KR0156732B1 - 연속 셀 라인에서의 ibdv 생성 - Google Patents

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에.지.제. 베르메텐, 에프.지.엠.헤르만스
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Abstract

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Description

연속 셀 라인에서의 IBDV 생성
본 발명은 영구적인 포유 동물 셀 라인(cell line)을 사용하여 조류에 감염되기 쉬운 감염성 점액낭 질병 바이러스(infectious bursal disease virus:IBDV)와 IBDV 항원을 증식시키는 방법에 관한 것이다.
조류 바이러스는 보통 1차 또는 2차 닭 배아 섬유 아세포(chicken embryo fibroblast:CEF), 1차 닭 간 세포 또는 닭 신장 세포와 같이, 배란으로부터 유도되는 조류 세포 기질상의 배란에서 산출되거나 혹은 패브리시우스(Fabricius)의 점액낭에서와 같이, 살아있는 동물 기관에서 산출된다. 이러한 종류의 출처로부터의 바이러스는 불활성화 백신 및 생(生) 백신을 제조하는데 널리 사용되고 있다.
백신의 제조를 위해 동물 및 배란을 사용함에 있어서, 근본적인 단점은 이들의 질이 불명확하다는 점이다. 특히, 병원체를 갖고 있지 않은 닭이라도 예기치 않게 감염될 수 있어 백신 제조를 부적합하게 한다. 경우에 따라, 이러한 타입의 감염은 일정 기간 동안 발견되지 않은 상태로 유지되기도 한다.
영구적인 셀 라인을 사용함으로써 상기 문제를 해결할 수 있다. 그러나, 백신 제조에 적합한 닭 셀 라인은 지금까지 이용할 수 없었다. 조류의 셀 라인 대부분은 유임파 백혈증(lymphoid leucosis) 또는 마렉스 질병(Marek's disease)을 갖는 동물로 부터 산출되는 임파아구 세포(lymphoblastoid cell)로 구성된다.
정상의 닭 배아 섬유 아세포로 부터 영구적인 셀 라인을 발육시키려는 여러 시도는 아직까지 성공하지 못했다. 경우에 따라서, 셀 라인은 정상의 배아로 부터 발육될 수도 있지만, 모든 경우에 있어서, 이들은 레트로바이러스 게놈을 함유하며, 심지어 어떤 경우에는 바이러스 입자를 발산한다는 것을 후에 알게 되었다.
이제는 닭의 배아 섬유 아세포의 세포 배양물에서 생장할 수 있는 IBDV 균주(예:D78 및 SP 균주)가 또한 포유 동물의 셀 라인내에서 효과적으로 배양됨을 알게 되었다. 또한, 바이러스를 포유 동물 기질에 적응시킬 필요가 없다는 것을 알게 되었다. 더욱이, 포유 동물 세포에서의 수율이 CEF 시스템에서의 수율보다 흔히 훨씬 크다는 것을 알게 되었다. 일반적으로, 바이러스 수율은 단위 부피당 감염성 바이러스 입자(EID50/ml; TCID50/ml)로 표시된다. 바이러스 수율을 정량화하는 또 다른 방법은 항원 질량을 측정하는 것이다. ELISA와 같은 면역화학적 기법을 사용하여 바이러스 제조물의 항원 함량을 표준 제조물의 항원 함량과 비교하므로써 항원 질량 단위의 고정값을 얻을 수 있다. 이러한 두가지 타입의 측정 방법에 있어서, 포유 동물 셀 라인 시스템은 CEF 시스템보다 훤씬 큰 수율을 제공한다.
더욱이, 이러한 바람직한 수율은 놀랍게도 CEF에서의 항원 제조에 주로 사용되는 농도보다 더욱 낮은 농도에서 얻어질 수 있다. 포유 동물 세포 시스템에서의 세포의 최적 농도는 CEF에서의 제조에 주로 사용되는 세포의 농도보다 3-6배 낮다. 이러한 결과는, 일반적으로 포유 동물 세포가 CEF보다 IBDV에 대한 더 우수한 기질이라는 것을 보여준다. 또한, 이러한 방식으로 제조된 바이러스 항원은 CEF에서 산출되는 항원과 적어도 동일하게 백신에 효과적이라는 것을 알게 되었다.
본 발명에 따라 IBDV를 제조하는데 적합한 포유 동물 셀 라인은, 예를 들면 베로 세포(Vero cell), 침팬지, 간세포, 버팔로 버어빗 세포(buffalo vervet cell) 및 마우스의 3T3 세포이다.
세포 배양 플라스크 및 로울러 플라스크내의 고정 배양 시스템을 사용하여 포유 동물 세포를 배양할 수 있다. 일반적으로, 더 큰 규모가 기타 세포 배양 시스템으로는 고정-독립형 세포 배양용 교반 용기(발효조), 고정-의존형 세포 배양용 마이크로캐리어(microcarrier) 시스템, 및 상기 두 타입의 세포 배양용 중공 섬유 시스템이 있다. 또한, 고정-의존형 세포 배양용의 기타 고정 시스템이 다수 있다. 후자의 시스템은 통상적으로 세포가 부착될 수 있는 큰 표면을 갖는 것을 특징으로 한다.
포유 동물 세포의 배양은 복합 배양액의 사용을 필요로 한다. 이것은 주로 화학적으로 충분히 정의된 기본액(배지) 및 화학적으로 덜 정의된 하나 또는 그 이상의 첨가제로 구성된다. 상기 첨가제는 일반적으로 혈청 및 단백질 가수 분해 산물과 같은 단백질이 풍부한 용액이다. 혈청은 세포 성장 및 세포 분열에 매우 중요하다. 송아지 태아 혈청(FoCS) 또는 단식한 송아지 혈청(FaCS)이 1-10%(v/v)의 농도로 대부분의 배양 시스템에 첨가된다. 단지 특별한 경우에 있어서만, 적응기간 후에 혈청이 없거나 또는 심지어는 단백질이 없는 배양 배지내에서 포유 동물 세포를 배양하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 IBD 바이러스는 살아있는 바이러스로서, 혹은 불활성화된 바이러스로서 필요에 따른 약독화 전 또는 후에 백신에 혼입시킬 수 있다.
살아있는 바이러스를 함유하는 백신은 현탁액 형태로, 혹은 동결 건조된 형태로 제조 및 시판될 수 있다.
동결 건조된 백신은 하나 또는 그 이상의 안정화제를 함유하는 것이 바람직하다. 적합한 안정화제로는, 예를 들어 SPGA(Bovarnik(1950):J.Bacteriology 59:509), 탄수화물(예:소르비톨, 마니톨, 전분, 슈크로오스, 덱스트란 또는 글루코오스), 단백질(예:알부민 또는 카세인), 또는 이것의 분해 산물, 단백질-함유 물질(예:소의 혈청 또는 스킴 밀크) 및 완충액(예:알칼리 금속 포스페이트)이 있다. 필요에 따라, 보조 작용을 지닌 하나 또는 그 이상의 화합물을 첨가할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 화합물은, 예를 들면 알루미늄 수산화물, 포스페이트 또는 옥사이드, 광유(예:Bayol F(R), Marcol 52(R)) 및 사포닌이다.
IBD 바이러스를 불활성화시키는 목적은 바이러스의 복제 능력 및 독력(virulence)을 제거하는 데 있다. 일반적으로, 이것은 화학적 또는 물리적 수단에 의해 달성될 수 있다. 화학적 불활성화는, 예컨대 효소, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 에틸렌이민 또는 이것의 유도체, 유기 용매(예:할로겐화된 탄화수소) 및/또는 세정제(예:Tween(R), Triton X(R), 나트륨 데옥시-콜레이트, 설포베타인 또는 세틸 트리메틸암모늄 염)로 바이러스를 처리함으로써 이루어질 수 있다. 필요에 따라, 불활성화 물질은 후에 중화시킬 수 있는 데, 예를 들면 포름알데히드로 불활성화시킨 물질은 티오설페이트로 중화시킬 수 있다. 물리적 불활성화는 에너지-풍부 방사선(예:UV선, X-선 또는 γ-선)을 바이러스에 조사함으로써 수행되는 것이 바람직할 수 있다. 필요에 따라, 처리후 pH를 약 7로 다시 조절할 수 있다.
일반적으로, 보조제(예:전술한 보조제), 및 필요에 따라 하나 또는 그 이상의 유화제(예:Tween(R)및 Span(R))를 불활성화된 바이러스 물질에 첨가하기도 한다.
본 발명에 의한 백신은 가금(예:닭 및 칠면조)을 IBD(Cumboro 질병)로 부터 보호하는 데 적합하다.
본 발명에 의한 백신은, 예를 들면 근육내, 피하 또는 난포내 주사, 안구적하, 비강적하, 또는 음료용 물 또는 스프레이 형태로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 의한 IBDV 물질과 백신과의 조합물을 포함한다. 불활성화된 백신에 있어서, 상기 IBDV 물질은 뉴우캐슬 질병 바이러스(Newcastle Disease Virus), 감염성 기관지염 바이러스, 에그 드롭 증후군 바이러스(Egg Drop Syndrome Virus), 레오바이러스, 박테리아(예:Escherichia coli) 및/또는 기생충(예:에이메리아 종(Eimeria species))의 항원 물질과 조합될 수 있다. 뉴우캐슬 질병 바이러스 및/또는 마렉 바이어스(Marek Virus)와 조합된 조합물은 살아있는 조합 백신에 매우 적합하다.
[실시예]
[포유 동물 셀 라인에서의 IBDV 제]
[세포 배양]
액체 질소중의 유리 앰푸울(ampoule)내에 세포 스톡을 보관하였다. 세포 배양을 개시하기 위해, 앰푸울의 내용물을 빠르게 녹여 세포 배양 배지로 서서히 희석시켰다. 세포 현탁액을 저속으로 원심 분리시켜 냉장제중의 DMSO를 제거하였다. 침전된 세포를 완전한 세포 배지에 재현탁시키고 그 세포를 적합한 배양 배트(culture vat)에서 시이드(seed)화시켰다. 일반적으로, 세포는 트립토스 포스페이트 배양액으로 보충된, MEM에서 또는 M199/F10 배지의 혼합물(1:1)에서 배양시켰다. 상기 배지는 2-10%의 FoCS를 함유하였으며, 필요에 따라 항생제 및 살균제를 함유하였다. 세포를 37℃의 고정 배양기(조직 배양 플라스크) 또는 로울러 플라스크(490cm2)에서 배양시켰다. 세포가 조밀한 단일층(monolayer)을 형성하는 밀도에 도달한 후, 상기 세포를 아배양물(subculture)의 제조를 위해 트립신으로 처리하였다.
[바이러스 생성, 수확 및 불활성화]
동결-건조된 시이드(seed) 바이러스를 재용해시키거나, 혹은 상당히 냉동된 시이드 바이러스를 녹인 다음, 이것을 정확히 일정 부분으로 나눌 수 있는 농도로 세포 배양 배지로 희석시켰다. 세포를 10°-10-4TCID50/세포의 M.O.I.(multiplicity of infection)(다중 감염) 비율로 감염시켰다.
필요에 따라, 상기 세포를 시이드화시킨 후, 시이드 바이러스를 직접 첨가하였다.
상기 감염된 세포를 10일 이하의 기간 동안 배양시켰다. 일반적으로, 바이러스 감염 후 2-10일 경과 후에 상기 바이러스를 수확하였다. 배양 배트내의 상청액을 수취하여 포르말린으로 불활성화시켰다. 이러한 목적을 위해, 0.05-0.2%의 농도에 도달할 때까지 포름알데히드를 세포 현탁액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 20-22℃에서 1-3일간 배양시켰다.
[백신 생성]
백신으로 사용하기 위해, 불활성화된 IBDV 항원을 물-오일 유화제(Marcol 52(R))에 혼입시켰다.
[1차 닭 배아 섬유 아세포(CEF)에서의 IBDV 생성]
[CEF의 제조]
당 기술 분야에 공지된 방법에 따라 특별한 병원체가 없는 배양된 10-11일 령의 난(egg)으로부터 CEF를 제조하였다.
[CEF의 배양]
연속적인 셀 라인의 배양에 사용되었던 것과 동일한 배지내에서 CEF를 배양시켰다. FoCS 또는 FaCS를 농도가 5%가 될 때까지 상기 배지에 첨가하였다. 트립신으로 처리한 후 수득되는 진한 세포 현탁액을 세포 배지로 0.5-10×106세포/ml의 농도로 희석시켰다. 그 세포 현탁액을 조직 배양 플라스크 또는 로울러 플라스크로 옮겼다. 그 세포를 37-39.5℃의 온도에서 약 24시간 동안 배양시킨 후, 조밀한 단일층이 형성되었다.
[바이러스의 생성, 수확 및 불활성화]
동결-건조된 시이드 바이러스를 용해시킨 다음, 세포상에 시이드시키기에 적합한 양으로 나누기 위해 충분히 큰 부피로 세포 배양 배지로 희석시켰다. 상기 바이러스를 10°-10-5TCID50/세포의 농도로 첨가하였다. 필요에 따라, 상기 세포를 시이드화시킨 후 시이드 바이러스를 직접 첨가하였다.
상기 감염된 세포를 48-96시간 동안 배양시켰다. 상청액을 배양 배트로부터 수취한 후, 실온에서 24시간 동안 0.2% 포름알데히드로 불활성화시켰다.
[IBDV 항원 질량의 측정]
정량적 샌드위치 ELISA에 의해 IBDV 항원을 측정하였다;
1. 마이크로타이터 플레이트를 IBDV-특히 항체로 피복시켰다;
2. 상기 플레이트의 웰을 일련의 항원 샘플 희석액으로 채운 후, 배양시켰다;
3. 이어서, 상기 웰을 효소와 결합된 IBDV-특이 항체로 배양시켰다;
4. 그후, 효소 기질을 상기 웰에 첨가하였다;
5. 얼마간의 시간 경과 후, 묽은 황산으로 웰에서의 효소 반응을 중단시키고, 웰 내용물의 색깔 강도를 분광 광도계로 측정하였다.
상기 측정된 흡광도를 공지된 농도를 갖는 일련의 표준 항원 제제 희석액의 흡광도와 비교하였다. 항원의 질량 값은 ELISA단위/ml(EU/ml)로 표시하였다.
[바이러스 적정]
마이크로타이터 플레이트의 1차 닭 배아 섬유 아세포상에서 감염성 바이러스 역가(titre)의 측정을 수행하였다. 먼저, 5×105세포/ml를 함유하는 1차 CEF 현탁액중에서 샘플의 10배 희석액 시리즈를 제조하였다. 각 경우에 있어서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 200μl의 샘플의 희석 시리즈로 채우고; 각 샘플을 6-10회 테스트하였다. 상기 플레이트를 CO2배양기내에서 37-39℃의 온도에서 4-7일간 배양시킨 후, 세포 병리학적 효과의 발생을 알아보기 위해 이들을 현미경으로 검사하였다. 상기 역가는 TCID50/ml로 계산되었다. 일반적으로, 바이러스 역가는 10log TCID50/ml로서 표시되었다.
[바이러스-중화 항체의 측정]
마이크로타이터 플레이트에서 마이크로중화 테스트로 바이러스-중화 항체를 측정하였다. 이러한 목적을 위해, 혈청 샘플의 한쌍의 희석액 시리즈를 CO2배양기내에서 37℃에서 1-2시간 동안 혈청이 없는 세포 배양 배지중의 IBDV 1,000TCID50으로 배양시켰다. 이어서, 완전한 세포 배양 배지내의 1051차 닭 배아 세포를 각 웰에 주입하였다. 상기 플레이트를 CO2배양기내에서 37℃에서 4-7일간 배양시킨 후, 세포 병리학적 효과의 발생을 알아보기 위해 이들을 현미경으로 검사하였다. 바이러스 중화(VN) 역가는 세포 병리학적 효과가 완전히 없어지는 가장 높은 희석도의 역수 값으로서 정의되었다. 보통, VN 역가는2log VN 역가로서 표현되었다.
[실시예 1]
[1차 닭 배아 섬유 아세포에서의 D78 항원의 대규모 생성]
특이적인 병원체가 없는 11일령의 닭 배아로부터 CEF를 수득하였다. 상기 세포들을 5% FaCS로 보충된 M199/F10 세포 배지내에서 1-3×106세포/ml의 농도로 1585cm2유리 로울러 플라스크내에서 시이드화시켰다. 플라스크당 300ml의 세포 현탁액을 사용하였다.
플라스크를 38.5-39.5℃에서 18-24시간 동안 배양시켰다. 이어서, 시이드 바이러스 및 과량의 세포를 상기 플라스크에 첨가하였다. 로울러 플라스크당 D78 시이드 바이러스 104-106TCID50및 3-9×106세포/ml를 함유하는 현탁액 100ml를 사용하였다. 이어서, 로울러 플라스크를 38.5-39.5℃에서 부가로 48-120시간 동안 배양시킨 후, 바이러스 현탁액을 수확하여 포름알데히드로 불활성화시켰다. 8개의 대표적인 생성 배치에 대한 항원 질량 측정 결과를 하기 표 1에 요약하였다.
Figure kpo00001
[실시예 2]
[최적화된 실험실 조건하에서 1차 닭 배아 섬유 아세포에서의 D78 항원 제조]
특이적인 병원체가 없는 11일령의 닭 배아로부터 CEF를 수득하였다. 상기 세포들을 5% FoCS로 보충된 M199/F10 세포 배지내에서 1.5, 3.0 및 6.0×10 세포/ml의 농도로 490cm 의 플라스틱 로울러 플라스크내에서 시이드화시켰다. 플라스크당 100ml의 세포 현탁액을 사용하였다.
동시에, 10 TCID시이드 바이러스를 각 플라스크에 첨가하여 각각 0.12, 0.06 및 0.03TCID/세포의 감염 정도를 산출하였다. 상기 로울러 플라스크를 37℃에서 배양시켰다. 2일간 배양시킨 후 샘플을 취하고 3일째날에 수확하였다. ELISA를 사용하여 상기 샘플 및 수확 물질에서 항원 질량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 요약된다.
Figure kpo00002
결론:최적의 실험실 조건하에서, CEF 상에서 항원 질량을 실질적으로 향상시킬 수 있지만, 세포당 생성율은 세포 농도가 증가함에 따라 상당히 감소된다.
[실시예 3]
[Vero 세포에서의 IBDV 항원의 제조]
A. 완전히 성장한 단일층(monolayer)에의 감염
Vero 세포를 0.25×10 세포/ml의 농도로 두개의 490cm 로울러 플라스크내에서 시이드화시켰다. 트립토스 포스페이트 배양액 및 5% FoCS로 보충된 Eagle's MEM중의 세포 현탁액 100ml를 각 로울러 플라스크에 첨가하였다. 하나의 플라스크를 4일간 배양시키고, 다른 하나의 플라스크를 37℃에서 5일간 배양시켰다. 이어서, 세포 배지를 제거한 다음, D78 시이드 바이러스를 로울러 플라스크당 10 TCID의 양으로 첨가하였다. 상기 세포-바이러스 혼합물을 37℃에서 30분간 배양시킨 후, 100ml의 세포 배지를 첨가하였다. 각각 8일 또는 7일간 부가로 배양시킨 후, 바이러스 현탁액을 수확하여 항원 질량을 측정하였다. 7일간의 배양후에는 19413EU/ml가, 8일간의 배양후에는 19706EU/ml가 관찰되었다.
B. 현탁액에서 IBDV로의 세포 감염
Vero 세포를 트립토스 포스페이트 배양액 및 5% FoCS로 보충된 Eagle MEM중의 1×10 세포/ml 농도로 490cm 플라스틱 로울러 병에서 시이드화 시켰다. 플라스크당 100ml의 세포 현탁액을 사용하였다. 또한, IBD 시이드 바이러스, 균주 D78 또는 SP를 세포 직후에 첨가하였다.
상기 배양물을 7일간 배양시켰다. 감염 45, 96 및 144시간 후에 샘플을 취하였다. ELISA에 의해 상기 샘플들의 항원 질량 함량을 측정하였다(표 3).
Figure kpo00003
결론:포유 동물 세포에서의 IBDV 생성에 의한 항원 질량은 실시예 2에 의한 비교 조건하에서 CEF에서의 생성에 의해 수득되는 항원 질량에 비해 약 10배 증가하였다. 단알층에서 및 현탁액 배양물에서는 거의 동일한 생성 정도를 수득하였다.
[실시예 4]
[Vero 세포에서 생성된 IBDV의 감염성 바이러스 역가]
Vero 세포를 1×10 세포/ml의 농도로 490cm 로울러 플라스크내에서 시이드화시켰다. 트립토스 포스페이트 배양액 및 5% FoCS로 보충된 Eagle MEM중의 세포 현탁액 100ml를 각 로울러 플라스크에 주입하였다. 동시에, D78 또는 SP 시이드 바이러스를 0.01TCID/세포의 양으로 첨가하였다. 상기 플라스크를 37℃에서 배양시켰다. 배양 동안, 샘플을 취하여 그 내부에 함유된 감염성 바이러스 및 항원 질량을 측정하였다. ELISA를 사용하여 항원 질량(EU/ml)을 측정하였다. 1차 CEF의 도움으로 마이크로타이터 플레이트 테스트에 의해 감염성 바이러스 역가를 측정하였다( log TCID/
ml). 그 결과를 표 4에 기록한다.
Figure kpo00004
[실시예 5]
[생 백신]
4마리의 SPF 닭(3주령) 두 그룹을 Vero 세포에서 산출된 생 IBD 바이러스, 균주 D78로 0일째에 백신처리시켰다. 상기 바이러스 0.1ml 부피를 새(조류)에 접안 투여하였는데, 한 그룹은 조류 한마리당 10 TCID을, 다른 그룹은 조류 한마리당 10 TCID을 수취했다. 또한, 4마리 조류로 구성되는 하나의 그룹을 1차 CEF에서 생성된 D78 백신으로 상기와 동일한 방법으로 백신처리시켰다. 백신처리 16일 후 혈액을 채취하여 IBDV-중화 항체의 존재를 검사하였다. 그 결과를 하기 표 5에 기술하였다.
Figure kpo00005
또한, 백신 처리 3, 6 및 16일 후에 점액낭을 제거한 다음, 급성 및 만성 병변을 시간적으로 조사하는, 상기와 동일한 실험을 많은 조류에 대해서 실시할 수 있다. CEF에서 산출된 바이러스로 백신 처리한 조류로부터의 점액낭과 Vero 세포에서 산출된 바이러스로 백신 처리한 조류의 점액낭 사이에는 어떠한 차이도 발견할 수 없었다.
결론:Vero 세포에서 산출된 생 IBD 백신은 CEF에서 산출된 생 IBD 백신과 마찬가지로 면역원성이 있고 해가 없다.
[실시예 6]
[침팬지 간 셀 라인에서의 IBDV 균주 D78의 제조]
침팬지 간 세포의 현탁액(농도:0.6×10 세포/ml) 100ml를 490cm 로울러 플라스크내에서 시이드화시켰다. IBDV 시이드 바이러스(균주 D78)를 10 TCID/세포의 농도로 첨가하였다. 7일간 배양시킨 후, 항원 질량은 27042EU/ml인 바, 이는 약 45×10 EU/10 시이드화된 세포에 상응한다.
[실시예 7]
[마우스 셀 라인에서의 IBDV 균주 D78의 제조]
NIH3T3 마우스 세포의 현탁액(농도:0.3×10 세포/ml) 100ml를 490cm 로울러 플라스크내에서 시이드화 시킨후, IBD 시이드 바이러스(균주 D78)를 10 TCID/세포의 농도로 첨가하였다. 7일간 배양시킨 후, 바이러스의 항원 질량은 3514EU인 바, 이는 약 12×10 EU/10 시이드화된 세포에 상응한다.
[실시예 8]
[CEF 또는 Vero 세포에서 배양된 IBDV 항원의 면역원성 비교]
1차 CEF 또는 Vero 세포내에서 제조된 D78 및 SP 항원을 포르말린으로 불활성화시킨 후 광유중에 유화시켰다. 특이적인 병원체가 없는 4주령의 닭(White Leghorns)들을 각각 전술한 유화제 0.5ml로 근육내 투여하여 백신처리시켰다. 백신처리 6주후. 상기 닭들로부터 혈액을 채취하고, 혈청을 56℃에서 30분간 불활성화시킨 후, 그 내부에 함유된 바이러스-중화 항체를 1차 CEF상에서 측정하였다. 그 결과를 하기 표 6에 요약하였다.
Figure kpo00006
[실시예 9]
[CEF 또는 Vero 세포에서 배양된 IBDV 항원에 대한 백신 처리 효과의 비교]
불활성화된 D78-오일 유화제 백신으로 10그룹의 8주령 닭을 백신처리시켰다. 백신 0.5ml를 각각의 닭에 근육내 투여하였다. 상기 조류의 하나의 그룹을 Vero 세포상에서 산출된 항원으로 백신 처리시켰으며, 두개의 그룹은 CEF상에서 산출된 항원으로 백신 처리시켰다. 상기 두 항원들을 실시예 2 및 3에 기술된 방법에 따라 로울러 플라스크에서 산출시켰다. 백신처리 6주후에, 상기 조류들로부터 혈청을 수취하여 바이러스-중화 항체를 조사하였다. 그 결과를 하기 표 7에 기술하였다.
Figure kpo00007
D78/Vero에 의해 유도된 역가가 D78/CEF에 의해 유도된 역가보다 훨씬 크다는 것을 상기 통계적 분석으로 부터 알 수 있다(스튜던트 T 테스트(Student's T test:P0.05 CEF2).

Claims (11)

  1. 불활성화된 감염성 점액낭염 바이러스(IBDV)를 포함하는 IBDV 백신으로서, 상기 백신은 IBDV로 감염된 포유 동물 셀 라인의 세포 배양액 상징액으로부터 유래된 불활성화된 IBDV 항원을 함유하는 것을 특징으로 하는 IBDV 백신.
  2. 제1항에 있어서, 포유 동물 셀 라인이 원숭이 셀 라인인 것을 특징으로 하는 백신.
  3. 제2항에 있어서, 원숭이 셀 라인이 Vero셀 라인인 것을 특징으로 하는 백신.
  4. 하기의 단계들로 이루어지는 불활성화된 IBDV 백신의 제조방법:(a) 포유 동물 셀 라인에서 IBDV를 배양하는 단계, (b) 상기 셀 라인으로부터 세포 배양액 상징액의 IBDV 항원 물질을 수거하는 단계, (c) 수거된 항원 물질을 불활성화시키는 단계, 및 (d) 불활성화된 항원 물질을 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 보조제와 혼합하는 단계.
  5. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 백신이 D78 균주의 IBDV을 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
  6. 제4항에 있어서, 항원 물질이 바이러스 감염 후 2 내지 10일경에 수거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항원 물질이 감염 후 96시간 이상 지나서 수거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 약독화된 생(生) IBDV를 포함하는 IBDV 백신으로서, 상기 백신은 IBDV로 감염된 포유 동물 셀 라인의 세포 배양액 상징액으로부터 수득된 생 IBDV을 함유하고, 상기의 생 IBDV을 음료용 물 또는 안구적하에 의해 가금에 투여했을 때 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 IBDV 백신.
  9. 제8항에 있어서, 포유 동물 셀 라인이 원숭이 셀 라인인 것을 특징으로 하는 백신.
  10. 제9항에 있어서, 원숭이 셀 라인이 Vero 셀 라인인 것을 특징으로 하는 백신.
  11. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 D78 균주의 IBDV을 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
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