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Verfahren zum Trennen von lebendem Virus von virusfremden Eiweißstoffen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Trennen von lebendem Virus von
virusfremden Eiweißstoffen aus einer kalten wäßrigen Suspension von Virus-Protein,
z. B. Allanto-in enthaltenden Flüssigkeiten mit bekannten wasserlöslichen organischen
Eiweißfällungsmitteln in bestimmtem p$ Bereich und gegebenenfalls unter Zentrifugieren.
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Zahlreiche Forscher haben gezeigt, daß die Verabfolgung von aktivem
und inaktivem Virus eine Zunahme des Gehaltes an spezifischen Schutzkörpern gegen
Krankheiten im Körper hervorruft und daß der durchschnittliche Gehalt an Schutzkörpern
deutlich, wenn auch nicht direkt proportional, zur Menge des angewandten Virus in
Beziehung steht. Die handelsmäßige Herstellung derartiger Impfstoffe hängt von der
Fähigkeit ab, mit Erfolg große Mengen des Virus in einer Form herzustellen, die
von fremden Proteinen genügend frei ist, daß sie Menschen injiziert werden kann,
ohne schädliche Reaktion hervorzurufen.
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Viren sind dadurch charakterisiert, daß sie in lebendem Gewebe vermehrt
werden müssen. Am häufigsten erfolgt die Vermehrung in bebrüteten und befruchteten
Eiern, von denen der Virus aus der allantoischen Eihaut, aus dem flüssigen Inhalt,
der Dotterhaut oder dem Embryo selbst, je nach dem besonderen Fall, extrahiert wird.
Da manche Individuen gegen Eiprotein empfindlich sind und andere nach der Injektion
von Lymphen, die Eiprotein enthalten, empfindlich werden, ist es erforderlich, Methoden
zu finden, durch die das
empfindlich machende Protein vom Virus
abgetrennt wird, ohne ernstlichen Verlust an Virus oder Abschwächung seiner antigenen
Eigenschaften. Viren sind auch in Tieren vermehrt worden; Gehirn, Milz, Leber und
andere Organe oder das Blut selbst, wurden entnommen und Lymphen daraus hergestellt.
Auch in solchen Fällen ist es wünschenswert, virusfremden Eiweißstoff zu beseitigen,
um die Sensibilisierung von Personen zu vermeiden, die die Lymphe erhalten.
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Verschiedene Methoden wurden erfunden, Viren zu konzentrieren und
fremde Proteine zu entfernen, um ein zuverlässigeres und wirksameres Präparat zu
erlangen, das als immunisierender Impfstoff verwendet werden kann. Eine solche Methode
umfaßt wiederholtes Gefrieren und Auftauen der infizierten, allantoischen Flüssigkeit,
aus der dann die Hauptmasse des aktiven Virus ausfällt. Der Virus ist auch an verschiedene
Adsobentien adsorbiert worden, wie rote Blutkörperchen, Calciumphosphat, Aluminium-Zink-
und Magnesiumhydroxyde usw. Der ausgefällte Virus wird dann herausgelöst oder in
anderer Weise vom Adsorptionsmittel zurückgewonnen.
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Eine der erfolgreichsten Methoden führte den Gebrauch von Zentrifugen
hoher Geschwindigkeit ein, von denen behauptet wird, daß durch sie die infizierte,
allantoische Flüssigkeit, die einen Proteingehalt von weniger als 10% Virus und
über 90% eines Proteins mit niedrigem Molekulargewicht aufweist, zu einem Produkt
gereinigt werden kann, in dem das virusfremde Protein weniger als etwa 5% vom Ganzen
ausmacht.
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Obwohl einige dieser Methoden handelsmäßig zur Reinigung der Virus-Impfstoffe
verwendet wurden, besitzen sie doch zahlreiche Nachteile. Der schwerwiegendste besteht
in der Schwierigkeit, Produkte herzustellen, die vollständig frei von virusfremden
Protein sind. Ein anderer bedenklicher Nachteil besteht in der Tatsache, daß die
wiedergewonnene Menge des Virus verhältnismäßig gering ist. Die Zentrifugiermethode,
obwohl wahrscheinlich die am leichtesten zugängliche, besitzt zusätzliche Nachteile,
die auf der hohen Geschwindigkeit und der geringen Leistung der Maschinen beruhen,
und in den mechanischen Brüchen, denen diese ausgesetzt sind, und in der verhältnismäßig
geringen Ausbeute an Impfstoff bestehen.
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Bei einer anderen bekannten Methode läßt sich der Tabakmosaikvirus
mit Alkohol oder Aceton in der Kälte fällen. Es wurde dabei der Alkohol in hoher
Konzentration, 66 bis 75 % verwendet; trotzdem war es nicht möglich, die virusfremden
Eiweißstoffe vom lebenden Virus zu trennen.
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Das erstrebte Ziel, nämlich die Trennung der virusfremden Eiweißstoffe
vom lebenden Virus, wird nun nach der Erfindung dadurch erzielt, daß zu der Virus
und Eiweißstoffe enthaltenden Flüssigkeit bei einem pH Wert von 5,0 bis 8,0, einer
Ionenkonzentration von 0,005 bis 0,5 und bei einer Temperatur unter etwa -f-5° 15
bis 40 V olumprozent eines wasserlöslichen organischen Eiweißfällungsmittels zugesetzt
werden, worauf der ausgefällte Virus abgetrennt, in wäßriger Suspension unter den
gleichen Bedingungen noch ein- oder mehrmals gefällt und hierbei gegebenenfalls
ein-oder mehrmals zentrifugiert wird. Dabei kann das mehrmalige Zentrifugieren zunächst
bei einer Drehzahl von etwa 3500/141in. und anschließend nochmals bei einer Drehzahl
von etwa 50000/1in. durchgeführt werden.
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Bei einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird eine Allantoin enthaltende
Flüssigkeit, die einen sich fortpflanzenden Virus zusammen mit virusfremden Eiweißstoffen
enthält, zur Gewinnung des Virus in reiner und lebensfähiger Form zum Gebrauch als
Impfstoff in der Weise behandelt, daß 15 bis 40 Volumprozent eines wasserlöslichen
organischen Eiweißfällungsmittels zu der erwähnten Flüssigkeit, die einen pH-Wert
zwischen 5,0 und 8,0 und eine Ionenkonzentration zwischen 0,005 und 0,5 aufweist,
bei Einhaltung einer Temperatur unter etwa 5° C, unter Einhaltung des Volumens des
Fällungsmittels, des pH-Wertes, der Ionenkonzentration und der Temperatur zur selektiven
Ausfällung des Virus in lebensfähiger Form zugegeben wird, worauf der ausgefällte
Virus von der überstehenden Flüssigkeit, welche die virusfremden Eiweißstoffe enthält,
abgetrennt wird. Eine besonders vorteilhafte Behandlung nach dem Verfahren ist darin
zu sehen, daß die erneute Suspension des Virus in einer wäßrigen Lösung bei einem
p$ Wert zwischen 5 und 8 und einer Ionenkonzentration zwischen 0,005 und 0,5 erfolgt
und der wäßrigen Suspension von 15 bis 40 Volumprozent eines wasserlöslichen, organischen
Eiweißfällungsmittels, bei Einhaltung einer Temperatur unter 5° C und Erhaltung
des Volumens des Fällungsmittels, des pH-Wertes, der Ionenkonzentration und der
Temperatur zur selektiven Ausfällung des Virus in lebensfähiger Form zugegeben wird,
worauf der ausgefällte Virus von der überstehenden Flüssigkeit, welche die virusfremden
Eiweißstoffe enthält, abgetrennt wird und diese Verfahrensmaßnahme beliebig wiederholt
werden kann.
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Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird der Virus entweder
beim beginnenden Verfahren oder irgendeinem der folgenden Verfahren durch erneute
Suspension in einem wäßrigen Medium erhalten, wobei die entstehende wäßrige Suspension
erst schwach zentrifugiert wird, um die unlöslichen virusfremden Eiweißstoffe von
der wäßrigen Suspension zu trennen, und dann einer weiteren Behandlung durch starkes
Zentrifugieren ausgesetzt wird, um den Virus hiervon zu trennen. Die Weiterbehandlung
des Virus kann nach den geschilderten Verfahren erfolgen.
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Um das Wesen der Erfindung klarer hervortreten zu lassen, werden einige
Verfahrensstufen beschrieben. In dieser Arbeit wurden der PR 8-, der Weiß- und der
Lee-Stamm des Influenza-Virus verwendet. Diese Viren wurden in befruchteten Eiern
vermehrt; die Eier wurden durch eine kleine Öffnung in der Schale über dem Luftsack
im allantoischen Sack von 11 Tage alten weißen Leghornhühnerembryos
geimpft.
Die infizierten Embryos wurden bei 33' C 42 bis 48 Stunden lang wieder bebrütet,
6 bis 8 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten und dann 6 bis 8 Stunden auf 4' C
gekühlt, worauf die allantoische Flüssigkeit aseptisch entnommen und als Ausgangsmaterial
verwendet wurde.
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Zu 100-ccm-Portionen von Weiß-allantoischer Flüssigkeit, die auf 1o
C gekühlt war, wurde 95%iger Äthylalkohol (gekühlt auf 40' C) tropfenweise zugefügt,
bis Konzentrationen von 15; 20, 25 und 30% bezüglich der einzelnen Portionen erhalten
wurden. Die Temperatur der allantoischen Flüssigkeit-Alkohol-Mischung wurde allmählich
in dem Maße erniedrigt, wie die Alkoholkonzentration erhöht würde, so daß eine Temperatur
der Mischung von -5o C während des letzten Stadiums der Alkoholzugabe erhalten wurde.
Die :Mischung wurde annähernd 3 Stunden lang =bei -5' C stehengelassen
und dann bei 3500 -Umdr./Min. 30 Minuten lang in einer Zentrifuge, die mit einem
Winkelkopfrotor ausgerüstet war, zentrifugiert. Dieses Zentrifugieren wurde bei
-5o C ausgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde weggetan. Der Virus-Niederschlag
wurde erneut in 10 ccm eines 0,lmolar72n Phosphatpuffers von PH 7,0 suspendiert
und bei Zimmertemperatur 1 Stunde stehengelassen. Die Suspension wurde ein zweites
Mal bei 2000 Umdr./Min. 15 Minuten lang in der gleichen Zentrifuge zentrifugiert,
nur daß das Zentrifugieren jetzt bei Zimmertemperatur stattfand.
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Die überstehende Flüssigkeit, die leicht von dem unlöslichen, fremden
Proteinsediment dekantiert werden konnte, wurde geprüft, um den Gehalt an anwesendem
Virus in CCA-Wirkungsgraden festzustellen. Die in Tabelle 1 angeführten Resultate
zeigen, daß eine Ausbeute von 92% Virus bei einer Endalkoholkonzentration von 25%
erzielt wurde, während Alkoholkonzentrationen von 20 und 30% Ausbeuten von 51 und
58% ergaben.
| Tabelle 1 |
| Volumprozent CCA Volumprozent |
| Äthylalkohol- Titer Ausbeute |
| konzentration |
| Weiß-allantoische Flüssigkeit, Ausgangsmaterial.. - 67 - |
| Weiß-allantoische Flüssigkeit, 2mal konzentriert . . 15 28
21 |
| desgl. ..................................... 20 69 51 |
| desgl. ..................................... 25 123 92 |
| desgl. ... .. . ................ . .............. 30
78 58 |
Durch gleiche Versuchsanordnungen wurde festgestellt, daß bei einer Äthylalkoholkonzentration
von 35% 85 bis 951/o vom Lee-Virus wiedergewonnen wurde Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse,
wenn Methanol zu Lee-allantoischer Flüssigkeit unter den gleichen Bedingungen wie
oben gegeben wurde.
| Tabelle 2 |
| Volumprozent CCA Volumprozent |
| Methanol- Titer Ausbeute |
| konzentration |
| Lee-allantoische Flüssigkeit, Ausgangsmaterial . . . - 141
- |
| Lee-allantoische Flüssigkeit, 10mal konzentriert . . 15 1020
72 |
| desgl. ..................................... 20 1350 96 |
| desgl. ..................................... 25 1410 100 |
| desgl. ......................,.............. 30 1380 90 |
Es ist zu ersehen, daß eine 100%ige Ausbeute an Virus bei Verwendung von 251/o Methanol
erhalten wurde und daß 98 und 96 % wiedergewonnen wurden, wenn Methanolkonzentrationen
von
30 und 20% Verwendung fanden. Weiterhin ist es ersichtlich, daß die günstigste
Konzentration nicht so kritisch ist wie bei Äthylalkohol und daß ausgezeichnete
Ausbeuten an Virus in einem breiten Konzentrationsbereich vom Methanol erzielt werden.
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In gleichartigen Versuchen mit Allantoin enthaltender Flüssigkeit,
die mit dem Weiß-Stamm infiziert war, wurde gefunden, daß eine annähernd 100%ige
Ausbeute bei 25%iger Methanolkonzentration erzielt werden konnte, wohingegen die
Ausfällung von mit PR 8-Stamm infizierter, allantoischer
Flüssigkeiten
zeigte, daß eine etwas geringere Menge an Methanol zu bevorzugen ist, da die günstigste
Wiedergewinnung dieses Stammes bei annähernd 21 % Methanol erzielt wurde.
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Die verschiedenen Konzentrate, die, wie oben beschrieben, aus der
allantoischen Flüssigkeit durch Alkoholfällung gewonnen waren, enthielten - wenn
auch erheblich hinsichtlich ihres Gehaltes an virusfremdem Protein reduziert - noch
mehr Kükenprotein, als erwünscht war. Obwohl dieses restliche Kükenprotein durch
wiederholte Fällungen mit Alkohol entfernt werden kann, wurde gefunden, daß es vorteilhafter
war, weitere Mengen in dieser Verfahrensstufe durch Zentrifugieren zu beseitigen.
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Zu 1500 ccm infizierter, allantoischer Flüssigkeit, die kein Konservierungsmittel
enthielt, wurden 500 ccm Methanol, absolut, wie oben beschrieben, zugefügt. Die
Mischung wurde 3 Stunden lang bei -5° C gehalten und dann 30 Minuten lang bei 3500
Umdr./Min. zentrifugiert; das Zentrifugieren fand in einem Kühlraum bei -5° C statt.
Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Der im Virus enthaltene Niederschlag
wurde erneut in 200 ccm eines 0,1molaren Phosphatpuffers von pg 7,0 suspendiert.
Nach 1stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wurde der unlösliche fremde Eiweißstoff
durch 15 Minuten langes Zentrifugieren bei 2000 Umdr./Min. bei Zimmertemperatur
entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde im Verhältnis zum Ausgangsmaterial
71/2fach konzentriert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann 30 Minuten lang bei
50 000 Umdr./Min. in einer Sharples Laboratoriumszentrifuge bewegt und dann 11 0,1molarer
Phosphatpuffer mit pH 7,0 durch die Zentrifuge in Portionen von 11 pro Stunde und
unter Aufrechterhaltung der Geschwindigkeit von 50 000 Umdr./Min. gegeben. Der Inhalt
der Zentrifuge wurde dann aufgeschüttelt, um den Virus wieder im Phosphatpuffer
zu verteilen und das Endvolumen auf 300 ccm mit dem genannten Puffer gebracht und
somit eine 5fache Konzentrierung im Verhältnis zur ursprünglichen allantoischen
Flüssigkeit erzielt.
| Tabelle 3 |
| CCA Gesamt N Ei he ten "/o |
| Titer in mg/ccm pro mg N Ausbeute |
| Lee-allantoische Flüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . .
. 102 0,80 127 - |
| Lee-allantoische Flüssigkeit, |
| Alkohol, 71/2mal konzentriert . .. .. .. .. .. . 735 0,236
3115 97 |
| Lee-allantoische Flüssigkeit, |
| Alkohol, zentrifugiert, 5mal konzentriert. . 485 0,033 14,700
95 |
In der folgenden Tabelle werden die Ergebnisse, die durch das gleiche Verfahren
mit dem Weiß-Stamm erzielt wurden, gezeigt.
| Tabelle 4 |
| CCA Gesamt N CCA % |
| Titer in mg/ccm Einheiten Ausbeute |
| pro mg N |
| Weiß-allantoische Flüssigkeit . .. .. .... .. .. . 177 0,96
184 - |
| Weiß-allantoische Flüssigkeit, |
| Alkohol, 71/2mal konzentriert . .. .. . . .. .. . 1324 0,336
3940 99 |
| Weiß-allantoische Flüssigkeit, |
| Alkohol, zentrifugiert, 5mal konzentriert. . 815 0,048 16,980
92 |
| Weiß-allantoische Flüssigkeit, |
| Alkohol, zentrifugiert und wieder gefällt |
| mit Alkohol, 5mal konzentriert . . . . . . . . . . . 622 0,027
24,520 76 |
Die relative Ansteckungsfähigkeit des mit Methanol gefällten Virus wurde festgestellt
und gefunden, daß diese selbst nach drei aufeinanderfolgenden Fällungen unverändert
geblieben war. Das Endprodukt besaß einen Infektionsendpunkt von 10-8,50, während
das Kontrollmaterial 10-875 titrierte. Aceton und andere bekannte wasserlösliche
organischeEiweiß fällungsmittel können an Stelle von Alkohol angewandt werden. Wiederholte
Fällungen können auch unter abweichenden Temperaturbedingungen, Alkoholkonzentrationen,
pH-Werten und Ionenkonzentrationen ausgeführt werden, wobei ein von virusfremdem
Eiweiß völlig freier
Impfstoff erhalten werden kann. Diese Ausfällungen
werden innerhalb eines p,1-Bereiches von 5,0 bis 8,0, einer Temperatur vom Gefrierpunkt
der Lösung bis etwa +S° C, einer Ionenkonzentration von 0,005 bis 0,5 und Alkoholkonzentration
von 15 bis etwa 40 Volumprozent durchgeführt. Da diese veränderlichen Faktoren in
irgendeinem Maße voneinander abhängen, sind die günstigsten Bedingungen für eine
maximale Reinigung durch einfache Versuche festzustellen. Unter gewöhnlichen Verhältnissen
erfordert die den Virus enthaltende allantoische Flüssigkeit Suspensionen, die aus
dem lebenden Gewebe hergestellt werden, keine Einstellung eines besonderen pH-Wertes
oder Ionenkonzentration, sofern sie sich innerhalb der erforderlichen Grenzwerte
bewegen. Wenn das rohe Viruspräparat viel Gewebezellen enthält, können diese in
irgendeiner Stufe des Verfahrens durch Zentrifugieren mit mäßiger Geschwindigkeit
oder durch andere geeignete Methoden entfernt werden.
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Obwohl, wie oben bemerkt, die Abtrennung von virusfremden Proteinen
durch wiederholte Fällung mit Alkohol erreicht werden kann, scheint die wirkungsvollste
Methode die kombinierte Verwendung von Alkoholfällung und Zentrifugieren zu sein.
Bei dieser Vereinigung beider Verfahrensstufen wird die Abtrennung von Proteinfraktionen
möglich, die sich sonst üblicherweise nicht durch Alkoholfällung oder Zentrifugieren
allein trennen lassen. Es scheint, daß einige der virusfremden Eiweißstoffe die
gleichen Sedimentierungseigenschaften besitzen wie die Virusproteine, so daß eine
vollständige Trennung durch Zentrifugieren schwierig oder unmöglich ist. Die Eigenschaften
der verschiedenen Arten von Eiweißstoffen in bezug auf die Alkoholfällung weichen
jedoch ausreichend voneinander ab. Um ihre Abtrennung auf diesem Wege zu ermöglichen,
wird dies durch Alkoholfällung und fraktionierte Methoden bewirkt.
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Offensichtlich ist das vorstehend beschriebene Verfahren für die Herstellung
sowohl immunisierender Impfstoffe als auch diagnostischer Antigene anwendbar. Die
genaueren Einzelheiten der Herstellung solcher Produkte sind in diesem wissenschaftlichen
Spezialgebiet gut bekannt.
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Das hier beschriebene Verfahren für den Influenza-Virus kann für die
Herstellung gereinigter Impfstoffe und Antigene anderer Viren und Rickettsiae angewendet
werden, wie z. B. östlicher und westlicher Rückenmarksentzündung, Gelbes Fieber,
St. Louis Gehirnentzündung, Colorado Fleckfieber, Tollwut, Papageienkrankheit, Rocky
Mountain Flecktyphus, epidemischer und muriner Typhus, Hungertyphus, Q-Fieber, Jap
B-Gehirnentzündung, spinale Kinderlähmung und Newcastle Virus.