DE2165401A1

DE2165401A1 - Kombinations-Totvaccine

Info

Publication number: DE2165401A1
Application number: DE19712165401
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Shiga; Otsuki Koichi Tottori; Irii (Japan). P A6 Ik 9-04
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1970-12-29
Filing date: 1971-12-29
Publication date: 1972-07-13
Also published as: SE398514B; FI48480B; DK135853B; GB1324619A; JPS4823893B1; BE777498A; NL7117873A; FR2120078A1; DK135853C; DE2165401C3; FR2120078B1; FI48480C; GB1324618A; DE2165401B2

Description

Priorität: 29. Dezember 1970, Japan, Nr. 129 817/70

Infektiöse Coryza, infektiöse Bronchitis und Newcastle-Krankheit sind als Erkrankungen der Atmungsorgane bei Geflügel von Bedeutung. Die infektiöse Coryza wird von Hämophilus gallinarum verursacht; die infektiöse Bronchitis und die Newcastle-Krankheit sind durch Viren verursachte Krankheiten. Das Geflügel wird durch solche Seuchen schwer beeinträchtigt. Solche Seuchen brechen häufig bei Küken, Truthühnern, Perlhühnern, Enten, Gänsen, Tauben, Fasanen und Rebhühnern aus.

Die infektiöse Bronchitis bewirkt bei jungem Geflügel eine hohe Sterblichkeit,· bei ausgewachsenem'Geflügel sind hingegen die Wirkungen dieser Krankheit weniger ernst. Die infektiöse Coryza bewirkt nur eine geringe Sterblichkeit; ihre Hauptw:irkungen bestehen in der Wachstumshemmung und im plötzlichen Rückgang der Produktion von Eiern, wodurch schwere wirtschaftliche Schäden entstehen. Die Newcastle-Krankheit ist die schwerste dex· vorgenannten Krankneiten; die durch diese Erankneit bewirkte Sterblichkeitsrate ist unabhängig vom Alter des infizierten Geflügels

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Bisher wurden zur Bekämpfung der Hewcastle-Krankheit und der infektiösen Broncnitis sowohl Tct- als auch Lebend-Virusvaccinen verwendet. Sämtliche dieser Vaccinen lagen jedoch als Einzejl-Vaccinen und nicht als Kombinations-Yaceinen vor. Ferner hat die im Handel erhältliche Totvaccine zur Bekämpfung der infektiösen Bronchitis nur eine geringe Wirkung. Lebendvacclnen ergeben zwar eine relativ'langanhaltende Immunität, aber ihre Anwendung ist im allgemeinen nicht ungefährlich. Normales, gesundes Geflürgel wird häufig durch die Vaccination mit Lefc°r-vaceinen getötet, wobei diese Gefahr besonders gross bei Geflügel mit einem Alter unter 3 Wochen ist. Ferner werden die Krankheiten durch Verwendung von Lebendvaccinen manchmal von dem vaccinierten Geflügel auf anfälliges oder nicht-immunes Geflügel übertragen. Aus diesen Gründen werden Totvaccinen bevorzugt. >

Bekanntlich treten Infektionen der Atmuiigaorgane bei Geflügel gewöhnlich in Form eines sogenannten, "respiratorischen Krankheitskomplexes" auf, der durch mehrere Verursacher, wie Hämophilus gallinarum, Newcastle-Krankheit-Yirus und infektiöses Bronchitis-Virus, hervorgerufen wird. Der bei der Geflügelzüchtung auftretende wirtschaftliche Verlust, der durch Mehrfachinfektion hervorgerufen wird, ist viel grosser als der auf einer Einzelinfektion beruhende Verlust. Ferner ist zur Behandlung einer grossen Zahl von Geflügel bei wiederholter Anwendung zweier oder mehrerer Einzelvaccinen eine beträchtlich hohe Zeit erforderlich, wodurch die Vaccination sehr kostspielig wird. Aus diesen Gründen ist die Verwendung einer Kombinations-Vaccine in tier

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_ 5 —

Geflügelsüchtung, besonders in der Geflügelzüchtung in grossem Masstab, sehr wünschenswert. Bisher wurden jedoch auf diesem Anwendungsgebiet keine Kombinations-Totvaccinen eingesetzt.

Aufgabe der Erfindung war es daher, Kombinations-Totvaccinen zur Verfugung zu stellen, mit denen die vorgenannten Krankheiten wirksam bekämpft werden können. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine Kombinations-Totvaccine, enthaltend eine v/irksame Menge von mindestens zwei der Komponen-

ten inaktiviertes Hämophilus gallinarum-Bakterium, inaktiviertes infektiöses Bronchitis - Virus und inaktiviertes Newcastle-Krankheit-Yirus.

Entgegen der naheliegenden Annahme, dass sich die Kombination mehrerer Vaecinen nachteilig auf das Geflügel auswirken könnte, wurde erfindungsgemäss überraschenderweise festgestellt, dass die Koiiibinations-Vaccine eine sichere Anwendung erlaubt und keine nachteiligen Wirkungen hervorruft. Es ist bekannt, dass die einzelnen Komponenten eines Gemisches verschiedener Vaccinen leicht ihre Aktivität durch Wechselwirkung oder gegenseitige Hemmung verlieren; vergl. Michael A. Bratt and Harry Rubin, Virology, Bd. 33 (1967), S. 598 bis 608. Erfindungsgemäss wurde jedoch festgestellt, dass bei der vorliegenden Kombinations-Totvaccine keine solchen Unverträglichkeiten auftreten.

Die bisher bekannten Totvaccinen zur Bekämpfung der infektiösen Coryza wurden durch Züchten eines Stammes von Hämophilus

gallinarum in halbsynthetischen Nährmedien hergestellt. Wegen

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ihrer zu niedrigen immunologischen Wirkungen sind diese Vaeeinen in der Praxis ungeeignet; (Clark and Godfrey» Avian Dis., Bd. 5, (1961) S. 37 und Page et al., Avian Dis., Bd. 7 (1963) S. 239). Erfindungsgemäss wurde jedoch überraschend festgestellt, dass eine Totvaccine, die durch Züchten des vorgenannten Mikroorganismus in natürlichen Nährmedien anstelle von synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedien erhalten wird, eine beträchtlich höhere immunologische Wirkung zeigt als die bekannten Vaccinen. Ferner wurde erfindungsgemäss festgestellt, dass die aus infektiösem Bronchitis-Virus hergestellte Einzel-Totvaccine, die besonders im Frühstadium nach der Vaccination nur eine geringe Aktivität zeigt, als Gemisch mit der aus Neweastle-Krankheit-Virus hergestellten Totvaccine und/oder der aus Hämophilus gallinarum hergestellten Totvaccine eine beträchtlich erhöhte immunologische Wirkung gegen die infektiöse Bronchitis aufweist. Die beiden zuletzt genannten Vaccinen verstärken also synergistisch die immunologische Wirkung der Vaccine aus inaktiviertem infektiösem Bronchitis-Virus. Die vorstehenden Ausführungen zeigen somit deutlich die beträchtlichen Vorteile der erfindungsgemässen Vaccine.

Die erfindungsgemässen Kombinations-Totvaccinen enthalten eine wirksame Menge von inaktiviertem Hämophilus gallinarum-Bakterium, inaktiviertem Newcastle-Krankheit-Virus und inaktiviertem infektiösem Bronchitis-Virus oder mindestens zwei Komponenten aus der Gruppe von inaktiviertem Hämophi'Jus gallinarum-Bakterium, inaktiviertem Ilewcastle-Krankheit-Virus und inaktiviertem infektiösem Bronchitis-Virus. Ferner wird erfin'dungsgemäss eine neue Einzel-Totvaccine zur Bekämpfung der infektiösen Ooryza geschaf-

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fen.

Me Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorgenannten lotvaceinen.

Zur Herstellung einer Totvaccine zur Bekämpfung der infektiösen Coryza werden erfindungsgemäss natürliche Nährmedien verwendet, die im allgemeinen zur Züchtung von Bakterien der Gattung ' Hämophilus eingesetzt werden. Wie vorstehend erwähnt, wurde festgestellt, dass eine durch Züchten von Bakterien der Gattung Hämophilus in natürlichen Nährmedien nergestellte Vaccine eine höhere Aktivität hat als die bei Verwendung synthetischer oder halbsynthetischer Nährmedien erhaltene Vaccine. Ferner wurde festgestellt, dass das in einem natürlichen Nährmedium gezüchtete Bakterium Hämophilus gallinarum Stamm 221 eine andere Morphologie auf v/eist als der in einem synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedium gezüchtete Stamm. Als natürliches Nährmedium kann im erfindungsgemässen Verfahren z.B. ein im wesentlichen aus 1000 ml Hühnerfleischbouillon, 5 g Natriumchlorid, 10 g Polypepton und 0,5 Prozent Hühnerserum bestehendes Medium, dessen p„-Wert auf 7,0 bis 7,4 eingestellt wird, verwendet werden. Obwohl das Nährmedium zahlreiche natürliche Nährstoffe enthalten kann, ist die Verwendung von Rindfleischextrakt oder Kartoffeln anstelle von Hühnerflcischbouillon, Caseinhydrolysat oder Hefeextrakt anstelle von Polypepton und Schafserum oder Diphosphopyridinnucleotiden anstelle von Hühnerserum bevorzugt. Als natürliches Nährmedium können auch angebrütete Hühnereier verwendet werden.

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Das Bakterium Hämophilus gallinaruia Stamm 221 ist im National Institute of Animal Health (KIAH), Ministeriuni für Landwirtschaft und Porsten, das in Verbindung mit der Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms steht, hinterlegt, Es wird darauf hingewiesen, dass erfindungsgemäss nicht nur der vorgenannte Stamm., sondern auch, andere bekannte Stämme von Hämophilus gallinarum zur Herstellung der erfindungsgemässen Vaccinen eingesetzt v/erden können.

Erfindungsgemäss wird ein natürliches Nährmedium mit Eämophilus gallinarum beimpft, und das beimpfte Nährmedium wird, in einer Standkultur mit grossem Volumen bei üblichen Temperaturen, z.B. 30 bis 40 C, bebrütet. Die Züchtung kann,auch unter aeroben Bedingungen in Submerskultur durchgeführt werden. Nach beendeter Züchtung wird die Kulturbrühe mit einem Inaktivierungsmittel zur Inaktivierung des Mikroorganismus versetzt. Als"Inaktivierungsmittel können z.B. das Natriumsalz der Äthylmercurithiosalicylsäure, ß-Propiolacton, Tylosin-, Salicylsäure, Kristallviolett, Benzoesäure, oberflächenaktive Mittel, wie Benzethoniumchlorid, Polymyxin und Gramicidin eingesetzt v/erden. Nach der Zugabe einer geeigneten Menge eines Adjuvans wird die Kulturbrühe in einer Durchlaufzentrifuge zentrifugiert. Als Adjuvans kann z.B. Aluminiumhydroxidgel, Aluminiumphosphatgel, Calciumphosphatgel oder ein Alaun eingesetzt werden. Der bei der Zentrifugation erhaltene Rückstand wird zur Herstellung einer Suspension mit einer Zellkonzentration von 10 bis 10 Zellen/ml in einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wird zur Lagerung mit einem antiseptischen Mittel versetzt. Als antiseptisches Mittel kann z.B. das

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Ii atriums al 55 der Äthylmercurithiosalicylsäure, Tylosin, ß-Propio- !acton, Benzoesäure, Formalin, Salicylsäure, Kristallviolett, oberflächenaktive Mittel, wie Benzethoniumchlorid, Polymyxin oder Gramicidin verv-'endet werden. Die so hergestellte infektiöse CoryKa-Totvaccine wird nachstehend als Hg-Vaccine bezeichnet.

Die Herstellung von Eewcastle-Krankheit-Totvaccine und von infektiöser Brojichitis-Totvaccine kann nach üblichen Methoden erfolgen, z.B. durch Vermehren des Virus in einem angebrüteten Hühnerei, Isolieren, Inaktivieren und Suspendieren des Virus in einer x³ufferlösung und anschliessendes Versetzen der Suspension mit " einem Adjuvans.

Ein typisches Mev/castle-Krankheit-Virus zur Herstellung der Newcastle-Krankheit-Totvaccine ist Sato-Stamm Newcastle-Krank·- heit-Virus. Dieses Virus ist im KlAH hinterlegt. Ferner kann anstelle des vorgenannten Virus auch Miyadera-Stamm Bewcastle-Krankheit-Virus verwendet werden. Die erfindungsgemäss ersetzbaren Kewcastle-Krankheit-Viren sind jedoch nicht auf die vorgenannten zwei Stämme beschränkt. Die so hergestellte Newcastle-Krankheit-Totv&ecine wird nachstehend als ND-Vaccine bezeichnet.

Ein typisches infektiöses Bronchitis-Virus zur Herstellung der infektiösen Br oiiehiti ε-Tot vaccine ist Beauciette~42<-Stamm infektiöses Bronchi tis~ViruK, das ebenfalls im HIAH hinterlegt ist. Die orfiiidungsfeiiiass einsetzbaren Viren sind jedoch nicht auf diesen Stamm Lt ::;-hräul;t. So ktmn z.B. anstelle von Beaudette-42-Stamia auch Ila&.'-.'iChusetts-Typ-Stamm oder Connecticut-Typ-Stamm infektiöses Bronchitis-Virus verwendet werden. Der Beaudette-42-Stour.: ist dem Iiaasachusetts-Typ-Stamm ähnlich, so dass die aus

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Beaudette-42-Starnm hergestellte Virus-Totvaccine ebenfalls eine immunologische V/irkung gegen die durch Massachusetts-Typ-Stamm und Connecticut-Typ-Stamm verursachte infektiöse Bronchitis aufweist. Die so hergestellte infektiöse Bronchitis-Totvaccine wird nachstehend als IB-Vaccine bezeichnet.

Zur Herstellung von Kombinations-Vaccinen v/erden zwei oder drei

Bakterium, Vaccinen von inaktiviertem Hämophilus gallinaruni-/inaktiviertem Newcastle-Krankheit-Virus und inaktiviertem infektiösem Bronchitis-Virus in solchen Mengen vermischt, dass jede A^raccine in dem -Endprodukt in e>rer wirksamen Konzentration enthalten ist. Eine bevorzugte Kombinat!ons~Vaceine enthält 5 Dis 30 Volumteile inaktiverte Hämophilus gallinarum Stamm 221-Suspension in einer Konzentration von 3,3 x 10 bis 3,3 x 10^ Zellen/ml, 5 bis 30 Volumteile inaktivierte Beaudette-42-Stamm infektiöses Bronchitis-Virus-Suspension in einer Konzentration von 10 bis 10' EID^/ml und 5 "bis 30 Volumteile inaktivierte Sato-Stamm Newcastle - Krankheit-Virus-Suspension in einer Konzentration von 1O⁶'⁵ bis 1O-⁹'⁵ EID₅₀/ml pro 100 Volumteile Kombinati οηε-Vaccine. Die vorgenannten Mengenverhältnisse sind jedoch nicht erfindungswesentlich.

Obwohl die erfindungsgernäss hergestellten Vaccinen in den meisten Fällen eine ausreichende immunologische Wirkung ohne einen Zusatz eines Adjuvans aufweisen, werden die Vaccinen vorzugsweise zur Verstärkung ihrer Wirkung mit einem Adjuvans versetzt. Ein bevorzugtes Verhältnis des Adjuvans beträgt 1 bis 50 Volumteile pro 100 Volumteile Kombinations-Totvaccine; dieses Verhältnis ist jedoch nicht erfindungswesentlich. Als Adjuvans

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kann erfindungsgemäss Aluminiumhydroxidgel, Aluminiumphosphatgel, Calciumphosphatgel oder ein Alaun verwendet werden. Den Vaccinen kann,falls notwendig, ein antiseptisches Mittel, wie das Natriumsalz der Athylmercurithiosalicylsaure, ß-Propiolacton, Tylosin, Salicylsäure, Kristallviolett, Benzoesäure, oberflächenaktive Mittel, wie Benzethoniumchlorid, Polymyxin oder Gramicidin zugesetzt werden« Die erfindungsgemässen Totvaccinen können dem Geflügel intramuskulär, subcutan oder intracutan injiziert werden.

Die erfindungsgemässen Kombinations-Totvaccinen haben eine ausgezeichnete immunologische Wirkung. Durch eine einzige Anwendung kann eine Immunisierung gegen sämtliche der vorgenannten drei Krankheiten, d.h., gegen infektiöse Coryza, infektiöse Bronchitis und Newcastle-Krankheit, bewirkt werden. Ferner tritt bei Geflügel, das mit einer erfindungsgemässen Vaccine behandelt wurde, keine merkliche Nebenwirkung auf. Die erfindungsgemässen Vaccinen eignen sich somit vorzüglich zur ;

■ ■ ι Immunisierung von Geflügel gegen Infektionen der Atmungsorgane. \

Durch die Anwendung dieser Vaccinen in der Geflügelzüchtung, j

ι besonders in der GeflügelZüchtung in grossem Masstab,'ergeben '

sich somit beträchtliche Vorteile. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiell

Zur Herstellung einer Hg-Totvaccine wird ein Medium mit der nachstehenden Zusammensetzung verwendet:

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Hühnerfleischbouillon * 1000 ml

Natriumchlorid 5 g

Polypepton 10 g

Huhnerserum 0,5 Prozent P_H 7,0 bis 7,4

* 1 kg zerkleinertes Hühnerfleisch wird unter Rühren mit 2 Liter Wasser versetzt. Das Gemisch wird etwa 24 Stunden bei 0 C stehengelassen, dann 50 bis 60 Minuten mit Wasserdampf behandelt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wird als Hühnerfleischbouillon eingesetzt.

Das Hühnerfleischbouillon wird zusammen mit Natriumchlorid und ^ Polypepton in einem 4.ii^?nklav 20 Minuten bei 121 C sterilisiert.

Das Hühnerserum wird getrennt mittels eines Seitz-Filters sterilisiert. Das sterilisierte Hühnerserum wird zu dem sterilisierten Gemisch der übrigen Komponenten gegeben..

Das aus einer gefriergetrockneten Vorratskultur erhaltene Bakterium Hämophilus gallinarum Stamm 221 wird in den Dottersack eines 4 Tage bebrüteten Hühnereis in einer Konzentration von etwa 10 lebenden Zellen/ml eingeimpft. Nach etwa 24stündiger Inkubation ist der Embryo abgestorben; der Eidotter v/ird auf einem Blutagar-Nährboden ausgestrichen, und Hämophilus gallinarum Stamm 221 wird 24 Stunden in einer '5 bis 10 Prozent Kohlendioxid enthaltenden Atmosphäre bei 37°C gezüchtet. Die aus einer Kolonie auf dem Blutagar-Nährboden erhaltenen Zellen werden in 1 Liter des in einem 2 Liter fassenden Kolben befindlichen vorstehend hergestellten Mediums in einer Konzentration

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von 10 bis 10 lebende Zellen/ml eingeimpft. Die Züchtung wird in einer Standkultur bei 37 C solange durchgeführt, bis eine stationäre Phase mit einer Zellkonzentration von 10 bis 10

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Zellen/ml erreicht ist. Die Zellen werden dann durch Zugabe von 0,1 Prozent Natriumsalz der Athylmercurithiosalicylsäure inak-

tiviertjUiid die'Kulturbrühe wird etwa 24 Stunden bei 4 C stehendes nachstehend beschriebenen gelassen. Dann wird die Kulturbrühe mit etwa 1 Volumt'eilVAluminaumhydroxidgells pro 50 Volumteile Kulturbrühe versetzt. Das Gemisch wird etwa 5 Minuten bei.Raumtemperatur stehengelassen und dann bei 6000 bis 12 000 UpM mit einer Ausflussgeschwindigkeit von 100 ml/Minute in der Durchlauf zentrifuge zentrifugiert. Der Zentrifugationsrückstand wird mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (p„ 7,2 bis 7,5) versetzt; es wird eine Suspension*hergestellt, die et- ™ wa die 33fache Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe aufweist. Diese Suspension wird mit soviel Tylosin als antiseptischem Mittel versetzt, dass dessen Endkonzentration 5 Prozent ausmacht.

Herstellung von 15prozentiger Hg-Vaccine:

15 Volumteile der vorstehend .hergestellten Suspension v/erden

mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und

physiologischer Kochsalzlösung (p„ 7,2 bis 7,5) und Aluminium-

hydroxidgel in solchen Mengen vermischt, dass 100 Vol.umteile Hg-Vaecine erhalten werden, die 5^ Volumteile Aluminiumhydroxidgel enthält.

Herstellung des Aluminiumhydroxidgels:

Ein geringer Überschuss einer lprozentigen wässrigen Lösung von Ammoniumaluminiumsulfat wird mit lprozentiger wässriger Ammoniaklösung umgesetzt. Der.Überstand'wird dekantiert; Der Niederschlag wird solange mit Wasser gewaschen, bis das Wasch-, v/asser keine Ammoniumionen mehr enthält. Der Niederschlag wird

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30 Minuten bei 120 C in einem Autoklav sterilisiert. Das so erhaltene Aluminiumhydroxidgel wird als Adjuvans verwendet.

Beispiel 2

Etwa 10 Zellen von Sato-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus v/erden in die Allantoishöhle eines 9 bis 11 Tage bebrüteten Hühnereis eingeimpft und 26 bis 36 Stunden in einem Inkubator bei 37°C vermehrt. Die Allantoisflüssigkeit wird dann aus dem Ei entnommen und mit ß-.Propiolacton als Inaktivierungsmittel bis zu einer Endkonzentration von 0,05 Prozent versetzt. Dieses Gemisch α wird dann 30 bis 6O^- Minuten bei 4 C stehengelassen und anschlies-

send etwa 30 Minuten bei 3000 UpM zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert.

Herstellung von 15prozentiger ND-Vaccine:

15 Volumteile des bei der Zentrifugation erhaltenen Überstands, der 10 '⁵ bis 10^'^ EID_5Q/ml Sato-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus enthält, werden mit 50 Volumteilen von gemäss Beispiel 1 hergestelltem Aluminiumhydroxidgel versetzt. Das Gemisch wird dann mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (p_H 7,2 bis 7,5) auf 100 Volumfe teile verdünnt.

Beispiel 3

Eine IB-Totvaccine wird gemäss dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt, mit der Ausnahme, dass Beaudette-42-Stamm infektiöses Bronchitis-Virus anstelle von Sato-Sta;üm Newcastle-Krankheit-Virus eingesetzt wird.

' · Herstellung von 15prozentiger IB-Vaccine:

15 Volumteile des erhaltenen Über stands, der 10 bis 10 EID₁-q/ ml Beaudette-42-Stamm enthält, werden mit 50 Volumteilen von

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gernäss Beispiel 1 hergestelltem Aluminiumhydroxidgel versetzt. Das Gemisch wird dann mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (p^ 7,2 bis 7,5) auf 100 Volumteile verdünnt. " · ' ·

Beispiel 4

Herstellung einer Kombinat!ons-Totvaceine, die.15 Prozent ND-Vaccine und 15 Prozent IB-Vaecine enthält:

Ein Gemisch von 15 Volumteilen gemäss Beispiel 2 hergestelltem Überstand mit 10 *⁵ bis 1O⁹*⁵ EID^/ml Sato-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus und 15 Volumteilen des gemäss Beispiel 3 herge- * stellten Überstands mit 10⁴ bis 10 EID₅₀/ml Beaudette-42-Stamm wird mit 50 Volumteilen von gemäss Beispiel 1 hergestelltem Aluminiumhydroxidgel versetzt. Das Gemisch wird dann mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pp. 7,2 bis 7,5) auf 100 .Volumteile -verdünnt.

Beispiels

Herstellung einer Kombinations-Totvaecine, die 15 Prozent IB-Vaccine und 15 Prozent Hg-Vaccine enthält;

Ein Gemisch von 15 Volumteilen Überstand, der 10 bis 10 EIDn₀/ A ml Beaudette-42-Stamm gemäss Beispiel 3 enthält, und 15 Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension gemäss Beispiel 1

mit
wird/Aluminiumhydroxidgel gemäss Beispiel 1 und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (Pji 7,2 bis 7,5) versetzt. Es werden 100 Volumteile Kombinations-Totvaccine hergestellt, die 50 Volumteile Aluminiumhydroxidgel enthält.

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Beispiel 6 Herstellung einer Kombinations-Totvaccine, die 15 Prozent ND-Vaccine und 15 Prozent Hg-Vaccine enthält:

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Ein Gemisch von 15 Volumteilen Überstand, der IO *^ bis 10 *

Q Sato-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus gemäss Beispiel 2 enthält, und 15 Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension gemäss Beispiel 1 wird mit Aluminiumhydroxidgel gemäss Beispiel 1 und einem aterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (p„ 7»2 bis 7,5) versetzt. Es werden : 100 Volumteile Kombinations-Totvaecine hergestellt, die 50 Vo-' lumteile Aluminiumhydroxidgel enthält.

Beispiel?

Herstellung einer Kombinations-Totvaccine, die 15 Prozent ND-Vaccine, 15 Prozent IB-Vaccine und 15 Prozent Hg-Vaccine ent-' hält:

Ein Gemisch von 15 Volumteilen Überstand, der 10 * bis 10 ' EID(-₀/ml Sato-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus geraäss Beispiel 2

enthält, 15 Volumteilen Überstand, der 10* bis 10⁷ EID₁-₀/ml ^ Beaudette-42-Stamm gemäss Beispiel 3 enthält, und 15 Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension gemäss Beispiel 1 wird mit Aluminiumhydroxidgel gemäss Beispiel 1 und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (p_H 7,2 bis 7,5) versetzt. Es werden 100 Volumteile Kombinations-Totvaccine hergestellt, die 50 Volumteile Aluminiumhydroxidgel enthält.

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Beispiel 8

Herstellung einer Kombinations-Totvaccine, die 15 Prozent ND-Vaceine, 15 Prozent IB-¥accine und 15 Prozent Hg-Vaccine enthält:
Ein Geraisch von 15 Volumteilen Überstand, der 10 * bis

10 ' EID^/ml Sato-Stamm Newcastle—Krankheit-Virus gemäss Beispiel 2 enthält, 15 Volumteilen Überstand, der 10 bis 10 EID₁-Q/ml Beaudette-42-Stamm gemäss Beispiel 3 enthält, und 15 Volumteilen der 33faeh konzentrierten Suspension von Hämophilus gallinarum-Stamra 221, die gemäss Beispiel 1 hergestellt wurde, mit der Ausnahme, dass anstelle von Aluminiumhydroxidgel das nachstehend beschriebene CaIciumphosphatgel eingesetzt wird, wird mit Calciumphosphatgel und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (p_H 7,2 bis 7,5) versetzt. Es werden 100 Volumteile Kombinations-Totvaccine hergestellt, die 50 Volumteile Calciumphosphatgel enthält.

Herstellung des CaIciumphosphatgels:

10 Liter einer 0,1 m wässrigen Calciumchloridlösung werden mit 10 Liter einer 0,1 m wässrigen Natriumhydrogenphosphatlösung versetzt. Nach dem Dekantieren des Überstands wird der Niederschlag solange mit Wasser gewaschen, bis im Waschwasser keine Ammoniumionen mehr enthalten sind. Der Niederschlag wird 30 Minuten Dei 120 C in einem Autoklav sterilisiert. Das sterilisierte Produkt wird als Caleiumphosphatgel eingesetzt.

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Beispiel 9

Herstellung einer Kombinations-Totvaecine, die 15 Prozent ND-Vaccine, 15 Prozent IB-Vaccine und. 15 Prozent Hg-Vaccine

enthält:

6 b Ein Geraisch von 15 Volumteilen Überstand, der 10 * bis

10 ' EIDj-q/πιΙ Sato-Stamm Newcastle-Krankneit-Virus gernäss Beispiel 2 enthält, 15 Volumteilen Überstand, der 10 bis

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10 EID_t-_n/mLBeaudette-42-Stamin gemäss Beispiel 3 enthält, und 15 Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension von Hämophilus gallinarum Stamm 221, die gemäss Beispiel 1 hergestellt wurde, mit der Ausnahme, dass anstelle des Aluminiumhydroxidgels das nachstehend beschriebene Aluminiumphosphatgel eingesetzt wird, wird mit Aluminiumphosphatgel und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung Cp₁₁ 7,2 bis 7,5) versetzt. Es werden 100 Volumteile Kombinations-Totvaeeine hergestellt, die 50 Volumteile Aluminiumphosphatgel enthält.

Herstellung des Aluminiumphosphatgels:

Eine lprozentige wässrige Natriumhydrogenphosphatlösung wird bei Raumtemperatur unter Rühren mit einer lprozentigen wässrigen Aluminiumchloridlösung versetzt. Nach Dekantieren des Überstands wird der Rückstand solange mit Wasser gewaschen, bis im Waschwasser keine Chloridionen mehr enthalten sind. Der Niederschlag wird 30 Minuten bei 120⁰C in einem Autoklav sterilisiert. Das sterilisierte Produkt wird als Aluminiumphosphatgel eingesetzt.

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Vergleichsversuch 1

Männlicnen, 4 Wochen alten Forsgate-Küken werden intramuskulär 0,5 ml der gemäss Beispiel 1, 2, 3, 6 bzw. 7 hergestellten Einfach- oder Kombinations-Totvaccine injiziert. Die Gruppen der immunisierten und der nicht-immunisierten Küken werden 2 Wochen später durch Eintropfen von Hämophilus galliharum Stamm 221 in die Nasenhöhle infiziert. Die Symptome der infektiösen Coryza (Nasenabscheidung, Schwellungen in der Gesichtsgegend und Niesen) werden während der 7 auf die Infektion folgenden Tagen täglich registriert. Die Zunahme des Körpergewichts wird 6 Tage lang bestimmt. Die Ex'gebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

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	Gruppe	IV	' Vaccine	Tabelle I	Symptome	. .2.	infektiöser ti on ρ fo	.'...4.'.	Coryza	nach der	Infek	18 -
	Infiziert		-		L %..	100	'.. . 3. .	100	.. .5	... 6 .	7 (
	Il		15io Hg	Anzahl der Küken	100	0	100	0	100	100	100	Zunahme ■"" des Körper- — gewichts, Tage) g/Küken
	Il	1596 ND	6	0	100	0	100	0	0	0	31,6
	Il ti	I556 IB ' 15#Hg + 159έ UD	Ul	100	100 0	100	100 0	100	100	100	67,0
	15$ Es)	5	100 0	0	100 0	0	100 O	100 0	100 0	4,0
O	*15 IBJ**	in in	0		0		0	0	0	33,0 ■ 89,0
9829/	nicht infiziert (Kontrolle).	5		0		P				123,0
1 120		0		0		0	0	0
	6				90,0

Die mit 15prozentiger Hg-Vaccine oder mit der Kombinations-'Vaccine, die 15 Prozent Hg-Vaccine, 15 Prozent ND-Vaccine und 15 Prozent IB-Vaccine enthält, immunisierten Küken zeigen keine Symptome der infektiösen Coryza. Die nicht-immunisierten und die mit 15prozentiger ND-Vaceine oder mit 15prozentiger IB-Vaccine immunisierten Küken zeigen Symptome der infektiösen Coryza und eine verminderte Zunahme des Körpergewichts.

Vergleichsversuch 2

Männlichen, 4 Wochen alten Forsgate-Küken werden intramuskulär 0,5 ml der geraäss Beispiel 9 hergestellten Kombinations-Vaccine ^ Injiziert. Die Wirksamkeit der Kombinations-Vaecine wird gemäss

den nachstehend beschriebenen Methoden bestimmt:

1) Immunitätstest:

Immunisierte bzw. nicht-immunisier te Küken v/erden durch Eintropfen von Hämophilus gallinarum Stamm 221 in- einer Konzentration von 5 x 10 Zellen/ml in die Nasenhöhle oder durch Injizieren von Sato-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus in einer Konzentration von 1,000 der minimalen Letaldosis in den Muskel infiziert. Die Symptome der infektiösen Coryza (Nasenabschei- | dung und Schwellungen in der Gesichtsgegend) werden während der 10 auf die Infektion folgenden Tagen täglich registriert. Es wird die Anzahl der Küken bestimmt, die 10 Tage nach der Infektion überleben.

2) Hemmung der Häinagglutination (HI):

2 Wochen nach der Vaccination hergestelltes Kükenserum wird nach Art einer Verdünnungsrexhe verdünnt. 0,2 ml eines Antigens, das 4 HA-Einheiten Ishii-Stamm Neweastle-Krankheit-Virus

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eingegangenam ..AiIiL-

enthält, werden mit 0,2 ml des verdünnten Serums versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 0,4 ml einer 0,5 Prozent rote Blutkörperchen von Küken enthaltenden Suspension versetzt. Es wird das maximale Verdünnungsverhältnis des Serums bestimmt, bei dem die Hämagglutination vollständig gehemmt wird. Dieses Verdünnungsverhältnis stellt den HI-Titer gegen NDV dar; vergl. Kawashima et al., Heport of Gov. Exp. Sta. Anim. Hyg., Bd. 29, (1959), S. 19.

3) Virusneutralisation:

™ 2 Wochen nach der Vaccination v/erden den Küken 0,2 ml Serum entnommen. Dieses Serum wird mit 0,2 ml geeignet verdünntem Beaudette-42-Stamm infektiösem Bronchitisvirus (IBV) geschüttelt. Das Gemisch wird 15 Stunden bei 0 bis '4⁰C inkubiert. Anschliessend werden 0,1 ml dieses Gemisches in die Allantonshöhle eines 11 Tage bebrüteten Hühnereis eingeimpft. Nach 1-wöchiger Inkubation werden die beimpften Eier auf eine aufgetretene Infektion untersucht. Der 50 Prozent-Endpunkt der Mortalität der Embryonen wird in jeder Versuchsserie nach Behrens-Kärber (D. Kärber, Arch. Exp. Path. Pharin., Band 162 (1931), S. 480) bestimmt. Die Differenz zwischen den Mortalitätsendpunkten der Virustitration und der Titration des Serum-Virus-Gemisches stellt die Neutralisationskanazität des Serums dar.

»Wenn z.B. die Mcrtalitätsendpunkte der Virustitration bzw. der Ti-C h

tration des Serum-Virus-Gemisches in 10 fächer bzw. 10 fächer Ver-, dünnung erreicht werden, beträft der Neutralisationstiter des Serums 2,00 Neutralisationsdosen in 0,05 ml Serum (Biester und Schwarte, Diseases of Poultry, 5. Auflage (196$), The Iowa State University Press, Ames, Iowa, V.St.Α., S. 605 bis 619). Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

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Tabelle II - 21 -

Zunahme Immunitäts- Neutra-

des Kör- _w, _φ· test mit lisa-

Symptome infektiöser Corysa nach Infek- perge- P'^'Newcastle- -fcions-

Anzahl tion mit Hämophilus gallmarum 'wichts Krankheit- titer

Gruppe der , . . · über 10 ||f^en Virus gegen

Küken τ ₂ 3 4^5 β 7 89 'lo(Tage)Tage, g " IBV

Kontrol- 2F----- + ----. 90,0 <5 D

σ le '. . ·

-* 5e ■ 65 0' i5 D

to ■ '

Mittelwert

80,0	40	S
145,0	80	S
120,0	10	S
115,0	40	S
140,0	40	S

78,0 <5 0/5** - 0,10

F -■■■-'- -;'-.-■■■■- - - -

vaccmier- , . . . .

te Tiere _ö F- - -.-. -.— -. _. - . _ ■

Q-F - - .- - -.■·'-:-··-. - ,- ;■ ■ 115.0. 40 S TO

. 10 F — — —,.— — — ■ — — —..·- xfu, υ *(-υ ο (jn

Mittelwert .· . . 120,0 38 5/5** 2,20 —>·

eingegangen ^

- 22 -

Symptome infektiöser Coryza:

P = Schwellungen in der Gesichtsgegend, S = Nasenabscheidung.

Die Stärke der Symptome wird grob durch die Anzahl der + Zeichen wiedergegeben:

- : keine Symptome ++ : massig starke Symptome +++ : sehr starke Symptome * D : eingegangen S: überlebend ** Überlebende Küken/Anzahl der Versuchsküken.

Aus Tabelle II ist ersichtlich, dass die mit der aus 15 Prozent Hg-Yaccine, 15 Prozent ND-Vaccine und 15 Prozent IB-Vaccine bestehenden Kombinations-Totvaccine immunisierten Küken ^epen infektiöse Coryza, Newcastle-Krankheit und infektiöse Bronchitis geschützt sind.

_ Vergleichsversuch J>

Die Wirkungen der Einfach- und Kombinations-Totvaccinen gegen infektiöse Bronchitis und Newcastle-Krankheit werden gemäss
den im Vergleichaversuch 2 beschriebenen Methoden untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt.

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216b4ül

	Küken- Nr.	T	- 23 -	II	0/5	' · ·	5/5	•	Neutralisa- tionstiter gegen IBV	-	0,20
	1	Körper ge wicht, g	abolle I							*
	2	234		Immunitäts test mit Newcastle- Krankheit- Virus *
Vaccine	3.	172	HI- T it er gegen NDV
	4	219	<5 '			-0,80
	5	220	<5
Kon	6	190	<5	0/6 '	5/5 .
trolle	7 ·	204	<5
	8	176	<5	•		0,20
	9	160	<5
	IO	166	<5		-
15^ Hg	11	192	<5	0/5
	12	160	<5
	13	184	<5	•
-	14	182	<5		0,00
	15	186	10
	16	202	<5
15JÄ ND	17	218	10
	18	188	20
	19	194	5 .	0,00
	20	172	<5
	21	178	<5
1 5?δ IB	22	. 200	<5
	23	178
	24	216	<5
	25	240	20
15?ί Hg	26	210	10
+		200	40
155S ND	5
	5

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2165A01

- 24 Tabelle III - Fortsetzung

27 186 <5

Hg ' 28. 218 <5

+ 29 ■ 150 <5 0/5 0,00

IB 30 196 <5

31 192 <5

32 220 40 .IB 33 234

+ 34 190 5 5/5 ' . ;' 2.20

15$ ND * 35 180 10

36 200 20

!',"A Hg 37 ' 178 40

+ 38 216 10 · ;

IB 39 188 5 5/5 2_?5Ο

+ 40 194

ND 41 132 -10

* Überlebende Küken/Anzahl der Versuchslcüken.

Die verwendeten Totvaccinen werden geniäss Beispiel 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 hergestellt.

209829/1

- 25 Tabelle IV

Vaccine Küken, ^I-Iiter Immunitätstest Neutralisations-Nr. gegen mit Newcastle- titer gegen IBV NDV Krankheit-Virus a

Kontrolle

1 2 3 4 5

<5 O

0,00

Im Handel
erhältliche

ND-Τοΐ-vaccine **

6 7

8 9

10

80 80

40 40

0,30

ND

11 12 13 14 15

80 80 20 10 5

0,70

16 17 18 19 20

<5

<5 <5 <5

0,00

IB

21 22 23 24 25

<5

<5 <5

<5

-0,30

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■ * 26 - Tabel]e IY -Fortsetzung

26 5

I5<fo ND 27 160

+ . . 28 40 5/5 1₅5O

IB 29 10

. 30 20 ' .

31 40 ' .

ND .. 32 20 ' ■

+ 33 20 5/5 1,80 5?δ IB 34-80

. 35 · 40 .

· - 36 40 . ....

ND ... 37 . 20 - " ■'■_'

+ ■ 38 40. 5/5 2p.O

15fe IB 39 40 ■■

^: - 40 80 - -', {' ■ ■

* ■· .41 5 '■■ .- "■■■:... ■ .-

ND . 42 io ' ·'ν

+ 43 . 10 5/5 2*00

30?δ IB 44 80 ' "".·..

45 80 · " -

46 40 ·; ;

47 80 * · ·.

+ .48 80 * 5/5 2_;20

IB 49 80 . ·

""."' 50 80

2 0 9829/1120 ORIGINAL INSPECTED

~ 27 Tabelle IV -Fortsetzung

	80
51 ■	5
52	5
53	20
■ 54	40
55

lO^c/o ND

5/5 2,80

AOfo IB

* Überlebende Küken/Anzahl der Versuchsküken

** Hergestellt von Chemo-sero-Therapeutic Research Institute, Kumampto, Japan,

Die in dem Versuch verv/endeten Totvaccinen wurden gemäss den Beispielen 2, 3 und 4 hergestellt, mit der Ausnahme, dass das Aluminiumhydroxidgel durch Aluminiumphosphatgel erse.tzt wurde. X^cß> Vaccine bedeutet, dass X Volumteile Überstand, der 10 *⁵ bis 1O⁹'⁵ EIDc_o/ml Sato-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus

4 9
oder 10 bis 10 ΕΠ),-₀/πι1 Beaudette-42-Stamm infektiöses Bronchitis-Virus enthält, in 100 Volumteilen Vaccine enthal- ■ ten ist.

Es ist ersichtlich, dass Küken, die durch Injizieren einer 15prosentigen IB-Einfachvaccine immunisiert wurden, zwei Wochen nach der Vaccination kaum Antikörper gegen infektiöses Bronchitis-Virus· bilden; hingegen bilden Küken, die mit der 15 Prozent IB_rVaccine und 15 Prozent ND-Vaccine oder mit der 15 Prozent IB-Vaccine, 15 Prozent NB-Vaccine und 15 Prozent Hg-Vaccine enthaltenden Kombinations-Totvaccine immunisiert wurden, in vollem Mass Antikörper gegen infektiöses Bronchitis-Virus-. Aus den Tabellen III und IV geht somit hervor, dass die Wirkung der IB-Vaccine durch gemeinsame Verabreichung mit ND-Vaccine beträchtlich verstärkt wird.

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eingegangen am.....1Λ2ι1ι

^{216 5 4} °¹

Vergleichsversuch ^

Die Wirkungen der 15prozentigen IB-Vaccine, der 15prozentigen Hg-Vaccine und der aus 15 Prozent IB-Vaccine und 15 Prozent Hg-Vaccine bestehenden Kombinationsvaccine auf infektöse Bronchitis werden nach der im Vergleichsversuch 2 beschriebenen Methode untersucht. Die Hemmung der Hämagglutination bei infektiöser Coryza wird gemäss der im Vergleichsversuch 2 beschriebenen Methode durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Hämophilus gallinarum Stamm 221 anstelle von Ishii-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus eingesetzt wird. Die Er-. gebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.

	ΓΙ β	Tabelle V	Wochen nach der	HI-Titer gegen "Hämophilus gallinarum	5	9
			5 9	Vaccination	<5	<5
		Neutralisationstiter gegen IBV	OO	0 3	<T5	< 5
/ ac c ι	IB		,2 1,0 1,7	<5 <5	80	20
	Hg	0 3	0 0	! <£5 <5	80	30
	Hg	0 0	>2 2,0 2_T2	< 5 80
15/_O		0 1,		<5 80
15f₀	0 0
	0 1,

Die im Versuch verwendeten Totvaccinen wurden gemäss Beispiel 1, 3 und 5 hergestellt, mit der Ausnahme, dass Aluminiumhydroxidgel durch Aluminiumphosphatgel ersetzt wurde. Aus Tabelle V ist ersichtlich, dass die Aktivität von IB-Vaccine durch gleichzeitiges Verabreichen mit Hg-Vaccine verstärkt wird.

Obwohl die mit den erfindungsgemässen Einfach- und Kombinations-Totvaccinen verbundenen Vorteile nur für Küken nachgewiesen wurden, ist es für den Fachmann klar, dass die erfindungsgemässen Vaccinen in gleicher Weise auf andere Geflügelarten anwendbar sind.

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Claims

- 29 Patentansprüche

1. Kombiriations-Totvaecine, enthaltend eine wirksame Menge von mindestens zwei der Komponenten inaktiviertes Hämophilus gallinarum-Bakterium, inaktiviertes infektiöses Bronchitis-Virus und inaktiviertes Newcastle-Krankheit-Virus.

2. Kombinations-Totvaccine nach Anspruch 1, enthaltend eine wirksame Menge von

(1) inaktiviertem Hämophilus gallinarum-Stamm 221,

(2) inaktiviertem Beaudette-42-Stamm infektiösem Bronchitis- U Virus, inaktiviertem Massachusetts-Typ-»-Stamm infektiösem Bronchitis-Virus oder inaktiviertem Connecticut-Typ-Stamm infektiösem Bronchitis-Virus und

(3) inaktiviertem Sato-Stamia Newcastle-Krankheit-Virus oder inaktiviertem Miyadera-Stamm Eewcastle-Krankheit-Virus.

3. Kombinations—Totvaccine nach Anspruch 1, enthaltend eine wirksame Menge von inaktiviertem Hämophilus gällinarum-Bakterium und inaktiviertem infektiösem Bronchitis-Virus.

4. Kombinations-Totvaccine nach Anspruch 1 und 3, enthaltend eine wirksame Menge von

(1) inaktiviertem Hämophilus gallinarum Stamm 221 und

(2) inaktiviertem Beaudette-42-Stamm infektiösem Bronchitis-Virus, inaktiviertem Massachusetts-Typ-Stamm infektiösem Bronchitis-Virus oder inaktiviertem Connecticut-Typ-Stamm infektiösem Broncnitis-Virus.

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2165A01

5. KomDinations-Totvaccine, enthaltend eine wirksame Menge von inaktiviertem Hämophilus gallinarum-Bakterium und inaktiviertem Newcastle-Krankheit-Virus.

6." Kombinations-Totvaccine nach Anspruch 1 und 5, enthaltend eine wirksame Menge von

(1) inaktiviertem Hämophilus gaxiinarum Stamm 221 und

(2) inaktiviertem Sato-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus oder inaktiviertem Miyadera-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus,

7. Kombinations-Totvaccine nach Anspruch 1, enthaltend eine wirksame Menge von inaktiviertem infektiösem Bronchitis-Virus und inaktiviertem Newcastle-Krankheit-Virus.

8. Kombinations-Totvaccine nach Anspruch 1 und 7, enthaltend eine wirksame Menge von

(1) inaktiviertem Beaudette-42-Stamm infektiösem Bronchitis-Virus, inaktiviertem Massachusetts-Typ-Stamm infektiösem Bronchitis-Virus oder inaktiviertem Connecticut-Typ-Stamm infektiösem Bronchitis-Virus und

(2) inaktiviertem Sato-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus oder inaktiviertem Miyadera-Stamm Newcastle-Krankheit-Virus.

9. Infektiöse Coryza-Totvaccine, hergestellt durch Züchten eines Stammes von Hämophilus gallinarum in einem natürlichen Nährmedium, Inaktivieren der gezüchteten Zellen und Aufarbeiten auf eine Vaccine.

BAD

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- 51 -

10. Infektiöse Coryza-Totvaccine nach Anspruch 9, hergestellt durch Züchten von Hämophilus. gallinarum Stamm 221.

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