DE2553998A1

DE2553998A1 - Mumpsvaccin und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2553998A1
Application number: DE19752553998
Authority: DE
Inventors: Costantino Peter Cerini
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1974-12-02
Filing date: 1975-12-01
Publication date: 1976-08-12
Also published as: NL184196C; CA1059908A; NL7514014A; US3961046A; NL184196B; DE2553998C2; FR2293218A1; BE836156A; FR2293218B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Vaccin, und insbesondere auf ein abgeschwächtes lebendes Mumpsvirus, das Menschen zum Schutz gegenüber Mumps injiziert wird.

Die Erfindung ist somit auf ein lebendes nicht-phatogenes abgeschwächtes Mumpsvirus und seine Verwendung als Vaccin gerichtet, das nach Injektion beim Menschen zu einem Schutz gegenüber Mumps führt. Die klinischen Merkmale einer Mumpsinfektion sind ausreichend dokumentiert. Es handelt sich dabei um eine Kinderkrankheit, die nach erfolgtem Durchlaufen eine ständige Immunität verleiht. Erwachsene, die in der Kindheit diese Krankheit nicht bekommen haben, können in ihrem späteren Leben davon befallen werden. Eine wahrnehmbare Antikörperkonzentration kann als Schutz beim Menschen angesehen werden. Das abgeschwächte lebende Mumpsvirus stimuliert die Bildung von Antikörper im Menschen, ohne daß es dabei zur Ausbildung einer klinischen Krankheit kommt.

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Mumpsvaccine und ihre Herstellung sind natürlich bekannt. In US-PS 3 555 149 wird beispielsweise ein lebendes abgeschwächtes Mumpsvirusvaccin beschrieben, das hergestellt wird, indem man das Virus in wenigstens zehn aufeinanderfolgenden Durchläufen in embryonalen Hühnereiern wachsen läßt und dann in einer Hühnerembryogewebekultur propagiert. Im Gegensatz dazu erfolgt die Herstellung von lebendem Mumpsvirus erfindungsgemäß dadurch, daß man das Virus in drei hintereinander folgenden Durchgängen durch primäre menschliche Amniongewebezelleinschichten, einen anschließenden Durchgang durch embryonale Hühnereier und nachfolgende 8 bis 28 Reihendurchgänge durch Hühnerembryogewebezellen wachsen läßt.

Im allgemeinen erfolgt die erfindungsgemäße Herstellung des lebenden Mumpsvirusvaccins nach folgenden Verfahrensstufen:

(A) Isolierung des lebenden Virus aus primären menschlischen Amnionzelleinschichten, anschließende Reproduktion in embryonalen Hühnereiern und Adaption an eine Hühnerembryogewebekultur ,

(B) Entwicklung des abgeschwächten Virus durch Reihendurchgänge in einer Hühnerembryogewebekultur und

(C) Herstellung des Vaccins aus diesem abgewächten lebenden Virus.

Die Herstellung des lebenden Mumpsvirus erfolgt erfindungsgemäß dadurch, daß man das Virus in drei aufeinanderfolgenden Durchgängen in einer primären Humanamniongewebekultur, einem nachfolgenden Durchgang in embryonalen Hühnereiern und sich daran anschließenden 8 bis 28 Reihendurchgängen in einer Hühnerembryogewebekultur wachsen läßt. Der Mumpsvirus wird aus einem klinischen Material in einer primären Humanamniongewebekultur isoliert. Nach drei Reihendurchgängen wird es

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an Gewebekultur adaptiert, indem man es einmal durch embryonale Hühnereier gehen läßt. Anschließend läßt man das Virus der Reihe nach durch primäre Humanamniongewebekultur, embryonale Hühnereier und Hühnerembryogewebekultur laufen, wodurch es reproduziert und abgeschwächt wird. Die obigen Durchgänge werden sowohl rait unverdünntem als auch mit verdünntem Inokulum durchgeführt, wobei man jeweils nur einmal erntet.

Jede Stufe der Herstellung des erfindungsgemäßen lebenden Mumpsvaccins wird im einzelnen wie folgt durchgeführt:

(A) Das lebende Mumpsvirus wird von Menschen gewonnen, die eine aktive Mumpsinfektion haben. Dieses Virus wird in primäre Humanamnionzellmonoschichten (PHA) inokuliert und 7 bis 12 Tage (vorzugsweise 10 Tage) bei einer Temperatur von 34 bis 37 ⁰C (vorzugsweise 36 ⁰C) inkubiert. Anschließend wird das Virus geerntet und ein zweites Mal unter den gleichen Bedingungen 7 bis 12 Tage (vorzugsweise 7 Tage) in PHA-Zellen inokuliert. Die dabei erhaltene Ernte inokuliert man ein drittes Mal- in PHA-Zellen und inkubiert sie dann unter den gleichen Bedingungen 7 bis 12 Tage (vorzugsweise 11 Tage), worauf man erneut wie vorher beschrieben erntet. Die dabei erhaltene Ernte wird in das Amnion 6 Tage alter embryonaler Hühnereier inokuliert und wie oben beschrieben 6 bis 8 Tage (vorzugsweise 7 Tage) inkubiert. Anschließend inokuliert man die Ernte in primäre Huhnerembryofibroplastzellen (CETC) und inkubiert sie wie oben angegeben 6 bis 8 Tage (vorzugsweise 7 Tage)_f worauf geerntet wird.

Die auf diese Weise erhaltene erste Ernte wird dann in nicht verdünnter Form in CETC inokuliert, 4 bis 13 Tage (vorzugsweise 7 Tage) bei 32 bis 37 ⁰C inkubiert und anschließend durch Einfrieren geerntet. Dieser Durchgang in CETC wird 9 bis 27 mal wiederholt, wobei man entweder eine unverdünnte

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Ernte oder eine auf 10 bis 10 verdünnte Ernte verwendet.

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(C) Das nach wiederholten Reihendurchgängen durch CETC geerntete Mumpsvirus ist nicht pathogen, verursacht beim Menschen keine klinische Erkrankung und stimuliert die Bildung einer wahrnehmbaren Konzentration an Antikörper. Die Virusinfektivität wird durch Zusatz eines geeigneten Stabilisators stabilisiert, bei dem es sich um Saccharose, menschliches Albumin, Glutamin, Phosphat, Sorbit, Sorbit und N-Z-Amin-NaK oder ein Stabilisatorgemisch handeln kann. Der Virusvorrat wird eingeforen und gelagert. Aufgetaute Teilmengen werden in Ampullen abgefüllt, gefriergetrocknet und bis zu ihrer Verwendung bei 4 ⁰C gelagert.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Propagierung von Mumpsvirus durch insgesamt drei Durchgänge durch primäre Humanamnionzellmonoschichten

Speichelabstriche eines Kindes, das eine unkomplizierte Mumpserkrankung hat, werden gesammelt und in Plastikflaschen inokuliert, die primäre Humanamnionzelleinschichten (PHA) enthalten. Die Flaschen werden 10 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und dann geerntet, indem man die Gewebekulturzellen und die Flüssigkeit zusammenfriert. Die hierbei erhaltene Ernte wird in unverdünnter Form ein zweitesmal in PHA-Zellen inokuliert, 7 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und dann wie oben angegeben geerntet. Diese zweite Ernte inokuliert man anschließend in unverdünnter Form ein drittesmal in PHA-Zellen, inkubiert sie 11 Tage bei 36 ⁰C und erntet sie wiederum wie oben angegeben.

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Beispiel 2

Propagierung von Mumpsvirus aus primären Humanamnionzellen durch einmaligen Durchgang durch embryonale Hühnereier

Die nach Beispiel 1 erhaltene Ernte wird in unverdünnter Form in das Amnion 6 Tage alter embryonaler Hühnereier inokuliert. Nach 7 Tage langer Inkubation bei 36 C wird die Amnionalflüssigkeit geerntet und gesammelt.

Beispiel 3

Propagierung von Mumpsvirus aus embryonalen Hühnereiern durch mehrfache Durchgänge durch Hühnerembryofibroplastzellen

Die nach Beispiel 2 erhaltene Amnionalflüssigkeit wird in unverdünnter Form in Glasflaschen inokuliert, die eine primäre Monoschicht von Hühnerembryofibroplastzellen (CETC) enthalten, anschließend 7 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und schließlich geerntet, indem man Gewebekulturzellen und Flüssigkeit zusammen einfriert. Die dabei erhaltene Ernte wird dann in unverdünnter Form in CETC-Einzellen inokuliert, 7 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und erneut durch Einfrieren geerntet. Die so erhaltene zweite Ernte wird anschließend in unverdünnter Form in CETC-Einschichten inokuliert, 10 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und wiederum durch Einfrieren geerntet. Diese dritte Ernte inokuliert man in einer Verdünnung von 10 in CETC-Einzellen, inkubiert sie dann 8 Tage bei 36 ⁰C und erntet sie wiederum durch Einfrieren.

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Die vierte Ernte wird bei einer Verdünnung von 10 in

eine Zellsuspension von CETC inokuliert, 2 Stunden damit vermischt, in Glasflaschen übertragen, 13 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und durch Einfrieren geerntet. Die so hergestellte fünfte

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Ernte inokuliert man anschließend in einer Verdünnung von 10 in eine Zellsuspension aus CETC, worauf man das Ganze 2 Stunden vermischt, in Glaskolben überträgt, 4 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und wiederum durch Einfrieren erntet. Diese sechste Ernte wird anschließend in einer Verdünnung von 10 in eine Suspension von CETC inokuliert, 2 Stunden durchmischt, in Glasflaschen übertragen, 4 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und durch Einfrieren geerntet. Die auf diese Weise erhaltene siebte Ernte inokuliert man schließlich in einer Verdünnung von 1O in eine Suspension von CETC, worauf man das Ganze 2 Tage durchmischt, in Glaskolben überträgt, 7 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und abschließend erntet.

Das bei dieser Ernte erhaltene Virus hat demzufolge 3 PHA-Durchgänge (Beispiel 1), einen Durchgang durch ein Hühnerei (Beispiel 2) und 8 CETC-Durchgänge (Beispiel 3) durchlaufen.

Beispiel 4 Herstellung eines Vaccins aus abgeschwächtem Mumpsvirus

Eine Suspension aus Hühnerfibroplastzellen mit einer Konzentration von 2 000 0OO lebenden Zellen pro ml in Eägle-Basalmedium (BME) mit 10 % inaktiviertem Kälberserum wird mit einer geeigneten Verdünnung der achten und letzten Ernte gemäß Beispiel 3 inokuliert. Das erhaltene Gemisch wird 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, dann in Glasflaschen übertragen und bei 36 ⁰C inkubiert. 24 Stunden nach Inokulation wird das Wachstumsmedium aseptisch dekantiert, worauf man die Flaschenkulturen zweimal mit je 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung wäscht. Jede Flaschenkultur versetzt man anschließend mit jeweils 100 ml BME-ünterhaltsmedium und inkubiert die Flaschen

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6 Tage bei 36 ⁰C. Am siebten Tag nach Inokulation sammelt man eine einzige Ernte durch Abtrennen und Zusammenfassen des Unterhaltsmediums. Die Ernte wird durch eine 5 Mikron große Milliporenmembran filtriert. Die Virusinfektivität stabilisiert man durch Zusatz eines Stabilisators bis zu einer Endkonzentration aus 4 % N-Z-Amin und 4 % Sorbit. Anschließend wird das Virus in einem Gemisch aus Trockeneis-Alkohol eingefroren und bei -6O ⁰C gelagert. Hierauf werden in CETC-Infektivitätstitrationen durchgeführt. Die virusstabxlisierte Ernte wird dann aufgetaut, den Infektivitätstitern entsprechend auf eine geeignete Konzentration verdünnt, auf Ampullen verteilt, eingefroren und bei 4 ⁰C gelagert.

Beispiel 5

Weitere Propagierung von Mumpsvirus in CETC Das Virus läßt sich wie folgt weiter propagierens

Die achte und letzte Ernte nach Beispiel 3 wird in einer Verdünnung von 10 in eine Suspension von CETC inokuliert, worauf man das Ganze 2 Stunden durchmischt, in Glasflaschen überträgt, 7 Tage bei 36 ⁰C inkubiert und durch Einfrieren erntet.

Die weitere Propagierung verläuft in abgekürzter Form wie folgt;

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σ> ο co οο

ο co cn

Ernte

9. 10.

11

27. plus

Inokulationsstärke in dem CETC

-4 1O Verdünnung

10 Verdünnung

10~ Verdünnung 1O Verdünnung Inkubation bei 36 C

Ernte

7 Tage	10.	plus	OC
6 Tage	11.		V
7 Tage	12.
7 Tage	28.

cn cn co

Die in obiger Weise schließlich erhaltene Ernte wird

wie in Beispiel 4 beschrieben zu einem Vaccin verarbeitet.

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Claims

Patentansprüche

(i) keine klinische Erkrankung manifestiert und

(ii) beim Menschen eine Antikörperreaktion auf einen wachsenden Virus hervorruft,

(b) in lebenden Zellen seine eigene Reproduzierung induziert und

(c) aus lebendem Mumpsvirus durch drei Reihendurchgänge durch primäre Humanamnionzellmonoschichten bei 34 bis 37 C, einen anschließenden Durchgang durch embryonale Hühnereier bei 34 bis 37 ⁰C und eine nachfolgende Reproduktion durch 8 bis 28 Durchgänge durch Hühnerembryogewel

abgeschwächt worden ist, und

(B) einen Stabilisator enthält.

gänge durch Hühnerembryogewebe bei 32 bis 37 ⁰C
2. Vaccin nach Anspruch 1_f dadurch gekennzeichnet, daß es als Stabilisator Sorbit und N-Z-Amin-NaK enthält.

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3. Gefriergetrocknetes Mumpsvaccin nach Anspruch 1
4. Mumpsvaccin, dadurch gekennzeichnet, daß es

(A) als wesentlichen Bestandteil eine immunologisch wirksame Menge eines abgeschwächten Mumpsvirus, der

(a) nach Injizieren am Menschen

(i) keine klinische Erkrankung manifestiert und

(ii) beim Menschen eine Antikörperreaktion auf einen wachsenden Virus hervorruft,

(b) in lebenden Zellen seine eigene Reproduzierung induziert und

(c) aus lebendem Mumpsvirus durch drei Reihendurchgänge durch primäre Humanamnionzellmonoschichten bei 36 ⁰C, einen anschließenden Durchgang durch embryonale Hühnereier bei 36 C und

eine nachfolgende Reproduktion durch 8 bis 23 Durchgänge durch Hühnerembryogewebe bei 3,6 ⁰C abgeschwächt worden ist, und

(B) Sorbit und N-Z-Amin-NaK als Stabilisator enthält.
5. Gefriergetrocknetes Mumpsvaccin nach Anspruch 4.

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6. Verfahren zur Herstellung eines lebenden Mumpsvirus, der sich als Antigen in einem Vaccin eignet, durch das beim Menschen eine Antikörperreaktion gegen einen virulenten Mumpsvirus hervorgerufen wird, ohne daß es zu einer klinischen Manifestierung der Erkrankung kommt, dadurch gekennzeichnet, daß man das virulente Virus zuerst durch drei Reihendurchgänge in primären Humanamnionzelleinschichten bei 34 bis 37 C wachsen läßt, anschließend durch einen Durchgang durch embryonale Hühnereier bei 34 bis 37 C weiter wachsen läßt und schließlich durch 3 bis 28 Durchgänge durch Hühnerembryogewebe bei 32 bis 37 ⁰C reproduziert.
7. Verfahren zur Herstellung eines lebenden Mumpsvirus, der sich als Antigen in einem Vaccin eignet, durch das beim Menschen eine Antikörperreaktion gegen einen virulenten Mumpsvirus hervorgerufen wird, ohne daß es zu einer klinischen Manifestierung der Erkrankung kommt, dadurch geken. nzeichnet, daß man das virulente Virus zuerst durch drei Reihengänge in primären Humanamnionzelleinschichten bei 36 °C wachsen läßt, anschließend durch einen Durchgang durch embryonale Hühnereier bei 36 C weiter wachsen läßt und schließlich durch 8 bis 23 Durchgänge durch Hühnerembryogewebe bei 36 ⁰C reproduziert.

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