ＰＣＶ２ゲノム中に同定された。代わりにＯＲＦ４として示されたＯＲＦ１（Meehan et al., (1998)）は、ヌクレオチド３９８〜４３４２（GenBankアクセッション番号ＡＦ０５５３９２）を含み、予測分子量３７．７ｋＤのタンパク質をコードする可能性を有する。代わりにＯＲＦ１３として示されたＯＲＦ２（Meehan et a1., (1998)）は、１〜３１４に結合したヌクレオチド１３８１〜１７６８を含み（GenBankアクセッション番号ＡＦ０５５３９２）、予測分子量２７．８ｋＤのタンパク質をコードし得る。ＰＣＶ２のＯＲＦ１〜１３のさらなる説明は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれている米国特許第６，３６８，６０１号、米国特許第６，３９１，３１４号、米国特許第６，６６０，２７２号、米国特許第６，２１７，８８３号、米国特許第６，５１７，８４３号、米国特許第６，４９７，８８３号、並びにＡＵ７６４３７９、ＥＰ１０１９５１０、ＭＸ２２１５６２、ＭＸ２１６９９６、ＲＵ２２３７４９２及びＮＺ５０５００８に見出し得る。

ＰＣＶ２のＯＲＦ１は、ＰＣＶ１単離物のＯＲＦ１に非常に似ている（８６％の同一性）（Meehan et al., (1998)）。ＰＣＶ１のＯＲＦ１タンパク質は、部分的に特徴付けられており（Meehan et al., 1997、Mankertz et al., (1998) Virus genes 16:267-276）、ウイルス複製に必須であり、ウイルスＤＮＡ複製に関連している可能性が最も高いことが示されている。

それぞれのＯＲＦ２の間のタンパク質配列の同一性は、ＯＲＦ１間より低かったが（６６％の同一性）、ＯＲＦ２の各々は、トリサーコウイルスであるニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）の主要な構造タンパク質のＮ末端領域において観察されるものと同様の、高度に保存されたＮ末端塩基性領域を共有した（Meehan et al., 1998）。最近、Mankertz et al., in (1998) J. Gen. Virol. 79:381-384は、ＰＣＶ１単離物のＯＲＦ２（Mankertz et al., 1998においてはＯＲＦ１と示される）は、キャプシドタンパク質をコードすることを示唆した。ＰＣＶ２のゲノムの転写解析はまだ公表されていない。ＰＣＶ１単離物で得られた最近のデータは、ＯＲＦ２転写物がスプライシングされていることを示した（Mankertz et al., 1998）。

現在までＰＣＶ２について公表された研究においては、野生分離株に由来する組織ホモジネート又は培養ウイルスを使用した。Tischer et al. ((1987) Arch Virol. 96:39-57)は、ブタ腎細胞が刺激を受けて、Ｄ−グルコサミン処理によって細胞周期のＳ期に入ることを報告する。しかし、Ｄ−グルコサミンは細胞培養において毒性であるために、この処理は注意深く行わなくてはならない（Allan et al. (2000) J. Vet. Diagn. Investigation. 12:3-14を参照されたい）。
米国仮出願第６０／６７０，８９２号ＷＯ９９／４５９５６ＷＯ００／０１４０９ＷＯ００／７７２１６米国特許第６，３６８，６０１号米国特許第６，３９１，３１４号米国特許第６，６６０，２７２号米国特許第６，２１７，８８３号米国特許第６，５１７，８４３号米国特許第６，４９７，８８３号ＡＵ７６４３７９ＥＰ１０１９５１０ＭＸ２２１５６２ＭＸ２１６９９６ＲＵ２２３７４９２ＮＺ５０５００８ Clark E. G. (1997) Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 499-501 La Semaine Veterinaire No. 26, supplement to La Semaine Veterinaire 1996 (834) La Semaine Veterinaire 1997 (857): 54 Nayar et al. (1997) Can.Vet. J. 38:385-387 Ellis et al. (1998) Can.Vet. J.39:44-51 Lukert et al. 1995, The Circoviridae, pp. 166-468. In Murphy, et al. (eds.) Virus Taxonomy, Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Arch. Virol. 10 Supp1. Murphy et al. (1999, Circoviridae p. 357-361, Veterinary Virology, 3rd ed. Academic Press, San Diego) Allan G. (1995) Vet. Microbiol 44: 49-64 Tischer et al. (1982) Nature 295:64-66 Tischer et al. (1986) Arch. Virol 91:271-276 Allan et al. (1998) Eur. J. Vet. Diagn. Investig. 10:3-10 Morozov et al. (1998), J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 Mankertz et al. (1997) J. Virol. 71:2562-2566 Meehan et al. (1997) J. Gen. Virol. 78:221-227 Hamel et al. (1998) J. Virol. 72:5262-5267 Mankertz et al. (2000) Virus Res. 66:65-77 Meehan et al. (1998) J. Gen. Virol. 79:2171-2179 Meehan et al., (1998) Meehan et al., 1997 Mankertz et al., (1998) Virus genes 16:267-276 Mankertz et al., in (1998) J. Gen. Virol. 79:381-384 Mankertz et al., 1998 Tischer et al. ((1987) Arch Virol. 96:39-57) Allan et al. (2000) J. Vet. Diagn. Investigation. 12:3-14

高収量のサーコウイルスが可能となるように、例えば、ＰＣＶ１、ＰＣＶ２及び他のサーコウイルスを含めたサーコウイルスを培養する方法に対する必要性が依然としてある。このような方法は、ＰＭＷＳに対するワクチンとして、特にＰＣＶ２抗原の調製のために有利であろう。本発明は、このような必要性に対処する。本発明は、バッチ培養中のウイルス産生の進行状況のインプロセスモニタリングを可能にする、感染性又は抗原性の量を増殖させ、定量化し、サーコウイルス、特にブタサーコウイルス（ＰＣＶ）に対する抗体を決定する方法に関する。

ブタサーコウイルスは、ブタ組織培養物中で汚染物質として検出することができるが、ウイルスの大規模なバッチ培養が成功するためには、ウイルス産生の進行状況の連続モニタリングを可能にし、最適化した収量を得るための迅速なアッセイを必要とする。したがって本発明の目的は、ＯＲＦの動的発現を調べることができるように、インビトロでブタサーコウイルスなどのサーコウイルスの培養の進行状況をモニタリングする方法を開発することであった。生ワクチンとして不活化ＰＣＶ又は非病原性ＰＣＶ株を必要とし得るワクチン産生のために、細胞培養物のウイルス収量を増加させることも意図した（例えば、様々な細胞培養物への適応後、及び／又は変異誘発物質による感染細胞培養物の処理後、又はＰＣＶの遺伝子組換え後の、非病原性ＰＣＶ株の選択によって）。さらに、増殖ブタサーコウイルスから得た抗原性材料は、診断の目的のために用いることもできる。したがって、ワクチン又は他の目的に適切なウイルス粒子を提供する条件下で、サーコウイルスのバッチ細胞培養の進行状況を定期的且つ迅速にモニタリングできる必要性がある。その目的のために現在用いられている労働集約的で時間のかかる方法ではなく、迅速に結果を出すことができるモニタリング方法に対する必要性が存在する。

本出願中の任意の文献の引用又は確認は、これらの文献が本発明に対する従来技術として利用できることを認めるものではない。

本発明は、ウイルスの最適収量が得られるように、サーコウイルスに感染した細胞培養物のインプロセスモニタリング及び有用な収穫時点の迅速な決定のためのＦＡＣＳに基づく手順を提供する。この方法は、サーコウイルス感染宿主細胞の種培養物を用意し、バッチ培養物にそれを接種し、種培養物をインキュベーションし、培養細胞の一定分量を取り出し、上清の細胞及び接着細胞を分離し、それらの基質から接着細胞を離間し、宿主細胞生存率を決定し、ＦＡＣＳによりＯＲＦ１陽性細胞及びＯＲＦ２陽性細胞の割合を決定することによって、培養物の収穫時点を決定することを包含する。

本発明の一態様は、宿主細胞の培養によるサーコウイルス抗原の産生を検出する、ＦＡＣＳに基づく方法を提供し、この方法は、サーコウイルスに感染した宿主細胞培養物から、非接着宿主細胞集団及び基質に接着している宿主細胞集団を含む試料を得るステップと、試料からその非付着宿主細胞を単離するステップと、試料から接着宿主細胞及びその基質を単離し、接着宿主細胞を基質から離間するステップと、非接着宿主細胞及び離間した接着宿主細胞とＯＲＦ１特異抗体とを接触させることによって、前記細胞中のＯＲＦ１の量を決定するステップと、非接着宿主細胞及び離間した接着宿主細胞とＯＲＦ２特異抗体とを接触させることによって、前記細胞中の感染細胞の割合を決定するステップと、試料中のＯＲＦ１陽性細胞及びＯＲＦ２陽性細胞の割合と試料中のサーコウイルスの量とを関連付けるステップとを包含し得る。

本方法の様々な実施形態において、サーコウイルスはＰＣＶ２でよい。様々な実施形態において、宿主細胞株は、ＰＫ−１５又は他の適切な細胞系でよい。しかし、本発明のこの方法は、単離した宿主細胞上で培養され、利用可能なウイルス抗原特異抗体がある、任意のサーコウイルス産生の検出及びインプロセスモニタリングのために有用に適用することができることが意図されている。

本発明の他の態様は、培養宿主細胞からのサーコウイルスの産生のインプロセスモニタリングのためのＦＡＣＳに基づく方法を提供し、この方法は、サーコウイルスに感染した宿主細胞培養物から時間依存性の複数の試料（一連の各試料は、非接着宿主細胞集団及び基質に接着している宿主細胞集団を含む）を得るステップと、細胞培養物の各試料からその非付着宿主細胞を単離するステップと、細胞培養物の各試料から接着宿主細胞及びその基質を単離し、基質から接着宿主細胞を離間するステップと、フローサイトメトリーを使用してヨウ化プロピジウム取込みを測定することによって試料中の宿主細胞生存率を決定するステップと、非接着宿主細胞及び離間した接着宿主細胞とＯＲＦ１特異抗体とを接触させることによって、前記細胞中のＯＲＦ１の量を決定し、それにより非接着細胞中及び離間した接着細胞中に存在するＯＲＦ１陽性細胞の割合を決定するステップと、ＦＡＣＳによって細胞に結合している抗体の量を決定し、結合した抗体の量と細胞中に存在するＯＲＦ１の量とを関連付けるステップと、非接着宿主細胞及び離間した接着宿主細胞とＯＲＦ２特異抗体とを接触させることによって、前記細胞中のＯＲＦ２の量を決定し、それにより非接着細胞中及び離間した接着細胞中に存在するＯＲＦ２陽性細胞の割合を決定するステップと、ＦＡＣＳによって細胞に結合している抗体の量を決定し、結合した抗体の量と細胞中に存在するＯＲＦ２の量とを関連付けるステップと、細胞生存率、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２のレベルの変化をグラフ化することによって、宿主細胞培養物中のサーコウイルスの産生の時間経過を決定するステップとを包含する。

本発明のこの方法の一実施形態では、細胞生存率は、ヨウ化プロピジウム及びフローサイトメトリーによって決定することができる。

本発明のこの方法の様々な実施形態において、サーコウイルスは、ＰＣＶ２でよく、宿主細胞株はＰＫ−１５でよいが、この方法は、この株のサーコウイルス／宿主細胞の組合せのみに適用できると解釈されるべきではない。

しかし、本発明の他の態様は、例えばワクチンの調製に有用であり得る収量のサーコウイルスを産生する方法であり、この方法は、ＯＲＦ１の発現のインプロセスモニタリングによってサーコウイルスの種培養物を調製するステップと、サーコウイルスの種培養物を宿主細胞培養物に接種するステップと、ウシ胎仔血清の非存在下で宿主細胞培養物をインキュベートするステップと、（ｉ）宿主細胞生存率、並びに（ii）宿主細胞によるＯＲＦ１及びＯＲＦ２発現をモニタリングするステップと、ＯＲＦ２発現が宿主細胞培養物の非接着細胞及び接着細胞中でほぼ同一である場合、宿主細胞培養物からサーコウイルスを収穫するステップとを包含する。

本発明のこの態様の様々な実施形態において、種培養物中のサーコウイルスの収量は、蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく方法を使用して、上清の宿主細胞中のサーコウイルスＯＲＦ１及びＯＲＦ２抗原の発現をモニタリングすることによって決定することができ、ＯＲＦ２が非接着細胞によって発現した場合に、種培養物が収穫される。

本発明のこの態様の様々な実施形態において、細胞生存率は、フローサイトメトリーを使用してヨウ化プロピジウム取込みを測定することによって決定し得る。

本発明のこの方法の様々な実施形態において、サーコウイルスはＰＣＶ２でよく、宿主細胞株はＰＫ−１５でよいが、この方法は、この株のサーコウイルス／宿主細胞の組合せのみに適用できると解釈されるべきではない。しかし、本発明のこの方法は、単離した宿主細胞上で培養され、利用可能なウイルス抗原特異抗体がある、任意のサーコウイルス産生の検出及びインプロセスモニタリングのために有用に適用することができることが意図されている。

本開示において、特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む（comprises）」、「含んだ」、「含んでいる」などの用語は、米国特許法に帰する意味を有することができ、例えば、それらは「含む（includes）」、「含まれた」、「含まれている」などを意味することができ、「から本質的になっている」及び「から本質的になる」などの用語は、米国特許法に帰する意味を有し、例えば、明確に列挙していない要素を許容するが、従来技術で見出される要素、又は本発明の基礎的若しくは新規な特徴に影響を及ぼす要素は除外することに留意されたい。

これら及び他の実施形態が、開示され、又は下記の詳細な説明から明らかであり、それらに包含される。

例として示され、記載する特定の実施形態のみに本発明を限定することを意図していない下記の詳細な説明は、参照により本明細書中に組み込まれている添付図面と共に最もよく理解され得る。

様々な文献が、下記文中に引用されており、様々な文献が、下記文中に引用した文献中に参照され又は引用されている。このような文献のいずれも本発明に対して実際従来技術であることは認めない。本明細書において引用した全ての文献、及び本明細書において引用した文献中で参照され又は引用された全ての文献は、参照により本明細書中に組み込まれている。

本明細書で使用する場合「フローサイトメーター」という用語は、液体培地中で懸濁している粒子に第１の波長の光を照射し、同一波長又は異なる波長の光を検出することができる任意の装置を示し、検出された光は細胞又は細胞上の指標の存在を示す。「フローサイトメーター」は、粒子又は細胞を、第２の光を発しない他の粒子又は細胞から単離することができるセルソーターに連結され得る。細胞表面上の指標は、これらに限定されないがＦＩＴＣなどのフルオロフォアに結合している抗体でもよく、蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）を実現する。

本明細書で使用する場合「宿主細胞」という用語は、ウイルス、好ましくはサーコウイルスの感染及び複製のための宿主である単離された細胞を示す。

本明細書で使用する場合「接着細胞」という用語は、インビトロで増殖し、基質に付着している動物細胞を示す。基質は培養物容器の表面でもよく、又はバッチ細胞培養物中の場合は、CYTODEX（商標）（Amersham Biosciences,Inc社製）ビーズなどの微粒子固体支持体でもよい。このような細胞は、これに限定されないがトリプシンなどのプロテアーゼを用いた制御条件下での消化を含めた、細胞内マトリックスの酵素消化を必要とする方法によって、根底にある固体支持体から取り出し得る。反対に、「非接着細胞」という用語は、培養期間中に基質から離れている培養細胞を示す。

本明細書で使用する場合、遺伝子、遺伝子座又はその転写物は、イタリック体の識別子を有し、それらから発現したタンパク質又はポリペプチドは、イタリック体でない識別子を有する。

本明細書で使用する場合「ＯＲＦ１」及び「ＯＲＦ２」という用語は、それぞれオープンリーディングフレームＯＲＦ１及びＯＲＦ２から発現したサーコウイルス抗原を示す（Meehan et al.,（(1998)J.Gen.Virol.78:221-227）により示されたように）。ＯＲＦ１は初期のレプリカーゼで、ＯＲＦ２はウイルスキャプシドをもたらすポリペプチドであると考えられている。１３個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、ＰＣＶ２ゲノム中で同定されている。ＰＣＶ２のＯＲＦのさらなる説明は、その内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている米国特許第６，３６８，６０１号、米国特許第６，３９１，３１４号、米国特許第６，６６０２７２号、米国特許第６，２１７，８８３号、米国特許第６，５１７，８４３号、米国特許第６，４９７，８８３号、並びにＡＵ７６４３７９、ＥＰ１０１９５１０、ＭＸ２２１５６２、ＭＸ２１６９９６、ＲＵ２２３７４９２及びＮＺ５０５００８に見出し得る。ＰＣＶ２の各ＯＲＦに割り当てられた様々な識別子間の対応関係を、下記の実施例１に示す。本明細書で使用する場合、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２は、（上記で参照した特許中に示されているように）それぞれＯＲＦ４及びＯＲＦ１３に相当する。

「インプロセス」という用語は、培養の期間に亘るウイルス感染細胞の培養を含めた、細胞及びウイルス培養の特徴を示すパラメーターのモニタリングを示す。モニタリングは、培養培地のｐＨ又は酸素含量のモニタリングなどの、連続モニタリングでもよく、或いは選択した時点で試料を培養物から取り出す定期的モニタリングでもよく、細胞生存率又はウイルス抗原含量などのパラメーターが検出及び測定され、パラメーターが培養時間に対してグラフ化される。

本明細書で使用する場合「種培養物」という用語は、サーコウイルスなどの選択されたウイルスに感染し、次いでウイルス価を増加可能にする一定期間インキュベーションされた宿主細胞の培養物を示す。必ずしもそうではないが、通常種培養物の量は、種培養物を与えられるそれに続く本培養物又は発酵培地の量未満である。

長年の法律規則に従って、特許請求の範囲を含めて本明細書で使用する場合、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という用語は、「１」又は「複数」を意味すると理解される。

略語：ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ＯＲＦ、ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列；ＰＫ、ブタ腎臓；ＰＣＶ、ブタサーコウイルス；ＰＫ−１５、ブタ腎細胞；ＦＡＣＳ、蛍光抗体細胞選別；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着検定法；Ｍａｂ、モノクローナル抗体；ＦＩＴＣ、フルオレセインイソチオシアネート；ＩｇＧ、免疫グロブリンＧ；ＰＢＳ／ＢＳＡ、リン酸緩衝生理食塩水／ウシ血清アルブミン

本発明は、サーコウイルス、特にブタサーコウイルスに感染した宿主動物細胞培養物のウイルス収量を決定する方法を提供する。しかし本発明の方法は一般に、特にバッチ培養手順の間に、細胞培養物上で増殖したサーコウイルスの任意の他の株又は種類に適用できる。本発明の方法は特に、ブタサーコウイルス株ＰＣＶ２のバッチ培養物のウイルス収量をモニタリングするために有用である。

本発明のＦＡＣＳに基づく方法は、細胞培養培地上清中の宿主細胞、及びこれらに限定されないがCYTODEX（商標）（Amersham Biosciences,Inc社製）などの固体支持体に接着している細胞の生存率を決定することを含む。培養宿主細胞のウイルス量は、非接着細胞及び離間した接着細胞中に存在するＯＲＦ１陽性細胞の割合を決定し、非接着細胞及び離間した接着細胞中に存在するＯＲＦ２陽性細胞の割合を決定し、試料中のＯＲＦ１陽性細胞及びＯＲＦ２陽性細胞の割合と試料中のサーコウイルスの量を関連付けることによって測定される。ウイルス収量は、例えば宿主細胞が無血清培地に移送されてから５〜７日目に上清の細胞中の両方の抗原を検出及び測定することによって確定される。

したがって本発明の一実施形態は、ＯＲＦ１とＯＲＦ２のどちらかに特異的なモノクローナル抗体を使用して、フローサイトメトリーによってウイルスタンパク質のＰＫ−１５宿主細胞中の免疫検出に基づいた、ＰＣＶ２の滴定に適切である新規なアッセイである。さらに、ＰＫ−１５細胞増殖の動態も、フローサイトメトリーによってモニタリングできる。本発明の方法の迅速さによって、高ウイルス収量を達成するために最適な収穫時点を決定することが可能となる。付随的コストの削減を伴って細胞のインキュベーション期間を最小化する一方で、例えばワクチンの産生のために有用なウイルス収量を得られる収穫時点を選択することができる。本発明の方法は、迅速に定量的データをもたらす。これによって、インキュベーション期間に亘るウイルス産生の繰り返しのモニタリング、及び最も適切な収穫時点の即時の選択が可能となる。

ウイルス価を測定する従来の方法は、はるかに遅く、数えられるプラークを形成するために検査試料の長期間に亘る培養を伴う。ＯＲＦ２モノクローナル抗体に基づいたＥＬＩＳＡを使用した免疫蛍光検出に基づいた、ＰＫ−１５細胞上で増殖するウイルスの従来のプレートアッセイは、時間がかかり労働集約的であり、有用な結果を得るために数日が必要となる。

本発明の一態様は、バッチ培養の時間経過において培養宿主細胞の生存特性を迅速に決定する方法である。この方法は、ウイルス産生のための任意細胞培養のモニタリングのために有用であり適切であるが、この方法は、ワクチン産生用ＰＣＶ２サーコウイルスのバッチ産生のための、ＰＫ−１５細胞の細胞培養物のインプロセス制御のために特に有用である。

本発明の方法のこの態様において、及び図１において例示されるように、バッチ細胞培養物の試料を、上清の（非接着性）細胞の集団及び固体基質に接着した細胞の集団に分ける。宿主のＰＫ−１５細胞の培養に使用するための基質は、例えばCYTODEX（商標）（Amersham Biosciences,Inc社製）ビーズであるが、組織培養の当業者に公知の任意の他の適切な材料を選択することができる。高密度の基質ビーズは、重力によって沈降し、非接着細胞を有する上清の培養培地は、吸引、デカンテーション、遠心分離などの種々の方法のいずれかによって取り出される。次いで基質に接着した細胞は、例えばトリプシン処理によって基質から離間することができ、細胞自体への損傷が最小の状態で、基質からの細胞の最大離間時点を確立するために、消化離間の程度が顕微鏡下でモニタリングされる。離間した細胞は回収され、２種類の所望の細胞集団の第２の集団をもたらす。

本明細書に記載するのは、これらに限定されないがＰＣＶ２などのサーコウイルスのＯＲＦ１又はＯＲＦ２タンパク質の１種又は複数のエピトープを特異的に認識することができる抗体の産生方法である。このような抗体には、それだけに限らないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ＦＡｂ発現ライブラリーによって産出したフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられ得る。有利には、本発明で使用される抗体は、サーコウイルスのＯＲＦ１及びＯＲＦ２遺伝子によって発現した、ＯＲＦ１又はＯＲＦ２タンパク質のいずれかに特異的なモノクローナル抗体である。最も有利には、ＯＲＦ１又はＯＲＦ２タンパク質は、サーコウイルスＰＣＶ２によって発現する。

抗体産生のために、様々な宿主動物を、単離したＯＲＦ１又はＯＲＦ２ポリペプチド又はその免疫原性ペプチドの注射によって免疫化し得る。このような宿主動物には、ほんの数例を示しても、それだけに限らないが、ウサギ、マウス、及びラットが挙げられる。様々なアジュバントを宿主種に応じて、免疫応答を増強させるために使用することができ、それだけに限らないが、フロイントのアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。免疫化ステップの完了に続いて、ＯＲＦ１又はＯＲＦ２タンパク質と反応する抗血清を回収して、所望であればポリクローナル抗ＯＲＦ１（又は抗ＯＲＦ２）タンパク質抗体が単離され得る。

ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物、又はその抗原性機能的誘導体などの抗原で免疫化した動物の血清に由来する抗体分子の不均質な集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、上述したような宿主動物は、これも上述したようなアジュバントを追加したＯＲＦ１又はＯＲＦ２タンパク質の注射によって免疫化され得る。

特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞系によって抗体分子の産生をもたらす任意の技術によって得ることができる。これらには、それだけに限らないが、ハイブリドーマ技術（Kohler & Milstein (1975) Nature 256: 495-497、及び米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al. (1983) Immunology Today 4: 72、Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2026-2030）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96）が挙げられる。手短に言えば、免疫化されたマウスから脾臓細胞を収穫し、不死化細胞（すなわち、骨髄腫細胞）と融合して、抗体産生ハイブリドーマをもたらす。ハイブリドーマは、ＯＲＦ１又はＯＲＦ２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体の産生のために免疫化学的に選別することができる。オーダーメードのポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体を得るための商業用供給源も利用できる。例えば、HTI Bio-Products,Inc.社（Ramona, Calif.）は、オーダーメードの抗体、抗血清、腹水及びハイブリドーマ系を産生する。

従来のモノクローナル抗体を産生し、単離し、精製するための手順は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれているCassone et al. (1988) J. Med. Microbiol. 27: 233-238、Hancock & Evan Production and Characterization of Antibodies against Synthetic Peptides pp23-33 in Immunochemical Protocols ed. M. M. Manson, (1992) (Humana Press, Totowa, N.J.)、Goding, J. W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., (1986) (Academic Press Ltd., London)及びLam & Mutharia, "Antigen-Antibody Reactions," pp104-132 in Methods for General and Molecular Bacteriology, ed. P. Gerhardt, (1994) (ASM Press, Washington, D.C.）に記載されたものと類似であってもよい。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含めた任意の免疫グロブリンのクラス及び任意のそのサブクラスでよい。本発明のＭＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養し得る。インビボでの高力価のＭＡｂの産生によって、これは現在好ましい産生方法となっている。

或いは、これらだけに限らないが、米国特許第４，９４６，７７８号、Bird (1988) Science 242: 423-426、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883、及びWard et al. (1989) Nature 334: 544-546などの単鎖抗体の産生のための記載された技術は、ＯＲＦ１又はＯＲＦ２タンパク質特異抗体を産生するために適応させることができる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖フラグメントを結合することによって形成し、単鎖ポリペプチドをもたらす。

特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントには、それだけに限らないが、抗体分子のペプシン消化によって生成することができるＦ（ａｂ’）_２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって生成することができるＦａｂフラグメントなどが挙げられる。或いは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速で容易な同定を可能にするように構成され得る（Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281）。

本発明により作製された抗体は、ＯＲＦ１若しくはＯＲＦ２タンパク質を含有する場合がある、細胞中又は細胞上、細胞抽出物、或いは他の生物学的製剤中の、ＯＲＦ１（又はＯＲＦ２）タンパク質を検出するために使用することができる。さらに、このような抗体は、抗原／抗体複合体を検出できるように検出分子で標識されることができる。適切な標識には、様々な酵素、蛍光分子、放射活性標識、化学発光分子などが含まれる。例えば、抗体を標識するのに有用な酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが含まれる。蛍光標識には、それだけに限らないが、フルオレセイン、ローダミン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられる。

２種類の細胞集団の細胞生存率は、下記の実施例２に記載のように、一定分量の単離された細胞集団と、生育不能細胞によってのみ細胞核へ取り込まれるヨウ化プロピジウムとを混合することによって決定される。染色細胞をフローサイトメトリーで分析し、例えば図２に示されているように総細胞数、並びに図３に示されているように試料集団中の生細胞と死細胞の割合を得る。

宿主細胞の細胞生存率測定に加えて、本発明の方法は、これも下記の実施例２に記載されているように、単離された細胞集団とウイルス抗原ＯＲＦ１及びＯＲＦ２に特異的な抗体とを接触させるステップをさらに含む。次いで細胞を洗浄し、これも実施例２に記載されているように、フローサイトメーターによって細胞結合蛍光を測定する前に、これらに限定されないがＦＩＴＣなどのフルオロフォアで標識された抗ＩｇＧ抗血清と接触し得る。

培地中にウシ胎仔血清を有する１リットルのバッチ培養物中で増殖したＰＫ−１５細胞上のＰＣＶ２ウイルスの増殖についての例示的な細胞生存率の結果を、図２、３及び４に示す。例えば、５日間のインキュベーション後の１つの実験において、全培養細胞集団の約５０％は、培地上清中に存在し、大部分は死んでいた。これは、CYTODEX（商標）（Amersham Biosciences,Inc社製）基質に接着し、生存していた残りの５０％の細胞と対照的であった。

ウシ胎仔血清を含有するバッチ培養物中のウイルス産生の測定によって、ＯＲＦ１は１日目及び２日目に一時的に、基質接着細胞中にのみ発現したことが示された。ＯＲＦ１は、例えば図６において示されるように３日目から５日目にのみ、上清の（又は非接着）細胞中に検出された。ウイルスキャプシド抗原ＯＲＦ２は、図６に示されているようにインキュベーションの第１日目以降インキュベーション期間に亘って連続増加を伴い、上清の非接着細胞中にのみ検出可能であった。

本発明の方法は、収穫時点まで上清（したがって大部分が死んだ）細胞中に発現するＯＲＦ１及びＯＲＦ２を検出することによって、サーコウイルス及び感染細胞の検出及びモニタリングを可能にする。これらのデータを得るときの迅速性によって、細胞培養物の感染の進行状況のたびたびの定期的なモニタリングを可能にする。次いで、例えばワクチン開発及び産生において使用するのに十分な質及び量のウイルスの究極の産生のために、大きなバッチの宿主細胞培養物を接種するのに適した高収量のウイルスを得る時点で、この培養物は収穫され得る。

本発明の方法の使用の結果として開発された種培養物は、１００〜１０００リットル程度の量の大量の細胞培養物に接種するために使用することができる。この手順において、上記で決定されたＯＲＦ２発現によって特に示されるような５日目又は他の時点で収穫された種培養物は、ウシ胎仔血清を含有する細胞培養培地を含む大規模な細胞培養物へと接種される。次いでＰＫ−１５細胞などの宿主細胞の生存率を、下記の実施例２に記載する方法によってモニタリングする。これには限定されないが約３日間でもよい当初のインキュベーション期間後に、細胞培養培地はウシ胎仔血清を含まない培地と交換することができ、インキュベーションは、例えば図７に示されるように、定期的なインプロセスの試料採取及び決定を伴い再び続けられる。

したがって本発明の他の態様は、ＦＡＣＳを使用してＯＲＦ１及びＯＲＦ２の産生をモニタリングすることによる、大規模な宿主細胞培養物中のサーコウイルス産生のインプロセスモニタリングである。実施例２に記載のように本発明の方法を使用して、所望のウイルス収量が一度得られれば培養物を収穫し得るように、従来の培養物をベースとする手順と比較した場合に、迅速により頻繁に細胞培養物をモニタリングしてもよい。例えば図７に示されるように、ウイルス特異抗原ＯＲＦ１及びＯＲＦ２の発現のために、培養物をモニタリングすることができる。通常、図７に示されているように、全ＯＲＦ１及びＯＲＦ２抗原の産生は、図７に例示されるように宿主細胞増殖のパターンを模倣する。例えば、下記の実施例５に記載するように、ＰＫ−１５細胞上で増殖するＰＣＶ２のマーカーＯＲＦ１及びＯＲＦ２は、４日目から７日目に直線的に増加し、基質に接着した接着細胞及び培地上清中の非接着細胞の両方について、同様の増加パターンを示す。

培養培地からの血清の除去は、ウイルス抗原発現を減少させ、開始を遅らせるが、これは培養物が５日目に収穫された場合特に顕著である。しかし、（培養物の接種の時点から決定して）５日を超えて培養を連続することによって、ＯＲＦ２抗原、すなわち成熟したウイルス粒子の収量を有意に増加させることができる（図７を参照のこと）。

したがって本発明は、ウイルスの最適収量が得られるように、サーコウイルスに感染した細胞培養物の、インプロセスモニタリング及び有用な収穫時点の迅速な決定のためのＦＡＣＳ手順を提供する。この方法は、サーコウイルス感染宿主細胞の種培養物を用意し、それでバッチ培養を接種するステップと、種培養物をインキュベーションするステップと、一定分量の培養細胞を取り出すステップと、上清の細胞及び接着細胞を分離するステップと、接着細胞をそれらの基質から離間するステップと、宿主細胞生存率を決定するステップと、ＦＡＣＳによって細胞試料中のＯＲＦ１及びＯＲＦ２の割合を決定するステップと、培養物の収穫時点を決定するプロセスとを含む。

本発明の一態様は、サーコウイルス抗原の産生が、オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）及びオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）陽性細胞の割合に関連している、ウイルス感染宿主細胞の培養によってサーコウイルス抗原の産生を検出する蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく方法を提供し、この方法は、サーコウイルスに感染した宿主細胞培養物からの、非接着宿主細胞集団と、基質に接着している宿主細胞集団とを含む試料から、（ｉ）非接着宿主細胞及び（ii）基質から離間した接着宿主細胞を単離するステップと、単離した非接着宿主細胞及び基質から離間した接着宿主細胞中に存在する、（ｉ）オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）陽性細胞の割合、及び（ii）オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）陽性細胞の割合を決定するステップとを含む。

本方法のこの態様の様々な実施形態において、サーコウイルスはＰＣＶ２でよい。様々な実施形態において、宿主細胞株はＰＫ−１５でよい。しかし、本発明のこの方法は、単離した哺乳動物宿主細胞上で培養され、利用可能なウイルス抗原特異抗体がある、任意のサーコウイルス産生の検出及びインプロセスモニタリングのために有用に適用することができることが意図されている。

本発明の他の態様は、細胞生存率、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２のレベルの変化をグラフ化することによって、宿主細胞培養物中のサーコウイルス産生の時間経過を決定する、培養宿主細胞からのサーコウイルスの産生のインプロセスモニタリングのための、蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく方法を提供し、この方法は、サーコウイルスに感染した宿主細胞培養物からの、非接着宿主細胞集団と、基質に接着している宿主細胞集団とを含む試料から、（ｉ）非接着宿主細胞及び（ii）基質から離間した接着宿主細胞を単離するステップと、非接着宿主細胞及び接着宿主細胞の生存率を決定するステップと、単離した非接着宿主細胞及び基質から離間した接着宿主細胞中に存在する、（ｉ）オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）陽性細胞の割合、及び（ii）オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）陽性細胞の割合を決定するステップとを含む。

本発明のこの方法の一実施形態では、細胞生存率は、フローサイトメトリーを使用してヨウ化プロピジウム取込みを測定することによって決定される。

本発明のこの方法の様々な実施形態において、サーコウイルスはＰＣＶ２でよく、宿主細胞株はＰＫ−１５でよいが、この方法はこの株のサーコウイルス／宿主細胞の組合せのみに適用できると解釈されるべきではない。例えば、本発明の方法は、一般に、ニワトリ貧血ウイルス又は嘴羽毛病ウイルス及び適切なトリ宿主細胞などの宿主細胞に適用され得る。

さらに本発明の他の態様は、血清がない条件でサーコウイルスを産生する方法であり、したがってワクチンの調製に有用である。この方法は、ＯＲＦ１の発現のインプロセスモニタリングによってサーコウイルスの種培養物を調製し、サーコウイルスの種培養物を宿主細胞培養物に接種するステップと、ウシ胎仔血清の非存在下で宿主細胞培養物をインキュベートするステップと、（ｉ）宿主細胞生存率、並びに（ii）宿主細胞によるＯＲＦ１及びＯＲＦ２発現をモニタリングするステップと、ＯＲＦ２発現が宿主細胞培養物の非接着細胞及び接着細胞中でほぼ同一である場合、宿主細胞培養物からサーコウイルスを収穫するステップとを含む。

本発明のこの態様の様々な実施形態において、種培養物中のサーコウイルスの収量は、蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく方法を使用して、上清の宿主細胞中のサーコウイルスＯＲＦ１及びＯＲＦ２抗原の発現をモニタリングすることによって決定することができ、種培養物は、ＯＲＦ２が非接着細胞によって発現した場合に収穫される。

本発明のこの方法の様々な実施形態において、ウイルス感染宿主細胞培養物中のＯＲＦ１及びＯＲＦ２抗原の発現は、蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく方法を使用してモニタリングでき、サーコウイルス抗原の産生は、オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）及びオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）陽性細胞ＦＡＣＳの割合と関連している。

本発明のこの方法の様々な実施形態において、サーコウイルスはＰＣＶ２でよく、宿主細胞株はＰＫ−１５でよいが、この方法は、この株のサーコウイルス／宿主細胞の組合せのみに適用できると解釈されるべきではない。しかし、本発明のこの方法は、単離した哺乳動物宿主細胞上で培養され、利用可能なウイルス抗原特異抗体がある、任意のサーコウイルス産生の検出及びインプロセスモニタリングのために有用に適用することができることが意図されている。

本発明は、本明細書に記載する特定の組成物、装置又は方法に限定されず、記載するものと同等である式又は方法ステップを有する任意の組成物は、本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。細胞培養物中の感染細胞の割合を決定するこの方法ステップは、説明した方法及びその同等と見なされる方法に従って、当業者がこの組成物を作製し使用することができるための例示にすぎない。ここに示し記載する本発明の形態は、本発明の好ましい実施形態を構成するが、本発明の全ての可能な形態を例示することは意図していないことも理解されよう。使用される言葉は、限定する言葉というよりは説明する言葉である。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変化及び変更が本発明になされ得る。

本発明を下記の非限定的実施例によってさらに説明する。

サーコウイルスＰＣＶ２のＯＲＦ識別子間の相関性
サーコウイルスＰＣＶ２のＯＲＦ、それらと同等の識別子、及び参照により本明細書中にその全体が組み込まれている各々のそれらの出典を、下記の表１に示す。Meehan et al. (1997; 1998)によって説明されているように、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２は、代わりにそれぞれＯＲＦ４及び１３として示されてきた。

ＰＣＶ２に感染したＰＫ−１５細胞中のＯＲＦ１及びＯＲＦ２を検出する細胞生存率のアッセイ
（ａ）細胞数及び細胞生存率の決定
ヨウ化プロピジウムを、原形質膜の完全性を評価するために使用した。ヨウ化プロピジウムは、核酸を染色する蛍光生体色素である。死細胞は、Galaxy血球計算器を使用したフローサイトメトリーによって赤色の染色として検出されたヨウ化プロピジウムを取り込む（フローサイトメーターの他の同様の機能モデルを使用し得る）。この血球計算器は、無染色の（生存）細胞、又はヨウ化プロピジウムによって染色された（死）細胞を、識別、検出、計数する性能を有する。使用する血球計算器の特定モデルのメーカー取扱い説明書に従って、２００μｌの体積中の細胞数を決定する。

細胞懸濁液１ｍｌを、Galaxy血球計算器用のチューブ内のＰＢＳ中で調製した。細胞懸濁液の希釈度を、１ｍｌ当たり約２×１０^４〜約１×１０^６個の細胞を有するように調節した（血球計算器による計数のリニアリティ値に対応する）。細胞懸濁液に、５μｌのヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）を添加した。次いで、懸濁液を数秒間ボルテックスミキサーにかけ、血球計算器で即座に分析した。血球計算器の典型的な設定は、ＦＳＣリニアスケールでは閾値で、ＦＬ３ログスケールでは検出された細胞の蛍光であった（ヨウ化プロピジウムチャンネルに対応する）。図２及び３に示すように、血球計算器のソフトウェアが、自動的に点グラフとして計数の結果を示した。

（ｂ）ＯＲＦ１及び／又はＯＲＦ２測定による感染細胞の割合の決定
１回のアッセイに、ネガティブコントロールのために１×１０^６、ＯＲＦ１検出のために１×１０^６及びＯＲＦ２検出のために１×１０^６として分取した、約３×１０^６個の細胞を必要とした。細胞の異なる量のために、試薬の量をそれに応じて適応させた。
（ｉ）固定：BD CytofixCytoperm（BD Biosciences社製、参照番号５５４７１４）を使用した。固定剤メーカーの推奨に従って、固定を行った。簡単に言えば、３×１０^６個の細胞を、１５ｍｌ又は５０ｍｌの円錐管中において６分間４００ｇで遠心分離機にかけた。上清を廃棄し、細胞をCytofix７５０μｌと共に再懸濁し、２０分間氷上でインキュベーションした。細胞を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で再懸濁した。染色する前に、試料を１５日まで５℃で保管した。
（ii）ＯＲＦ１及びＯＲＦ２の染色：固定された細胞を、６分間４００ｇで遠心分離機にかけた。上清を廃棄し、３００μｌの1×BD Perm Wash溶液を添加した。１００μｌの固定した細胞を９６マイクロウェルプレートの３つのウェルに分注し、６分間４００ｇで遠心分離機にかけた。上清を廃棄し、１００μｌの1×BD Perm Wash溶液を添加した。５μｌの抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。通常、５μｇのモノクローナル抗体−精製Ｍａｂ抗ＰＣＶ２（ＯＲＦ１）Ｎｏ１９９１Ｄ３ＧＡ（初濃度＝ｌｍｇ／ｍｌ）又は精製Ｍａｂ抗ＰＣＶ２（ＯＲＦ２）Ｎｏ１９０３Ａ８ＢＣ（初濃度＝ｌｍｇ／ｍｌ）で、各々の染色に十分であった。精製Ｍａｂ抗クロストリジウムＮｏ１０１Ｂ９Ｂ又は同等物（初濃度＝ｌｍｇ／ｍｌ）をネガティブコントロールとして使用した。

ウェルを氷上で３０分間インキュベーションした。細胞を1×BD Perm Wash溶液（２００μｌ／wash／ウェル）で２回洗浄した。次いで１μ１の抗マウスＦＩＴＣ（ＦＩＴＣと結合した抗マウスＩｇＧ（例えばBeckman社製、参照番号１１５−０９５−１４４６）又はその同等物）を含有する1×BD Perm Wash溶液１００μ１をウェル毎に添加し、ウェルを３０分間氷上で再びインキュベーションした。細胞を1×BD Perm Wash溶液（２００μｌ／wash／ウェル）で２回洗浄し、ウェル毎に２００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で再懸濁させた。
（iii）ＦＣＭによる検出：Galaxy血球計算器（Partec社製）などの血球計算器のための設定パラメーターは通常、ＦＳＣリニアスケールでは閾値で、ＦＬ１ログスケールでは検出された細胞の蛍光であった（ＦＩＴＣチャンネルに対応する）。

細胞のネガティブコントロール集団と比較した、感染したＰＫ−１５宿主細胞の集団中のＯＲＦ１の検出による蛍光活性中に示される代表的なヒストグラムを図３に示す。感染細胞の割合を計算するために、ネガティブ細胞の割合を、ＯＲＦ細胞の割合から引く。左側のヒストグラムでは、感染細胞は０％であり、一方図３の右側の実施例では、細胞の８８％が感染していた。

粒度分析によって決定した生細胞及び死細胞の通常の分布を図２に示し、感染宿主細胞集団の死によるヨウ化プロピジウムの蛍光シグナルのシフトを図４に示す。この場合、宿主細胞の８０％は死んでいた。

バッチ種培養物中のＰＣＶ２接種後のＰＫ−１５の数及び細胞生存率
図３に示されているように、ＰＫ−１５細胞上で増殖するＰＣＶ２ウイルスのバッチ種培養物のインキュベーション期間の５日目に、宿主細胞の５０％が上清中に存在し、大部分が死んでいた（７３％）。対照的に、宿主細胞の５０％は、CYTODEX（商標）（Amersham Biosciences,Inc社製）基質支持体上に存在し、ほぼ全体的に生存している集団であった（９６％）。

ＰＣＶ２に感染したＰＫ−１５細胞を５日目に培養の終わりに検出したが、フローサイトメトリーを使用して上清の細胞中にのみＯＲＦ１及びＯＲＦ２を検出した。例えば図６に示すように、ウイルス特異性抗原形成の動態は、ＯＲＦに依存していた。ＯＲＦ１は、初期に低水準で生成し、一方ＯＲＦはインキュベーションサイクルにおいてそれより遅くより高水準で生成した。

ＯＲＦ１及びＯＲＦ２全体染色
図６に示されているように、ＯＲＦ１では、培養物インキュベーション期間の後期の間に細胞膜に検出されたシグナルはなかった。下記の表２は、CYTODEX（商標）（Amersham Biosciences,Inc社製）に接着した細胞上に膜シグナルが検出されなかったことを示す。主要なＯＲＦ特異的シグナルは、培養上清からの細胞上にあり、２日目から５日目にかけて上昇していた。結果は、４日目に最高値が６０％であり、生細胞又は死細胞で同様であった。

３日後に血清を除去する、大規模バッチ培養におけるＰＫ−１５細胞上のＰＣＶ２サーコウイルスの培養
本明細書において引用した文献に従って、３００リットル発酵槽にＰＣＶ２ウイルスと共に５日間予めインキュベーションしたＰＫ−１５細胞の培養物を添加した。培養の３日後に、培地はウシ胎仔血清を含まない増殖培地と交換した。上記の実施例に記載されているように、各々の日に採取された試料について、ＰＫ−１５細胞生存率並びにＯＲＦ１及びＯＲＦ２の発現を試験した。

ウイルス抗原ＯＲＦ１及びＯＲＦ２発現の時間経過を、図７に示す。

本発明の好ましい実施形態を詳細にこのように説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって規定する本発明は、上記の説明に記載された特定の詳細によって限定されるものではなく、多くの明らかなその変形が本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなしに可能であることを理解すべきである。

上清及び接着ＰＫ−１５細胞の細胞培養物からの分離、並びにその中に含まれるウイルス抗原ＯＲＦ１及びＯＲＦ２の決定のための概要を例示する図である。生細胞及び死細胞を含めた細胞懸濁液中の全ＰＫ−１５細胞のフローサイトメトリー計測を例示する図である。ヨウ化プロピジウム取込みのシフト及びＦＡＣＳによる、ＰＣＶ２に感染したＰＫ−１５細胞集団中の死細胞の割合の検出を例示する図である。インキュベーション期間に亘ってウシ胎仔血清が存在する、ＰＣＶ２に感染したＰＫ−１５細胞の処理用種培養物の細胞生存率の時間経過を例示する図である。ＦＡＣＳによるＯＲＦ１免疫検出及び測定を例示する図である。処理用種培養物のインキュベーション期間における、ＰＣＶ２ウイルスＯＲＦ１及びＯＲＦ２抗原の産生を例示する図である。３日後に培養培地からＦＣＳの除去を行う、ＰＣＶ２ウイルスに感染したＰＫ−１５細胞中のウイルス抗原ＯＲＦ１及びＯＲＦ２の産生を例示する図である。

Claims

蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく、ウイルス感染宿主細胞の培養によるサーコウイルス抗原の産生を検出する方法であって、
サーコウイルス抗原の産生が、オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）及びオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）陽性細胞の割合と関連しており、
サーコウイルスに感染した宿主細胞培養物からの、非接着宿主細胞集団と、基質に接着している宿主細胞集団とを含む試料から、（ｉ）非接着宿主細胞及び（ii）基質から離間した接着宿主細胞を単離するステップと、
単離した前記非接着宿主細胞及び前記基質から離間した前記接着宿主細胞中に存在する、（ｉ）オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）陽性細胞の割合、及び（ii）オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）陽性細胞の割合を決定するステップと
を含む方法。
蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく、培養宿主細胞からのサーコウイルス産生のインプロセスモニタリング方法であって、
細胞生存率、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２のレベルの変化をグラフ化することによって、宿主細胞培養物中のサーコウイルス産生の時間経過が決定され、
サーコウイルスに感染した宿主細胞培養物からの、非接着宿主細胞集団と、基質に接着している宿主細胞集団とを含む試料から、（ｉ）非接着宿主細胞及び（ii）基質から離間した接着宿主細胞を単離するステップと、
前記非接着宿主細胞及び接着宿主細胞の細胞生存率を決定するステップと、
単離した前記非接着宿主細胞及び前記基質から離間した前記接着宿主細胞中に存在する、（ｉ）オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）陽性細胞の割合、及び（ii）オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）陽性細胞の割合を決定するステップと
を含む方法。
細胞生存率を、フローサイトメトリーを使用してヨウ化プロピジウム取込みを測定することによって決定する、請求項２に記載の方法。
サーコウイルスの産生方法であって、
サーコウイルスの種培養物を宿主細胞培養物に接種するステップと、
ウシ胎仔血清の非存在下で前記宿主細胞培養物をインキュベートするステップと、
（ｉ）宿主細胞生存率、及び（ii）前記宿主細胞によるＯＲＦ１及びＯＲＦ２発現をモニタリングするステップと、
前記宿主細胞培養物の非接着細胞及び接着細胞中のＯＲＦ２発現がほぼ同一である場合に、前記宿主細胞培養物からサーコウイルスを収穫するステップと
を含む方法。
蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく方法を使用して、種培養物中のサーコウイルスの収量を、上清の宿主細胞中のサーコウイルスＯＲＦ１及びＯＲＦ２抗原の発現をモニタリングすることによって決定し、ＯＲＦ２が非接着細胞によって発現する場合に前記種培養物を収穫する、請求項４に記載の方法。
細胞生存率を、フローサイトメトリーを使用してヨウ化プロピジウム取込みを測定することによって決定する、請求項４に記載の方法。
蛍光抗体細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく方法を使用して、ウイルス感染宿主細胞培養物中のＯＲＦ１及びＯＲＦ２抗原の発現をモニタリングし、サーコウイルス抗原の産生が、オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）及びオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）陽性細胞ＦＡＣＳの割合と関連している、請求項４に記載の方法。
サーコウイルスがＰＣＶ２である、請求項４に記載の方法。
宿主細胞がＰＫ−１５である、請求項４に記載の方法。