DE2165401B2 - Inaktivierter Kombinationsimpfstoff zum Immunisieren von Geflügel gegen Infektion der Atmungsorgane - Google Patents
Inaktivierter Kombinationsimpfstoff zum Immunisieren von Geflügel gegen Infektion der AtmungsorganeInfo
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Description
15
Infektiöse Coryza, Infektiöse Bronchitis und Newcastle-Krankheit sind als Erkrankungen der Atmungsorgane bei Geflügel von Bedeutung. Die Infektiöse Coryza
wird von Haemophilus gallinarum verursacht; die Infektiöse Bronchitis und die Newcastle-Krankheit sind
durch Viren verursachte Krankheiten. Das Geflügel wird durch solche Seuchen schwer geschädigt Solche
Seuchen brechen häufig bei Hühnern, Truthühnern, Perlhühnern, Enten, Gänsen, Tauben, Fasanen und
Rebhühnern aus.
Die Infektiöse Bronchitis bewirkt bei jungem Geflügel eine hohe Sterblichkeit; bei ausgewachsenem
Geflügel sind hingegen die Wirkungen dieser Krankheit weniger ernst Die Infektiöse Coryza bewirkt nur eine jo
geringe Sterblichkeit; ihre Hauptwirkungen bestehen in
der Wachstumshemmung und im plötzlichen Rückgang der Produktion von Eiern, wodurch schwere wirtschaftliche Schaden entstehen. Die Newcastle-Krankheit ist
die schwerste der vorgenannten Krankheiten; die durch J5
diese Krankheit bewirkte hohe Sterblichkeitsrate ist unabhängig vom Alter des infizierten Geflügels.
Bisher wurden zur Bekämpfung der Newcastle-Krankheit und der Infektiösen Bronchitis sowohl
inaktivierte Impfstoffe als auch Lebendimpfstoffe verwendet. Diese Impfstoffe lagen jedoch als Einzelimpfstoffe und nicht als Kombinationsimpfstoffe vor.
Ferner hat der im Handel erhältliche inaktivierte Impfstoff zur Bekämpfung der Infektiösen Bronchitis
nur eine geringe Wirkung. Lebendimpfstoffe ergeben zwar eine relativ langanhaltende Immunität, aber ihre
Anwendung ist im allgemeinen nicht ungefährlich. Normales, gesundes Geflügel wird häufig durch
Impfung mit Lebendimpfstoffen getötet, wobei diese Gefahr besonders groß bei Geflügel mit einem Alter
unter 3 Wochen ist Ferner werden die Krankheiten durch Verwendung von Lebendimpfstoffen manchmal
von dem geimpften Geflügel auf anfälliges oder nicht-immunes Geflügel übertragen. Aus diesen Gründen werden inaktivierte Impfstoffe bevorzugt. >5
Bekanntlich treten Infektionen der Atmungsorgane bei Geflügel gewöhnlich in Form eines sogenannten
»respiratorischen Krankheitskomplexes« auf, der durch mehrere Erreger, wie Haemophilus gallinarum, Newcastlevirus und Infektiöse Bronchitis-Virus, hervorgeru- w>
fen wird. Der bei der Geflügelzüchtung auftretende
wirtschaftliche Verlust, der durch Mehrfachinfektion hervorgerufen wird, ist viel größer als der auf einer
Einzelinfektion beruhende Verlust. Ferner ist zur Behandlung einer großen Zahl von Geflügel bei h>
wiederholter Anwendung zweier oder mehrerer Einzelimpfstoffe eine beträchtliche lange Zeit erforderlich,
wodurch die Impfung sehr kostspielig wird. Aus diesen
Gründen ist die Verwendung eines Kombinationsimpfstoffes in der Geflügelzüchtung sehr wünschenswert
bisher wurden jedoch auf diesem Anwendungsgebiet keine inaktivierten Kombinationsimpfstoffe eingesetzt
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen inaktivierten Kombinationsimpfstoff zum Immunisieren
von Geflügel gegen Infektion der Atmungsorgane zur Verfugung zu stellen, mit denen die vorgenannten
Krankheiten wirksam bekämpft werden können. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst
Gegenstand der Erfindung ist somit ein inaktivierter Kombinationsimpfstoff zum Immunisieren von Geflügel
gegen Infektion der Atmungsorgane, der gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an inaktiviertem, in einem
natürlichen Nährmedium gezüchteten Haemophilus gallinarum Stamm 221, inaktiviertem Newcastlevirus
Sato Stamm und inaktiviertem Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm.
Entgegen der naheliegenden Annahme, daß sich die Kombination mehrerer Impfstoffe nachteilig auf das
Geflügel auswirken könnte, wurde erfindungsgemäß überraschenderweise festgestellt, daß der inaktivierte
Kombinationsimpfstoff der Erfindung eine sichere Anwendung erlaubt und keine nachteiligen Wirkungen
hervorruft Es ist bekannt, daß die einzelnen Komponenten eines Gemisches verschiedener Impfstoffe leicht
ihre Aktivität durch Wechselwirkung oder gegenseitige Hemmung verlieren; vergl. Michael A. Bratt and
Harry Rubin, Virology Bd. 33 (1967), S. 598 bis 608.
Erfindungsgemäß wurde jedoch festgestellt, daß bei dem inaktivierten Kombinationsimpfstoff der Erfindung
keine solchen Unverträglichkeiten auftreten.
Die bisher bekannten inaktivierten Impfstoffe zur Bekämpfung der Infektiösen Coryza wurden durch
Züchten von Haemophilus gallinarum Stamm 221 in halbsynthetischen Nährmedien hergestellt Wegen ihrer
zu niedrigen immunologischen Wirkungen sind diese Impfstoffe in der Praxis ungeeignet (Clark and
Godfrey, Avian Dis, Bd. 5 (1961), S. 37 und Page et
al_ Avian Dis, Bd. 7 (1963), S. 239). Erfindungsgemäß
wurde jedoch überraschend festgestellt, daß ein inaktivierter Impfstoff, der durch Züchten des vorgenannten Mikroorganismus in natürlichen Nährmedien
anstelle von synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedien erhalten wird, eine beträchtlich höhere
immunologische Wirkung zeigt, als die bekannten Impfstoffe. Ferner wurde erfindungsgemäß festgestellt,
daß der aus Infektiöse Bronchitis-Virus hergestellte Einzelimpfstoff, der besonders im Frühstadium nach der
Impfung nur eine geringe Aktivität zei^t, als Gemisch mit dem aus Newcastlevirus Sato Stamm hergestellten
inaktivierten Impfstoff und den aus Haemophilus gallinarum Stam.n 221 — gezüchtet in natürlichem
Nährmedium — hergestellten inaktivierten Impfstoff eine beträchtlich erhöhte immunologische Wirkung
gegen die Infektiöse Bronchitis aufweist. Die beiden zuletzt genannten Impfstoffe verstärken also synergistisch die immunologische Wirkung des Impfstoffes aus
inaktiviertem Infektiöse Bronchitis-Virus. Die vorstehenden Ausführungen zeigen somit deutlich die
beträchtlichen Vorteile des erfindungsgemäßen Kombinationsimpfstoffs.
Zur Herstellung eines inaktivierten Impfstoffes zur Bekämpfung der Infektiösen Coryza werden natürliche
Nährmedien verwendet, die im allgemeinen zur Züchtung von Bakterien der Gattung Haemophilus
eingesetzt werden. Wie vorstehend erwähnt, wurde festgestellt, daß ein durch Züchten von Haemophilus
gallinarum Stamm 221 in natürlichen Nährmedien
hergestellter Impfstoff eine höhere Aktivität hat als der bei Verwendung synthetischer oder halbsynthetischer
Nährmedien erhaltene Impfstoff. Ferner wurde festgestellt, daß der in einem natürlichen Nährmedium
gezüchtete Haemophilus gallinarum Stamm 221 eine andere Morphologie aufweist als der in einem
synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedium gezüchtete Stamm. Als natürliches Nährmedium kann
z. B. ein im wesentlichen aus 1000 ml Hühnerfleischbouillon, 5 g Natriumchlorid, 10 g Polypepton und 04%
Hühnerserum bestehendes Medium, dessen pH-Wert auf 7,0 bis 7,4 eingestellt wird, verwendet werden.
Obwohl das Nährmedium zahlreiche natürliche Nährstoffe enthalten kann, ist die Verwendung von
Rindfleischextrakt oder Kartoffeln anstelle von Hühnerfleischbouillon, Caseinhydrolysat oder Hefeextrakt
anstelle von Polypepton und Schafserum oder Diphosphopyridinnucleotiden anstelle von Hühnerserum bevorzugt Als natürliches Nährmedium können auch
bebrütete Hühnereier verwendet werden.
Haemophilus gaiiinarum Stamm 22 ί ist im National
Institute of Animal Health (NIAH), Ministerium für Landwirtschaft und Forsten, das in Verbindung mit der
Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms steht, hinterlegt
Ein natürliches Nährmedium wird mit Haemophilus
gallinarum Stamm 221 beimpft, und das beimpfte Nährmedium wird in einer Standkultur mit großem
Volumen bei üblichen Temperaturen, z. B. 30 bis 400C,
bebrütet Die Züchtung kann auch unter aeroben Bedingungen in Sulmerskultur durchgeführt werden.
Nach beendeter Züchtung wird die Kulturbrühe mit einem Inaktivierungsmittei zur Inaktivierung des
Mikroorganismus versetzt Als lnak-*:-vierungsmittel
können z. B. das Natriumsalz der Äthylmercurithiosalicylsäure, j?-Propiolacton, Tylosin, Salicylsäure, Kristallviolett, Benzoesäure, oberflächenaktive Mittel, wie
Benzethoniumchlorid, Polymyxin und Gramicidin eingesetzt werden. Nach der Zugabe einer geeigneten Menge
eines Adjuvans wird die Kulturbrühe in einer Durchlaufzentrifuge zentrifugiert. Als Adjuvans kann z. B.
Aluminiumhydroxidgel, Aluminiumphosphatgel,
Calciumphosphatgel oder ein Alaun eingesetzt werden. Der bei der Zentrifugation erhaltene Rückstand wird
zur Herstellung einer Suspension mit einer Zellkonzentration von 106 bis 10" Zellen/ml in einem sterilen
Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung suspendiert Die Suspension wird zur
Lagerung mit einem antiseptischen Mittel versetzt Als antiseptisches Mittel kann z. B. das Natriumsalz der
Äthylmercurithiosalicylsäure, Tylosin, /?-Propiolacton,
Benzoesäure, Formaldehyd, Salicylsäure, Kristallviolett, oberflächenaktive Mittel, wie Benzethoniumchlorid,
Polymyxin oder Gramicidin verwendet werden. Der so hergestellte inaktivierte Impfstoff gegen Infektiöse
Coryza wird nachstehend als Hg-Impfstoff bezeichnet.
Die Herstellung von inaktivierten Impfstoffen gegen Newcastle-Krankheit und Infektiöse Bronchitis kann
nach üblichen Methoden erfolgen, z. B. durch Vermeh- ho
ren der Viren im bebrüteten Hühnerei, Isolieren, Inaktivieren und Suspendieren des Virus in einer
Pufferlösung und anschließendes Versetzen der Suspension mit einem Adjuvans.
Das Newcastlevirus Sato Stamm ist ebenfalls im NIAH hinterlegt. Der hergestellte inaktivierte Impfstoff
gegen Newcastle-Krankheit wird nachstehend als ND-ImDfstoff bezeichnet.
Das Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm
ist ebenfalls im NIAH hinterlegt
Der hergestellte inaktivierte Impfstoff gegen Infektiöse Bronchitis wird nachstehend als IB-Impfstoff
bezeichnet
Zur Herstellung von Kombinationsimpfstoffen werden der Hg-Impfstoff, der ND-Impfstoff und der
IB-Impfstoff in solchen Mengen vermischt daß jeder Impfstoff im Endprodukt in einer wirksamen Konzentration enthalten ist Ein bevorzugter Kombinationsimpfstoff enthält 5 bis 30 Volumteile inaktivierte
Haemophilus gallinarum Stamm 221-Suspension in einer Konzentration von 33 χ 107 bis 33 χ 10* Zellen/ml,
5 bis 30 Volumteile einer Suspension des inaktivierten Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm in
einer Konzentration von 104 bis 107 EIDso/ml und 5 bis
30 Volumteile einer Suspension des inaktivierten Newcastlevirus Sato Stamm in einer Konzentration von
10« bis 109·5 EIDso/ml pro 100 Volumteile KomDinationsimpfstoff. Die vorgenannten Mengenverhältnisse
sind jedoch nicht erfindungswesentlich.
Obwohl der erfindungsgemäße Kombinationsimpfstoff in den meisten Fällen eine ausreichende immunologische Wirkung ohne einen Zusatz eines Adjuvans
aufweist, wird der Kombinationsimpfstoff vorzugsweise zur Verstärkung seiner Wirkung mit einem Adjuvans
versetzt Ein bevorzugter Anteil des Adjuvans beträgt 1 bis 50 Volumtefle pro lOO Volumteile Kombinationsimpfstoff; dieses Mengenverhältnis ist jedoch nicht
erfindungswesentlich. Als Adjuvans kann Aluminiumhydroxidgel, Aluminiumphosphatgel, Calciumphosphatgel
oder ein Alaun verwendet werden. Dem Kombinationsimpfstoff kann, falls notwendig, ein antiseptisches
Mittel, wie das Natriumsalz der Äthylmercurithiosalicylsäure, /J-Propiolacton, Tylosin, Salicylsäure, Kristallviolett Benzoesäure, oberflächenaktive Mittel, wie Benzethoniumchlorid, Polymyxin oder Gramicidin zugesetzt
werden. Der Kombinationsimpfstoff kann dem Geflügel intramuskulär, subcutan oder intracutan injiziert werden.
Der erfindungsgemäße Kombinationsimpfstoff hat eine ausgezeichnete immunologische Wirkung. Durch
eine einzige Anwendung kann eine Immunisierung gegen sämtliche vorgenannten drei Krankheiten d.h.
gegen Infektiöse Coryza, Infektiöse Bronchitis und Newcastle-Krankheit bewirkt werden. Ferner treten
bei Gefügel, das mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff behandelt wurde, keine merklichen Nebenwirkungen auf. Der erfindungsgemäße Kombinationsimpfstoff
eignet sich somit vorzüglich zur Immunisierung von Geflügel gegen Infektionen der Atmungsorgane.
A) Zur Herstellung des inaktivierten Hg-Impfstoffes
wird ein Medium mit der nachstehenden Zusammensetzung verwendet:
Hühnerfleischbouillon*) | 1000 ml |
Natriumchlorid | 5g |
Polypepton | 10g |
Hühnerserum | 0,5 Prozent |
pH 7,0 bis 7,4 |
*) I kg zerkleinertes Hühnerfleisch wird unter Rühren mit
2 Liter Wasser versetzt. Das Gemisch wird etwa 24 Stunden bei OC stehengelassen, dann 30 bis 60 Minuten mit
Wasserdampf behandelt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wird als Hühnerfleischbouillon eingesetzt.
Die Hühnerfleischbouillon wird zusammen mit Natriumchlorid und Polypepton in einem Autoklav 20
Minuten bei 121°C sterilisiert Das Hühnerserum wird getrennt mittels eines Seitz-Filters sterilisiert Das
sterilisierte Hühnerserum wird zu dem sterilisierten Gemisch der übrigen Komponenten gegeben.
Das aus einer gefriergetrockneten Vorratskultur erhaltene Bakterium Haemophilus gallinarum Stamm
221 wird h den Dottersack eines 4 Tage bebrüteten Hühnereis in einer Konzentration von etwa 106
lebenden Zellen/ml eingeimpft Nach etwa 24stündiger Inkubation ist der Embryo abgestorben; der Eidotter
wird auf einem Blutagar-Nährboden ausgestrichen, und Haemophilus gallinarum Stamm 221 wird 24 Stunden in
einer 5 bis tO Prozent Kohlendioxid enthaltenden Atmosphäre bei 37° C gezüchtet. Die aus einer Kolonie
auf dem Blutagar-Nährboden erhaltenen Zellen werden in I Liter des in einem 2 Liter fassenden Kolben
befindlichen vorstehend hergestellten Mediums in einer Konzentration von 104 bis 105 lebende Zellen/ml
eingeimpft Die Züchtung wird in einer Standkultur bei
37° C so lange durchgeführt bis eine stationäre Phase
mit einer Zellkonzentration von 106 bis 108 Zellen/ml
erreicht ist Die Zellen werden dann durch Zugabe von 0,1 Prozent Natriumsalz der Äthylmercurithiosalicylsäure
inaktiviert und die Kulturbrühe wird etwa 24 Stunden bei 4° C stehengelassen. Dann wird die Kulturbrühe mit
etwa 1 Volumteil des nachstehend beschriebenen Aluminiumhydroxidgels pro 50 Volumteile Kulturbrühe
versetzt. Das Gemisch wird etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann bei 6000 bis
12 000UpM mit einer Ausflußgeschwindigkeit von 100 ml/Minute in der Durchlaufzentrifuge zentrifugiert
Der Zentrifugationsrückstand wird mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer
Kochsalzlösung (pH 7,2 bis 73) versetzt; es wird eine
Suspension hergestellt, die etwa die 33fache Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe aufweist. Diese
Suspension wird mit soviel Tylosin als antiseptischem Mittel \ ersetzt, daß dessen Endkonzentration 5 Prozent
ausmacht.
Herstellung von I5prozentigem Hg-Impfstoff:
15 Volumteiie der vorstehend hergestellten Suspension
werden mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung ^pH 7,2 bis
7,5) und Aluminiumhydroxidgel in solchen Mengen vermischt, daß 100 Volumteile Hg-Impfstoff erhalten
werden, der 50 Volumteile Aluminiumhydroxidgel enthält.
Herstellung des Aluminiumhydroxidgels:
Ein geringer Überschuß einer Iprozentigen wäßrigen Lösung von Ammoniumaluminiumsulfat wird mit
Iprozentiger wäßriger Ammoniaklösung umgesetzt. Der Überstand wird dekantiert. Der Niederschlag wird
so lange mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser keine Ammoniumionen mehr enthält. Der Niederschlag
wird 30 Minuten bei 12O0C in einem Autoklav sterilisiert. Das so erhaltene Aluminiumhydroxidgel
wird als Adjuvans verwendet.
B) Etwa 105 Zellen von Newcastlevirus Sato Stamm
werden in die A"antoishöhle eines 9 bis 11 Tage bcbrütctcn Hühnereis eingeimpft und 26 bis 36 Stunden
in einem Inkubator bei 370C vermehrt. Die Allantoisflüssigkeit
wird dann aus dem Ei entnommen and mit J3-Propiolacton als Inaktivierungsmittel bis zu einer
Endkonzentration von 0,05% versetzt. Dieses Gemisch wird dann 30 bis 60 Minuiten bei 4°C stehengelassen und
anschließend etwa 30 Minuten bei 3000 UpM zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert.
Herstellung von 15prozentigem ND-Impfstoff:
15 Volumteiie des bei der Zentrifugation erhaltenen Überstands, der 106·5 bis 109·5 EID50ZmI Newcastlevirus
Sato Stamm enthält werden mit 50 Volumteilen von gemäß Beispiel 1 hergestelltem Aluminiumhydroxidgel
versetzt Das Gemisch wird dann mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer
Kochsalzlösung (pH 7,2 bis 7,5) auf 100 Volumteile verdünnt
C. Ein inaktivierter IB-Impfs* :.ff wird gemäß dem in
B) beschriebenen Verfahren hergestellt, mit der Ausnahme, daß Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette
42 Stamm anstelle von Newcastlevirus Sato Stamm eingesetzt wird.
Herstellung von 15prozentigem IB-Impfstoff:
15 Volumteile des erhaltenen Überstands, der 104 bis
107 EIDso/ml Beaudette 42 Stamm enthält, werden mit
50 Volumteilen von gemäß Beispiel 1 hergestelltem Aluminiumhydroxidgel versetzt Das Gemisch wird
dann mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,2 bis 7,5) auf
100 Volumteile verdünnt
B e ii s ρ i e I 1
Herstellung eines inaktivierten Kombinationsimpfstoffes, der 15% ND-Impfstoff, 15% IB-Impfstoff und 15%
Hg-Impfstoff enthält:
« Ein Gemisch von 15 Volumteilen Überstand, der 106·5
bis 109·5 EID50/1T1I Newcastlevirus Sato Stamm gemäß B
enthält 15 Volumteilen Überstand, der 104 bis 107
EID50/1T1I Beaudette 42 Stamm gemäß Beispiel 3 enthält
und 15 Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension von Haemophilus gallinarum Stamm 221 gemäß A
wird mit Aluminiumhydroxidgel gemäß A und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer
Kochsalzlösung (pH 7,2 bis 7,5) versetzt. Rs werden 100 Volumteile Kombinationsimpfstoff herge-
stellt, der 50 Vnlumteile Aluminiumhyd-oxidgei enthält.
Herstellung eines inaktivierten Kombinationsimpfstoffes, der 15% ND-Impfsl;off, 15% I3-!mpfstoff und 15%
Hg-Impfstoff enthält:
<>5 Ein Gemisch »on 15 Volumteilen Überstand, der 106·5
bis ΙΟ*1·5 EID50/ml Newcnstlevirus Sato Stamm gemäß B
enthält, 15 Volumteilen Überstand, der 104 bis 107
EIDso/ml Beaudette 42 Stamm gemäß C enthält, und 15
Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension von
Haemophilus gallinarum Stamm 221, die gemäß A hergestellt wurde, mit der Ausnahme, daß anstelle von
Aluminiumhydroxidgel das nachstehend beschriebene Calciumphosphatgel eingesetzt wird, wird mit Calciumphosphatgel
und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,2 bis
7,5) versetzt. Es werden 100 Volumteile Kombinationsimpfstoff hergestellt, der 50 Voliimteile Calciumphosphatgel
enthält.
Herstellung des Calciumphosphatgels:
10 Liter einer 0,1 m wäßrigen Calciumchloridlösung werden mit 10 Liter einer 0,1 m wäßrigen Natriumhydrogenphosphatlösung
versetzt. Nach dem Dekantieren des Überstands wird der Niederschlag so lange mit
Wasser gewaschen, bis im Waschwasser keine Ammoniumionen mehr enthalten sind. Der Niederschlag wird
30 Minuten bei 120cC in einem Autoklav sterilisiert. Das
sterilisierte Produkt wird als Calciumphosphatgel eingesetzt.
Herstellung eines inaktivierten Kombinationsimpfstoffes,
der 15% ND-Impfstoff, 15% IB-Impfstoff und 15%
Hg-Impfstoff enthält:
Ein Gemisch von 15 Volumteilen Überstand, der 106·5
bis ΙΟ9·5 ElD5OAnI Newcastlevirus Sato Stamm gemäß B
enthält, 15 Volumteilen Überstand, der 104 bis 107
EIDw/ml Beaudette 42 Stamm gemäß C enthält, und 15
Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension von Haemophilus gallinarum Stamm 221, die gemäß A
hergestellt wurde, mit der Ausnahme, daß anstelle des
IO
Aluminiumhydroxidgels das nachstehend beschriebene Aluminiumphosphatgel eingesetzt wird, wird mit Aluminiumphosphatgel
und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung
(pH 7,2 bis 7,5) versetzt. Es werden 100 Volumteile Kombinationsimpfstoff hergestellt, der 50 Volumteile
Aluminiumphosphatgel enthält.
Herstellung des Aluminiumphosphatgels:
Eine Iprozentige wäßrige Natriumhydrogenphosphatlösung
wird bei Raumtemperatur unter Rühren mit einer lprozentigen wäßrigen Aluminiumchloridlösung
versetzt. Nach Dekantieren des Überstands wird der Rückstand so lange mit Wasser gewaschen, bis im
Waschwasser keine Chloridionen mehr enthalten sind. Der Niederschlag wird 30 Minuten bei 1200C in einem
Autoklav sterilisiert. Das sterilisierte Produkt wird als Aluminiumphosphatgel eingesetzt.
Vergleichsversuch 1
Männlichen, 4 Wochen alten Forsgate-Küken werden intramuskulär 0,5 ml des gemäß Beispiel A, B, C und
.') Beispiel 1 hergestellten Einfach- oder Kombinationsimpfstoffes injiziert. Die Gruppen der immunisierten
und der nicht immunisierten Küken werden 2 Wochen später durch Eintropfen von Haemophilus gallinarum
Stamm 2* T in die Nasenhöhle belastungsinfiziert. Die
jo Symptome der Infektiösen Coryza (Nasenabscheidung,
Schwellungen in der Gesichtsgegend und Niesen) werden während der 7 auf die Infektion folgenden Tage
täglich registriert. Die Zunahme des Körpergewichts wird 6 Tage lang bestimmt. Die Ergebnisse sind in
r, Tabelle I zusammengestellt.
Gruppe
Impfstoff
Anzahl | Symptome | Infektiöser | Coryza | nach der | Belastungs- | Zunahme des |
der | infektion, % | Körper | ||||
Küken | Tage 1 2 |
3 | 4 | 5 | 6 7 | gewichts. g/Küken |
Belastungs | — |
infektion | |
Desgl. | |
Desgl. | 15% Hg |
Desgl. | 15% ND |
Desgl. | 15% IB |
Desgl. | 15% Hg |
Desgl. | 15% ND |
Micht infiziert | 15% IB |
(Kontrolle) |
100
100
100
100
100 100
31.6
5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 67,0 |
5 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4,0 |
5 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 33.0 |
0 0
Die mit 15prozentigem Hg-Impfstoff oder mit dem Kombinationsimpfstoff, der 15% Hg-Impfstoff, 15%
ND-Impfstoff und 15% IB-Impfstoff enthält, immunisierten Küken zeigen keine Symptome der Infektiösen
Coryza. Die nicht-immunisierten und die mit 15prozen-
0 123,0
0 90,0
tigern ND-Impfstoff oder mit 15prozentigem IB-Impfstoff
immunisierten Küken zeigen Symptome der Infektiösen Coryza und eine verminderte Zunahme des
Körpergewichts.
Vergleichsversuch 2
Männlichen. 4 Wochen alten Forsgate-Kütcn werden
intramuskulär 0,5 ml des gemäß Beispiel 3 hergestellten Kombinationsimpfstoffs injiziert. Die Wirksamkeit des
Kombinationsimnfstoffs wird gemäß den nachstehend beschriebenen Methoden bestimmt:
1) BelastuHgsinfektionstest
Immunisierte bzw. nicht-immunisierte Küken werden durch Eintropfen von Haemophilus gallinarum Stamm
221 in einer Konzentration von 5 χ ΙΟ7 Zellen/ml in die
Nasenhöhle oder durch intramuskuläre Injektion von Newcastlevirus Sato Stamm in der lOOOfachen Konzentration
der minimalen Letaldosis belastet. Die Symptome der Infektiösen Coryza (Nasenabscheidung und
Schwellungen in der Gesichtsgegend) werden während 10 Tagen täglich registriert. Es wird die Anzahl der
Küken bestimmt, die 10 Tage nach der Belastungsinfektion überleben.
2) Hemmung der Hämagglutination (Hl)
2 Wochen nach der Impfung hergestelltes Kükenserum wird reihenmäBig verdünnt. 0,2 ml eines Antigens.
das 4 πΑ-Eiiiheiieii NewLäsiieviiuS isnii SiaiiiMi (NDV;
enthält, werden mit 0,2 ml des verdünnten Serums versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur
stehengelassen und dann mit 0,4 ml einer 0,5 % rote Blutkörperchen von Küken enthaltenden Suspension
versetzt. Es wird die höchste Verdünnungsstufe (Endtiter) des Serums bestimmt, bei dem die Hämagglutination
vollständig gehemmt wird. Dieser Endtiter stellt den HI-Titer gegen NDV dar; vgl. Kawashima u.
Mitarb., Report of Gov. Exp. Sta. Anim, Hyg., Bd., 29 (195S)1S. 19.
3) Virusneutralisation
2 Wochen nach der Impfung werden den Küken 0,2 ml Serum entnommen. Dieses Serum wird mit 0,2 ml
geeignet verdünntem Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm (IBV) geschüttelt. Das Gemisch wird
15 Stunden bei 0 bis 4°C inkubiert. Anschließend werden 0,1 ml dieses Gemisches in die Allantoishöhle
eines 11 Tage bebrüteten Hühnereis eingeimpft. Nach Iwöchiger Inkubation werden die beimpften Eier auf
eine aufgetretene Infektion untersucht. Der 50%-Endpunkt der Mortalität der Embryonen wird in jeder
Versuchsserie nach Behrens-Kärber (Arch. Exp. Path. Pharm., Bd. 162 (1931), S. 480) bestimmt. Die Differenz
zwischen den Mortalitätsendpunkten der Virustitration und der Titration des Serum-Virus-Gemisches stellt die
Neuiraiisaiiouskapaziiäi des Serums dar. Wenn z. B. die
Mortalitätsenopunkte der Virustitration bzw. der Titration des Serum-Virus-Gemisches in lO^facher bzw.
Wfacher Verdünnung erreicht werden, beträgt der Neutralisationstiter des Serums 2,00 Neutralisationsdosen
in 0,05ml Serum (Biester und Schwarte,
Diseases of Poultry, 5. Auflage (1965), The Iowa State University Press, Ames, Iowa, V. St. Α., S. 605 bis 619).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengestellt.
sraisifc&^^
Gruppe Anzahl Symptome Infektiöser Coryza nach Infektionen mit Haemophilus gallinarum
der Tage
12 3 4 5 6 7!
Küken
Zunahme HI-Titer Belastungs- Neutralisa-
des Körper- gegen NDV infektionstest tionstiter gewichts mit Newcastle- gegen IBV
über virus
10 Tage, g
Kontrolle 1
2
3
4
2
3
4
Mittelwert
Geimpfte 6
Tiere
Tiere
10
Mittelwert
F S
F S F S F S F S
F S F S F S
F S
F S
Symptome Infektiöser Coryza: F - Schwellungen in der Gesichtsgegend.
S = Nasenabscheidung.
Die Stärke der Symptome wird grob durch die Anzahl der + Zeichen wiedergegeben:
- : Keine Symptome.
++ : Mäßig starke Symptome. +++ : Sehr starke Symptome. ♦D : Eingegangen S: Überlebend.
++ : Mäßig starke Symptome. +++ : Sehr starke Symptome. ♦D : Eingegangen S: Überlebend.
** : Überlebende Küken/Anzahl der Versuchsküken.
115,0 | <5 | D |
90,0 | <5 | D |
85,0 | <5 | D |
35,0 | <5 | D |
65,0 | <5 | D |
78,0 | <5 | 0/5** |
80,0 | 40 | S |
145,0 | 80 | S |
120,0 | 10 | S |
115,0 | 40 | S |
140,0 | 40 | S |
120,0 | 38 | 5/5** |
-0,10
2,20
Aus Tabelle II ist ersichtlich, d&ß die mit dem aus 15%
Hg-Impfstoff, 15% ND-Impfsioff und 15% IB-lmpfstoff
bestehenden Kombinationsimpfstoff immunisierten Kü-
ken gegen Infektiöse Coryza, Newcastle-Krankheit und Infektiöse Bronchitis geschützt sind.
Vergleichsversuch 3
Die Wirkungen der Einfach- und Kombinationsimpfstoffe gegen Infektiöse Bronchitis und Newcastle-Krankheit
werden gemäß den im Vergleichsversuch 2
beschriebenen Methodem untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.
Tabelle III | Küken-Nr. | Körper gewicht, g |
Ill-Titer gi:gen NDV |
ßelastungs- iniektionstest mit Newcastle- |
Neutralisations- liter gegen IBV |
Impfstoff | virus | ||||
1 | 234 | <5 | |||
2 | 172 | <5 | |||
3 4 |
219 220 |
<5 <5 |
0/6 | -0,80 | |
Kontrolle | 5 | 190 | <5 | ||
6 | 204 | <5 | |||
7 | !78 | <5 | |||
8 | 160 | <5 | |||
9 | 166 | <5 | 0/5 | 0,20 | |
15% Hg | 10 | 192 | <5 | ||
11 | 160 | <5 | |||
12 | 184 | 10 | |||
13 | 182 | <5 | |||
14 | 186 | 10 | 5/5 | 0,00 | |
15% ND | 15 | 202 | 20 | ||
16 | 218 | 5 | |||
17 | 188 | <5 | |||
18 | 194 | <5 | |||
19 | 172 | <5 | 0/5 | 0,00 | |
15% IB | 20 | 178 | <5 | ||
21 | 200 | <5 | |||
37 | 178 | 40 | |||
15% Hg | 38 | 216 | 10 | ||
+ | 39 | 188 | 5 | 5/5 | 2,50 |
15% IB | 40 | 194 | <5 | ||
+ | 41 | 132 | i0 | ||
15% ND | |||||
*) Überlebende Küken/Anzahl der Versuchsküken.
Die verwendeten Impfstoffe werden gemäß A, B, C und Beispiel 1 hergestellt.
Vergleichsversuch 4
Es ist ersichtlich, daß Küken, die durch Injizieren eines 15prozentigen IB-lmpfstoffes immunisiert wurden,
zwei Wochen nach der Impfung kaum Antikörper gegen Infektiöse Bronchitis-Virus bilden; hingegen
bilden Küken, die mit dem 15% IB-Impfstoff, 15% w Die Wirkungen der Einfach- und Kombinationsimpf-ND-!mpfstüff
und 15% Hg-Impfstoff enthaltenden stoffe gegen Haemophüus gäUinarum werden gemäß
Kombinationsimpfstoff immunisiert wurden, in vollem den vorstehend beschriebenen Methoden untersucht.
Maß Antikörper gegen Infektiöse Bronchitis-Virus. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.
Impfstoff |
HI-Titer gegen NDV Nf utraljsationstiter
gegen IBV Wochen nach der Impfung 2 3 2 3 |
20,0 | 2,5 | 2,0 |
HI-Titer gegen
Haemophilus gallinarum 2 3 |
320 |
i5% Hg + 15% ND + 15% IB | 8,7 | 20,0 | 0,2 | 0,0 | 16U | 80 |
15% Hg+15% ND | 11,1 | <5 | 0,0 | 0,0 | 80 | 160 |
15% Hg + 15% IB | <5 | 22,3 | 2,2 | 3,0 | 80 | <5 |
15% ND + 15% IB | 11,3 | <5 | 0,3 | 0,3 | <5 | 80 |
15% Hg | <5 | 11,0 | 0,0 | 0,0 | 40 | <5 |
15% ND | 7,5 | <5 | 0,0 | 1,5 | <5 | <5 |
15% IB | <5 | <5 | 0,0 | 0,0 | <5 | <5 |
Kontrolle | <5 | <5 |
Die angegebenen Werte stellen jeweils Mittelwerte aus 5 Küken dar und wurden nach den vorstehend
beschriebenen Verfahren bestimmt
Aus Tabeiie IV ist ersichilich, daß die Wirkung von inaktiviertem Hg-lmpfstoff durch den Zusatz voi
inaktiviertem ND-Impfstoff und inaktiviertem lB-!mpf stoff synergistisch verstärkt wird.
Die Aktivitäten von inaktivierten Coryzaimpfstoffen, die durch Züchtung von Haemophilus gallinarum
Stamm 221 in einem natürlichen bzw. einem halbsynteti-
schen Nährmedium erhalten wurden, werden unter sucht Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammenge
stellt.
Vergleich zwischen inaktivierten Coryzaimpfstoffen, die durch Züchtung von Haemophilus gallinarum
in einem natürlichen bzw. halbsynthetischen
Nährmedium hergestellt wurden.
Konzentration HI-Titer gegen Haemophilus gallinarum | Züchtung in halb |
an ina ivier- Züchtung in |
synthetischem
Medium**) |
em aem°- natürlichem
philusgalh- Medium,, |
|
narum im | mpfung |
ImpfstofT, Wochen nach der I | 2 3 |
Zellen/ml 2 3 | 6,6 35,0 |
'Λ Χ 10* 19,6 80,0 | 5,0 30,0 |
'/(XlO8 18,7 52,5 | 3,3 11,0 |
Vs x 108 10,0 52,5 | |
*) Natürliches Medium | 1000 ml |
Hühnerfleischbouillon | 5g |
Natriumchlorid | lOg |
Polypepton | 0,5% |
Hühnerserum | |
(pH-Wert 7,0-7,4) | |
**) Halbsynthetisches Medium | 0,5% |
Polypepton | 0,1% |
Casaminsäure | 0,5% |
Natriumglutamat | 0,1% |
Glucose | 0,5% |
Natriumchlorid | 0,2% |
Dikaliumhydrogenphosphal | 1,0% |
Hefeexlrakt | 0,5% |
Hühnerserum | |
(pH-Wert 7,0-7,4) |
30 Vülumleile Aluminiumhydroxidgel sind in
Voiumteilen des Impfstoffes enthalten.
Die Wirkungen der Impfstoffe werden gemäß Vergleichsversuch 2 festgestellt. Die Bestimmung des
HI-Titers gegen Haemophilus gallinarum wird ebenfall.'
100 (,-, gemäß Vergleichsversuch 2 durchgeführt, mit der
Ausnahme, daß anstelle des Ishii-Stammes des Newcast·
levirus der Stamm Haemophilus gallinarum 221 verwendet wird.
909 511/10
Claims (1)
- Patentanspruch:Inaktivierter Kombinationsimpfstoff zum Immunisieren von Geflügel gegen Infektion der Atmungs- organe, gekennzeichnet durch einen Gehalt an inaktiviertem, in einem natürlichen Nährmedium gezüchteten Haemophilus gallinarum Stamm 221, inaktiviertem Newcastlevirus Sato Stamm und inaktiviertem Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm.
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8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |