DE2045160C3 - Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die infektiöse Bursitis der Hühner - Google Patents

Description

;; 2 045 160

- 3

verimpft (I- Babymauspassage). Der Virusgehalt pro Schutzindex ist der Quotient aus Virustiter der Ver-

Q,05 ml betrog 10*-^s EHD^ Nach der Virusinfektion Suchskontrolle und Virustiter des Virus-Antiserum-

' erhielten die Babymäuse je 100 γ Prednisolonhemi- gemisches, z. B.

succinat (Na-SaIz) subcutan injiziert 8 Tage nach deir
^r Infektion der Tiere traten erste deutliche lühmungs- 5

Symptome sowie Gleichgewichtsstörungen auf. Die Serum-Schutzindex = J^*!^⁰—! = 10*·»

\ pabymäuse wurden draufhin für die 2. Babymaus- 10"⁴·⁴/0,05 ml |: passage getötet und mit physiologischer Kochsalzf lösung zu einem 10%igen Extrakt homogenisier!.

,' Der Extrakt wurde 1 Stunde mit 10 Volumprozent io Bis zur 8. Woche nach der Impfung stieg der Serum-Chloroform geschüttelt und 5 Minuten bei 3000 U/min Schutzindex auf 10³ⁱan und fiel dann bis zur 16. Woche zentrifugiert. Für die zweite Babymauspassage wurden nach der Impfung wieder auf 10²·⁰ ab. Da SPF-Küken ITag alte Babymäuse verwendet, die nach der vor einer Impfung einen Serum-Schutzindex gegen Infektion ebenfalls subcutan mit je 100 γ Prednisolon- Bursitis von nahezu 10° haben, war für mindestens hemisuccinat (Na-SaIz) behandelt wurden. Nach dem 15 16 Wochen nach der Impfung eine hohe Antikörper-Auftreten deutlicher Lähmungserscheinungen wurden entwicklung nachweisbar, die einen guten Infektions- \ die Babymäuse abermals getötet und das Vims schutz anzeigte.

daraus — wie bei der ersten Babymauspassage In einem zweiten Versuch wurden 80 SPF-Küken _t beschrieben — für die dritte Babymauspassage extra- im Alter von 12 Tagen mit je 10^s·⁸ Babymaus-ID₅₀ hiert. Die Passagen wurden fortgesetzt bis zur 12. Baby- *o Bursitis-Virus der 25. Babymauspassage über das mauspassage. Die 13. Babymauspassage wurde erst- Trinkwasser immunisiert. Klinische Impfreaktionen mais ohne nachfolgende Corticosteroid-Injektion auf traten auch bei diesen Impflingen nicht auf. Der 1 Tag alten Babymäusen durchgeführt. Die ersten Serum-Schutzindex der geimpften Küken (1: 10 verspezifischen Krankheitserscheinungen traten hierbei dünntes Serum) betrug 2 Wochen nach der Immuniam 4. Tag nach der Infektion auf. Die Aufbereitung as sierung im Mittel 10³·¹, 4 Wochen nach der Impfung der getöteten Babymäuse, die Virusextraktion und lag der Wert bei 10⁴·⁸. Beide Serum-Schutzindexdie Weiterführung der Mäusepassagen erfolgten in Bestimmungen wiesen auf eine gute Antikörperder beschriebenen Weise. entwicklung und somit auf einen ausreichenden Infek-

Zehn 2 Tage alte Babymäuse wurden mit je 0,05 ml tionsschutz hin.

der 20. Babymauspassage des Infektiösen Bursitis-Virus 30 Die beiden Untersuchungen zeigen, daß die er-

Ϊ intraperitoneal infiziert, nach 5 Tagen, auf dem Höhe- findungsgemäß hergestellten Vaccinen wirksam und

Γ< punkt der Lähmungsphase, getötet und mit physiolo- unschädlich sind. t gifcher Kochsalzlösung zu einem 20%igen Extrakt

-, homogenisiert. Der Extrakt wurde 1 Stunde mit Versuch 2 Ί; 10 Volumprozent Chloroform geschüttelt und nach 35

f 18stündiger Lagerung bei +4⁰C 5 Minuten lang bei Ausgehend von der 63. Eipassage eines nach her-

f 3000 U/min zentrifugiert. 100 ml des virushaltißen kömmlichen Verfahren erhaltenen Infektiösen Bursitis-

Überstandes wurden mit 50 ml der gemäß der deut- Virus wurde der Virusgehalt der 67. bis 73. Eipassage

S_-1 sehen Patentschrift 1118 792 hergestellten, einGelatine- mit dem Virusgehalt der 16. bis 22. Babymauspassage

Ö präparat enthaltenden Infusionslösung, gemischt, in 40 verglichen. Die Eipassagen wurden durch Beimpfung

Portionen zu 5 ml abgefüllt und lyophilisiert. 13er der Allantoishöhle von 6 Tage vorbebrüteten Hühner-

Virusgehalt der Trockenvaccine betrug nach Resus- eiern durchgeführt. Die am 3. bis 6. Tag nach Be-

pension und Verdünnung auf das Originalvolurnen impfung abgestorbenen Embryonen wurden mit der

|; 10⁷·¹ Babymaus-IDüo/ml. sie umgebenden Allantoisflüssigkeit homogenisiert.

45 Der Embryonalextrakt wurde 5 Minuten bei 3000 U/

Versuch 1 min zentrifugiert, der virushaltige Extraktionsüber-

stand diente jeweils als Infektionsmaterial für die

Die Unschädlichkeit und Wirksamkeit der er- folgende Passage. Der Virusgehalt wurde durch Ver-

p findungsgemäß durch Babymäusepassagen gewonnenen dünnung des Extraktionsüberstandes in Zehner-

$ Infektiösen Bursitis-Vaccine wurde in zwei Versuchen 50 potenzen und Beimpfung von 6 Tage vorbebrüteten

mit 8 und 12 Tage alten Küken nachgewiesen. Die Hühnereiern bestimmt. Die Beimpfungsdosis pro Ei

Küken waren frei von spezifischen hühnerpathogenen betrug 0,1 ml. Die zwischen dem 2. und dem 12. Tag

j Erregern sowie deren Antikörper (SPF-Küken). nach der Infektion abgestorbenen sowie alle über-

Im ersten Versuch wurden 75 SPF-Küken im Alter lebenden, aber virusspezinsche Veränderungen auf-

von 8 Tagen mit je 10⁵·· Babymaus-1D_6O Bursitis-Virus 55 weisenden Embryonen wurden nach einem statistischen

der 20. Babymauspassage über das Trinkwasser irnmu- Berechnungsverfahren für die Bestimmung des Virus-

nisiert. Klinisch erkennbare Impf reaktionen traten titers ausgewertet.

nicht in Erscheinung. 2 Wochen nach der Immuni- Die Babymauspassagen wurden nach der im Beisierung betrug der durch Virusneutralisationsteste spiel 1 erläuterten Methode ohne Verwendung eines ermittelte mittlere Schutzindex im 1:10 verdünnten 60 Corticosteroids ausgeführt. Für die Virustitrationen Impflingsserum 10²·¹. wurden die Virusverdünnungen 1 bis 2 Tage alten Bei dem Virusneutralisationstest wird die Anti- Babymäusen intraperitonal injiziert. Die innerhalb körperkonzentration im Serum bestimmt, indem die von 21 Tagen nach der Infektion unter Lähmungs-Antikörper im Serum mit fallenden Viruskouzen- erscheinungen erkrankten Jungmäuse wurden als virustrationen neutralisiert werden und danach auf nicht- 65 infiziert gewertet.

neutralisiertes Virus an der Babymaus geprüft wird. In der folgenden Tabelle sind die Virustiter pro ml

Der 50-%-Endpunkt wird nach herkömmlichen stati- desunverdünntenEmbryonaIextraktesunddes20%igen

stischen Berechnungsverfahren ermittelt. Der Serum- Babymaus-Extraktes einander gegenübergestellt:

	Viniütiter/ml	Mäuse	Vkustiter/ni*
Hipassage	unverdünnter	passage	20%iger
	Emfetryona]-		Babymaus-
67.	Eitrakt	16.	Extrakt
68.	10-4.0	17.	ίο-*·*
69.	10-*·«	18.	!0-5.8
70.	l()-*.8	19.	10-«. 1
71.	10-s.o	20.	!O-e.5
72.	10-s.s	21.	JO-7.1
73.	10-5.8	22.	ίο-«·8
10-s.s	10-'·5

Diese Zahlen zeigen, daß die auf 20% verdünnten Babymausexiraktc ein bis zwei Zehnerpotenzen mehr Virus enthalten als die unverdünnten Hühnerembryonalextrakte.

Beispiel 2

Eine Probe der gemäß Beispiel 1 erhaltenen 12. Babymauspassage des Infektiösen Bursitis-Virus wurde gemäß Beispiel 1 zu einem 10 %igen Extrakt aufgearbeitet und mit 10 Volumprozent Chloroform behandelt. Der so gewonnene virushaltige Babymausextrakt wurde sechs 2 Tage alten Mastomys natalensis in einer Dosis von je 0,05 ml intraperitoneal injiziert. Am 7. Tag nach der Infektion war ein Jungtier verendet, die übrigen fünf Jungtiere zeigten unterschiedlich ausgeprägte Lähmungserscheinungen. Nach Tötung der gelähmten Tiere wurde von allen 6 Mastomys natalensis in der beschriebenen Weise ein 10%iger, mit Chloroform behandelter Extrakt hergestellt, der wiederum einem Wurf von fünf 2 Tage alten Mastomys natalensis in gleicher Weise appliziert wurde. Diesmal erkrankten die Jungtiere bereits am 6. Tag nach der Infektion. Im Verlauf der folgenden 5 Passagen in Mastomys natalensis-Babys verkürzte sich die Passagedauer auf durchschnittlich 5 Tage. Die stets auf die beschriebene Weise hergestellten 10%igen Extrakte der 1., 3., 5. und 7. Mastomys natalensis-Passage erbrachten folgende Virustiter, die aus Vergleichsgründen — wie im Beispiel 1 erläutert — an 1 bis 2 Tage alten Babymäusen ermittelt wurden:

1. Mastomys-Passage =
3. Mastomys-Passage = 10-*-⁴/ml, 5. Mastomys-Passage = 10~*·⁸, /ml 7. Mastomys-Passage = lO^-'/ml.

Die Virustiter zeigen, daß die Babys von Mastomys natalensis in gleicher Wiese wie Babymäuse zur Gewinnung stark bursitisvirushaltiger Extrakte geeignet sind.

Versuch 3

Für die Prüfung auf Unschädlichkeit und Wirksamkeit der erfindungsgemäß durch Passagen in Babys von Mastomys natalensis gewonnenen Infektiösen Bursitis-Vaccine wurden 20 einwöchige SPF-Küken mit je 10⁵·⁸ Babymaus-ID₅₀ der im Beispiel 2 genannten 7. Mastomys-Passage über das Trinkwasser geimpft Zehn gleichaltrige Küken blieben als Kontrolltiere unbehandelt und wurden von den geimpften Tieren getrennt gehalten. Klinisch erkennbare bnpireaktionen oder Unverträglichkeitserscheinungen traten zu keinem Zeitpunkt nach der Impfung in Erscheinung. 3 Wochen nach der Impfung wurden die 20 geimpften sowie die IO unbehandelten Küken entblutet Die Einzelseren der Tiere wurden, entsprechend ihrer Gruppenzugehörigkeit, anteilgleich

ίο zu 2 Mischseren vereinigt Beide Mischseren wurden nach einer 1:10-Verdünnung im Virusneutralisationstest, wie im Versuch 2 des Beispiels 1 beschrieben, auf Antikörper gegen Infektiöses Bursitis-Virus untersucht Während das Impflings-Mischserum einen Schutzindex von IG²·* zeigte, betrug der Schutzindex der nicht geimpften Kontrollgruppe lediglich 10°·*.

Die Untersuchungen zeigen, daß auch die erfindungsgemäß von Babys der Mastomys natalensis gewonnene Vaccine für Küken unschädlich und wirksam ist.

^ao B e i s ρ i e I 3

Eine Probe des gemäß Beispiel 1 hergestellten Bursitisvirus enthaltenden Extraktionsüberstandes wurde in Mengen von 0,05 ml intraperitoneal an 3 Tage alte Babys von Mastomys natalensis verimpft. Nach der Virusinfektion erhielten die Babys 1Oy 6-Mercaptopur in subcutan injiziert 9 Tage nach der Infektion der Tiere traten erste Lähmungserscheinungen und Gleichgewichtsstörungen auf. Die Babys wurden daraufhin für die 2. Passage getötet und mit physiologischer Kochsalzlösung zu einem 10%igen Extrakt homogenisiert. Der Extrakt wurde — wie im Beispiel 1 angegeben — 1 Stunde mit 10 Volumprozent Chloroform geschüttelt und 5 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Für die 2. Passage wurden 3 Tage alte Babys von Mastomys natalensis verwendet, die nach der Infektion ebenfalls subcutan mit 1Oy 6-Mercaptopurin behandelt wurden. Nach dem Auftreten deutlicher Lähmungserscheinungen am 7. Tag nach der Infektion wurden die Tiere getötet und das Virus daraus für die 3. Passage extrahiert. Die Attenuierung wurde bis zur 14. Passage fortgesetzt. Die 15. bis 18. Passage wurde ohne Immuncupressivum vorgenommen. Durch Infektion von fünf 3 Tage alten Mastomys natalensis mit je 0,05 ml der 18. Passage wurde ein 20%iger Extrakt gewonnen, der 1 Stunde mit 10 Volumprozent Chloroform geschüttelt und nach lSstündiger Lagerung bei 4° C 5 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert wurde. Der virushaltige Überstand wurde mit der Hälfte eines Volumens mit einer gemäß der deutschen Patentschrift 1118 792 hergestellten, ein Gelatinepräparat enthaltenden Infusionslösung vermischt, in gleichen Portionen abgefüllt und lyophil getrocknet. Der Virusgehalt betrug nach Resuspension und Verdünnurg auf das Originalvolumen 10*· · Babymaus lD₅₀/ml.

Wie dieses Beispiel zeigt, ist auch die Mastomys natalensis geeignet, nach Adaption das Bursitisvirus zu attenuieren.

6c Die Unschädlichkeit und Wirksamkeit der gemäß Beispiel 2 gewonnenen Bursitisvaccine wurde an 8 und 12 Tage alten Küken nachgewiesen.

Claims (1)

1. Immunsuppressivum subcutan injiziert. Dadurch wer-Patentanspruch: den die Abwehr kraft der Tiere erniedrigt und die

   klinischen Erscheinungen der Infektion begünstigt.

   Verfahren zur Herstellunr; einer Lebendvaccine Geeignete iminunsuppressiva sind z. B. Corticosteroide gegen die Infektiöse Bursitis der Hühner, da- 5 wie Cortison, Hydrocortison, Prednison, Prednisolon, durch gekennzeichnet, daß man das 6-Methylprednisolon, Dexamethason und Parametha-Infektiöse Bursitis-Virus unter Verwendung von son sowie deren therapeutisch verwendete Ester ferner Iminunsuppressiva. durch Serienpassagen an Baby- Antimetaboliten wie 6-Mercaptopurin, alkylierende mause oder 1 bis 3 Tage alte Babys von Mastomys Agenzien wie Cyclophosphamid und schließlk Antinatalensis adaptiert und gleichzeitig attenuiert, das io lymphozytenserum und Antilymphozytenglobi ··· Die attenuierte Virus daraus .extrahiert und auf be- Dosierung beträgt je nach der verwendeten Substanz kannte Welse Jzu einer Vaccine aufarbeitet. 50 bis 500y pro Babymaus; bei Corticosteroiden ver

   wendet man z. B. 100 bis 200 y/Maus an.
   Nach einigen Tagen zeigen sich bei den infizierten

   —, 15 Tieren Lähmungen. In dieser Phase werden die Tiere

   getötet und mit physiologischer Kochsalzlösung zu einem 10- bis 20%igen Extrakt homogenisiert. Um

   Gegenstand der Anmeldung ist ein Verfahren zur Begleitproteine auszufällen, wird der Extrakt mit Herstellung einer Lebendvaccine gegen die infektiöse einem geeigneten Fällungsmittel, beispielsweise HaJo-Bursitis der Hühner. *° genwasserstoffen, wie Chloroform etwa 1 Stunde lang

   Die Infektiöse Bursitis ist eine auf der ganzen Welt geschüttelt und etwa 18 bis 24 Stunden bei etwa +4⁰C verbreitete Hühnerkrankheit, die vor allem junge Tiere gelagert. Danach werden die gefällten Begleitproteine in der 2. bis 6. Lebenswoche befällt. Die Tiere leiden durch Zentrifugation entfernt. Der virushaltige Überan Durchfällen, zeigen Blutungen in der Muskulatur stand¹ wird für die folgende Mäusepassage verwendet, und blutignekrotisisrende Entzündungen der Bursa as Die Zeit zwischen der Infizierung und dem Auftreten fabricii, eines Anhangorgans des Enddarmes. Sie gehen der Lähmungen verkürzt sich mit steigender Passagenentweder ein oder weisen verzögertes Wachstum und zahl von anfangs etwa 8 bis auf 4 bis 6 Tage. Wenn ungenügende Futterverwertung auf. Der wirtschaftliche eine weitere Verkürzung auch durch Fortsetzung der Schaden ist vor allem bei dem kurzlebigen Mast- Passagen nicht mehr erreicht werden kann, ist das geflügel groß. 30 Virus vollständig an Babymäuse adaptiert. Nach etwa

   Es ist schon versucht worden, eine Vaccine gegen 18 bis 25 Mäusepassagen ist das Infektiöse Bursitisdie Infektiöse Bursitis durch Passagen in embryonierten Virus für Hühner jeden Alters attenuiert.
   Hühnereiern herzustellen. Dies erwies sich jedoch als Das Immunsuppressivum-Präparat wird den Tieren

   schwierig, da das Bursitis-Virus häufig nach 3 bis bis etwa zur 10. bis 12. Mäusepassage injiziert. Danach 4 Passagen in der Eikultur nicht mehr vermehrt werden 35 ist eine Applikation von Immunsuppressiva nicht mehr kann. Gelingt in Einzelfällen die Passierung, se ist der notwendig.

   Virnsgehalt niedrig und die Virussuspension für die Für die Herstellung der Vaccine wird der von

   Herstellung einer Vaccine schlecht geeignet. Begleitproteinen befreite Mäuseextrakt mit einem

   Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren Schutzkolloid versetzt, z. B. mit entrahmter Milch zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die Infek- 40 oder der im Handel unter dem geschützten Warentiöse Bursitis der Hühner, das dadurch gekennzeichnet zeichen Haemaccel«*» erhältlichen, gemäß deutscher ist, daß man das Infektiöse Bursitis-Virus unter Ver- Patentschrift 1 118 792 hergestellten Infusionslösung, Wendung von Immunsuppressiva durch Serienpassagen die ein Gelatinederivat enthält. Die Konzentration an Babymäuse — oder 1 bis 3 Tage alte Babys von des Schutzkolloids ist je nach der verwendeten Substanz Mastomys natalensis — adaptiert und gleichzeitig 45 verschieden und liegt vorzugsweise bei 1,0 bis 5,0%. attenuiert, das attenuierte Virus daraus extrahiert Die das Schutzkolloid enthaltende Virussuspension und auf bekannte Weise zu einer Vaccine aufarbeitet. wird anschließend lyophilisiert. Die Trockenvaccine Die Zahl der Serienpassagen beträgt etwa 18 bis 25. enthält pro Impfdosis 10³·⁵ bis 10^e·⁵ MaUSe-IDg₀ Vorzugsweise verwendet man 1 bis 3 Tage alte Baby- Infektiöses Bursitis-Virus und wird für die Immunimäuse der weißen Maus oder der Mastomys natalensis so sierung der Hühner im Trinkwasser aufgelöst. Um eine und tötet die infizierten Tiere für die Extraktion in schnellere Trinkwasseraufnahme zu erreichen, läßt moribundem Zustand bzw. arbeitet sie unmittelbar man die Hühner vor der Vaccination zweckmäßigernach dem Verenden auf. weise 1 bis 2 Stunden dursten.

   Das Infektiöse Bursitis-Virus wird zweckmäßig aus

   der Bursa fabricii bursitiskranker Hühner isoliert, 55 B e i s ρ i e 1 1

   indem man die Bursa homogenisiert und das Homo-

   genat zentrifugiert. Die daraus gewonnene virushaltige Aus der Bursa fabricii bursitisspezifisch erkrankter

   Suspension wird Babymäusen intraperitoneal injiziert. Hühner wurde ein Homogenat hergestellt und embryo-Es können auch eine oder mehrere Eipassagen da- nierte Hühnereier damit inokuliert. Ein Hühnerei, zwischengeschaltet werden. Die 1 bis 3 Tage alten 60 dessen Embryo am 4. Tag nach der Infektion gestorben BabymäUse erhalten jeweils eine Applikationsdosis von war, wurde geöffnet und der Embryo mit der ihn umetwa 0,05 ml der Virussuspension, deren Virus- gebenden Allantoamnionflüssigkeit entnommen, homokonzentration mindestens 10* Ei-ID₆₀/ml beträgt. Eine genisiert und mit physiologischer Kochsalzlösung Ei-ID₆₀ ist dabei definiert als diejenige Viruskonzen- extrahiert. Der Extrakt wurde 1 Stunde mit 10 Volumträtion, die 50% der infizierten Hühnerembryonen zum 65 prozent Chloroform geschüttelt und anschließend Absterben bringt oder virusspezifisch verändert. Eine 5 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Der virus-Mäuse-ID₅₀ wird entsprechend definiert. haltige Extraktionsüberstand wurde in Dosen von

   Nach der Infizierung erhalten die Babymäuse ein 0,05 ml intraperitoneal auf 2 Tage alte Babymäuse