AT224807B - Verfahren zur Gewinnung eines neuen tumorhemmenden Polysaccharids - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Gewinnung eines neuen tumorhemmenden Polysaccharids 
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   Die tumorhemmende Wirkung der Viscumsäure wurde an folgenden überimpfbaren, soliden Tumoren   geprüft : Mäusetumoren : CrockerSarcom   180, Ehrlich Carcinom (solide Form) und   Adeno-Carcinom   EO 771. 



     Rattentumoren : Walker Carcinosarcom   256,   Uterusepitheliom T - 8 Guérin   und Flexner-Joblin Carcinom. 



   Das Präparat wurde täglich während 6 Tagen intraperitoneal gegeben. Die wässerigen Lösungen wurden täglich frisch hergestellt. Die Wirkung auf den Tumor wurde 2 Tage nach Abschluss der Behandlung bestimmt. 



   Die Resultate sind in folgender Tabelle zusammengestellt : 
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<tb> 
<tb> Tumoren <SEP> Hemmungsstärke
<tb> Crocker <SEP> Sarcom <SEP> 180 <SEP> +
<tb> Ehrlich <SEP> Carcinom <SEP> +
<tb> Adeno-Carcinom <SEP> EO <SEP> 771 <SEP> ++
<tb> Walker <SEP> Carcinosarcom <SEP> 256 <SEP> ++ <SEP> 
<tb> Uterusepitheliom <SEP> T-8 <SEP> Guérin <SEP> ++ <SEP> 
<tb> Flexner-Joblin <SEP> Carcinom <SEP> +++ <SEP> 
<tb> 
 Zeichenerklärung   fez+ =   starker Behandlungseffekt ; mittlerer Behandlungseffekt ; + = leichter Behandlungseffekt. 
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 mittelstark gehemmt, wobei die Wirkung auf das letztere ausgeprägter erscheint. 



   Weitere Versuche haben ergeben, dass die Haematopoese nicht gehemmt wird. Die cytologischen Untersuchungen lassen vermuten, dass ein Effekt auf die Nucleinsäuren, möglicherweise durch Beeinflussung der Zuckerbausteine, vorliegt. 



   Das Verfahren zur Gewinnung der Viscumsäure ist dadurch gekennzeichnet, dass man Pflanzenmaterial von Viscum album oder Loranthus-Arten, speziell Loranthus europeus L., mit Wasser extrahiert oder auspresst und hierauf den Extrakt oder Presssaft einer Dialyse unterwirft. Bei dieser Dialyse gehen die bekannten Wirkstoffe, wie   z. B.   das Viscotoxin, in das Dialysat, während die Viscumsäure zurückbleibt. Der so gewonnene nicht-dialysierbare Anteil des Extraktes enthält noch Ballaststoffe, die man abtrennt und so die Viscumsäure in reiner Form, gegebenenfalls als Metallsalz oder als Gemisch der beiden Formen, erhält. 



   Als Ausgangsmaterial für die Wasserextraktion oder die Gewinnung des Presssaftes verwendet man in erster Linie die reifen Beeren der genannten Pflanzen, vor allem von Viscum album, oder auch die Blätter davon. Man kann dabei die ganzen Beeren verwenden, oder nur die Kerne oder das Fruchtfleisch. Zweckmässig nimmt man   die Extraktion als Kaltwasserextraktion   vor. Die Extrakte werden von den ungelösten Bestandteilen, vorteilhaft durch Zentrifugieren, getrennt. 



   Der so gewonnene Extrakt bzw. Presssaft wird hierauf dialysiert. Zweckmässig verwendet man hiezu die üblichen semipermeablen Membranen, vor allem Cellophan,   z. B. Cellophansch1äuche   mit einem Porendurchmesser von 2,5 bis 8, 0   mu,   und dialysiert gegen Leitungswasser und abschliessend gegen destilliertes Wasser. Die rückständige (nicht-dialysierte) Lösung wird hierauf zweckmässig konzentriert. Dies geschieht vorteilhaft im Vakuum, möglichst in einem Schnellverdampfer oder nach dem System der Lyophilisierung oder mittels einer Kombination dieser Methoden, wobei zunächst mit einem Schnellverdampfer und hierauf mit einem Lyophilisator gearbeitet wird. Der so gewonnene Extrakt enthält die Viscumsäure 

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 bzw. ihre Salze mit in Pflanzen vorhandenen Metallen (z. B.

   Natrium, Calcium, Magnesium   usw.)   in an- gereicherter Form und besitzt schon eine deutliche Antitumorwirkung. 



     Zur Isolierung der Viscumsäure   bzw. ihrer Salze kann man sich verschiedener Methoden bedienen. Ein bevorzugter Weg ist die fraktionierte Fällung mittels mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln. 



  Solche sind vor allem Dioxan, niedere aliphatische Alkohole, z. B. Glykole,   wie Äthylenglykol, Diäthylen-   glykol, Propylenglykol, Methoxyäthanol,   Diäthylenglykolmonomethyläther,   Diäthylenglykolmonoäthyl- äther, Äthylenglykolmonoacetat, Polyäthylenglykol, besonders Alkanole, wie Methanol oder Propanol, oder Ketone, wie Alkylketone, z. B. Aceton oder Methyläthylketon, vor allem aber Äthanol. Die ge- wünschte, die Viscumsäure bzw. ihre Salze enthaltende Fraktion lässt sich leicht an Hand ihrer tumorhem- menden biologischen Eigenschaften feststellen. Mit Äthylalkohol   z. B.   erhält man die Viscumsäure durch
Zugabe von Äthanol zu den wässerigen Lösungen und Abtrennung des bei einer Alkoholkonzentration von
55 bis   75fla   erhaltenen Niederschlages.

   Das Präzipitat lässt sich in üblicher Weise,   z. B.   durch Zentrifugie- ren, abtrennen. Die Fällung kann mehrmals wiederholt werden, wobei der Reinheitsgrad der Viscumsäure bzw. ihrer Salze noch gesteigert werden kann. Die Fällungen können auch in Gegenwart von Absorptions- mitteln, wie Hyflo und ähnlichen Adsorbentien, vorgenommen werden, oder in Gegenwart eines starken
Elektrolyten, um die Ausfällung zu erleichtern. 



   Eine weitere Methode zur Isolierung der reinen Viscumsäure bzw. ihrer Salze besteht in der elektro- phoretischen Trennung. Diese wird in üblicher Weise vorgenommen, wobei sich die gesuchte Fraktion wiederum durch ihre tumorhemmende Wirksamkeit ermitteln lässt. Allgemein kann gesagt werden, dass sich die Viscumsäure in der stehenden bzw. langsam anodisch wandernden Fraktion befindet, während die schnell wandernden Fraktionen aus Ballaststoffen bestehen. 



   Schliesslich kann man die Viscumsäure auch durch Fällung der Begleitstoffe mit einer quaternären Am- moniumverbindung reinigen. Hiezu verwendet man besonders eine solche, die eine lange Kohlenstoffkette 
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    enthält, z- dimethyl-dodecylammoniumchlorid,   oder die entsprechenden Bromide, Jodide oder Hydroxyde. 



   Gewisse Begleitstoffe bilden dabei schwerlösliche Komplexe mit der quaternären Ammoniumverbindung, die in an sich bekannter Weise,   z. B.   durch Zentrifugieren, abgetrennt werden können. Die Menge der zuzufügenden quaternären Ammoniumverbindung kann in weiten Grenzen variiert werden, wobei lediglich zu beachten ist, dass nicht ein allzu grosser Überschuss zugegeben wird, da die entstehenden Komplexverbindungen dann teilweise gelöst werden. Die entstandenen Komplexe werden dann durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt und das den Wirkstoff enthaltende Filtrat durch Dialyse gegen destilliertes Wasser vom überschüssigen Ammoniumsalz befreit. Aus dem nicht dialysablen Teil wird durch Lyophilisation der reine Wirkstoff gewonnen. 



   Man kann   auchAmmoniumverbindungen zumFällen derViseumsäure   bzw. ihrer Salze verwenden, sofern in einem Boratpuffer von zirka PH 10 gearbeitet wird. 



   Je nach der Verfahrensweise erhält man   die Viscumsäure in freier Form   oder als Salz oder als Mischung der beiden. Aus den Salzen kann die freie Viscumsäure in üblicher Weise,   z. B.   mittels Kationenaustauschern oder mit Hilfe der Dialyse gegen verdünnte Säuren, erhalten werden. Aus der freien Säure lassen sich in üblicher Weise Metallsalze herstellen, z. B. von Alkali oder Erdalkalimetallen. 



   Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens, bei denen obige Verfahren in beliebiger Form kombiniert und/oder durch weitere Reinigungsoperationen oder Hilfsmittel ergänzt oder durch äquivalente Verfahren ersetzt werden oder worin   andere viscumsäurehaltige Pflanzenmaterialien   verwendet werden. 



   Die Viscumsäure oder ihre Salze können als Heilmittel bei Krebserkrankungen verwendet werden. Hiezu können sie z.   B.   in Form pharmazeutischer Präparate vorliegen, die sie zusammen mit pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägerstoffen, die für die parenterale Gabe geeignet sind, enthalten. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Trockenampullen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-,   Stabilisierungs-,   Netz- oder Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffer. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. 



   Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. 



   Beispiel 1 : 8 kg reife Mistelbeeren zerquetscht man zwischen Steinwalzen und verrührt sie anschliessend in einem eisgekühlten Gefäss in 12   l   eiskaltem destilliertem Wasser während 3 h. Sehr intensives Rühren muss durch zwei gegenläufige Propellerrührer (Taifun), deren Schaufeln jedoch nicht zu scharf- 

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 kantig sein dürfen, gewährleistet sein. Dabei geht der sehr zähe Schleim durch Quellung und mechanische
Zerkleinerung allmählich in Lösung. Man lässt kurze Zeit stehen, so dass sich die Beerenhäute und-kerne absetzen können und schöpft dann die viskose Lösung in eine nicht zu schnell laufende Sackzentrifuge. Das   Extraktionsgefäss   und die Zentrifuge wird mit 3-5   l   kaltem destilliertem Wasser nachgewaschen.

   Das von festen Partikeln befreite, jedoch noch trübe   Zentrifugat   wird in 10 Cellophanschläuche abgefüllt und zuerst gegen ein grosses Volumen eiskaltes, kontinuierlich erneuertes Leitungswasser, anschliessend unter mindestens sechsmaligem Wechsel gegen jeweils 200 1 eiskaltes destilliertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wird verworfen, die nicht dialysablen Anteile (Schlauchinneres) vereinigt und bei einer Lösungstemperatur von zirka 300 im Schnellverdampfer im Vakuum auf   1,   71 Volumen eingeengt. Durch Gefriertrocknung erhält man aus dieserhochviskosen Lösung 240 g eines fast farblosen flockigen   Präparates (Präp. 22   303 D), das die Viscumsäure in angereicherter Form enthält und eine guteAntitumorwirksamkeit zeigt, die es während unbeschränkter Zeit beibehält. 



   Beispiel 2 : 400 g   Präp. 22 303   D werden zur Isolierung der Viscumsäure durch 3-stündiges intensives Rühren in 6   l   eiskaltem destilliertem Wasser gelöst. Dann werden 12 1 absoluter Alkohol über ein Zeitintervall von zirka 3 h in die gut gerührte Lösung eingetropft und noch 16 h bei 00 weitergerührt. Den farblosen flockigen Niederschlag lässt man absitzen und dekantiert anschliessend die gelbe überstehende Lösung, die Zucker und niedermolekulare Polysaccharide enthält, ab. Der Bodensatz wird dann zentrifugiert und   der Festkörper   auf einer Glasfilternutsche mit 50 cm3   75'igem   wässerigem Alkohol nachgewaschen.

   Darauf löst man den Rückstand durch- intensives Rühren in   1, 5 l   destilliertem Wasser bei 00 auf und befreit die gebildete hochviskose Lösung von ungelösten Schwebeteilchen durch Zentrifugieren   (Laval-Zentrifuge).   Die klare Lösung wird durch Lyophilisation in 82 g eines farblosen flockigen Produktes von hoher Antitumoraktivität übergeführt (Präp. 24467 A). Dieses Produkt stellt die Viscumsäure im Gemisch mit ihren in der Pflanze vorkommenden Metallsalzen dar. 



   Beispiel 3 : Das bei   derExtraktion   nach Beispiel 1 in der Sackzentrifuge zurückbleibende Gemenge von Beerenhäuten und-kernen lässt sich durch Ausschlämmen in die leichteren Häute und die spezifisch schwereren, grün gefärbten und ziemlich harten Beerenkerne trennen. Man erhält auf diese Weise aus 8 kg Beeren zirka 400 g Kerne. 



   Davon werden 100 g in 150   cms   Wasser zerkleinert, durch eine Schicht aus 40   g"Hyflo"Supercel   abgeschwungen, der Rückstand und das Filtermittel zweimal mit 50 cm3 destilliertem Wasser nachgewaschen und das Filtrat der Dialyse unterworfen. Man dialysiert zuerst gegen eiskaltes Leitungswasser, dann gegen eiskaltes destilliertes Wasser (vgl. Beispiel   1).   Der zirka 350 cm3 Volumen bildende, nicht dialysable Anteil wird im Vakuum unter schonenden Bedingungen auf 40 cm3 eingeengt (enthaltend zirka 20 g Feststoffe). 



  Diese Lösung versetzt man gemäss Beispiel 2 unter gutem Rühren mit 80 cm3 absolutem Alkohol und erhält dabei Präp.25 236 A, ebenfalls ein Gemisch von Viscumsäure und ihren Salzen mit guter tumorhemmender Wirkung. 



   B e i s p i e l 4: Beim Sammein der Mistelbeeren ist wiederholt eineinfektion des Materials mit Mikroorganismen (z. B. Heubacillus usw. ) beobachtet worden. Die Herstellung von keimfreien Präparaten lässt sich durch Zwischenschaltung einer Behandlung mit Formaldehyd an geeigneter Stelle des Anreicherungs- 
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B.stündiges Rühren bei   0    in 6 l destilliertem Wasser in Lösung gebracht, von geringen Mengen ungelöster Schwebestoffe durch Zentrifugieren befreit und die Viscumsäure durch Zutropfen von 12 1 absolutem Alkohol während 3 Stunden und anschliessendem Weiterrühren bei 00 während 16 Stunden ausgefällt. Die Abtrennung des Niederschlages vom gelben Filtrat geschieht in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise.

   Der Rückstand wird anschliessend in 2   l   destilliertem Wasser durch intensives Rühren gelöst, mit 50 cm3 (40   Vol.-a) Formalinlösung   versetzt und 24 h bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann wird die Lösung gegen das zehnfache Volumen destilliertes Wasser unter häufigem Wechsel so lange dialysiert, bis das Dialysat keinen nach   CH ; 0   riechenden Rückstand mehr bildet. Die sterile Lösung des nicht dialysablen Anteils wirdin einer sterilen Apparatur lyophilisiert, wobei man   82g flockiges, blendend weisses Präp. 26 327     erhält, das ein Gemisch von Viscumsäure   und ihren Metallsalzen darstellt und frei von Mikroorganismen ist. 



   Beispiel 5 : 20 g der gemäss Beispiel 1 erhaltenen angereicherten Viscumsäure werden mit 300 cm3 destilliertem Wasser während 1/2 h geschüttelt und zur Entfernung der Trübung durch 5 g "Hyflo" Supercel filtriert und das Filter nachgewaschen. Die Waschwasser werden zur Lösung gegeben und man erhält ein Volumen von total 320    cas.   Nach Zugabe von 20 g Hyflo werden in diese Lösung unter gutem Rühren 590 cms absoluter Alkohol in feinem Strahl eingegossen und noch 15 min weiter gerührt. Man lässt das mit dem Präcipitat beladene Hyflo absitzen und filtriert dann durch ein Sinterglasfilter. Dem Hyflorückstand wird das Polysaccharidmaterial durch Wasserextraktion entzogen. 

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   Das Filtrat besitzt ein Volumen von zirka 900 cm3 und wird wiederum mit 20 g Hyflo Supercel versetzt. Dann werden in der oben beschriebenen Weise erneut 370 cm3 absoluter Alkohol eingerührt und die Fällung abgenutscht. Zur Gewinnung der Polysaccharidfraktion wird der Hyflorückstand mit Wasser extrahiert. 
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Alkohol eine weitere Polysaccharidfraktion gefällt. Es wird durch eine Glasfilternutsche G3 abfiltriert, wobei ein gelbes, klares Filtrat zurückbleibt, das praktisch keine Polysaccharide mehr enthält. Der Hyflo- rückstand wird wie bei den oben beschriebenen Fällungen dreimal mit je 100 cm3 destilliertem Wasser ausgeschüttelt, durch eine Glasfilternutsche abfiltriert und mit Wasser nachgewaschen. Durch Lyophili- sation gewinnt man aus dem   wässerigen Extrakt   ein farbloses flockiges Pulver.

   Nachstehende Tabelle gibt die Mengenverhältnisse der einzelnen Fällungen an : 
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<tb> 
<tb> 1. <SEP> Fällung <SEP> : <SEP> Alkoholkonzentration <SEP> 65% <SEP> : <SEP> Rückstand <SEP> 3 <SEP> g <SEP> 
<tb> 2. <SEP> Fällung <SEP> : <SEP> Alkoholkonzentration <SEP> 75% <SEP> : <SEP> Rückstand <SEP> 2,9 <SEP> g
<tb> i <SEP> 3. <SEP> Fällung <SEP> : <SEP> Alkoholkonzentration <SEP> 80% <SEP> : <SEP> Rückstand <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> g
<tb> Nichtfällbare <SEP> Restlösung <SEP> (niedermolekulare
<tb> Anteile) <SEP> 4. <SEP> 5 <SEP> g
<tb> 
 
Die erhaltenen Präcipitate werden einzeln gelöst und wieder nach den drei Alkoholkonzentrationen   65%,     79o   und   80%     gefällt. Man   vereinigt dann alle Präcipitate von 65% Alkoholgehalt, alle von   7e   und alle von 80%.

   Wird diese fraktionierte Fällung und selektive Vereinigung aller gleichartigen Fraktionen ein drittes Mal wiederholt, so erhält man Präparate von Polysacchariden, die nach fallendem Molekular- gewicht differenziert sind. Das Präcipitat bei 65% Alkoholgehalt stellt die Viscumsäure im Gemisch mit ihren Metallsalzen in hochgereinigter Form dar, während das Präcipitat bei 75% Alkoholgehalt neben
Viscumsäure und ihren Salzen noch Ballaststoffe enthält und das Präcipitat bei   80%   praktisch unwirksam   ! ist, d. h.   keine Viscumsäure enthält. 



   Beispiel 6 : 4 kg Mistelbeeren werden in einer hydraulischen Presse mit einem Druck von 100 t ausgepresst und der Presskuchen mit wenig destilliertem Wasser nachgewaschen. Man erhält dabei zirka 4   l  
Presssaft. Dieser wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, in Cellophanschläuchen gegen destilliertes Wasser dialysiert und der nicht dialysable Anteil wie in Beispiel 1 auf angereicherte Viscumsäure verarbeitet. 



     Beispiel 7 : 49 g Mistelbeerenkerne werden   in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise extrahiert, wobei man 10 g Trockenextrakt (Lyophilisat) erhält. Davon werden 4 g in 70   cm*   Wasser gelöst und in einem Cellophanschlauch gegen destilliertes Wasser erschöpfend dialysiert. Aus dem nicht dialysierbaren
Anteil erhält man   durchLyophilisation 0, 85   g   Präp. 20101 B ,   als farbloses flockiges Produkt, das ein an- gereichertes Gemisch von Viscumsäure und Salzen davon darstellt. 



   Dieses Gemisch kann wie folgt auf hochgereinigte Viscumsäure aufgearbeitet werden :
Eine Lösung von 240 mg der Substanz in 50 cm3 Borat-Salzsäurepuffer vom PH 8,51 (nach Sörensen) werden in einer Tiselius-Apparatur bei einer Spannung von 260 V (Stromstärke 52 mA) und einer Tempe- ratur von 3,   5 bis 5 C   während   6 1/2   h der Elektrophorese unterworfen. Dabei wird nur der anodenseitig liegende Schenkel mit der Substanz beschickt. Es lassen sich folgende drei verschiedenen Komponenten unterscheiden : 1. eine rasch anodisch wandernde, 2. eine langsam anodisch wandernde und 3. eine sich nicht vom Ursprungsort fortbewegende. Durch zirka zweistündliche Entnahme lassen sich die entsprechen- den Fraktionen isolieren. Die Viscumsäure befindet sich in der stehenden Fraktion, während die beiden andern Fraktionen unwirksam sind.

   Durch Dialyse gegen destilliertes Wasser und Lyophilisation gewinnt man die Viscumsäure. 



     Beispiel 8 :   1,35 g des nach Beispiel 1 gewonnenen Präp. 22 303 D, gelöst in 40   cm3   Borat-Salz- säurepuffer vom PH 8,51 (nach Sörensen) werden in einer schnellaufenden Zentrifuge von Schwebeteil- chen befreit und in einem durch Mischen von Borat-Salzsäurepuffer (pH 8,51) mit konzentrierter Rohr- zuckerlösung   erzeugtenDichtegradienten   der Elektrophorese unterworfen. Dabei befindet sich die Kathode oben und die Anode unten in der Kolonne. Im U. V.-Licht können vier schwach fluoreszierende Zonen unterschieden werden. Sie werden nach Abschluss der Operation einzeln aus der Säule herausgenommen und durch erschöpfende Dialyse gegen destilliertes Wasser in Cellophanschläuchen von den niedermoleku- larenBeimischungen befreit.

   Der nicht dialysable Anteil wird jeweils durchLyophilisation in ein Trocken- pulver übergeführt. Es lassen sich folgende Fraktionen abtrennen : 

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<tb> 
<tb> Zone <SEP> Verhalten <SEP> im <SEP> elektrischen <SEP> Feld <SEP> tumorhemmende <SEP> Wirkung
<tb> l <SEP> sehr <SEP> rasch <SEP> anodisch <SEP> wandernd <SEP> inaktiv
<tb> 2 <SEP> rasch <SEP> anodisch <SEP> wandernd <SEP> stark <SEP> aktiv <SEP> |Vi
<tb> 3 <SEP> langsam <SEP> anodisch <SEP> wandernd <SEP> stark <SEP> aktiv|
<tb> 4 <SEP> stehend <SEP> wenig <SEP> Material
<tb> 
   Beispiel 9 :

   Eine Lösung   von 5 g Präp. 26327, erhalten nach Beispiel 4, gelöst in 20 cm3 Wasser, lässt man sukzessive durch einen basischen Ionenaustauscher (Dowex 1 x8, OH-form ; 20 ml) und einen sauren Ionenaustauscher (Dowex 50 x 8,   H-form ;   20 ml) laufen, wobei jeweils mit zirka 75 cm3 destilliertem Wasser nachgewaschen wird. Die auf diese Weise von anorganischen Ionen befreite Polysaccharidlösung wird anschliessend in einem   Kammer-Rührdialysator   kontinuierlich gegen 60   l   destilliertes Wasser während 70 h dialysiert und zum Schluss in der Ultrazentrifuge (U = 12590/min während 35 min) von einer kleinen Menge Schwebeteilchen befreit. Aus der klaren Lösung erhält man durch Lyophilisation ein flokkiges   seidenglänzendes   Präparat der freien Viscumsäure, Präp. 28316. 



   Die freie Viscumsäure zeigt die gleichen tumorhemmenden Eigenschaften wie das Gemisch von Säure und ihren Salzen. Sie ist jedoch analytisch besser zu charakterisieren. Sie besitzt die eingangs gezeigten physikalischen Eigenschaften. 



   Beispiel 10 : In einem   Kammer-Rührdialysator   mit Cellophanmembranen   ("Cuprophan"und     "Cellpack")   wird   eine Lösung   von   Ig   Präp. 26 327 in 20 cm3 Wasser kontinuierlich dialysiert, zuerst gegen 20   1 O. Oln-Salzsäure.   dann gegen 20   l   destilliertes Wasser (bis keine Na- und Cl-ionen mehr nachweisbar sind). Dann wird der nicht dialysable Anteil herausgenommen und lyophilisiert. Man erhält ein farbloses seidenglänzendes Präparat der Viscumsäure (Präp. 28 316). 



     Beispiel 11 :   50 mg Viscumsäure (Präp. 28 316) werden in 1 cm3   85% niger   Ameisensäure gelöst, in einem Glasrohr eingeschmolzen und während 2h auf 1100 erhitzt. Dann wird die Ameisensäure im Vakuum abgedampft und die letzten Spuren durch mehrmaliges Abuampfen mit absolutem Alkohol entfernt. Anschliessend wird das Hydrolysat an Papier chromatographiert (Systeme : n-Propanol/Äthylacetat/Wasser 7 : 1 : 2 
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 filtriert, der Filterrückstand mit 20   crr   Wasser ausgekocht und der wässerige Extrakt mit dem ersten Filtrat vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Papierchromatogramm wird in den in Beispiel 11 beschriebenen Systemen durchgeführt.

   Als Hauptbestandteile der Viscumsäure werden identifiziert : Galactose, Arabinose, Rhamnose und wahrscheinlich eine Aldobiuronsäure. 
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 bei einer Ölbadtemperatur von 140 bis 1500 im Stickstoffstrom während 5 h am Rückfluss gekocht. Die freigesetzte Kohlensäure wird in   Bariumhydroxydlösung   aufgefangen und das ausgeschiedene Bariumkarbonat gut getrocknet und gewogen. Man erhält   27mg   Bariumcarbonat, was zirka 6 mg Kohlendioxyd entspricht und ein Äquivalentgewicht von zirka 1500 bezüglich 1 Mol Uronsäure ergibt. 



   Beispiel 14 : 50 mg Viscumsäure   (präp. 28316) werden   in 3 cm destilliertem Wasser gelöst, in ein Glasrohr eingeschmolzen und während 4 h auf 1100 erhitzt. Nach dem Abkühlen wird von einigen un-   gelösten Flocken   abfiltriert und das Hydrolysat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Papierchromatogramm ergibt folgendes Bild : Vom Molekül der Viscumsäure wird hauptsächlich nur Arabinose abgespalten. Weiter findet man einen schwachen Fleck, der auf 2-Desoxygalactose zurückgeführt werden könnte. 
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 verschlossenen Gefäss im Dunkeln während einer Woche bei Zimmertemperatur stehen gelassen.

   Die Schwefelsäure wird dann mit Bariumhydroxyd und Bariumcarbonat wie in Beispiel 12 beschrieben entfernt und man erhält beim Papierchromatogramm des Hydrolysates von Viscumsäure die gleichen Bilder wie bei der in Beispiel 14 beschriebenen Heisswasser-Hydrolyse. 



     Beispiel 16 ; 12, 7gPräp. 22303 D (vgl.   Beispiel   l) werden   durch4-stündiges Schütteln in 150 cm3 Wassergelöst. DanntrenntmandurchZentrifugierendienochvorhandenenSchwebeteilchenabJndie150cm3 

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