DE1667929A1

DE1667929A1 - Vakzine

Info

Publication number: DE1667929A1
Application number: DE19681667929
Authority: DE
Inventors: Kostadin Apostolov
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1967-02-21
Filing date: 1968-02-21
Publication date: 1971-06-16
Also published as: US3632745A; CH540338A; FR1592089A; ES350690A1; GB1214135A; NL6802466A; IL29444A; BE711116A

Description

DR. EULE DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

8 MÜNCHEN 2. HI LBLESTRASSE

• Dr. EuIa Dr. Berg Dipi.-Ing. Stapf, 8 MOndien 2, Hilblestraße 20

Ihr Zeichen Unser Zeichen

Anwalts-Akte 17 027 Be/Be

Datum 21· Feb. 1968

The Wellcome Foundation Limited, London Ii.W. 1 /England

"Vakzine"

Dieae Erfindung betrifft die Heratellung von Influenza-Viren entnaltenden Vakzinen und im besonderen gereinigte und konzentrierte iJu3 pens ionen solcher Viren.

Ea ist bekannt, daß Viren der Influenzagruppe, wie Myxovirua influenzae-A, influenzae-B oder irifluenzae-C beispiels-A 315 -2-

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gAD

weise auf einer Kückenembryo-, Affennieren- oder Kalbsnieren-Gewebekultur oder geeigneterweise in embryonierten Hühnereiern gezüchtet werden können. Die Gewebekulturflüssigkeiten oder Allantoinflüssigkeit enthält nach dem Sammeln beträchtliche Mengen nicht-viralen Proteins, und ea wurden bedeutende lOrschungsanstrengungen vorgenommen, um Mittel zum Abtrennen des Virus von diesen anderen Materialien zu schaffen. Zusätzlich muß die Konzentration des Virus erreicht werden,
um ein ausreichend virales Antigen in einer geeigneten Vakzindosis zu erhalten.

Es wurden Verfahren unter Verwendung von beispielsweise Ultra zentrifugierung, Adsorption auf Bariumsulfat oder Ausfällung mit Ammoniumsulfat oder organischen lösungsmitteln vorgesehen oder verwendet, um den Virus in einer konzentrierten und vorzugsweise gereinigten Form, geeignet zur Verwendung
in einem Vakzin nach Inaktivierung, zu erhalten. Die ültrazentrifugierung erfordert jedoch eine sehr teure, spezialisierte Anlage und vorzugsweise die Verwendung von Dichtegradienten fur die zufriedenstellende Abtrennung und kann im
Maßstab nicht ohne beträchtliche, weitere Ausgaben erhöht
werden. Weder die Adsorption noch die Ausfällung ist ausreichend selektiv, weil große Mengen verschiedener Proteine,
zusammen mit dem Virus, der ebenso eine proteinhaltige Substanz ist, dazu neigen adsorbiert, eluiert oder ausgefällt
zu werden.

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_ 3 —

Es wurde nunmehr gefunden, daß Influenza-Viren der besonderen Gruppe vorteilhafterweise aus rohen, wäßrigen Suspensionen mittels Dialyse ausgefällt werden können. Unerwarteter-.vei3e verringert die Entfernung von etwas "kristalloiden Materialien" die Stabilität des Virus in einer selektiven Weise, wodurch der Virus befähigt wird erst ausgefällt und dabei von den nachfolgend ausgefällten anderen proteinartigen Verunreinigungen getrennt zu werden. In diesem Zusammenhang sind unter der Bezeichnung "kristalloide Materialien" Materialien in der rohen Virus-Suspension zu verstehen, die durch eine halb-durchlässige Membrane diffundieren können. Diese Materialien umfassen anorganische Salze und vermutlich organische Verunreinigungen von niederem Molekulargewicht. Offenbar beeinflussen die kristalloiden Materialien die Löslichkeit der Partikel mit größerem Molekulargewicht, wie der Viren, und ihre relative Menge kann durch die Leitfähigkeit der Lösung bezeichnet werden.

Die vorteilhafte und selektive Abtrennung und Reinigung des Virus v/erden daher durch die Entfernung solcher kristalloider Materialien bis zu dem Ausmaß, welches die Viruspartikel zur Ausfällung aus der Lösung befähigt, erreicht. Der Virus kann dann in einer Fraktion gesammelt werden, die ein Zehntel bis ein Fünfzehntel des Anfangsvolumena darstellt mit einem Verhältnis der Virusaktivität zu Protein, das durch einen Paktor von wenigstens 10 erhöht ist.

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Eine weitere Verbesserung kann durch Einstellen der Konzentration von zweiwertigen Kationen in der Dialysenflüssigkeit, wie Calcium, Magnesium, Barium oder Kobalt auf einen Wert innerhalb einem spezifischen Bereich erhalten werden. Es wurde gefunden, daß die Ausfällung der Viren vollständiger erfolgt, wenn diese Kationen nicht vollständig aus dem Medium, das die Viren enthält, entfernt werden.

Nach der vorliegenden Erfindung wird daher in einer Hinsicht ein Verfahren zum Konzentrieren und Reinigen der Viren der Influenza-Gruppe geschaffen, wobei dieses Verfahren das Dialysieren einer Suspension des Virus in einem ausreichenden Ausmaß umfaßt, welches den Virus befähigt eine Ausfällung zu bilden und Abtrennung der den Virus enthaltenden Fraktion von der überstehenden Lösung. In einer besonderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren, wie es vorausgehend erläutert wurde, das Einstellen der Konzentration zweiwertiger, metallischer Kationen in der Dialysenflüssigkeit auf einen Wert von 0,003 bis ungefähr 0,012M. Weiter wird das oben beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren in dem Verfahren zur Herstellung des Vakzins, das solche gereinigte Influenza-Viren enthält, verwendet.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann irgendein geeignetes Wuchsmedium verwendet werden, um die Anfangssuspension des Virus herzustellen, es werden jedoch die von embryonierten Hühnereiern erhaltenen AllantoinflUsaigkeiten

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bevorzugt. Die Flüssigkeit wird gewöhnlich durch Niedergeschwindigkeit-Zentrifugieren (1600 g) geklärt, um Partikelmaterial und Blut zellen vor der Dialyse zu entfernen.

Die Dialysenflüssigkeit ist gewöhnlich Wasser, auf einen geeigneten pH-Wert mit einem Puffer eingestellt, der vorzugsweise einen zweiwertigen Metallkationengehalt, wie oben angegeben, hat. G-eeigneterweise kann Leitungswasser verwendet v/erden, sofern desaen Härtewert dem angegebenen Bereich entspricht. Beste Ergebnisse werden mit der auf ungefähr 0,01M eingestellten Konzentration erhalten. Die diese Katione:; begleitenden An ionen können irgendwelche unschädliche Anione, ;/ie Chlorid, Sulfat, usw. sein.

Zum Dialysieren kann irgendeine geeignete Vorrichtung verwendet //erden. Im kleinen Maßstab ist eine halb-durchläaaige Cellophanronro zufriedenstellend, und beim größeren Ausmaß yvurde die so bezeichnete Merenmas chine (kidney machine), die ursprünglich zur Reinigung von Blut ausgelegt wurde, für geeignet zur Verwendung befunden. Das Verhältnis der Dialy- ;rie rungs oberfläche zu dem i'liissigke its volumen war ungefähr

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1,6 cm , und zwar im Falle der Cellophanröhre und 4,5 om bei der Hierenmaschine. Leitungswasser, auf einen pH zwischen 5 und 9 eingestellt, mit S/Trensen-Puff er wird außerhalb der Membrane zirkulieren lassen und die Leitfähigkeit der Virus-TJuapension oder irgendeine andere der Leitfähigkeit entsprechende Eigenschaft wird, sofern notwendig, regulär gemessen oder überwacht.

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Die Zeit für die Dialyse hangt τοπ der verfügbaren Membranoberfläche und der Temperatur der Suspension ab. Wenn die oben erwähnte Vorrichtung bei Zimmertemperatur verwendet wird, sind 3 bis 4 Stunden ausreichend, um niehx· als 80 bis. 90$ VirusaktivitMt in der Ausfüllung zu gewinnen. Unterdessen fällt die Leitfähigkeit der Virussuspension von der Anfangsgröße von 10 uinho/cm auf den Bereich unter 3 χ 10^ oder häufiger auf den Bereich von 2 bis 10 mal 10 jumho/cm ab. Der Chloridgehalt der AnfangsallantoinflüS3igkeit wird

entsprechend von 4,25 mg/ml auf 1,3 mg/ml oder weniger verringert, und es ist zweckmäßig auf diesen anstelle der Leitfähigkeit der Lösung zu achten, vorausgesetzt daß die Verfahrensbedingungen standardisiert wurden und äquivalente Werte für die beiden Versuche festgesetzt werden. Die Konzentration der Calcium- und Magnesiumionen in der Suspension kann ebenso überwacht und das Verfahren nach wenigen Stunden angehalten werden, wenn die Konzentration das Gleichgewicht mit der in der Dialysenflüssigkeit erreicht.

Man läßt die Suspension nach der Dialyse stehen, währenddessen das langsame Absetzen des Virus stattfindet oder vorzugsweise wird zentrifugiert, um das Absitzen zu beschleunigen. Die überstehende Flüssigkeit wird dann entfernt und die Ablagerung, die der an Virus angereicherten Fraktion entspricht,wird wieder mittels einer auf pH 7 bis 8 gepufferten Phosphat- oder Citratsalzlösung oder mit d-iier tilgen

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Trypsiiilösung in Phosphat gepufferter Salzlösung suspendiert. Das Volumen der für die Wiedersuspendierung der Virusablagerung verwendeten wäßrigen Lösung wird geeigneterweise so eingestellt, daß die gereinigte Virussuspension noch wenigstens eine Zehnfache Konzentration im Vergleich zu dem Anfangs volumen hat. Der in dem Konzentrat vorhandene Virus stellt gewöhnlich wenigstens 70$, häufig mehr als 90$ der Anfangsvirusaktivität, ausgedrückt in IiA (Haemagglutina- f

ti ons)-Einhe it en, dar.

Die Ablagerung scheint schneller und selektiver zu erfolgen, wenn die zweiwertige Kationmenge der Dialysenflüssigkeit, wie vorgesehen, eingestellt wird. Die getrennte Ablagerung kann mit Wasser, das 0,1M Calcium enthält, gewaschen werden, und man kann es nochmals vor der "Medersuspendierung absitzen lassen.

Vorteilhafterweise kann die ausgefällte Virusablagerung in \

Triammoniumcitrat-Puffer, mit vorzugsweise einer Konzentration von 0,2M und einem pH von 5»6 bis 7_t2 wiedersuspendiert werden. 1 ml einer solchen Lösung kann für jeweils 10 ml Volumen Anfangsvirussuspension, zum Erhalten einer 10-fachen Konzentration, verwendet werden. Der wiedersuspendierte Virus kann dann mittels chemischer oder physikalischer Mittel inaktiviert oder als Vakzin nach geeigneter prüfung verwendet werden.

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Das erfindungsgemäße Verfahren trennt und konzentriert die Influenza-Viren vorteilhaft und schnell durch einfache Mittel ohne Verunreinigung der Virussuspension mit Salzen oder anderen Mitteln und ohne merklichen Verlust der Virusaktivität. Das Verfahren kann in großem.Maßstab in zwei oder mehr getrennten Stufen durchgeführt werden, wobei zwei oder mehr die verschiedenen Heinheitsgrade darstellende Fraktionen vorhanden sind. Die am wenigsten bevorzugten letzten Fraktionen können dann einer weiteren Reinigung unterworfen oder müssen "dann dem Kreislauf des Verfahrens wiederzugeführt werden.

Das konzentrierte Vakzin wird hinsichtlich Aktivität und Infekt ivität geprüft und seine Stärke auf einen Wert nach den üblichen Bestimmungen eingestellt. Die Aktivität wird gewöhnlich in Internationalen Haemagglutinations-Einheiten ausgedrückt und die Vakzinpotenz ist der Wert pro Milliliter. Die Einheit und das Verfahren zur Durchführung des Versuchs wurde in dem '"First Report of the Experts Committee on Influenza, 1953" (Weltgesundheitsorganisation Technical Report Nr. 64) erläutert. Die Inaktivierung des Virus ,vird gewöhnlich nach der Reinigung durchgeführt, aber das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren kann ebenso durchgeführt werden, wenn die Viren bei einer früheren Stufe des Verfahrens inaktiviert wurde.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

BÄD ORIGINAL

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Beispiel 1

Die Allantoinflüssigkeit, die den Stamm Influenza B/Eng./66, ge zueiltet in 10 lage alten Kückenembryos, enthielt, wurde durch Zentrifugieren bei 1600 g in einer M,S.E.Multex Zentrifuge (bei 2500 ürndr. pro Minute) 10" Minuten geklärt. Die Flüssigkeit wurde dann in einer "Visking Tubing" (Gellophan, Durchmesser ungefähr 2,5 cm), erhältlich bei dem Scientific Instrument Centre, gegen Leitungswasser bei

Proben.wurden in stündlichen Abständen bis zur vierten Stunde gesammelt. Diese Proben wurden wie oben 10 Minuten lang zentrifugiert und dann das Überstehende und die Ablagerungen getrennt gesammelt.

Diese beiden Fraktionen wurden hinsichtlich des Haemagglutinintiters nach dem Standard-Takatsy micro-Verfahren geprüft. Der Gesamtproteingehalt wurde nach dem Verfahren von Lowry und Anderen J.Biol.Chem., 1961, 193, 265 bis 275, bestimmt. Die aus den Proben erhaltenenAblagerungen wurden auf das Ausgangsanfangsvolumen in Dulbecco phosphat-Puffer-Salzlösung (P.B.S.¹A¹) für Testzwecke wiedersuspendiert.

Die Leitfähigkeit der überstehenden Lösung wurde bestimmt, und es wurden die nachfolgenden Ergebnisse erhalten:

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Stunden

Int ernationale

dialysiert Haemagglutinations- Protein bei 37 C Einheiten/ml mg/ml

Leitfähigk, pnho/cm

	[Jbersteh.	,Ablagerung	!"!bersten	.Ablager.	CTberst eh.
0	1280	80	4,39	0,135	98 χ TO²
1	320	320	3,94	O,T55	14 x 10²
2	320	640	3,95	0,222	10,5x 10²
3	320	1280	3,90	0,289	8,4X tO² :
4	160	1280	-3,74	0,318	7,3x 1Ό²
Kontrolle 4 Stdn. nicht di- aIygiert	640	80	4,35	0,106	96 χ TO²

Praktisch wurde die gesamte ■ Virus aktivität in der ATalagerung gewonnen, wobei ungefähr 93$ der anderen Proteine entfernt wuräeoi. Eer Eeinigung3faktor, der als Zunahme des Virus- zu Prote.inverhältnisses ausgedrückt wird, betrug das 14-fache.

Beispiel 2

Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn für die im obigen Beispiel 1 angegebene Dialyse destilliertes Wasser verwendet wurde und wenn die Allant ο inflüssigkeit der embryonierten Eier mit dem Stamm Influenza A/Eng./1966 bebrütet wurden und die den Stamm Influenza C Taylor enthaltende Amniotinflüasigkeit nach dem Verfahren von Beispiel 1 behandelt wurde.

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BAD ORlGiNAL

Beispiel 3

Influenza Typ Ag/Eng./1966 wurde in der Allantoinflüssigkeit von TT [Tage ~altenembryOnierten Eiern ge züchtet, und die infizierte Allantoinflüssigkeit wurde 2 bis 3 Tage später abgenommen .

2,0 1 infizierte Allantoinflüssigkeit wurde gegen laufendes Leitungswasser bei Zimmertemperatur dialysiert mittels Zirkulieren durch eine Doppelwindung einer Dialysenröhre (Baxter Laboratories Disposable Coil Kidney, "Chronacoil") mit einer Kapazität von 500 ml und einer Gesamtfläche von 9000ci£. Man ließ die Flüssigkeit bei einer Geschwindigkeit von 200 ml/Min. 4 Stunden lang umlaufen. "Während dieser Zeit fiel

2 die Leitfähigkeit der Allantoinflüssigkeit von 65 x 10 umho/cm auf 25 χ 10 ytmho/om, und es erfolgte eine Ausfällung. Die Ausfällung v/urde durch Zentrifugieren gesammelt und in einem 1/I4tel des Anfangsνοlumens mit Phosphat gepufferter Salzlösung, die 1$ Gew./Vol.Trypsin enthielt, wiedersuspendiert.

Die Anfangsallantoinflüssigkeit hatte einen HA-Titer von und enthielt 1,25 mg Protein/ml, wobei die Messung durch Trichloressigsäure und Titrieren erfolgte. Das Konzentrat hatte einen Titer von 4096 und einen Proteingehalt von 2,5 mg/ml. Die Ausbeute an Virus betrug bei Messung durch HA 100?«, und das Konzentrat zeigte einen 64-fachen Reinigung j fakt or. -12-

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Beispiel 4

1,0 1 Allantoinflüssigkeit, die Influenza Typ A₂/Eng./66, kultiviert wie in Beispiel 3» enthielt, wurde wie bereits beschrieben drei Stunden dialysiert. Die Anfangsflussigkeit hatte einen Titer von 1024 und ein 25-faches Konzentrat, das wie in Beispiel 3 hergestellt wurde, Titer 50 000.

™ Beispiel 5

1,5 1 Allantοinflüssigkeit mit Influenza Virus Typ B/Eng./66 wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, bearbeitet. Die Dialyse betrug drei Stunden. Der Anfängst iter war 256 und das 20-fache Konzentrat hatte einen Titer von 4096.

Beispiel 6 .

Die in den Beispielen 1 bis 5 erhaltene Konzentrat-Virus-Suspension wurde mittels Formaldehyd nach bekannten Verfahren inaktiviert und auf eine Konzentration von 2500 oder 5000 HA Einheiten/ml eingestellt. Die so hergestellten Vakzine zeigten eine zufriedenstellende Leistung bei Prüfung.

Beispiel 7

Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden weitere Versuche durchgeführt, wobei die Dialysenflüssigkeit auf eine bestimmte Konzentration des zweiwertigen Metallkations eingestellt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben. -13-

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zweiwertige Kationltonz. in Dialysen—	Internationale Haemagglut inat ions - Einheit en/ml	Ablag.	Prot e in	mg/ml
flüssigkeit	Uberst eilend.	1024	überstellend.	Ablagerung
0,01M Ca⁺⁺	32 ·; -	1024	1,1	■ 0,13
0,005M Ca⁺⁺	33	256	1,09	0,13
0,01M Mg⁺⁺	4	128	2,01	0,35
0,0.1 M Ba⁺⁺	15	256	1,79	0,24
0,01M Go⁺⁺	8 :	2,11	0,31

Calcium, B/Iagnesium und Barium wurden als Ghlorid, Kobalt als Sulfat zur Einstellung der Dialysenflüssigkeit verwendet

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Claims

■ ~ 14 - Patentansprüche : *

1. Verfahren zur Konzentration und Reinigung der Viren der Influenzagruppe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension des Virus bis zu einem ausreichenden Ausmaß, um den Virus zur Bildung eines Niederschlags zu befähigen, dialysiert und die den Virus enthaltende Fraktion von der überstehenden Lösung abtrennt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch, gekennzeichnet, daß man die Konzentration der zweiwertigen Metallkationen in der Dialysenflüssigkeit auf einen Wert von 0,003 bis ungefähr 0,012M einstellt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der zweiwertigen Metallkationen 0,1 M ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3 dadurch gekennzeichnet , daß das zweiwertige Metallkation Calcium, Magnesium, Barium oder Kobalt, oder ein Gemisch derselben, ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß das Kat ion Calcium ist.

6. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Leitfähigkeit der Suspension

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"2

auf einen Bereich unter 5 χ 10 umho/cm verringert wird

7. Verfahren gemäß Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, daß die Leitfähigkeit der Lösung auf einen Wert von 2 "bis 10 χ 10 umho/cm verringert wird.

8. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß der Chloridgehalt der Suspension auf 1,3 mg/ml oder weniger verringert wird.

9. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Virussuspension eine Allan- . toinflüssigkeit ist, die aus embryonierten, infizierten Eiern erhalten wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit durch Niedergeschwindigkeit-Zentrifugieren vor der Dialyse geklärt wird.

11. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Dialyse in einer Nierenmaschine (kidney machine) durchgeführt wird.

12. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennte Ausfällung mit einer Lösung, die ein zweiwertiges Metallkation wie Calcium

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. : 1667923

■"-■■· - 16 -enthält, gewaschen und abgetrennt wird« ■

13. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche da.-durch gekennzeichnet, daß die abgetrennt« oder gewaschene Ausfällung in einem Puffer, der Triammoniumcitrat enthalt, wiedersuspendiert wird. ■ ^r '/

14. Verfahren zur Konzentration und Reinigung der Viren der Influenzagruppe im wesentlichen wie in einem der Beispiele beschriften.

15. Verfahren zur Herstellung von Vakzinen gegen-durch Viren'der Irifluenzagruppe verursachte Krankheiten, dadurch gekennzeichnet, daß es irgendeine der in den Ansprüchen 1 bis 14 beanspruchten Stufen, die Inaktivierung der Viren entweder vor öder nach der Dialyse mittels an sich bekannter Verfahren und die Darbietung des inaktivierten Virus in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, daß die Inaktivierung mit Formaldehyd durchgeführt wird.

17. Verfahren zur Herstellung von Vakzinen gegen durch Viren der Influenzagruppe verursachte Krankheiten, das einen geschwächten Stamm des Virus verwendet, dadurch gekennzeichnet, daß es irgendeine der in den Ansprüchen 1 bis 14 bean-

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spruchten Stufen umfaßt und die konzentrierte Virussuspension in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger dargeboten wird.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17 dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von M. influenzae-A oder

M. influenzae-B verwendet wird.

19. Verfahren zur Herstellung eines Vakzins im wesentlichen wie in einem der Beispiele 1 bis 6 beschrieben.

20. Konzentriertes und gereinigtes Vakzin, sofern es nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis .19 hergestellt wurde»

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