DE2045160A1 - Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die infektiöse Bursitis der Huhner - Google Patents

Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die infektiöse Bursitis der Huhner

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DE2045160A1 DE19702045160 DE2045160A DE2045160A1 DE 2045160 A1 DE2045160 A1 DE 2045160A1 DE 19702045160 DE19702045160 DE 19702045160 DE 2045160 A DE2045160 A DE 2045160A DE 2045160 A1 DE2045160 A1 DE 2045160A1
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Description

BEiIRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg / Lahn '
Aktenzeichen: P ! O HS 4GO: Q HOE ?ö/BGO5 ' Ma 12? Datum: 20. August 1970 Dr. Tg/stX ■
Verfahren zur Herstellung einer Lebeiidvaccine gegen die Infektiöse Bursitis der Hühner
Gegenstand der Anmeldung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die Infektiöse Bursitis der Hühner (Gumborö-Disöase). .
Die Infektiöse Bursitis ist eine auf der ganzen Welt verbreitete Huhnerkrankheit, die vor allem junge Tiere in der 2. bis 6. Lebenswoche befällt. Die Tiere leiden an Dui-chfallen, zeigen Blutungen in der Muskulatur und blutignekrotisierende Entzündungen der Bursa fabricii, eines Anhangorgans des Enddarmes. Sie gehen entweder ein oder weisen verzögertes Wachstum und' ungenügende Futterverwertung auf. Der wirtschaftliche Schaden ist vor allen) bei dem kurzlebigen Mastgeflügel groß.
Es ist schon versucht worden, eine Vaccine gegen die Infektiöse Bursitis durch Passagen in embryonierten Hühnereiern herzustellen. Dies erwies sich jedoch als schwierig, da das Bursitis-Virus häufig nach 3 ~ 'f Passagen in der Eikultur nicht mehr vermehrt werden kann. Gelingt in Einzelfällen die Passierung, so ist der Virusgehalt niedrig und die Virussuspension für die Herstellung einer Vaccine schlecht geeignet.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die Infektiöse Bursitis der Hühner, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Infektiöse
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BAD ORIGINAL
~ 2 —
Bursitis-Virus unter Verwendung von Imiriunsuppressiva darch ca. 18 - 25 Serienpassagen an Babymäuse adaptiert und gleichzeitig attenuiert, das attenuierte Virus daraus extrahiert und auf bekannte Veise zu einer Vaccine aufarbeitet.
Vorzugsweise verwendet man 1-3 Tage alte Babymiiuse der weißen Maus oder der Mastoinys natalensis und tötet die infizierten Babymäuse für die Extraktion in moribundem Zustand bzw, arbeitet sie unmittelbar nach dem Verenden auf.
Das Infektiöse Bursitis-Virus wird zweckmäßig aus der Bursa
»fabricii bursitiskranker Hühner isoliert, indem man die Bursa homogenisiert und das Homogenat zentrifugiert. Die dadurch gewonnene virushaltige Suspension wird Babyrnäusen intraperitoneal injiziert. Es können auch eine oder mehrere Ir.ipassagen dazwischengeschaltet werden. Die ein bis drei Tage alten Babymäuse erhalten ,jeweils eine Applikationsdosis von etwa 0,05 ml" der Virussuspension, deren Viruskonzentration mindestens 10 Ei-IDj, /ml beträgt. Eine Ei-ID- ist dabei definiert als diejenige Viruskonzentration, die 50 $> der infi zierten Hühnerembryonen zum Absterben bringt oder virusspezifisch verändert. Eine Mäuse-ID,,« wird entsprechend definiert.
Nach der Infizierung erhalten die Babymäuse ein Iinmunsuppressivum subcutan injiziert. Dadurch werden die Abwehrkraft der Tiere erniedrigt und die klinischen Erscheinungen der Infektion begünstigt. Geeignete Immunsuppressiva sind z.B. Corticosteroide wie Cortison, Hydrocortison, Prednison, . —■ Prednisolon, 6-Methylprednisolon, Dexamethason und Paramethason sowie deren therapeutisch verwendete Ester ferner Antirnetaboliten wie 6-Mercaptopurin, alkylierende Agenzien wie Cyclophosphainid und schließlich Antilymphozytenserum und Antilymphozytenglobulin. Die Dosierung beträgt je nach der verwendeten Substanz 50 - 500^pro Babymaus; bei Corticostero iden . ·· wendet man z.B. 100 - 200^/ilaus an.
BAD ORiGfNAL
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Nach einigen Tagen, zeigen sich bei den infizierton Tieren Lähmungen, In dieser Phase werden die Tiere getötet und init physiologischerKochsalzlösung zu einem 10- bis 20 $igen .....
Extrakt homogenisiert.. Uni Begleitproteine auszufällen, wird der Extrakt mit einem geeigneten Fällungsmittel, beispielsweise Halogenwasserstoff en. wie Chloroform etwa 1 Stunde lang ge-schüttelt und etwa 18 - 2.H Stunden bei etwa +k C gelagert.
Danach werden die gefällten Begleitproteine durch Zentrifugation entfernt. Der virushaltige Überstand wird für die folgende Mäusepassage verwendet.
Die Zeit zwischen der Infizierung und dem Auftreten der
Lähmungen verkürzt sich mit steigender Passagenzahl von ' "
anfangs etwa 8 bis auf 4 - 6 Tage. Wenn eine weitere Verkürzung auch durch Fortsetzung der Passagen nicht mehr erreicht werden kann, ist das Virus vollständig an Babymäuse adaptiert. Nach etwa 18 - 25 Mäusepassagen ist das Infektiöse Bursitis-Virus für Hühner jeden Alters attenuiert.
Das Iramunsuppressivum-Präparat wird den Tieren bis etwa zur 10..- 12. Mäusepassage injiziert. Danach ist eine Applikation von Immunsuppressiva nicht mehr notwendig.
Für·' die Herstellung der Vaccine wird der von Begleitproteinen befreite Mäuseextrakt mit einem Schutzkolloid versetzt, ä
z.B. mit entrahmter Milch oder der im Handel unter dein Warenzeichen Haemaccel ' gemäß DBP 1 118 792
hergestellten Infusionslösung, die ein Gelatinederivat _;
enthält. Die Konzentration des SchutzkoU oids ist je nach ■der verwendeten Substanz verschieden und liegt vorzugsweise bei 1,0 - 5»0 f'. Die das Schutzkolloid enthaltende Virussuspension wird anschließend lyophilisiert. Die Trocken-■vaccine enthält pro Impfdosis 10 V bis 10 Mäuse-ID^Q Infektiöses Bursitis-Virus und wird für die Immunisierung der Hühner im Trinkwasser aufgelöst. Um eine schnellere Trinkwasserauf nähme zu erreiche:», läßt nian die Hühner vor der Vaccination zweckmäßigerweise ein bis zwei Stunden dursten.
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BAD ORIGINAL ·
Dei spiel 1
Aus der Bursa fabricii bursitisspezifisch eiicrankter Hühner wurde ein Ilomogenat hergestellt und embryoniertc Hühnereier damit inokuliert. Ein Hühnerei, dessen Embryo am k. Tag nach der Infektion gestorben war, wurde geöffnet und der Embryo mit der ihn umgebenden Allantoamnionflüssigkeit entnommen, homogenisiert und mit physiologischer Kochsalzlösung extrahiert. Der Extrakt wurde eine Stunde mit. 10 Vol-f; Chloroform geschüttelt und anschließend 5 Minuten bei 3000 13/Min. zentrifugiert. Der virus-haltige Extraktionsüberstand wurde in Dosen von 0,05 ml intraperitoneal auf zwei Tage alte Babymäuse verimpft (1. Babymauspassage), Der Virusgehalt
2 5
pro 0,05 ml betrug 10'' Ei-IDj,. Nach der Virusinfektion erhielten die Babymäuse je 100 / Prednisolonheinisuccinat (Na-SaIz) subcutan injiziert. Acht Tage nach der Infektion der Tiere traten erste deutliche Lähmungssymptome sowie Gleichgewichtsstörungen auf. Die Babymäuse wurden daraufhin für die 2. Babymauspassage getötet und mit physiologischer Kochsalzlösung zu einem 10 ^igen Extrakt homogenisiert. Der Extrakt wurde eine Stunde mit 10 Vol··^ Chloroform geschüttelt und 5 Minuten bei 3OOO U/Min. zentrifugiert. Eür die zweite Babymauspassage wurden 1 Tag alte Babymause verwendet, die nach der Infektion ebenfalls subcutnn mit je 100 j/Prednisolonhemisuccinat (Na-SalZ) behände] t wurden. Nach dem Auftreten deutlicher Lähmungperscheinungen wurden die Babymäuse abermals getötet und das Virus daraus - wie bei der ersten Babymauspassage beschreiben - für die dritte Eabyrnaiispassage extraliiert. Die Passagen wurden fortgesetzt bis zur 12. Babymauspassage, Die I3. Babymauspassage wurde erstmals ohne nachfolgende Corticosteroid-Injektion auf 1 Tag alten Babymausen durchgeführt. Die ersten spezifischen Krankheitserscheinungeii traten hierbei am '( . Tag nach der Infektion axif. Die Aufbereitung der getöteten Babymäuse, die Virusextralc I i on und die Vox t ei r führung der Mnuscpassagen erfolgten in der beschriebenen Koise.
2 0 9814/1643 BAD ORiQhMAL
■■'.-■■ - 5 - ■ ■-■ ■'■■■■
. 1O zwei Τείβ-β alte Babymause iiurdeii mit- je 0,05 ml der 20. Babymauspassage des Infektiösen Bursitis-Virus intraperitojieal infiziert, nach 5 Tagen, auf dem Höhepunkt der Lähmungsphase, getötet und mit physiologischer Kochsalzlösung· zu einem 20 ^,igen Extrakt homogenisiert. Der Extrakt wurde eine Stunde mit 10 VoI-^o Chloz"oform geschüttelt und nach 18-stündiger Lagerung bei- +Ί- C fünf Minuten lang bei 3°00 U/Min. · zentrifugiert. 100 ml des virushaltigen TJb e-r st and es wrden mit 50 ml Haemaccel^ ' gemischt, in Portionen- zu 5 ml abgefüllt und lyophilisiert. Der Virusgehalt der Trockenvaccine betrug nach Resuspension und Verdünnung auf das Orig'inalvolumen
7 1
1.0 ' Babymaus-IDp /ml.
Beispiel Z
Die Unschädlichkeit und Wirksamkeit der erfindungsgemäß durch Bnbymäuscpassagen gewonnenen Infektiösen Bursitis-Vaccine vitrde in zivei Versuchen mit 8 und 12 Tage alten Küken nachgowio.sen. Die Küken waren frei von spezifischen hühnerpathogonen Erregern so^vie deren Antikörper (SPF-Küken) .
Im ersten Versuch wurden 75 SPF-Küken im Alter von 8 Tagen mit
5 6
je 10'.' Babymaus-ID- l.'.ursitis-Virus der 20. Babymauspassage über das Trinkwasser immunisiert. Klinisch erkennbare Impfreaktionen traten nicht in Erscheinung. Zwei Wochen nach der Immunisierung betrug der durch Virusneutralisationsteste ermittelte mittlere Schiatzindex im 1 : 10 verdünnten Impflingsseruin 10'.
Bei dem Virusneutralisationstest wird die Antikörperkonzentration im Serum bestimmt, indem die Antikörper im Serum mit fallenden Viruskonzentrationen neutralisiert werden und danach auf nicht-neutralisiertes Virus an der Babymaus geprüft wird. Der 50 ^-Endpunkt wird nach herkömmlichen statistischen Berechrmngfiverfahreri ermittelt. Der Serum-Schutzindex ist der Quotient aus Virustiter der Versuchskontrolle und Virustiter
2 0 9 8 H / 1 6 4 3 bad original
des Virus-Antiserumgemisches, z.B.
o . , . , 10*" '-Vo, 05 ml in2,1 Serum-Schutzindex = j—j1— J— — = 10 '
j—j1— J— —
10 ' /0,05 ml
Bis zur 8, Voche nach der .Impfung stieg der Serum-Schutzindex
3 2
auf 10" ' an und fiel d£inn bis zur 16. Voche nach der Impfung
2 0
wieder auf 10 ' ab. Da SPF-Küken vor einer Impfung einen Serura-Schutzindex gegen Bursitis-Virus von nahezu 10 haben, war für mindestens 16 Wochen nach der Impfung eine ho] 1.0 Antikörperentwicklung nachweisbar, die einen guten Infektionsschutz anzeigte.
Im zweiten Versuch wurden 80 SPF-Küken im Alter von 12 Tagen
Cj Q
mit je 10 ' Babymaus-ID Bursitis-Virus der 25. Babymauspassage über das Trinkwasser immunisiert. Klinische Impfreaktionen traten auch bei diesen Impflingen nicht auf. Der Serum-Schutzindex der geimpfton Küken (1 : 10 verdünntes Serum)
3, h beti-ug zwei Wochen nach der Immunisierung im Mittel 10 , h Wochen nach der Impfung lag der Wert bei 10 ' . Beide Serum-Schutzindex-Bestimmungen wiesen auf eine gute Antikörperentwicklung und somit auf einen ausreichenden Infektionsschutz hin.
Die beiden Untersuchungen zeigen, daß die erfindungsgemäß hergestellten Vaccinen wirksam und unschädlich sind.
Beispiel 3
Ausgehend von der 63. Eipassage eines nach herkömmlichen
Verfahren erhaltenen Infektiösen Bursitis-Virus wurde der Virusgehalt der 67. - 73· Eipassage mit dem Virusgehalt der 16. - 22. Babymauspassage verglichen. Die Eipassagen wurden durch Beimpfung- der Allantoishöhle von 6 Tage vorbebrüteten Hühnereiern durchgeführt. Die am 3. - 6. Tag nach Beimpfung abgestorbenen Embryonen wurden mit der sie umgebenden AllantoisfIwssigkeit homogenisiert. Der Embryonalextrakt wurde
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BAD ORiGIMAL
3 Minuton" :to-ei 300Ό IT/Min» zentrifugiert* der virushaltlge ExtraktiorLsüberstand diente jeweils als Infektionsmaterial ilix die folgende Passage.. Der Virusgehalt wurde durch. Verdünnung des Extraktionsüberstandes in Zehnerpotenjzen und Beimpfung von 6 Tage vorbebrüteten llühnex-eiern "bestimmt. Die Beimpfuii£'s~ dosis pro Ei betrug 0,1 ml. Die zwischen dem 2. und dem 12, Tag nach der Infektion abgestorbenen sowie alle überlebenden, aber virusspezifische Veränderungen aufweisenden Embryonen wurden nach einem statistischen Berechnungsverfahr&n für die Bestimmung des Virustiters ausgewertet.
Die Babymauspassagen wurden nach, der im Beispiel T erläuterten. Methode ohne Verwendung eines Corticosteroids ausgeführt. Tür die Virustitrationen wurden, die Virusverdünnungen 1 - 2 Tage alten Babymäusen intraperitoneal injiziert. Die innerhalb von 21 Tagen nach der Infektion unter Lähmungserscheinungen erkraräten Jungmäuse wurden als virusinfiziert gewertet.
In der folgenden Tabelle sind die Virustiter pro ml des unverdünnten Einbryonalextraktes und des 20 ^igen Babymaus-Bxtraktes "einander gegenübergestellt:
Eipassage Virus t'it er/ml Mäusepassage Virustiter/ml un\rerd.Embryonal-Extrakt 20^iger Baby-
rnaus-Extrakt ,
ίο"6'9 ΙΟ"5'8
ίο"6'1
το"6'5
— 7 1 ΙΟ7'
το"6'8 10-7,5
Diese Zahlen zeigen, daß die auf 20 <?ο verdünnten Babymausextrakte ein bis zwei Zehnerpotenzen mehr Virus enthalten als cid e unverdünnten Hühnerenibryonalextrakt e .
20981471643 ' BAD OR.QINAL ·
67.
68. 		lo^·5 16.
17.
69.
70.. 		το"5'0 18.
19.
71 .
72. 		ΙΟ"5'5 . 20.
21 .
73 TO"5'3 22.

Claims (5)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen die Infektiöse Bursitis der Hühner, dadurch gekennzeichnet, daß man das Infektiöse Bursitis-Virus unter Verwendung von Immunsuppressiva durch Serienpassagen an Babymäuse adaptiert und gleichzeitig attenuiert, das attenuiei'te Virus daraus extrahiert und auf bekannte Veise zu einer Vaccine a\if arbeitet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 1-3 Tage alte Babymäuse der weißen Maus oder Mastomys natalensis verwendet.
3· Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die infizierten Babymäuse für die Extraktion in moribundom Zustand tötet oder unmittelbar nach dem Verenden extrahiert.
h. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Immunsuppressiva Corticosteroide verwendet.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1 und h, dadurch gekennzeichnet, daß man als Imtnunsuppressivum Prednisolon bzw. dessen medizinisch gebräuchliche Ester verwendet.
BAD ORIGINAL 2098U/1643
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