JP2003024057A - 生物物質からシルコウイルスを増幅する方法または除去する方法 - Google Patents

生物物質からシルコウイルスを増幅する方法または除去する方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 シルコウイルスの増幅または除去する方法の
提供。 【解決手段】 ブタ、ウシ、ヒトの細胞の培養細胞にお
いて、シルコウイルス、特にブタシルコウイルスを感染
させたそれらの細胞を一またはそれ以上の継代した後得
られたシルコウイルス、特にブタシルコウイルスを増幅
する方法および中和または除去する方法が開示されてい
る。ブタシルコウイルスが増幅すると、細胞培養物にお
いて細胞変性効果が生じる。シルコウイルスは抗体を含
有する基質、例えばブタ血清またはヒト免疫グロブリン
で処理することにより中和することができ、または低温
殺菌法により除去できる。不活性化または無発病性のシ
ルコウイルスを含有するワクチンおよび診断助薬もまた
記述されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、シルコウイルス、特にブタシル
コウイルス（ＰＣＶ）の増幅方法および感染量または抗
原量を定量する方法並びに抗体を測定する方法に関す
る。また本発明は生物物質からの医薬品の製造方法によ
りシルコウイルスおよびヒトのシルコウイルス様ウイル
スの減少を検出する方法に関する（１）。
【０００２】ブタシルコウイルスは大きさが約１７nmの
等軸のエンベロープを有さないウイルスであり、１.７
６kbの環状一本鎖ＤＮＡである。ブタシルコウイルス抗
体は、間接免疫蛍光検出（ＩＦＡ）法およびELISA法に
より、ヒト、マウスおよびウシ（cattle）由来の血清で
見出されてきた（２）。抗体は５３〜９２％の食肉用ブ
タにおいて検出される（３）。ＰＣＶの臨床的意義は依
然として判っていない。ブタ組織で病変を生じ病徴と関
連する可能性がある新型のブタシルコウイルスが最近検
出された；このいわゆる２型（ＰＣＶ２）は、主に病原
性の点で前述の１型（ＰＣＶ１）とは異なる（３および
４）。
【０００３】ブタシルコウイルスはブタ組織培養におい
て汚染病因として検出され得るが、今日までインビトロ
ではウイルスを培養することができず、ウイルスが複製
している細胞でウイルスの増幅および例えば細胞変性効
果(ＣＰＥ)に基づく定量的検出のためのルーチン試験を
確立できなかった（２）。
【０００４】しかし、ポリメラーゼ連鎖反応法によりＰ
ＣＶはリンパ節および脾臓、扁桃（腺）、肝臓、心臓、
肺、鼻の粘膜、腎臓、膵臓および腸の各細胞においてイ
ンビボで検出される（３）。ブタの器官はヒトへの移植
に用いられる（５）ので、ブタシルコウイルスはヒトに
とって潜在的に危険のあるウイルスとみなされるべきで
ある。
【０００５】それ故に本発明の目的は、ブタシルコウイ
ルスの感染性を検査できるようにインビトロでそれを培
養する方法を開発することである。治療目的のために、
例えばインスリン、へパリン、血液および血漿、細胞培
養用培地およびトリプシンを含むその成分を得るため
に、および組換え蛋白質を産生する細胞のためにこれら
の材料を直接的にまたは間接的に制限無く使用できるよ
うに、特異的抗体によりブタシルコウイルスを中和する
方法の開発およびブタ、ヒトまたは他の脊椎動物由来の
生物物質からブタシルコウイルスを除去する方法の開発
を更に目的とした。最後に細胞培養物においてＰＣＶの
増幅に成功したことにより従来方法によるワクチン産生
をも可能にすることを意図した。これには、不活性ＰＣ
Ｖまたは（例えば、いろいろな細胞培養物に吸着後およ
び/または感染した細胞培養物を変異原で処理した後ま
たはＰＣＶの遺伝的修飾後、無発病性のＰＣＶ株の選定
により）無発病性ＰＣＶ株を生ワクチンとして用いるこ
とが包含され得る。更にまた増幅したブタシルコウイル
スから得られる抗原性物質を診断目的で採用することも
できる。
【０００６】本発明の目的はブタ、ウシまたはヒトの細
胞培養物にシルコウイルス感染させ、一またはそれ以上
の継代後、増殖した感染細胞から得られるシルコウイル
ス、特にブタシルコウイルス（ＰＣＶ）を増幅する方法
により達成される。
【０００７】本発明の方法に関して、ＰＣＶに不顕性感
染したＰＫ１５（＝ブタ腎臓）細胞培養物から得られた
ブタシルコウイルスは、他の細胞培養物、特にブタ細胞
培養物の継代後、細胞変性効果を呈しつつこれらの細胞
培養物において増幅した。ブタシルコウイルスの存在が
この場合において特異的ネステッドポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）方法により証明された。以下のＤＮＡ塩基
配列を有するプライマーがこれに使用された： １．PCRプラス: GAG AGG AAG GTT TGG AAG AGG (946
−966) １．PCRマイナス: CCA CTG GCT CTT CCC ACA ACC (135
8−1338) ２．PCRプラス: GGT GAA GTG GTA TTT TGG TGC C (1025
−1046) ２．PCRマイナス: CTA TGA CGT GTA CAG CTG TCT TCC
(1326−1303) これらのプライマーは複製起点から選択された（７）。
【０００８】本発明の方法を行う場合、ブタシルコウイ
ルスは種種の哺乳類細胞およびヒト細胞の培養物全てに
おいて等しく十分に増幅できないということが観察され
た。いろいろなブタ組織由来、ウシ腎臓、ウシ肺および
ヒト肺由来細胞の培養物の増幅には成功した。ブタシル
コウイルスの成功した増幅に非常に適し、ブタ胎児精巣
由来で生育された細胞培養物は、ＤＳＭＺに寄託番号N
o.FSHO-DSM ACC 2466で寄託されている。
【０００９】ＥＬＩＳＡ法は血清に存在しているブタシ
ルコウイルスに対する抗体の定量的検出に大変適してい
る。これは支持体に吸着後シルコウイルスを調査したい
血清とインキュベートし、それにより血清に存在する一
次抗体に結合させことを必要とする。次いでその一次抗
体に対する二次標識抗体をそれと共に接触させその後結
合していないニ次抗体を洗い落とし、結合した標識抗体
から放射される光のシグナル（吸光度）を測定する。当
業者に知られたサンドイッチ法はシルコウイルス抗原を
検出するのに適している。それらの場合、支持物質に結
合するシクロウイルス抗体は調査対象の血清中の抗原に
結合する；それからシルコウイルス抗原に対する（標
識）抗体をそれと共に接触させ、その後結合していない
抗体を洗い落とし、結合した標識抗体から放射される光
シグナル（吸光度）を測定する。
【００１０】抗ブタシルコウイルス中和抗体を含有する
血清は、生物物質中のシルコウイルスを中和するのに適
している。中和抗体はブタ血清およびヒトイムノグロブ
リン(γ-グロブリン)において発見された。生物物質に
おけるシクロウイルスを中和するのに特に適しているヒ
トイムノグロブリンは、正常ドナーの力価、少なくとも
１０００ドナー由来の血漿プールで測定されるＰＣＶ抗
体の平均力価よりも少なくとも２〜３倍高い力価の特異
的抗体を有する高力価のヒトのドナーから得られたもの
である。
【００１１】生物源（例えばヒト血液／血漿由来、細胞
培養物由来、動物器官／組織由来）の医薬品のウイルス
安全性は、出典（例えば、CPMP／BWP／268／95：Note f
or guidance on virus validation studies: the desig
n, contribution and interpretation of studies vali
dating the interaction and removal of viruses；CPM
P／BWP／269／95 rev. 3: Note for guidance on plasm
a-derived medicinalproducts）により要求に応じて研
究されている;これらのいわゆるウイルス確認研究で、
生物学的製剤の製造方法の多様な製造工程においてウイ
ルスは故意に材料に添加され、そして本法工程によりウ
イルスの除去および／または不活性化が測定される。こ
の研究に使用されるウイルスは生物学的な開始材料に存
在する可能性があるか、これらのウイルスがインビトロ
で増幅できない場合は汚染するウイルスと同様な物理化
学的特徴を有するモデルウイルスであるかのいずれかで
あるべきである。ヒトシルコウイルスTTVのモデルウイ
ルスの一例はPCVである。生物物質由来治療組成物の製
造方法における一工程〜安定化された水性溶液中６０℃
で熱処理すること〜ブタシルコウイルスは不安定で数時
間以内で不活性されるらしいことができる;このように
生物製剤の製造方法で一回熱処理をするとＴＴＶが不活
性化する可能性を実証することができる。ＴＴＶを除去
(例えば析出、吸着またはクロマトグラフィーまたはろ
過処置による）またはＰＣＶを用いて（例えば、核酸に
挿入するカオトロピック塩または薬物、または高エネル
ギー線照射による）ＴＴＶを不活性化することができる
製造法の他の方法と類似して研究することが可能であ
る。更にウイルスの不活性化および／または除去、また
例えば活性成分を精製および濃縮するためのアフィニテ
イークロマトグラフィー用モノクローナル抗体または組
換え蛋白質を産生する培養細胞用の血清および他の培地
成分のような医薬の製造における添加剤にも適応できる
ことを確証できた。
【００１２】本発明は以下の実施例により詳細に説明さ
れる： 実施例１ 組織の多数の継代を維持し且つ継代後５日目でＰＣＲで
ＰＣＶポジテイブシグナルを示したＰＫ １５培養液由
来の培養物上澄みはＴ ２５細胞培養ボトルに新たには
ん種したいろいろな細胞株の比１：１００に継代培養し
た。
【００１３】以下のブタ細胞の樹立細胞培養物に接種し
た: ブタ胎児腎臓 ＝ ＦＰＫ ブタ胎児甲状腺 ＝ ＦＰＴｈ ブタ胎児精巣 ＝ ＦＰＴｅ ブタ胎児脾臓 ＝ ＦＰＳｐ ブタ胎児心臓 ＝ ＦＰＨ ブタ胎児皮膚 ＝ ＦＰＳｋ ブタ腎臓 ＝ ＰＳ
【００１４】接種から１０日後、ＦＰＴｈおよびＦＰＳ
ｋを除くその培養物全てが細胞病原性の変化（ＣＰＥ）
を示した。ＣＰＥ−ポジテイブの培養物から培養細胞上
澄みを回収し、更なる実験に使用するまで−８０℃に保
存された。１回目の継代からの細胞培養物上清にこれら
の細胞培養物を植え込むことにより、ＣＰＥを誘起する
薬剤のための２回目の継代を相同な細胞培養物に実施し
た。ＰＳ細胞ではたった４日後にＣＰＥが明白に示さ
れ、その他の株では接種後６日目で初めてＣＰＥが現れ
た。前述のプライマーを用いた特異的ＰＣＲを使うと、
ＣＰＥを示すＰＳ細胞培養物でPCVを検出することがで
きたが、ＰＫ １５細胞培養物上清の接種をしない対応
する対照細胞ではＰＣＲシグナルが明らかに無かった。
【００１５】実施例２ ＰＳ細胞培養物中で増幅したＰＣＶを、低速遠心分離し
た回収された細胞培養物を上清中で、終点希釈法により
定量化した。その細胞培養物上清を１０倍希釈工程で希
釈し、マイクロタイタープレートにＰＳ細胞培養物を移
し、そしてＰＣＶのグロースを細胞変性効果（ＣＰＥ）
として評価した。テストの最終解釈は感染後７日目に行
い、そしてウイルス力価（ＣＣＩＤ50−培養細胞物感染
量５０％−ｌｏｇ10で表示）は当業者に知られた方法に
より計算した（６）。シルコウイルスはエンベロープの
ないウイルスであるので、検査としておよび細胞培養物
におけるＰＣＶの増幅に細胞変性効果が帰因することを
確認するために、ＰＳ細胞培養物上澄みの一部をクロロ
ホルムで処理した。この方法はエンベロープを有するウ
イルスを不活性にするのに当業者に知られている。ＰＳ
細胞のウイルス懸濁液のクロロホルム処理および未処理
の比較力価では、力価に全く違いは見られなかった（表
１）。この結果は特異的ＰＣＲの結果と併せて、細胞培
養物、特にブタ細胞におけるＰＣＶの増幅を解明する。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例３ 実施例２に述べたように、ＰＳ細胞培養物のウイルス懸
濁液から出発して、Ｔ２５細胞培養ボトルにおける種種
の細胞を新たにはん種した培養物を感染した細胞培養物
上清の１：１００希釈で植菌した。全体で３回適応して
継代したものを実施した。すなわちＰＣＶが感染した培
養物上澄みを感染後１０日の相同細胞培養物の１：１０
０v／vで新しく準備した培養物に入れた。ＰＣＶの同一
性を明らかにするために、細胞変性効果のある培養物を
ＰＣＲ中で試験した。驚くべきことにこの結果から、例
１に示すブタ細胞培養物にだけでなく、ある種のウシ
（bovine）およびヒトの細胞においても細胞変性効果発
現を伴ってＰＣＶが増幅することが明らかになった（表
２）。
【００１８】
【表２】
【００１９】実施例４ インビトロで培養細胞でのＰＣＶの増幅後、ＰＣＶを中
和するために各種の哺乳類からの血清の能力を検査し
た。これらの検査はその後の血清交換で哺乳類のＰＣＶ
が増幅すること、またはこれらの血清はＰＣＶとクロス
−リアクトする抗体を含むかどうかを示す。しかしこれ
ら二つの可能性を確実に識別することは本実験デザイン
では不可能だった。個々の動物（イヌ、ネコ、ウマ、ブ
タ、サル）由来の種種の血清および数匹の動物（ウシ）
由来のプールされた血清またはヒトのプールされた血漿
からの免疫グロブリン濃縮物を中和テスト抗体希釈およ
びウイルスの一定量（１００ ＣＣＩＤ50）において試
験した。以下の表３に示すように、ブタシルコウイルス
中和抗体はブタ血清およびヒト免疫グロブリン（例えば
ベリグロブリン７）のみで検出可能である。
【００２０】
【表３】
【００２１】実施例５ ＰＣＶ−中和抗体および非中和抗体は、当業者に知られ
た他のインビトロの方法、例えば酵素免疫アッセイ（Ｅ
ＩＡ）によっても検出することができる。固相(例えば
ポリスチレン、ナイロンまたはセルロース)にＰＣＶを
吸着させ、続いて検査すべき血清とインキュベーション
し、更に、血清に存在する一次抗体に対する酵素標識し
た二次抗体とインキュベーションすることにより検査す
べき血清中のＰＣＶに対する抗体を定量する。
【００２２】ＰＣＶを含有する、ＰＳ細胞由来の細胞培
養物上澄みを０.１Ｍ ＮａＯＨで１：１００に前希釈
し、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに一連の幾何
学的希釈でピペットした（希釈用緩衝液０.０５Ｍ Ｎａ
2ＣＯａ、ｐＨ ９.６）。プレートをブロッキングし、
検査すべき血清と検査すべき血清に対する標識抗体とを
インキュベートする当業者に知られた方法により色強度
を測定した（表４）。本実施例はブタシルコウイルス抗
体がブタ血清およびヒト免疫グロブリン濃縮液のみに検
出できるということを示す。
【００２３】
【表４】
【００２４】実施例６:それらの生物物質由来の治療用
組成物または物質の製造に用いる該組成物または物質の
製造において、潜在的に存在するウイルスを不活性化ま
たは除去することが必要である。この理由でブタシルコ
ウイルスの熱安定性を種種の培地６０℃での更に一連の
テスト（水溶液中で低温殺菌した）において試験した。 ａ) イーグル最少栄養培地(EME培地)にて ｂ) ５％ヒト血清アルブミン溶液（ＨＳＡ）にて ｃ) 血液凝固因子（ＦVIII)製造物のための低温殺菌用
緩衝液 (スクロースおよびグリシンで安定化した水性溶
液)にて
【００２５】この目的のためにＰＣＶを実施例２で製造
し、上述した３種の培地に１：１１v／vで添加して（薬
を加えて）６０℃の水浴で加熱した。記載された時間の
後、サンプルを残りのウイルスの滴定に使用し、ＰＳ細
胞に滴定した。力価の最終解釈は、テストの開始後７日
目に顕微鏡下で細胞変性効果を観察するした７日後に行
った；結果は表５に示すとおりである。
【００２６】上記結果が示すように、ＰＣＶは物理化学
パラメータ、例えば高められた温度に対し不安定であ
る。ＰＣＶをある程度安定化させると同様に、低温殺菌
法を行う間、血液凝固因子VIII製造物のための低温滅菌
緩衝液にこの因子を安定化するために安定剤を加えた。
このようにして、シクロウイルスまたは関連ウイルスを
不活性化および／または除去するための製法または診断
助剤の能力を検査するためにシクロウイルスを使用する
ことが可能である。
【００２７】
【表５】
【００２８】引用文献: １. Handa, A. et al., Prevalence of the newly desc
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erization of the origin of DNA replication of porc
ine circovirus. J. Gen. Virol. 71: 2562-2566.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｎ 7/04 15/09 15/00 ＺＮＡＡ ＺＮＡ Ａ (72)発明者 トーマス・ヴァイマー ドイツ連邦共和国デー−35075グラーデン バハ．リヒャルト−ヴァーグナー−シュト ラーセ８ (72)発明者 アルブレヒト・グレーナー ドイツ連邦共和国デー−35041マルブルク. エーヴィゲスタール５ Ｆターム(参考） 4B024 AA14 CA01 HA15 4B063 QA19 QQ10 QQ79 QQ96 QR48 QR79 QS33 QX01 4B065 AA95X AC20 BA14 CA44 CA45 CA46 4C085 AA03 BA51 EE01

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ブタ、ウシ、ヒトの細胞の培養細胞にお
    いて、シルコウイルス感染させたそれらの細胞を一また
    はそれ以上の継代した後、得られたシルコウイルス、そ
    してそれにより細胞変性効果を得ることからなるシルコ
    ウイルス、特にブタシルコウイルス（ＰＣＶ）を増幅す
    る方法。
  2. 【請求項２】 生体物質からシルコウイルスを中和また
    は除去する方法においてその物質を抗体含有基質、例え
    ばブタ血清またはヒト免疫グロブリンで処理することま
    たは低温滅菌法を施すことからなる方法。
  3. 【請求項３】 シルコウイルスを支持物質に吸着後、研
    究対象の血清とインキュベートし次いで血清に存在する
    一次抗体に結合させ、続いてその一次抗体に対する標識
    二次抗体をそれと接触させ、それから結合した標識抗体
    から放射されるシグナルを測定することからなる、ＥＬ
    ＩＳＡ法を用いたシルコウイルスに対する抗体の検出お
    よび定量のための方法。
  4. 【請求項４】 支持体に結合するシルコウイルス抗体を
    シルコウイルス抗原の検査をすべき血清とインキュベー
    トし、それによりその抗原を結合させ、それを抗原に対
    して標識された抗体と接触させ、次いで結合していない
    標識された抗体を洗い落とし、結合し標識された抗体か
    ら放射されるシグナルを測定することから成る、ＥＬＩ
    ＳＡ法を用いたシルコウイルス抗原の検出および定量の
    ための方法。
  5. 【請求項５】 不活性または無発病性のシルコウイルス
    から成るワクチン。
  6. 【請求項６】 不活性または無発病性のシルコウイルス
    から成る診断の補助剤。
  7. 【請求項７】 生物資源由来の医薬の製造、医薬製造
    用の添加物または診断助剤について、シルコウイルスま
    たは関連ウイルスの不活性化能力および／または除去能
    力を検査するためのシルコウイルスの使用。
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