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Verfahren zur Gewinnung eines Arzneimittels Gegenstand der Erfindung
ist die Gewinnung eines Polysaccharids mit tumorhemmender Wirkung in reiner Form
aus Pflanzenmaterial von Viscum album (Mistel) oder Loranthus-Arten, speziell Loranthus
europeus L.
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Die Mistel wird seit vielen Jahrhunderten in der Medizin verwendet.
Insbesondere ihre Wirkung bei Fallsucht und Schwindel ist schon von Plinius im zweiten
Jahrhundert p. Chn beobachtet worden. Neuerdings finden Mistelpräparate darüber
hinaus bei hohem Blutdruck, bei Gefäßerkrankungen und Arteriosklerose Anwendung.
Dabei handelt es sich um rohe oder sogenannte Vollextrakte. Diesen wird auch eine
gewisse Wirkung bei Krebserkrankungen zugeschrieben. Es ist daher nicht verwanderlich,
daß bereits versucht wurde, aktive Prinzipien aus Pflanzenmaterial von Viscus album
zu gewinnen. Bereits 1860 hat P. Reinsch (Neues Jahrbuch für Pharmazie, XIV, Heft
6, S. 129 [1860]) das Viscin, den Vogelleim, durch fraktionierte Destillation aufgetrennt
und dabei ein Öl vom Kp. 227 bis 2290 C erhalten, aus dem er durch Behandeln mit
konzentrierter Natronlauge das Natriumsalz einer Säure gewann. Die ölige Säure läßt
sich destillieren und besitzt einen an Angelikasäure erinnernden Geruch. Sie erhielt
den Namen Viscinsäure. Außer Cholin und Acetylcholin, Urson und gewissen Harzaikoholen
wurde in späteren Arbeiten vor allem das Viscotoxin (K. Winterfeld und M. Leiner,
Naturwissenschaften, 42, 5. 487 [1955]) isoliert. Es handelt sich dabei um ein Polypeptid,
das sich durch eine Wirkung auf das Herz auszeichnet und darüber hinaus sehr heftig
reizende und nekrotisierende Eigenschaften besitzt. Diesen nekrotisierenden Eigenschaften
des Viscotoxins wurde auch die bei intratumoraler Anwendung von Mistelvollextrakten
beobachtete Verschrumpfung von impftumoren bei Mäusen zugeschrieben.
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Die außerordentlich toxischen Eigenschaften des Viscotoxins erschweren
jedoch die intravenöse Anwendung dieser Substanz oder von Gesamtextrakten, und die
Wirkung einer solchen systemischen Behandlung auf das Wachstum von Tumoren im Gegensatz
zur praktisch unbedeutenden intratumoralen Behandlung ist zumindest fragwürdig.
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Es wurde nun gefunden, daß man aus Pflanzenmaterial von Viscum album
und Loranthus-Arten, insbesondere der dem Viscum album sehr ähnlichen Eichenmistel
(Loranthus europeus L.) ein Polysaccharid in reiner Form isolieren kann, dem der
Namen Viscumsäure gegeben wird. Die Viscumsäure kann zur Bekämpfung von Tumoren
systemisch, z. B. intravenös, verwendet werden und zeichnet sich durch das Fehlen
der Blutdruckwirkung und anderer unerwünschter Effekte der Mistelvollextrakte oder
des Viscotoxins aus.
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Gemäß den Untersuchungen ist die Viscumsäure ein Polysaccharid, das
sich, wie hydrolytische Spaltung und papierchromatographische Untersuchungen der
Spaltprodukte gezeigt hat, hauptsächlich aus Galactose und Arabinose zusammensetzt,
daneben aber noch Rhamnose und eine Uronsäure, möglicherweise Glucuronsäure enthält.
Die Viscumsäure hat einen pKs von 3,9 (c = 1,1 - 10-2 [Val/1]). Der Quotient ihres
Molekulargewichtes mit der Anzahl der freien Carboxylgruppen, durch Titration in
wäßriger Lösung bestimmt, beträgt etwa 1900. Aus der bei der Hydrolyse der Viscumsäure
in 120/oiger Salzsäure freigesetzten Menge Kohlensäure (als BACK, gefällt und gewogen)
berechnet sich dieser Quotient zu etwa 1500. Die Elementaranalyse ergibt folgendes
Bild [Werte von zwei Analysen: C 43,50; 43,73°/o, H 6,41; 6,07°/o, (C)-CH3 2,11;
1,99O/o; N maximal 0,2°/o]. Viscumsäure ist in Wasser und Dimethylformamid löslich.
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Das UV-Spektrum zeigt keine Absorptionsbanden, während das Infrarotspektrum
(in Nujol) durch folgende Banden (in mll) ausgezeichnet ist: max. 2,95 bis 3,00;
5,74; 6,08; Schulter bei 7,2 mit max. bei 8,00 bis 9,05. Die optische Drehung in
Wasser (1,470wo) beträgt (nach Klärung durch Ultrazentri-
fugierung)
für die Natrium-D-Linie: [a205 -26,7 +10; für die nachfolgenden Quecksilberlinien:
fri]5= m. = 59,5 + 10 436mull= -50,7 + 10 546mol -31,0 + 10 578 -27,2 ::i: + 10
Die Sedimentationskonstante (Sm) der neutralisierten Viscumsäure in 2,670/oiger
Kochsalzlösung bei 200 C beträgt 3. 10-13 (c = 1,340/o). Die relative Viscosität
(real ) ist 1,39 (c = 0,440/0 in 0,lmolarer Kochsalzlösung bei 250 C). Viscumsäure
ist gemäß diesen Angaben von der öligen, destillierbaren Viscinsäure von P. Reins
ch offensichtlich verschieden.
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Die tumorhemmende Wirkung der Viscumsäure wurde an folgenden überimpfbaren,
soliden Tumoren geprüft: Mäusetumoren: Crocker Sarcom 180, Ehrlich Carcinom (solide
Form) und Adenocarcinom EO 771.
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Raffentumoren: Walker Carcinosarcom 256, Uterusepithelion T-8 Guerin
und Flexner-Joblin Carcinom.
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Das Präparat wurde täglich während 6 Tagen intraperitoneal gegeben.
Die wäßrigen Lösungen wurden täglich frisch hergestellt. Die Wirkung auf den Tumor
wurde 2 Tage nach Abschluß der Behandlung bestimmt.
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Die Resultate sind in folgender Tabelle zusammengestellt:
| Hemmungs- |
| Tumoren stärke |
| Crocker Sarcom 180 . r |
| Ehrlich Carcinom ...... + |
| Adenocarcinom EO 771 ++ |
| Walker Carcinosarcom 256 . . + + |
| Uterusepitheliom T-8 Guenn .. ++ |
| Flexner-Joblin Carcinom . . + + + |
Zeichenerklärung: + + + = starker Behandlungseffekt; + + = mittlerer Behandlungseffekt;
+ = leichter Behandlungseffekt.
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Aus obiger Tabelle geht hervor, daß das Flexner-Joblin Carcinom am
stärksten gehemmt werden kann.
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Das Uterusepitheliom T-8 Guerin, das Walker Carcinosarkom 256 und
das Adenocarcinom EO 771 werden mittelstark gehemmt, wobei die Wirkung auf das letztere
ausgeprägter erscheint.
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Weitere Versuche haben ergeben, daß die Haematopoese nicht gehemmt
wird. Die cytologischen Untersuchungen lassen vermuten, daß ein Effekt auf die Nucleinsäuren,
möglicherweise durch Beeinflussung der Zuckerbausteine, vorliegt.
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Das Verfahren zur Gewinnung der Viscumsäure ist dadurch gekennzeichnet,
daß man an sich bekannte wäßrige Extrakte oder Preßsäfte von Viscum album oder Loranthus-Arten,
speziell Loranthus europeus L., einer Dialyse unterwirft. Bei dieser Dialyse gehen
die bekannten Wirkstoffe, wie z. B. das Viscotoxin, in das Dialysat, während die
Viscumsäure zurückbleibt. Der so gewonnene nicht dialysierbare Anteil des Extraktes
enthält noch Ballaststoffe, die man abtrennt und so die Viscumsäure in reiner Form,
gegebenenfalls
als Metallsalz oder als Gemisch der beiden Formen erhält.
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Als Ausgangsmaterial für die Wasserextraktion oder die Gewinnung
des Preßsafts verwendet man in erster Linie die reifen Beeren der genannten Pflanzen,
vor allem von Viscum album, oder auch die Blätter davon. Man kann dabei die ganzen
Beeren verwenden oder nur die Kerne oder das Fruchtfleisch. Zweckmäßig nimmt man
die Extraktion als Kaltwasserextraktion vor. Die Extrakte werden von den ungelösten
Bestandteilen, vorteilhaft durch Zentrifugieren getrennt.
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Der so gewonnene Extrakt bzw. Preßsaft wird hierauf dialysiert. Zweckmäßig
verwendet man hierzu die üblichen semipermeablen Membranen, vor allem Cellophan,
z. B. Cellophanschläuche mit einem Porendurchmesser von 2,5 bis 8,0 mF, und dialysiert
gegen Leitungswasser und abschließend gegen destilliertes Wasser. Die rückständige
(nicht dialysierte) Lösung wird hierauf zweckmäßig konzentriert. Dies geschieht
vorteilhaft im Vakuum, möglichst in einem Schnellverdampfer oder nach dem System
der Lyophilisierung oder mittels einer Kombination dieser Methoden, wobei zunächst
mit einem Schnellverdampfer und hierauf mit einem Lyophilisator gearbeitet wird.
Der so gewonnene Extrakt enthält die Viscumsäure bzw. ihre Salze mit in Pflanzen
vorhandenen Metallen (z. B.
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Natrium, Calcium, Magnesium usw.) in angereicherter Form und besitzt
schon eine deutliche Antitumorwirkung.
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Zur Isolierung der Viscumsäure bzw. ihrer Salze kann man sich verschiedener
Methoden bedienen.
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Ein bevorzugter Weg ist die fraktionierte Fällung mittels mit Wasser
mischbaren organischen Lösungsmitteln. Solche sind vor allem Dioxan, niedere aliphatische
Alkohole, z. B. Glykole, wie Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Propylenglykol, Methoxyäthanol,
Diäthylenglykolmonomethyläther, Diäthylenglykolmonoäthyläther, Äthylenglykolmonoacet
at, Polyäthylenglykol, besondere Alkanole, wie Methanol oder Propanol, oder Ketone,
wie Alkylketone, z. B.
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Aceton oder Methyläthylketon, vor allem aber Äthanol. Die gewünschte,
die Viscumsäure bzw. ihre Salze enthaltende Fraktion läßt sich leicht an Hand ihrer
tumorhemmenden biologischen Eigenschaften feststellen. Mit Äthlyalkohol z. B. erhält
man die Viscumsäure durch Zugabe von Äthanol zu den wäßrigen Lösungen und Abtrennung
des bei einer Alkoholkonzentration von 55 bis 750/, erhaltenen Niederschlags. Das
Präzipitat läßt sich in üblicher Weise, z. B. durch Zentrifugieren abtrennen. Die
Fällung kann mehrmals wiederholt werden, wobei der Reinheitsgrad der Viscumsäure
bzw. ihrer Salze noch gesteigert werden kann. Die Fällungen können auch in Gegenwart
von Absorptionsmitteln, wie Diatomeenerde und ähnliche Adsorbentien, vorgenommen
werden, oder in Gegenwart eines starken Elektrolyten, um die Ausfällung zu erleichtern.
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Eine weitere Methode zur Isolierung der reinen Viscumsäure bzw. ihrer
Salze besteht in der elektrophoretischen Trennung. Diese wird in üblicher Weise
vorgenommen, wobei sich die gesuchte Fraktion wiederum durch ihre tumorhemmende
Wirksamkeit ermitteln läßt. Allgemein kann gesagt werden, daß sich die Viscumsäure
in der stehenden bzw. langsam anodisch wandernden Fraktion befindet, während die
schnell wandemden Fraktionen aus Ballaststoffen bestehen.
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Schließlich kann man die Viscumsäure auch durch Fällung der Begleitstoffe
mit einer quaternären Ammoniumverbindung reinigen. Hierzu verwendet man besonders
eine solche, die eine lange Kohlenstoffkette mit mehr als 8 Kohlenstoffatomen enthält,
z. B. Cetyl-trimethylammoniumchlorid, Cetyl-äthyldimethylammoniumchlorid, Cetyl-
dimethyl-benzyl ammoniumchlorid, Cetyl-pryridiniumchlorid, fl-Phenoxyäthyl-dimethyl-dodecylammoniumchlorid,
oder die entsprechenden Bromide, Jodide oder Hydroxyde.
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Gewisse Begleitstoffe bilden dabei schwerlösliche Komplexe mit der
quaternären Ammoniumverbindung, die in an sich bekannter Weise, z. B. durch Zentrifugieren,
abgetrennt werden können. Die Menge der zuzufügenden quaternären Ammoniumverbindung
kann in weiten Grenzen variiert werden, wobei lediglich zu beachten ist, daß nicht
ein allzu großer obere schuß zugegeben wird, da die entstehenden Komplexverbindungen
dann teilweise gelöst werden. Die entstandenen Komplexe werden dann durch Zentrifugieren
oder Filtrieren abgetrennt und das den Wirkstoff enthaltende Filtrat durch Dialyse
gegen destilliertes Wasser vom überschüssigen Ammoniumsalz befreit.
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Aus dem nicht dialysablen Teil wird durch Lyophilisation der reine
Wirkstoff gewonnen.
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Man kann auch Ammoniumverbindungen zum Fällen der Viscumsäure bzw.
ihrer Salze verwenden, sofern in einem Boratpuffer von etwa pH 10 gearbeitet wird.
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Je nach der Verfahrensweise erhält man die Viscumsäure in freier
Form oder als Salz oder als Mischung der beiden. Aus den Salzen kann die freie Viscumsäure
in üblicher Weise, z. B. mittels Kationenaustauschern oder mit Hilfe der Dialyse
gegen verdünnte Säuren, erhalten werden. Aus der freien Säure lassen sich in üblicher
Weise Metallsalze herstellen, z. B. von Alkali- oder Erdalkalimetallen.
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Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens;
bei denen obige Verfahren in beliebiger Form kombiniert und/oder durch weitere Reinigungsoperationen
oder Hilfsmittel ergänzt werden.
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Die Viscumsäure oder ihre Salze können als Heilmittel bei Krebserkrankungen
verwendet werden.
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Hierzu können sie z. B. in Form pharmazeutischer Präparate vorliegen,
die sie zusammen mit pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägerstoffen,
die für die parenterale Gabe geeignet sind, enthalten. Die pharmazeutischen Präparate
können z. B. als Trockenampullen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert
und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz-
oder Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmo tischen Druckes oder Puffer.
Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
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Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben.
Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
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Beispiel 1 8 kg reife Mistelbeeren zerquetscht man zwischen Steinwalzen
und verrührt sie anschließend in einem eisgekühlten Gefäß in 12 1 eiskaltem destilliertem
Wasser während 3 Stunden. Sehr intensives Rühren muß durch zwei gegenläufige Propellerrührer
(Taifun), deren Schaufeln jedoch nicht zu scharfkantig sein dürfen, gewährleistet
sein. Dabei geht der sehr zähe Schleim durch Quellung und mechanische Zerkleine-
rung
allmählich in Lösung. Man läßt kurze Zeit stehen, so daß sich die Beerenhäute und
-kerne absetzen können, und schöpft dann die viskose Lösung in eine nicht zu schnell
laufende Sackzentrifuge. Das Extraktionsgefäß und die Zentrifuge wird mit 3 bis
51 kaltem destilliertem Wasser nachgewaschen. Das von festen Partikeln befreite,
jedoch noch trübe Zentrifugat wird in zehn Cellophanschläuche abgefüllt und zuerst
gegen ein großes Volumen eiskaltes, kontinuierlich erneuertes Leitungswasser, anschließend
unter mindestens sechsmaligem Wechsel gegen jeweils 200 1 eiskaltes destilliertes
Wasser dialysiert.
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Das Dialysat wird verworfen, die nicht dialysablen Anteile (Schlauchinneres)
vereinigt und bei einer Lösungstemperatur von etwa 300 im Schnellverdampfer im Vakuum
auf 1,71 Volumen eingeengt.
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Durch Gefriertrocknung erhält man aus dieser hochviskosen Lösung 240
g eines fast farblosen flockigen Präparates (Präparat 22 303 D), das die Viscumsäure
in angereicherter Form enthält und eine gute Antitumorwirksamkeit zeigt, die es
während unbeschränkter Zeit beibehält.
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Beispiel 2 400 g Präparat 22303 D werden zur Isolierung der Viscumsäure
durch 3stündiges intensives Rühren in 6 1 eiskaltem destilliertem Wasser gelöst.
Dann werden 121 absoluter Alkohol über ein Zeitintervall von etwa 3 Stunden in die
gut gerührte Lösung eingetropft und noch 16 Stunden bei 0° weitergerührt. Den farblosen
flockigen Niederschlag läßt man absitzen und dekantiert anschließend die gelbe überstehende
Lösung, die Zucker und niedermolekulare Polysaccharide enthält, ab. Der Bodensatz
wird dann zentrifugiert und der Festkörper auf einer Glasfilternutsche mit 50 cm3
750/oigem wäßrigem Alkohol nachgewaschen. Darauf löst man den Rückstand durch intensives
Rühren in 1,5 1 destilliertem Wasser bei 0° auf und befreit die gebildete hochviskose
Lösung von ungelösten Schwebeteilchen durch Zentrifugieren (Laval-Zentrifuge). Die
klare Lösung wird durch Lyophilisation in 82 g eines farblosen flockigen Produktes
von hoher Antitumoraktivität übergeführt (Präparat 24 467 A). Dieses Produkt stellt
die Viscumsäure im Gemisch mit ihren in der Pflanze vorkommenden Metallsalzen dar.
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Beispiel 3 Das bei der Extraktion nach Beispiel 1 in der Sackzentrifuge
zurückbleibende Gemenge von Beerenhäuten und -kernen läßt sich durch Ausschlämmen
in die leichteren Häute und die spezifisch schwereren, grüngefärbten und ziemlich
harten Beerenkerne trennen. Man erhält auf diese Weise aus 8 kg Beeren etwa 400
g Kerne.
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Davon werden 100 g in 150 cm3 Wasser zerkleinert, durch eine Schicht
aus 40 g Diatomeenerde abgeschwungen, der Rückstand und das Filtermittel zweimal
mit 50 cm3 destilliertem Wasser nachgewaschen und das Filtrat der Dialyse unterworfen.
Man dialysiert zuerst gegen eiskaltes Leitungswasser, dann gegen eiskaltes destilliertes
Wasser (vgl. Beispiel 1).
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Der etwa 350 cm3 Volumen bildende nichtdialysable Anteil wird im Vakuum
unter sohonenden Bedingungen auf 40 cm3 eingeengt (enthaltend etwa 20 g Feststoffe).
Diese Lösung versetzt man gemäß Beispiel 2 unter gutem Rühren mit 80 cm3 absolutem
Alkohol und erhält dabei Präparat 25 236 A, ebenfalls ein Gemisch
von
Viscumsäure und ihren Salzen mit guter tumorhemmender Wirkung.
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Beispiel 4 Beim Sammeln der Mistelbeeren ist wiederholt eine Infektion
des Materials mit Mikroorganismen (z. B.
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Heubacillus usw.) beobachtet worden. Die Herstellung von keimfreien
Präparaten läßt sich durch Zwischenschaltung einer Behandlung mit Formaldehyd an
geeigneter Stelle des Anreicherungsvertahrens z. B. wie folgt durchführen: 400 g
Präparat 22303 D (vgl. Beispiel 1) werden durch intensives 3stündiges Rühren bei
0° in 6 1 destilliertem Wasser in Lösung gebracht, von geringen Mengen ungelöster
Schwebestoffe durch Zentrifugieren befreit und die Viscumsäure durch Zutropfen von
121 absolutem Alkohol während 3 Stunden und anschließendem Weiterrühren bei 0° während
16 Stunden ausgefällt. Die Abtrennung des Niederschlages vom gelben Filtrat geschieht
in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise.
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Der Rückstand wird anschließend in 21 destilliertem Wasser durch intensives
Rühren gelöst, mit 50 cm3 (40 Volumprozent) Formalinlösung versetzt und 24 Stunden
bei Zimmertemperatur stehengelassen.
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Dann wird die Lösung gegen das 10fache Volumen destilliertes Wasser
unter häufigem Wechsel so lange dialysiert, bis das Dialysat keinen nach C H2 0
riechenden Rückstand mehr bildet. Die sterile Lösung des nicht dialysablen Anteils
wird in einer sterilen Apparatur lyophilisiert, wobei man 82 g flockiges blendend
weißes Präparat 26327 erhält, das ein Gemisch von Viscumsäure und ihren Metallsalzen
darstellt und frei von lebenden Mikroorganismen ist.
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Beispiel 5 20 g der gemäß Beispiel 1 erhaltenen angereicherten Viscumsäure
werden mit 300 cm3 destilliertem Wasser während l/2 Stunde geschüttelt und zur Entfernung
der Trübung durch 5 g Diatomeenerde filtriert und das Filter nachgewaschen. Die
Waschwasser werden zur Lösung gegeben, und man erhält ein Volumen von total 320
cm5. Nach Zugabe von 20 g Diatomeenerde werden in diese Lösung unter gutem Rühren
590 cm3 absoluter Alkohol in feinem Strahl eingegossen und noch 15 Minuten weitergerührt.
Man läßt das mit dem Präzipitat beladene Adsorbens absitzen und filtriert dann durch
ein Sintergiasfilter.
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Dem Rückstand wird das Polysaccharidmaterial durch Wasserextraktion
entzogen.
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Das Filtrat besitzt ein Volumen von etwa 900 cm3 und wird wiederum
mit 20 g Diatomeenerde versetzt.
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Dann werden in der oben beschriebenen Weise erneut 370 cm8 absoluter
Alkohol eingerührt und die Fällung abgenutscht. Zur Gewinnung der Polysaccharidfraktion
wird der Rückstand mit Wasser extrahiert.
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Das Filtrat wird nun auf dem Rotationsverdampfer im Vakuum auf ein
Volumen von 200 cms eingeengt und aus der wäßrigen Lösung nach Zugabe von 20 g Diatomeenerde
durch Einrühren von 800 cm3 absolutem Alkohol eine weitere Polysaccharidfraktion
gefällt. Es wird durch eine Glasfilternutsche G 3 abfiltriert, wobei ein gelbes,
klares Filtrat zurückbleibt, das praktisch keine Polysaccharide mehr enthält. Der
Rückstand wird wie bei den oben beschriebenen Fällungen dreimal mit je 100 cm3 destilliertem
Wasser ausgeschüttelt, durch eine Glasfilternutsche abfiltriert und mit Wasser nachgewaschen.
Durch Lyophilisation
gewinnt man aus dem wäßrigen Extrakt ein farbloses flockiges
Pulver. Nachstehende Tabelle gibt die Mengenverhältnisse der einzelnen Fällungen
an: 1. Fällung: Alkoholkonzentration 65 0/o: Rückstand 3 g 2. Fällung: Alkoholkonzentration
75 0lo: Rückstand 2,9 g 3. Fällung: Alkoholkonzentration 80 0/o: Rückstand 3,9 g
Nichtfällbare Restlösung (niedermolekulare Anteile) 4,5 g Die erhaltenen Präzipitate
werden einzeln gelöst und wieder nach den drei Alkoholkonzentrationen 65, 75 und
80O/& gefällt. Man vereinigt dann alle Präzipitate von 650/0 Alkoholgehalt,
alle von 75 ovo und alle von 80°/o. Wird diese fraktionierte Fällung und selektive
Vereinigung aller gleichartigen Fraktionen ein drittes Mal wiederholt, so erhält
man Präparate von Polysacchariden, die nach fallendem Molekulargewicht diffenziert
sind. Das Präzipitat bei 650/0 Alkoholgehalt stellt die Viscumsäure im Gemisch mit
ihren Metallsalzen in hochgereinigter Form dar, während das Präzipitat bei 75 756/o
Alkoholgehalt neben Viscumsäure und ihren Salzen noch Ballaststoffe enthält und
das Präzipitat bei 80°/o praktisch unwirksam ist, d. h. keine Viscumsäure enthält.
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Beispiel 6 4 kg Mistelbeeren werden in einer hydraulischen Presse
mit einem Druck von 100 t ausgepreßt und der Preßkuchen mit wenig destilliertem
Wasser nachgewaschen. Man erhält dabei etwa 41 Preßsaft. Dieser wird, wie im Beispiel
1 beschrieben, in Cellophanschläuchen gegen destilliertes Wasser dialysiert und
der nicht dialysable Anteil wie im Beispiel 1 auf angereicherte Viscumsäure verarbeitet.
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Beispiel 7 49 g Misterbeerenkerne werden in der im Beispiel 3 beschriebenen
Weise extrahiert, wobei man 10 g Trockenextrakt (Lyophilisat) erhält. Davon werden
4 g in 70 cm3 Wasser gelöst und in einem Cellophanschlauch gegen destilliertes Wasser
erschöpfend dialysiert. Aus dem nicht dialysierbaren Anteil erhält man durch Lyophilisation
0,85 g Präparat 20 101 B2, als farbloses flockiges Produkt, das ein angereichertes
Gemisch von Viscumsäure und Salzen davon darstellt.
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Dieses Gemisch kann wie folgt auf hochgereinigte Viscumsäure aufgearbeitet
werden: Eine Lösung von 240 mg der Substanz in 50 cm3 Borat-Salzsäurepuffer vom
pH 8,51 (nach Sörensen) werden in einer Tiselius-Apparatur bei einer Spannung von
260V (Stromstärke 52 mA) und einer Temperatur von 3,5 bis 50 während 61/2 Stunden
der Elektrophorese unterworfen. Dabei wird nur der anodenseitig liegende Schenkel
mit der Substanz beschickt. Es lassen sich folgende drei verschiedene Komponenten
unterscheiden: erstens eine rasch anodisch wandernde, zweitens eine langsam anodisch
wandernde und drittens eine sich nicht vom Ursprungsort fortbewegende. Durch etwa
2stündliche Entnahme lassen sich die entsprechenden Fraktionen isolieren. Die Viscumsäure
befindet sich in der stehenden
Fraktion, während die beiden anderen
Fraktionen unwirksam sind. Durch Dialyse gegen destilliertes Wasser und Lyophilisation
gewinnt man die Viscumsäure.
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Beispiel 8 1,35 g des nach Beispiel 1 gewonnenen Präparates 22303
D, gelöst in 40 cm3 Borat-Salzsäurepuffer vom p, 8,51 (nach Sörensen), werden in
einer schnell laufenden Zentrifuge von Schwebeteilchen befreit und in einem durch
Mischen von Borat-Salzsäurepuffer (Pa 8,51) mit konzentrierter Rohrzuckerlösung
erzeugten Dichtegradienten der Elektrophorese unterworfen. Dabei befindet sich die
Kathode oben und die Anode unten in der Kolonne. Im UV-Licht können vier schwach
fluoreszierende Zonen unterschieden werden. Sie werden nach Abschluß der Operation
einzeln aus der Säule herausgenommen und durch erschöpfende Dialyse gegen destilliertes
Wasser in Cellophanschläuchen von den niedermolekularen Beimischungen befreit. Der
nicht dialysable Anteil wird jeweils durch Lyophilisation in ein Trockenpulver übergeführt.
Es lassen sich folgende Fraktionen abtrennen:
| Tumorhemmende |
| Zone | Verhalten im el. Feld | Wirkung |
| 1 sehr rasch inaktiv |
| anodisch wandernd |
| 2 rasch stark aktiv |
| anodisch wandernd . Viscum- |
| 3 langsam stark aktiv säure |
| anodisch wandernd |
| 4 stehend wenig Material |
Beispiel 9 Eine Lösung von 5 g Präparat 26 327, erhalten nach Beispiel4, gelöst
in 20 cm3 Wasser, läßt man sukzessive durch einen basischen Ionenaustauscher (Dowex'
1 8, OH-Form; 20 ml) und einen sauren Ionenaustauscher (Dowexe 50 8, H-Form; 20
ml) laufen, wobei jeweils mit etwa 75 cm3 destilliertem Wasser nachgewaschen wird.
Die auf diese Weise von anorganischen Ionen befreite Polysaccharidlösung wird anschließend
in einem Kammer-Rührdialysator kontinuierlich gegen 60 1 destilliertes Wasser während
70 Stunden dialysiert und zum Schluß in der Ultrazentrifuge (U = 12590 je Minute
während 35 Minuten) von einer kleinen Menge Schwebeteilchen befreit.
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Aus der klaren Lösung erhält man durch Lyophilisation ein flockiges
seidenglänzendes Präparat der freien Viscumsäure, Präparat 28 316.
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Die freie Viscumsäure zeigt die gleichen tumorhemmenden Eigenschaften
wie das Gemisch von Säure und ihren Salzen. Sie ist jedoch analytisch besser zu
charakterisieren. Sie besitzt die eingangs gezeigten physikalischen Eigenschaften.
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Beispiel 10 In einem Kammer-Rührdialysator mit Cellophanmembranen
wird eine Lösung von 1 g Präparat 26327 in 20 cm3 Wasser kontinuierlich dialysiert,
zuerst gegen 20 1 0,01 n-Salzsäure, dann gegen 201 destilliertes Wasser (bis keine
Na- und Cl-Ionen mehr nachweisbar sind). Dann wird der nicht dialysable Anteil
herausgenommen
und lyophilisiert. Man erhält ein farbloses seidenglänzendes Präparat der Viscumsäure
(Präparat 28 316).
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Beispiel 11 12,7 g Präparat 22 303 D (vgl. Beispiel 1) werden durch
4stündiges Schütteln in 150 cm3 Wasser gelöst.
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Dann trennt man durch Zentrifugieren die noch vorhandenen Schwebeteilchen
ab. In die 150 cm3 umfassende wäßrige Lösung werden darauf unter gutem Rühren und
Kühlung im Eisbad 300 cm3 Aceton eingetropft, worauf nach Zugabe von 10 g Diatomeenerde
noch während einer Stunde bei 0° weitergerührt wird. Das Präzipitat läßt sich durch
eine Glasfilternutsche leicht abtrennen. Man wäscht nach mit 700/obigem wäßrigem
Aceton. Dann wird das gefällte hochmolekulare Material durch wiederholtes Ausziehen
des Rückstandes mit destilliertem Wasser in Lösung gebracht, und man erhält durch
Lyophilisation der klaren Lösung 6,0 g eines gereinigten Präparates von Viscumsäure
im Gemisch mit ihren Metallsalzen.
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Beispiel 12 2 g Präparat 22300 A, ein dem Präparat 22303 D entsprechendes
Rohprodukt, das durch Klärfiltration mittels Diatomeenerde zusätzlich gereinigt
worden ist, wird in 40 cm3 Wasser gelöst. Dann tropft man unter Rühren und Kühlen
mit Eis 5 cmS einer 200/eigen Lösung von p-Phenoxyäthyl-dimethyl-dodecylammoniumchlorid
ein. Nach mehrtägigem Stehen bei tiefer Temperatur (00) setzt sich die anfänglich
starke Trübung zu einem flockigen Niederschlag ab, der sich durch Filtration abtrennen
läßt. Das Filtrat unterwirft man der Dialyse gegen destilliertes Wasser in einem
Cellophanschlauch. Der Schlauchinhalt wird lyophilisiert, und man erhält 1,15 g
eines farblosen, flockigen Produktes, das Viscumsäure im Gemisch mit seinen Salzen
darstellt.
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Beispiel 13 2,0 g Präparat 26 327 werden unter Rühren in destilliertem
Wasser gelöst und das Volumen auf 21 aufgefüllt. Die Lösung wird durch ein Membranfilter
(Membranfilterges. Göttingen Nr. 6) steril filtriert. Je 2,5 cm3 dieser Lösung werden
in Phiolen von 10 cm3 Fassungsvermögen abgefüllt, unter aseptischen Bedingungen
bei - 400 eingefroren, bei einer Endtempetur von + 200 lyophilisiert und sofort
verschlossen.
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Dabei ist zu beachten, daß das Präparat keiner starken UV-Bestrahlung
ausgesetzt wird, solange es sich in wäßriger Lösung befindet. Im Trockenzustand
ist es weniger empfindlich gegen UV-Licht.
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Spaltung der Viscumsäure 50 mg Viscumsäure (Präparat 28 316) werden
in 1. cm3 850/oiger Ameisensäure gelöst, in einem Glasrohr eingeschmolzen und während
2 Stunden auf 1100 erhitzt. Dann wird die Ameisensäure im Vakuum abgedampft und
die letzten Spuren durch mehrmaliges Abdampfen mit absolutem Alkohol entfernt. Anschließend
wird das Hydrolysat an Papier chromatographiert (Systeme: n-Propanol-Äthylacetat-Wasser
7 : 1: 2 und Äthyiacetat-Pyridin-Wasser 2: 1 : 2). Es lassen sich hauptsächlich
Galactose und Arabinose, daneben auch wenig Rhamnose und eine Uronsäure, möglicherweise
Glucuronsäure feststellen.
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50 mg Viscumsäure (Präparat 28316) werden in 3 cm3 n-Schwefelsäure
gelöst, in einem Glasrohr eingeschmolzen und während 4 Stunden auf 1100 erhitzt.
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Nach dem Abkühlen wird von einigen ungelösten Flocken abfiltriert
und das Filtrat mit 7 cm3 gesättigter Bariumhydroxydlösung (etwa 0,2 bis 0,3normal)
bis zum Kongorot-Umschlagspunkt neutralisiert und anschließend durch Zugabe einer
Spatelspitze Bariumcarbonat auf pH etwa 7 gebracht. Der Bariumsulfatniederschlag
wird durch eine dünne Schicht Diatomeenerde filtriert, der Filterrückstand mit 20
cm3 Wasser ausgekocht und der wäßrige Extrakt mit dem ersten Filtrat vereinigt und
im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Papierchromatogramm wird in den oben beschriebenen
Systemen durchgeführt. Als Hauptbestandteile der Vis cumsäure werden identifiziert:
Galactose, Arabinose, Rhamnose und wahrscheinlich eine Aldobiuronsäure.
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200 mg Viscumsäure (Präparat 28 316) werden in 10 cm3 12°/oiger Salzsäure
gelöst und bei einer Ölbadtemperatur von 140 bis 1500 im Stickstoffstrom während
5 Stunden am Rückfluß gekocht. Die freigesetzte Kohlensäure wird in Bariumhydroxydlösung
aufgefangen und das ausgeschiedene Bariumcarbonat gut getrocknet und gewogen. Man
erhält 27 mg Bariumcarbonat, was etwa 6 mg Kohlendioxyd entspricht und ein Äquivalentgewicht
von etwa 1500 bezüglich 1 Mol Uronsäure ergibt.
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50 mg Viscumsäure (Präparat 28 316) werden in 3 cm5 destilliertem
Wasser gelöst, in ein Glasrohr eingeschmolzen und während 4 Stunden auf 1100 erhitzt.
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Nach dem Abkühlen wird von einigen ungelösten Flocken abfiltriert
und das Hydrolysat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Papierchromatogramm ergibt
folgendes Bild: Vom Molekül der Viscumsäure wird hauptsächlich nur Arabinose abgespalten.
Weiter findet man einen schwachen Fleck, der auf 2-Desoxygalactose zurückgeführt
werden könnte.
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50 mg Viscumsäure (Präparat 28 316) werden in 3 cmS n-Schwefelsäure
gelöst und im verschlossenen Gefäß im Dunkeln während einer Woche bei Zimmer temperatur
stehengelassen. Die Schwefelsäure wird dann mit Bariumhydroxyd und Bariumcarbonat
wie oben beschrieben entfernt, und man erhält beim Papierchromatogramm des Hydrolysates
von Viscumsäure die gleichen Bilder wie bei der oben beschriebenen Heißwasserhydrolyse.