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Verfahren zur Herstellung von neuen Staphylococcen-Antigenen Die vorliegende
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von Polysaccharid-Verbindungen,
die imstande sind, gegen Staphylococceninfektionen zu immunisieren.
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Gemäß der Erfindung kann das Antigen gewonnen werden, indem man immunogenes
Protoplasma von gewissen Stämmen von Staphylococcus aureus mit einer wäßrigen Säure
bei einem pH-Wert von etwa 4 oder niedriger extrahiert und die Feststoffe von der
Lösung abtrennt, wodurch man eine wäßrige Lösung erhält, die das Polysaccharid enthält.
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Die besonderen Stämme von Staphylococcus aureus, die verwendet werden
können, sind solche, die die morphologische Eigenschaft aufweisen, daß sie lose
zusammenhängende, diffuse, halbopake Kolonien bilden, wenn man sie in einem halbfesten
oder weichen Agar-Kulturmedium züchtet, das Plasma, Serum und deren Proteinkomponenten
enthält. Dies ist eine hochcharakteristische Eigenschaft, da die große Mehrzahl
von Stämmen von Staphylococcus aureus unter den gleichenWachstumsbedingungen dichte,
kompakte, opake, zusammenhängende Kolonien bildet und als Quelle für das Verfahren
nach der Erfindung ungeeignet sind. Einige Beispiele von einzelnen Stämmen von Staphylococcus
aureus, die verwendet werden können, sind UC 76, Smith, S193N4, H & D, Castellani,
MCD 138, SK 4473, K 6, K 93 und K 93 M.
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Von diesen Stämmen werden die Stämme K 93 M, MCD 138, S193N4 und UC
76 bevorzugt. Alle diese Stämme von Staphylococcus aureus wurden niedergelegt in
der Kultursammlung von Parke, Davis & Company in Detroit, Michigan, und in der
Kultursammlung des Fermentation Laboratory, Northern Utilization Research and Development
Division, U. S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, unter den in der
nachstehenden Tabelle angegebenen Nummern.
Parke, Northern Utilization |
Stamm Davis & Co. Research Laboratory |
Sammlung Nr. Sammlung Nr. |
UC 76 05068 NRRL B-2467 |
Smith 05067 NRRL B-2468 |
S 193 N 4 05089 NRRL B-2469 |
H & D 05087 NRRL B-2471 |
Castellani 05088 NRRL B-2472 |
MCD 138 05085 NRRL B-2473 |
SK 4473 05086 NRRL B-2474 |
K 6 05090 NRRL B-2475 |
K93 05091 NRRLB-2476 |
K 93 M 05092 NRRL B-2477 |
Das als Ausgangsmaterial beim Verfahren der Erfindung verwendete immunogene Protoplasmamaterial
kann aus intakten Zellen des speziellen Organismus oder aus Zellbruchstückenbestandteilen
oder einem Abwandlungsprodukt mit immunogenen Eigenschaften bestehen. Wenn das immunogene
Protoplasmamaterial aus intakten Zellen besteht, können diese entweder lebend, d.
h. imstande sein, sich zu vermehren, oder abgetötet sein, d. h. nicht imstande sein,
sich zu vermehren, oder ein Gemisch von beiden. Das genaue Verfahren, wie es zur
Erzeugung von abgetöteten oder partiell abgetöteten Staphylococcen angewendet wird,
ist nicht kritisch.
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Einige Arbeitsweisen, die verwendet werden können, sind eine Behandlung
mit Wärme von etwa 600 C für 1 bis 1/2 Stunde, mit p-Propiolacton (0,1 bis 0,2 0/o
bei 37"C 2 Stunden) und mit Phenol (1 0/o bei 25"C für etwa 18 Stunden).
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Weitere Beispiele von immunogenem Protoplasmamaterial, wie es als
Ausgangsmaterial beim Verfahren nach der Erfindung Verwendung findet, sind immonugene
Massen, die aus Zellen der besonderen Stämme von Staphylococcus aureus durch eine
physikalische
oder chemische Behandlung erhalten werden, durch die
die Zelle zerrissen wird, ohne daß die immunogenen Eigenschaften in wesentlichem
Ausmaß verlorengehen.
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Einige Beispiele von solchen zusätzlichen immunogenen Plasmamaterialien,
wie sie als Ausgangsmateria beim Verfahren nach der Erfindung geeignet sind, sind
Zellenbruchteile, wie sie durch mechanisches Zerreißen von intakten Zellen entsteben,
das phenolunlösliche, wasserunlösliche, feste Material, wie es bei der Extraktion
von intakten Zellen mit Phenol oder einem wäßrigen Lösungsmittel anfällt, und die
wasserunlösliche Fraktion, wie sie durch Extraktion von intakten Zellen mit Phenol
und einem wäßrigen Lösungsmittel erhalten wird.
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Bei der Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung wird die Behandlung
des immunogenen Protoplasmamaterials mit einer wäßrigen Säure bei einem pH-Wert
von etwa 4 oder weniger durchgeführt mit einer beliebigen Säure aus einer Vielzahl
von organischen oder anorganischen Säuren. Einige Beispiele der zahlreichen verwendbaren
Säuren sind wäßrige Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Monochloressigsäure,
Trichloressigsäure und Salzsäure. Jedoch werden die Zeit und die Temperatur der
Behandlung mit den wäßrigen Säuren im Hinblick auf die spezielle Stärke der verwendeten
Säure eingestellt, so daß das Ausgangsmaterial in das gewünschte Polysaccharid umgewandelt
wird, ohne übermäßige Hydrolyse zu einzelnen Sacchariden. Im allgemeinen wird bei
einer Arbeitsweise bei einem pH-Wert von 2 bis 4 die Suspension oder Lösung des
Ausgangsmaterials erhitzt, während, wenn man bei einem pH-Wert unter 2, insbesondere
in Gegenwart von Mineralsäuren und anderen starken Säuren, wie Trichloressigsäure,
arbeitet, die Behandlung vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Obgleich
eine kurze Behandlung bei pH-Werten unter O angewendet werden kann, sind solche
Bedingungen nicht zu empfehlen, da sie weitergehende Hydrolyse des gewünschten Produktes
verursachen. Ein Beispiel einer bevorzugten Säure ist eine verdünnte Essigsäure.
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Zum Beispiel arbeitet man bei Bedingungen unter Verwendung dieser
Säure, indem man die Suspension und die Lösung des Ausgangsmaterials in O,ln-Essigsäure
5 bis 60 Minuten unter Druck auf etwa 121"C erhitzt, obgleich eine beträchtliche
Abweichung von diesen speziellen Reaktionsbedingungen ebenfalls befriedigende Ergebnisse
liefert.
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Nach der Behandlung mit wäßriger Säure bei einem pH-Wert von etwa
4 oder niedriger liegt das gewünschte Produkt in der wäßrigen Lösung vor. Die wäßrige
Lösung wird abgekühlt, falls notwendig, und von etwaigen unlöslichen Resten abgetrennt,
was durch Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren und ähnliche Arbeitsweisen geschehen
kann.
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Die auf diese Weise erhaltene wäßrige Lösung enthält das Polysaccharid
und kann als Impfprodukt oder zur Isolierung des gereinigten Polysaccharids verwendet
werden. Für die Verwendung als Impflösung wird der pH-Wert eingestellt, um die Lösung
für die Injektion brauchbar zu machen. Normalerweise wird der pH-Wert auf etwa 6
bis 8, vorzugsweise auf etwa 7,2, eingestellt. Wenn die Impflösung nicht isotonisch
ist, ist es vorzuziehen, sie durch Zugabe von Natriumchlorid isotonisch zu machen.
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Das fertige Impfprodukt kann nach zahlreichen Arbeitsmethoden steril
gemacht werden. Zum Beispiel kann es durch Wärme, Ultraviolettbestrahlung oder
durch
Zugabe von chemischen Schutzstoffen sterilisiert werden. Es ist vorzuziehen, der
fertigen Vaccine einen chemischen Schutzstoff zuzusetzen. Einige geeignete Schutzstoffe
sind Thimerosal (1:10000), Benzethoniumchlorid (1: 20 000) oder Phenol (0,2°/o).
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Eine Klärung durch eine Filtration durch ein Seitz-Filter kann ebenfalls
angewendet werden.
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Impflösungen, die das Polysaccharid enthalten und wie oben ausgeführt
hergestellt sind, erzeugen bei parenteraler Verabreichung eine hohe Immunität nicht
nur gegen eine Infektion durch den Stamm von Staphylococcus aureus, der bei ihrer
Herstellung verwendet wurde, sondern auch durch eine Infektion durch andere Stämme
von Staphylococcus aureus.
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Weiter werden gemäß der Erfindung das Polysaccharid und seine Salze
aus der beschriebenen wäßrigen Lösung, wie sie bei der wäßrigen Säurehydrolyse anfällt,
sowie aus der oben beschriebenen Impflösung durch Isolierung und Reinigung erhalten.
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Das Polysaccharidprodukt wird durch Entfernung des Wassers aus der
wäßrigen Lösung oder der Impflösung als rohe feste Substanz erhalten. Vorzugsweise
werden die wäßrigen Lösungen oder die Impflösung nach einer Dialyse gefroren und
dann in gefrorenem Zustand getrocknet, wodurch man ein festes Rohprodukt mit einem
UV-Absorptionsmaximum bei etwa 250 bis 261 Millimikron erhält auf Grund des Vorhandenseins
von Nucleinsäuren als Verunreinigung. Das Polysaccharidprodukt wird gereinigt durch
Chromatographie, durch Bildung eines unlöslichen quaternären Ammoniumkomplexes,
durch Ausfällen der Verunreinigung mit einem Alkohol, insbesondere einem niederen
Alkohol, z. B. Äthanol, in Gegenwart von Salzen, wie Natriumacetat oder Natriumsulfat,
oder durch Kombination dieser Arbeitsweisen.
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Für eine chromatographische Reinigung wird die wäßrige Lösung des
Polysaccharids durch eine Säule aus aktiver Kohle geleitet und das erhaltene aktive
Produkt durch Eindampfen oder Lyophilisierung des Ablaufes gewonnen.
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Zur Reinigung durch Bildung eines unlöslichen quaternären Ammoniumkomplexes
wird eine wäßrige Lösung des Polysaccharids mit einem langkettigen quaternären Ammoniumsalz,
z. B. Cetylpyridiniumchlorid oder Cetyltrimethylammoniumbromid, umgesetzt. Bei richtiger
Kontrolle des pH-Wertes und der Ionenstärke scheidet sich ein unlöslicher quarternärer
Ammonium-Polysaccharid-Komplex ab (vgl. G Ii c »Methods of biochemical Analysis«,
Bd. 8, S. 145 bis 197). Der unlösliche Komplex wird dann in Calciumchloridlösung
gelöst, und das Polysaccharid wird durch Zugabe von Äthanol ausgefällt. Das Produkt
kann dann erneut gefällt werden, sooft man will, durch Wiederauflösung in Wasser
und Zugabe von Äthanol. Bei Durchführung der Reinigung durch Bildung eines unlöslichen
quaternären Ammonium-Polysaccharid-Komplexes ist es ratsam, zunächst Nucleinsäuren
zu entfernen, da diese Verbindungen unter bestimmten Bedingungen mit den angesäuerten
Polysacchariden gemeinsam ausfallen. Die Entfernung der Nucleinsäuren kann erreicht
werden, indem man die Polysaccharidlösung mit neutralisierter Diatomeenerde oder
aktiver Kohle vorbehandelt, bis das zurückbleibende Bodenprodukt nur eine geringe
oder keine Absorption in Ultraviolett zeigt.
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Zur Reinigung durch Ausfällung von Verunreinigungen mit einem Alkohol
wird ein Alkohol in ausreichender Menge zugefügt, um die Hauptmenge der
Verunreinigungen
ohne Ausfällung einer wesentlichen Menge des gewünschten Polysaccharids zu bewirken.
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Für optimale Ergebnisse müssen die Konzentrationen des Polysaccharids
der zugefügten Salze und des Alkohols sorgsam geregelt werden. Befriedigende Ergebnisse
erhält man durch die Zugabe von 5 bis 10 Volumen absolutem Äthanol zu der 0,l5molaren
Natriumsulfatlösung mit nicht mehr als etwa 5 mg/ccm Polysaccharid. Die ausgefällten
Verunreinigungen werden dann z. B. durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt.
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Im Anschluß an die Reinigung durch Chromatographie, durch quaternäre
Ammoniumkomplexbildung oder durch Ausfällung von Verunreinigungen mit einem Alkohol
liegt das Polysaccharid normalerweise in Salzform in wäßriger - Lösung vor und wird
als gereinigte weiße feste Masse durch Dialyse der Lösung und Eindampfen oder Lyophilisierung
isoliert.
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Die durch Lyophilisierung erhaltenen Produkte sind teilweise wasserhaltig
und werden normalerweise in dieser Form für physikalische, chemische und biologische
Messungen und Anwendungen verwendet.
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Ein gründlich getrocknetes Produkt erhält man durch Trocknen bei 50"C,
und dieses wird normalerweise für Mikroelementaranalysen und gelegentlich für weitere
Untersuchungen verwendet. Und wenn nichts anderes angegeben ist, beziehen sich diese
Daten der Beschreibung auf lyophilisierte, nicht aber anderweitig getrocknete Proben.
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Bevorzugte Ausgangsstoffe für die immunogenen Protoplasmastoffe sind
intakte Zellen der besonderen Stämme von Staphylococcus aureus und das phenolunlösliche,
wasserunlösliche feste Material, wie es durch Extraktion der besonderen Stämme von
Staphylococcus aureus mit Phenolen und wäßrigen Lösungsmitteln erhalten wird. Diese
Ausgangsstoffe ergeben bei einer hohen Reproduzierbarkeit eine hohe Ausbeute des
gewünschten Polysaccharids von ausreichender Reinheit.
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Intakte Zellen, die als Ausgangsmaterial verwendet werden, können
entweder lebende, abgetötete oder partiell abgetötete Zellen sein. Wenn abgetötete
oder partiell abgetötete Zellen verwendet werden, können sie, wie oben angegeben,
mit Hilfe einer Behandlung mittels Wärme, B-Propiolacton oder Phenol hergestellt
sein.
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Das phenolunlösliche, wasserunlösliche, feste Material, wie es als
Ausgangsmaterial verwendet wird, kann durch Extraktion von lebenden oder abgetöteten
Zellen der speziellen Stämme von Staphylococcus aureus mit Phenol und Verwendung
des unlöslichen Rückstands erhalten werden. Gewöhnlich werden die speziellen Stämme
von Staphylococcus aureus mit einem wäßrigen Lösungsmittel sowie mit Phenol extrahiert,
und es wird in beiden Lösungsmitteln die feste, unlösliche Fraktion verwendet.
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Die beiden Extraktionen können entweder gleichzeitig oder, was vorzuziehen
ist, getrennt durchgeführt werden, indem man zunächst die Phenolextraktion vor der
Extraktion mit einem wäßrigen Lösungsmittel vornimmt.
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Das für die Extraktion verwendete wäßrige Lösungsmittel ist vorzugsweise
Wasser, obgleich auch physiologisch verträgliche wäßrige Salzlösungen, wie physiologische
Salzlösungen, Hanksche ausgeglichene Salzlösung u. ä. verwendet werden können. Wenn
beide Extraktionen gleichzeitig durchgeführt werden, muß ausreichend Phenol verwendet
werden, um eine Phenol-
phase zu bilden, aber unzureichend, um alles vorhandene wäßrige
Lösungsmittel zu lösen. Wenn die Phenolextraktion vor der Extraktion mit einemwäßrigen
Lösungsmittel durchgeführt wird, muß die Phenolphase hinreichend Wasser enthalten,
um das Phenol flüssig zu halten, aber auch unzureichend Wasser, um die Abtrennung
einer besonderen wäßrigen Phase zu bewirken, d. h. zwischen etwa 5 und 30°/e Wasser
aufweisen. Da die intakten Zellen von Staphylococcen, die als Ausgangsmaterial verwendet
werden, feucht sind und Wasser enthalten, ist es im allgemeinen nicht notwendig,
sehr viel Wasser zum Phenol zuzugeben, um es zu verflüssigen. Die normale und bevorzugte
Arbeitsweise besteht darin, Phenol zu verwenden, das am Ende nicht mehr als etwa
150/o Wasser enthält. Nach der Extraktion mit Phenol und einem wäßrigen Lösungsmittel
enthalten die Zellenbruchstücke, die in Phenol und in Wasser unlöslich sind, das
Polysaccharid.
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Die Polysaccharidverbindung, die nach dem Verfahren nach der Erfindung
hergestellt wird, ist eine hochmolekulare Substanz, die viele einzelne Saccharideinheiten
enthält. Das Polysaccharid enthält Carboxylgruppen und kann daher als freie Säure
vorliegen sowie in Form zahlreicher Salze, z. B. als Natrium-, Kalium-, Calcium-,
Magnesium-, Ammonium- und Aminsalz oder als deren Gemisch. Die Form der freien Säure
und die einfachen Salzbildungen haben ähnliche chemische, physikalische und biologische
Eigenschaften und sind bei geeigneten pH-Bedingungen leicht ineinander umwandelbar
und werden daher für die Zwecke dieser Erfindung als äquivalent angesehen; falls
nicht anderweitig bemerkt, wird kein Unterschied zwischen dem Polysaccharid als
Säure und der Form seines einfachen Salzes gemacht.
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Allgemeine Charakterisierung Das Polysaccharid ist weiß, wasserlöslich,
wärmebeständig und nicht dialysierbar. Es enthält Carboxylgruppen und enthält als
freie Säure nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff.
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In Form der freien Säure und einfacher Salze ist es stark linksdrehend.
Die spezifische Drehung entsprechend der freien Säure, getrocknet auf konstantes
Gewicht bei 50° C, beträgt [a] 203 = 79,40 in wäßriger Lösung. Durch Mikro analyse
von getrockneten Proben und Äquivalentgewichtsmessungen ergibt sich die empirische
Formel der freien Säure zu C,9H33N3O13.
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Das Polysaccharid ist polymerer Natur und besitzt ein sehr hohes Molekulargewicht.
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Spektroskopische Charakterisierung Die Zeichnungzeigtdas Infrarotabsorptionsspektrum
des Polysaccharids als freie Säure in- einer Kaliumbromidscheibe. Infrarotabsorptionsmaxima
erscheinen bei 2,95, 3,22, 3,33, 3,37, 5,73, 6,00, 6,43, 6,96, 7,24, 7,61,8,04,8,77,9,49,
10,83, 11,13 und 11,52 Mikron.
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Die Salzformen haben ebenfalls charakteristische Absorptionsspektra,
wie beschrieben ist in dem Experimentalabschnitt.
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Das Polysaccharid besitzt keine selektive Absorption in Ultraviolett.
Jedoch sind Messungen der Ultraviolettabsorption nützlich, um das Vorhandensein
von Verunreinigungen, wie Nucleinsäuren, zu bestimmen, die in Ultraviolett eine
charakteristische Absorption aufweisen.
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Chemisches Verhalten Das Polysaccharid gibt negative Molisch- und
Anthrontests, was anzeigt, daß die üblichen Hexosen und Pentosen nicht vorhanden
sind. Tests auf Sialin-und einfache Uronsäuren sind negativ. Nach einer Hydrolyse
wird ein positiver Elson-Morgan-Test erhalten, was anzeigt, daß das Hydrolyseprodukt
ein oder mehrere Aminosaccharide enthält. Durch Erhitzen mit Diphenylamin und Essigsäure-Schwefelsäure-Gemischen
(Dischs Test) erhält man ein Produkt mit einer blauen Farbe mit einem Absorptionsmaximum
bei 575 Millimikron. Die Empfindlichkeit dieses Tests ist verhältnismäßig gering,
und Verunreinigungen können stören. Durch Erhitzen in 79 0/0iger Schwefelsäure 15
Minuten bei 1100 C wird eine Lösung mit einem einzelnen Ultraviolettabsorptionsmaximum
bei 290 Millimikron erzielt.
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Das Polysaccharid zeigte keine merkliche Aufnahme von Perjodat unter
Standardbedingungen, was eine hochsubstituierte Struktur anzeigt.
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Durch Reaktion mit verdünnter methanolischer Salzsäure oder Diazomethan
wird das Polysaccharid in einen Methylester umgewandelt. Die Methylestergruppierung
wird in einen Alkohol durch Reduktion mit Natriumborhydrid in Natriumbicarbonatlösung
umgewandelt.
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Quantitative O-Acetyl-Bestimmungen zeigen die Anwesenheit von 5,5
bis 7,0 0/o Acetylgruppen, gebunden an Sauerstoff. Die Acetoxylgruppen werden mit
0,1 n-Natronlauge bei Raumtemperatur hydrolysiert.
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Eingehende Strukturbestimmungen sind gegründet auf die Untersuchung
der Hydrolyseprodukte des Polysaccharids und seine Derivate und haben gezeigt, daß
das Polysaccharid chemisch als ein Polymer von D-Glucosaminuronsäure beschrieben
werden kann, das ein amidgebundenes L-Alanin (wahrscheinlich N-acetyliertes, da
freie Aminogruppen nicht vorhanden sind) enthält und 5,5 bis 7,0 0/o Acetylgruppen,
gebunden an Sauerstoff, aufweist. Produkte, die nach der Hydrolyse des Polysaccharids
mit Mineralsäure identifizierbar sind, sind Alanin, Ammoniumchlorid und D-Glucosaminuronsäure.
Vorhandensein von D-Glucosaminuronsäureeinheiten ist ein hochcharakteristisches
Strukturmerkmal des Polysaccharids. D-Glucosaminuronsäure gehört nicht zu der Gruppe
der gewöhnlichen Uronsäuren, die mit den kolorimetrischen Standard-Versuchsmethoden
auf Uronsäure positive Tests ergeben.
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Kolorimetrische Untersuchung Das Polysaccharid entwickelt eine gelbe
Farbe in Essigsäure-Schwefelsäure-Lösung, die für quantitative Bestimmungen dienen
kann. 2 ccm wäßrige Polysaccharidlösung werden zu 4 ccm Eisessig, der 100/o Schwefelsäure
enthält, gegeben, und man erhitzt das Gemisch 30 Minuten in siedendem Wasser. Nach
dem Abkühlen zeigt die Lösung ein Absorptionsmaximum bei 283, 410 und 470 Millimikron.
Die meisten einfachen Zucker stören bei den Lösungen in dem Gebiet von 283 Millimikron,
aber die Absorptionsspitzen bei 410 und 470 Millimikron sind sehr spezifisch. Durch
Vergleich der Ablesung der optischen Dichte bei 410 und 470 Millimikron kann die
Reinheit einer unbekannten Polysaccharidprobe miteiner gereinigten oder einer standardisierten
Probe verglichen werden. Dieses Verfahren kann als Mittel einer quantitativen Analyse
angewendet werden.
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Elektrophoretisches Verhalten Das Polysaccharid kann nachgewiesen
werden, und seine elektrophoretische Beweglichkeit kann auf Glasfaserstreifen untersucht
werden. Wenn 50 bis 100 mg Polysaccharid auf solche Streifen aufgebracht und einer
Elektrophorese unterworfen werden, kann das Polysaccharid durch Besprühen der Streifen
mit einer Lösung, die 10/o p-Anisidin in feuchtem Butanol mit 201o konzentrierter
Schwefelsäure enthält, und Erhitzen auf 100"C während 10 bis 15 Minuten nachgewiesen
werden. Das Polysaccharid erscheint als rosa Fleck gegen einen farblosen Hintergrund.
Das Polysaccharid bewegt sich als Anion gegen die Anode oder den positiven Pol bei
pH-Werten von 4 und mehr. Eine gute Auflösung wird mit einem 0,05molaren Phosphatpuffer
bei pH 6,0 und 0,05molarem Boratpuffer bei pH-Wert 8,6 bei hoher Spannung von 300
Volt und niedriger Stromstärke (weniger als 20 Milliampere) erhalten. Bei pH-Werten
zwischen 3 und 4 bewegt sich das Polysaccharid durch Endosmose als ungeladenes Teilchen.
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Das elektrophoretische Verhalten des Polysaccharids als gemischtes
Calcium-Natrium-Salz wurde in einem Tiselius-Elektrophoreseapparat bestimmt, und
die nachstehenden Elektrophorese- Beweglichkeitskonstanten wurden bestimmt: Bei
einem pH-Wert von 4,4 6,3 10-5 cm2 sec-l Volt-l; bei einem pH-Wert von 6,0 5,87
10-5 cm2 sec-l Volt-l; bei einem pH-Wert von 7,5 5,83 10-5 cm2 . sec-l . Volt-'.
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Spezielle physikochemische Charakterisierung Bei physikochemischen
Bestimmungen wurde gefunden, daß das Polysaccharid ein sehr hohes Molekulargewicht
besitzt. Das Polysaccharid kann auch durch übliche Viskositätsmessungen charakterisiert
werden. Bei 23"C wurde die Viskosität des Polysaccharids als freie Säure bestimmt
zu 0,0151 Poise (0,30/0 in Wasser). Der entsprechende Wert für die Viskosität von
reinem Wasser bei 230 C ist 0,0938 Poise.
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Biologische Versuche Es wurde eine immunologische Wirkungseinheit
bestimmt, die von Wert ist bei Laboratoriumsversuchen von rohen und gereinigten
Polysaccharidpräparaten sowie von wäßrigen Lösungen, aus denen diese stammen. Die
Wirkungseinheit, bestimmt als Mäuseschutzeinheit, ist die Menge Material, die imstande
ist, 50 0/o einer Gruppe von Mäusen gegen eine Infektion durch das 10 OOOfache der
Menge an Staphylococcen zu schützen, die 500/o einer Gruppe von normalen Kontrollmäusen
abzutöten vermag. Die immunogene Substanz wird subkutan 7 Tage vor der Beimpfung
verabreicht, und die Beimpfung erfolgt durch intraperitoneale Verabreichung von
Staphylococcen in Mucin. Bei dem Standardversuch wird der Stamm UC 76 von Staphylococcus
aureus für die Beimpfung verwendet. Die Wirksamkeit eines Präparates kann ausgedrückt
werden als Zahl der Mäuseschutzeinheit je Milligramm oder je Kubikzentimeter Lösung
oder als die Zahl von PD50 (500/,ige Schutzdosis) je Milligramm oder je Kubikzentimeter
Lösung gegen den LD50-Wert bei 10 000facher Beimpfung (500/die Lethaldosis). Gereinigte
Präparate des Polysaccharids
enthalten, wie -gefunden wurde, etwa
300 000 Mäuseschutzeinheiten (oder PD50) je Milligramm oder 300 je Mikrogramm. Bei
der Beurteilung der Reinheit aus immunologischen Versuchen muß die übliche Toleranz
für Experimentalfehler bei bioIogischen Messungen beachtet werden.
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Das Polysaccharid und seine Salze sowie die Impflösungen, die diese
enthalten, vermögen die Bildung eines positiven Schutzkörpers zu stimulieren, und
bei einer parenteralen Verabreichung erzeugen sie ein hohes Ausmaß einer Immunität
nicht nur gegen die Infektionen durch den Stamm von Staphylococcus aureus, der bei
ihrer Herstellung verwendet wurde, sondern auch durch eine Infektion mit anderen
Stämmen von Staphylococcus aureus. Da das Polysaccharid und seine Salze gereinigt
und genau charakterisiert und standardisiert werden können, besitzen sie eine hohe
Reproduzierbarkeit in ihrer chemischen Zusammensetzung und in ihrem klinischen Effekt.
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Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
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Beispiel 1 Eine Stammlösung des Stammes UC76 von Staphylococcus aureus
wird in einem Kulturmedium mit der nachstehenden Zusammensetzung gehalten: Bestandteil
Menge Pepton aus Casein durch Pankreasverdauung (Trypticase) .............. 17,0
g Papain-Verdauungsprodukt von Sojabohnen (Phyton) 3,0 g Natriumchlorid .......................
5,0 g Dikaliumphosphat ................... . 2,5 g Dextrose .............................
2,5 g Destilliertes Wasser 1000,0 ccm Für die Verwendung wird dieses Medium durch
Autoklavieren bei 118 bis 121°C für 15 Minuten sterilisiert. Der Organismus wird
18 bis 24 Stunden bei 35 bis 37"C entwickelt und in einem gleichen Medium durch
einmalige Übertragung in jeder Woche gehalten.
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Saatkulturen wurden durch Beimpfung von großen Testrohren mit 30
ccm obengenannten Kulturmedien, enthaltend etwa 0,3 ccm Stammkultur, und Entwicklung
bei 35 bis 37"C während 6 bis 24 Stunden -hergestellt. Für jeden Kolben der Endproduktion
wird ein Rohr der Saatkultur hergestellt. Es wird eine Reihe von Endproduktionskolben
hergestellt, wobei jeder 1000 ccm sterilisiertes Medium, wie angegeben, enthält.
Jeder Kolben wird mit 30 ccm der 6- bis 24-Stunden-Kultur beimpft und 24 Stunden
bei 35 bis 37° C entwickelt. Man gibt reines Phenol hinzu in einer Konzentration
von 1 Gewichtsprozent je Volumen, und nach einem Durchmischen läßt man die Kultur
für die Inaktivierung bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Die Zellsuspension wird
dann in einer Sharples Laboratoriumsluftturbine bei Raumtemperatur bei einer Strömungsgeschwindigkeit
von etwa 250 ccm/ Min. zentrifugiert. Die dichtgepackten Zellen werden herausgenommen,
wieder in einem Zehntel des Orginalkulturvolumens 0,85 0/0iger Salzlösung in einem
Waring-Mischer aufgeschwemmt und wieder durch Zentrifugieren gesammelt. Die Anzahl
der erhaltenen Zellen wird auf den Umwandlungsfaktor berechnet, wobei 2,4 g nasser,
durch Zentrifugieren erhaltener dicht-
gepackter Zellen angenähert 1 1012 Organismen
entsprache. Das Gewicht der trockenen Zellen beträgt ungefähr 280/o des Naßzellengewichtes.
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Es wird Phenol mit einer kleinen Menge Wasser, um es flüssig zu machen,
zu der Zellmasse gegeben unter Verwendung von 9 ccm Phenol, für je 1 1012 Zellen.
Die feste Masse wird suspendiert, und durch weitere Zugabe von Phenol oder Wasser
wird die Suspension auf ein Volumen von 10,58 ccm für je 1.1012 Zellen gebracht
und rechnerisch auf eine Phenolkonzentration von 85 i 1 0/o Volumen eingestellt.
Die Zellenphenolsuspension wird auf eine Temperatur von 24 i 2"C gebracht und in
einem Waring-Mischer 8 bis 10 Minuten durchgemischt und bei einer Temperatur unter
etwa 50"C gehalten. Die hierbei erhaltene Emulsion wird 30 bis 60 Minuten in Teilmengen
bei 2500 Umdr./Min. bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die klare überstehende Flüssigkeit
wird verworfen, und die festen Tabletten werden wieder suspendiert in 85%igem Phenol
durch Vermischen während 1 bis 2 Minuten in einem Waring-Mischer unter Verwendung
von 10 ccm 85%igem Phenol für je 1 .1012 Originalzellen. Die Zellenmasse wird wieder
durch Zentrifugieren gesammelt, und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen.
Die Zellenmasse wird wieder in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 5,0 bis
5,5 ccm je 1 10l2 1.1012 Originalzellen suspendiert, und die Suspension wird 24
bis 28 Stunden gegen kaltes, laufendes Leitungswasser und dann über Nacht gegen
destilliertes Wasser bei angenähert 4"C dialysiert. Falls nötig, wird die Dialyse
wiederholt, bei der Ferricchloridtest auf Phenol negativ ist. Die Suspension wird
auf pH 7,4 i 0,2 mit 0,1 n-Natronlauge eingestellt und bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Die wäßrigen und festen Phasen werden voneinander getrennt, und beide werden aufbewahrt.
Die feste Pastille wird wieder mit destilliertem Wasser zu einem Volumen von 0,25
bis 0,30 ccm für je 1 1012 Originalzellen suspendiert, und nach gründlichem Durchmischen
wird die Suspension zentrifugiert. Die festen Pastillen werden zur Herstellung des
Polysaccharids durch Umsetzung mit Essigsäure verwendet.
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Das Polysaccharid wird auf folgende Weise hergestellt: Das gewaschene
feste Produkt aus der Phenol-Wasser-Extraktion des Stammes UC 76 von Staphylococcusaureus,wie
oben beschrieben, wird in destilliertem Wasser zu einem Volumen von 5,0 ccm für
je 1 1.1012 Originalzellen suspendiert. Man gibt hinreichend 10n-Essigsäure hinzu,
um eine endgültige KonzentrationvonO,ln-Essigsäure zu erzielen; der pH-Wert beträgt
an diesem Punkt etwa 3,4 i 0,3. Die Suspension wird gründlich durchgemischt und
5 Minuten bei 121"C im Autoklav behandelt. Die Suspension wird auf Raumtemperatur
abgekühlt und zentrifugiert.
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Das gewünschte Produkt erscheint an dieser Stelle in der wäßrigen
überstehenden Flüssigkeit. Die feste Ausfällung wird wieder in 0,1n-Essigsäure zu
einem Volumen von 0,5 ccm für je 1.10¹² Originalzellen suspendiert. Diese Suspension
wird zentrifugiert, die wäßrige überstehende Flüssigkeit vereinigt man mit der,
wie sie bei der vorhergehenden erhalten wurde, und die Ausfällung wird verworfen.
Die wäßrige Lösung wird mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7,4 L 0,2 eingestellt.
Wenn das Produkt in dieser Form verwendet werden soll, wird ein Schutzstoff, wie
Thimerosal (1:10000) oder Benzethoniumchlorid (1: 20 000), hinzugegeben, und die
Lösung wird sterilisiert und filtriert. Um das feste Polysaccharid zu
isolieren,
wird die wäßrige Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 i 0,2 eingestellt, 3 Tage gegen
laufendes Leitungswasser und dann 1 Tag gegen das 10fach seines Volumens von destilliertem
Wasser dialysiert.
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Die Lösung wird gefroren und in gefrorenem Zustand getrocknet, wobei
man eine weiße, flockige, feste Masse erhält, die rohes Polysaccharid mit94500Mäuseschutzeinheiten
je Milligramm enthält.
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Eine Reinigung des Polysaccharids kann durch Kohlechromatographie
erfolgen. Eine Suspension von 497 mg rohem Polysaccharid mit 94 500 Mäuseschutzeinheiten
je Milligramm, wie beschrieben, wird in 10 ccm Wasser suspendiert, und das unlösliche
Material wird abzentrifugiert. Der Niederschlag wird zweimal mit 5 ccm Wasser gewaschen,
und alle wäßrigen Lösungen werden vereinigt und mit verdünnter Essigsäure auf einen
pH-Wert von 4,5 eingestellt.
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Die wäßrige Lösung wird auf 40 ccm mit Wasser verdünnt und durch
eine Kohlechromatographiesäule, hergestellt aus 650 mg aktivierter Holzkohle und
650 mg Diatomeenerde, geleitet. Stoffe, wie Norit und Celite 545, können hierzu
verwendet werden. Die Säule wird mit etwas Wasser gewaschen, und eine Gesamtmenge
Ablauf von insgesamt etwa 43 ccm wird aufgefangen. Der Ablauf, der im Ultraviolett
kein Absorptionsmaximum zeigt, wird dann über Nacht gegen entionisiertes Wasser
dialysiert und in dem gefrorenen Zustand getrocknet, wobei man 176 mg weißes Pulver
erhält, das partiell gereinigtes Polysaccharid ist, das im Versuch 163 000 Mäuseschutzeinheiten
je Milligramm aufweist. Für eine weitere Reinigung wird eine zweite Kohlechromatographiesäule
aus 1,0 g aktivierter Holzkohle und 1,0 g Diatomeenerde hergestellt.
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Die Säule wird 100 ccm einer 0,20/0eigen Lösung von Tetranatriumäthylendiamintetraessigsäure
und dann mit Wasser gewaschen, bei die Lösung neutral ist.
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Das partiell gereinigte Polysaccharid wird in 15 ccm Wasser gelöst,
und der pH-Wert wird auf 4,1 mit Tetraessigsäure eingestellt. Die Lösung wird dann
durch die Kohlesäule geleitet, diese Säule wird mit etwas Wasser gewaschen. Der
Gesamtablauf wird aufgefangen, auf einen pH-Wert von 5,8 bis 6,0 mit Alkali eingestellt
und über Nacht gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die restliche Lösung mit
einem pH-Wert von etwa 4,5 wird durch Diatomeenerde filtriert und aus gefrorenem
Zustand getrocknet, wobei man gereinigtes Polysaccharid mit etwa 300 000 Mäuseschutzeinheiten
je Milligramm erhält. Das erhaltene Produkt ist ein gemischtes Calcium-Natrium-Salz.
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Das Produkt zeigt im Ultraviolett keine selektive Absorption und enthält
kein Protein, wie sich durch einen negativen Biuret-Test und quantitative Proteinbestimmung
ergibt. Die spezifische Drehung ist [acl 72,30(0,5260/0 in Wasser) oder [osl 2D
= 830, berechnet für wasserfreies Produkt nach einem Abtreiben von 13,2 0/o flüchtigen
Anteilen bei 50"C. Das Produkt ergibt bei der Analyse 39,8 0/o Kohlenstoff, 6,29°/o
Wasserstoff, 7,47 und 7,30 0/o Stickstoff, 2,0 0/o Calcium, 0,470/0 Natrium, eine
Spur Phosphor und 5,55 °lo Asche.
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Eine Reinigung des Polysaccharids kann auch durch Bildung eines unlöslichen
quaternären Ammoniumkomplexes durchgeführt werden. 100 mg rohes Polysaccharid mit
einem Wert von 94 500 Mäuseschutzeinheiten je Milligramm, wie beschrieben, werden
in 5 com Wasser gelöst, und die Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt. Die Lösung
wird auf ein
Volumen von 11 ccm und einen pH-Wert von 4,4 mit Essigsäure eingestellt
und wird mit 52 mg Aktivkohle 10 Minuten gerührt und dann filtriert.
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Das Filtrat wird durch Ultraviolettspektroskopie untersucht, um die
Vollständigkeit der Entfernung von Nucleinsäuren zu bestimmen, und es werden weitere
Behandlungen mit aktivierter Kohle durchgeführt, bis das Filtrat praktisch keine
selektive Absorption im Ultraviolett zeigt. Zum Beispiel werden zwei weitere Behandlungen
mit 50 und 30 mg aktivierter Kohle erforderlich. Das Endresultat nach einer Lyophilisierung
ergibt 63 mg partiell gereinigtes Polysaccharid mit 126000 Mäuseschutzeinheiten
je Milligramm. Zu einer Lösung von 60 mg dieses Pulvers in 5 ccm Wasser und 0,9
ccm ln-Natriumchloridlösung gibt man 8 ccm 1 0/0ige Cetylpyridiniumchloridlösung.
Es scheidet sich ein viskoses öliges Produkt ab. Das Gemisch läßt man bei Raumtemperatur
über Nacht stehen und zentrifugiert. Das aufgenommene Produkt wird zweimal durch
Zentrifugieren in 1 ccm Wasser gewaschen und in 1 com 0,5molarer Calciumchloridlösung
gelöst.
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Man fügt 4 bis 10 Volumina Äthanol hinzu, fängt das ausfallende Calciumsalz
auf und wäscht es dreimal mit Äthanol. Das Produkt wird in 1 ccm 0,05molarer Calciumchloridlösung
gelöst, wieder mit Äthanol ausgefällt und dreimal mit Äthanol gewaschen. Das auf
diese Weise erhaltene Produkt ist Polysaccharid-Calciumsalz mit 239 000 Mäuseschutzeinheitenje
Milligramm. Etwas phosphorylierte saure Polysaccharide verbleiben in dieser Probe.
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Eine Reinigung des Polysaccharids kann auch durch Ausfällung der
Verunreinigung durch einen Alkohol erfolgen. 590 mg rohes Polysaccharid mit 520/0
Reinheit, kolorimetrisch bestimmt, werden in 55 ccm 15molarer Natriumsulfatlösung
gelöst. Man gibt 165 ccm absoluten Äthanol tropfenweise unter Rühren hinzu, und
der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 5 bis 10 ccm 950/0im
Äthanol gewaschen und verworfen. Die überstehende Flüssigkeit einschließlich Waschäthanolwasser
wird mit weiteren 110 ccm Äthanol verdünnt und zentrifugiert. Es wird eine kleine
Menge ungelöster Verunreinigungen entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wird
im Vakuum auf ein Volumen von etwa 15 bis 20 ccm eingeengt, auf 50 ccm mit Wasser
verdünnt und über Nacht mit entionisiertem Wasser dialysiert. Die restliche Lösung
wird durch Diatomeenerde filtriert und lyophilisiert, wobei man 307 mg Polysaccharid
als gemischtes Calcium-Natrium-Salz als weißes Pulver erhält, das nach der kolorimetrischen
Bestimmung eine 1000/,ige Reinheit aufweist.
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Bei den Arbeitsweisen dieses Beispiels kann man auch an Stelle des
Stammes UC76 von Staphylococcus aureus einen beliebigen der nachstehenden Stämme
verwenden: Smith, S 193 N 4, H & D, Castellani, MCD 138, SK 4473, K 6, K 93
und K 93 M.
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Beispiel 2 300 mg phenolunlösliches, wasserunlösliches festes Material,
wie es bei der Extraktion von UC 76 von Staphylococcus aureus mit Phenol und Wasser
anfällt, werden mit 10 ccm 5°/"igerTrichloressigsäure 24Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Die ausfallende Suspension klärt man durch Zentrifugieren und Filtrieren
durch Diatomeenerde und neutralisiert das Filtrat mit Alkali, dialysiert, filtriert
und lyophilisiert zweimal und erhält rohes immunogenes Polysaccharid als
weißes
Pulver mit einer Reinheit von 200/o, kolorimetrisch und biologisch bestimmt. Das
Produkt wird gereinigt, wie im Beispiel 1 beschrieben ist.
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Als Ausgangsmaterial kann man auch den phenolunlöslichen Rückstand
aus der Extraktion des Stammes UC 76 von Staphylococcus aureus mit Phenol verwenden.
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Beispiel 3 316 mg phenolunlösliches, wasserunlösliches festes Material,
wie es bei der Extraktion des Stammes von UC76 von Staphylococcus aureus mit Phenol
und Wasser anfällt, werden in 20ccm 1 n-Essigsäure suspendiert, und man erhitzt
das Gemisch 30 Minuten unter Rückfluß unter Rühren. Die anfallende Suspension wird
durch Zentrifugieren und Filtrieren durch Diatomeenerde geklärt, und man neutralisiert
mit Alkali, dialysiert, filtriert und lyophilisiert, wobei man rohes Polysaccharid
erhält, das eine 260/0ige Reinheit, kolorimetrisch bestimmt, ergibt. Das Produkt
wird gereinigt, wie im Beispiel 1 beschrieben ist.
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Bei der vorstehenden Arbeitsweise ist es auch befriedigend, wenn
man die Suspension in 1 n-Essigsäure 45 Minuten auf 90 bis 95° C erhitzt.
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Beispiel 4 Eine nasse Paste von abgetöteten Zellen, hergestellt durch
Behandlung einer Kultur des Stammes UC 76 von Staphylococcus aureus mit 101o Phenol
(Gewicht/ Volumen) bei 18 Stunden bei Raumtemperatur, suspendiert man in destilliertem
Wasser, wobei man eine Suspension miteiner Zellenzahlvon 200 109 Zellen je Kubikzentimeter
erhält. Die Suspension teilt man in drei Teile, die je ein Volumen von 170 ccm auf
weisen.
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Den ersten Teil behandelt man mit Essigsäure bis zu einer Endkonzentration
von 0,1 n-Essigsäure (pH-Wert etwa 4,0 bis 4,2) und erhitzt 30 Minuten unter Druck
auf 121 cd. Man kühlt die Suspension ab und zentrifugiert bei 800 Umdr./Min. Die
klare überstehende Flüssigkeit enthält Polysaccharid und ergibt kolorimetrisch 1,53
mg/ccm.
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Den zweiten Teil behandelt man mit Essigsäure (pH-Wert etwa 3,3)
und erhitzt 30 Minuten unter Druck auf 121"C. Die Suspension kühlt man ab und zentrifugiert
bei 800 Umdr./Min. Die klare überstehende Suspension enthält Polysaccharid und ergibt
kolorimetrisch 1,66 mg/ccm.
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Den dritten Teil behandelt man mit Trichloressigsäure bis zu einer
Endkonzentration von 1 n-Trichloressigsäure (pH-Wert etwa 0,6) und rührt 16 Stunden
bei 23"C. Die Suspension wird dann zentrifugiert bei 8000 Umdr./Min. Die klare überstehende
Flüssigkeit enthält immunogenes Polysaccharid und ergibt 1,28 mg/ccm, kolorimetrisch
bestimmt.
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Das Polysaccharid, erhalten in wäßriger Lösung nach einer der vorstehenden
Arbeitsweisen, wird gereinigt, wie im Beispiel 1 beschrieben ist.
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Beispiel 5 Ein wäßriger Extrakt in einer Menge von 1280 ccm, erhalten
durch Phenol-Wasser-Extraktion der Stämme UC 76 und K 93 M von Staphylococcus aureus,
wird mit 12,8 ccm 10 n-Essigsäure zu einem pH-Wert von etwa 3,3 angesäuert. Die
Lösung wird 5 Minuten bei 121"C in einem Autoklav behandelt und dann auf
Raumtemperatur
abgekühlt. Den pH-Wert stellt man äuf etwa 7,0 durch Zugabe von 7,3 ccm 500/0iger
Natriumhydroxydlösung ein. Die Lösung, die nun das Polysaccharid enthält, ergibt
10500 Mäuseschutzeinheiten je Kubikzentimeter. Sie wird im Vakuum auf ein Volumen
von 250 ccm konzentriert und über Nacht dialysiert. Die zurückbleibende Lösung wird
filtriert und lyophilisiert, wobei man das Polysaccharid mit einer Reinheit von
12kl, (kolorimetrisch) erhält.
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374 mg dieses Produktes löst man in 16 ccm 0,45molarer Natriumsulfatlösung.
Man gibt 16 ccm Wasser und dann eine Lösung von 278 mg Cetylpyridiniumchlorid in
16 ccm Wasser hinzu. Das ausfallende Produkt wird abfiltriert, und das Filtrat wird
lyophilisiert. Die bei der Lyophilisierung erhaltenen Feststoffe löst man in 6,2
ccm Wasser und gibt 31 ccm absoluten Äthanol tropfenweise unter Rühren hinzu. Das
ausgefällte Produkt wird abzentrifugiert, und der Rückstand wird mit 25 ccm 950/0im
Athanol in drei Teilen gewaschen.
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Die Äthanollösungen werden vereinigt und im Vakuum auf einen hellbraunen
Sirup eingedampft. Man gibt absolutes Äthanol hinzu, wobei das feste Polysaccharid
ausfällt, das durch Zentrifugieren gesammelt, mit absolutem Äthanol gewaschen und
im Vakuum getrocknet wird. Ausbeute: 82 mg mit 480/o Reinheit (kolorimetrisch).
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80 mg dieses Produktes löst man in 1 mg lmolarem Natriumsulfatpuffer
bei einem pH-Wert von 5,6 und gibt 9 ccm absoluten Äthanol langsam unter Rühren
hinzu. Das unlösliche Produkt wir durch Zentrifugieren aufgefangen und dann dreimal
mit 950/,im Äthanol gewaschen. Das Produkt löst man in Wasser, dialysiert über Nacht
und lyophilisiert. Es wird dann wieder in 8 ccm Wasser gelöst, und der pH-Wert wird
auf 4,0 eingestellt. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Zentrifugieren aufgefangen
und durch eine Säule, hergestellt aus 0,5 g aktivierter Kohle und 0,5 g Diatomeenerde,
geleitet. Die Säule wird mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen, und die vereinigte
wäßrige Lösung, die etwa 7 ccm beträgt, wird mit 0,6 ccm 1 n-Natriumchloridlösung
und anschließend mit einer Lösung von 45 mg Cetylpyridiniumchlorid in 1 com Wasser
gewaschen. Der sich abscheidende harzartige Niederschlag wird abzentrifugiert, einmal
mit Wasser gewaschen und in 0,8 ccm lmolarer Calciumchloridlösung gelöst. Man fügt
10 Volumina absoluten Äthanol hinzu und sammelt das sich abscheidende unlösliche
Produkt durch Zentrifugieren, wäscht dreimal mit Äthanol, löst wieder in 1 ccm Wasser
auf und fällt erneut durch Zugabe von Äthanol. Das Produkt wird in Wasser gelöst,
gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, wobei man 22 mg Polysaccharid
als Calciumsalz erhält, das kolorimetrisch eine Einheit von 92 0/o zeigt. Das Produkt
wird in die freie Säure umgewandelt, indem man es in einer kleinen Menge destilliertem
Wasser löst und durch eine Säule mit 2,5 ccm Kationenaustauscherharz in freier Säureform
leitet. Die wäßrige Lösung wird lyophilisiert, wobei man das Polysaccharid als freie
Säure erhält, die kolorimetrisch eine 1000/,ige Reinheit zeigt und eine Viskosität
von 0,0159 (0,316 0/o in Wasser) hat.
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Beispiel 6 Gereinigtes Polysaccharid, isoliert aus der Kohlechromatographie
wie im Beispiel 1, wird als gemischtes Calcium-Natrium-Salz erhalten und durch die
nachstehende Arbeitsweise in das Calciumsalz umgewandelt.
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177 mg Polysaccharid werden in 8 ccm Wasser gelöst, und der pH-Wert
wird auf 7,0 mit einer Base eingestellt. Zu dieser Lösung gibt man 1,8 ccm 1molare
Natriumchloridlösung und dann 260 mg Cetylpyridiniumchlorid in 8 ccm Wasser. Das
Gemisch wird mit 30ccm Wasser verdünnt und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen,
worauf man das gebildete harzartige Präzipitat durch Zentrifugieren sammelt und
einmal mit 4 ccm Wasser wäscht. Den Niederschlag läßt man abtropfen und löst ihn
dann durch Rühren mit 5 ccm 0,5molarer Calciumchloridlösung.
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Man gibt 40ccm Äthanol hinzu und sammelt das ausfallende Polysaccharid-Calciumsalz
durch Zentrifugieren und wäscht dreimal mit Äthanol. Um ein höhergereinigtes Calciumsalz
zu gewinnen, löst man das Produkt in 5 ccm Wasser mit 0,1 ccm 0,5molarer Calciumchloridlösung
und fällt erneut durch Zugabe von 40 ccm Äthanol. Das Produkt sammelt man durch
Zentrifugieren, wäscht zweimal mit Äthanol, löst wieder in Wasser und dialysiert
die Lösung 16 Stunden gegen entionisiertes Wasser. Die Lösung mit dem Polysaccharid-Calciumsalz
filtriert man durch eine Schicht Diatomeenerde und lyophilisiert das Filtrat, wobei
man das gereinigte Polysaccharid-Calciumsalz als Filtrat erhält; [a3b = -80,8 0C
(0,6 0/o in Wasser) oder [d;]2D3 = ~ 90,6°C, berechnet als wasserfreies Salz nach
einem Abtreiben von 10,92°/o flüchtigen Stoffen bei 50"C. Das getrocknete Produkt
ergibt 40,8 °/o Kohlenstoff, 6,0 °/0 Wasserstoff, 7,77 0/o Calcium (nach der Flamme)
und 6,2 0/o Asche. Durch potentiometrische Titration in Wasser ergibt sich der pKa'-Wert
zu 3,35 entsprechend einem Äquivalentgewicht von etwa 600; umgerechnet auf den Gehalt
an Calcium und flüchtige Bestandteile ist das Äquivalentgewicht des Polysaccharids
als freie Säure etwa 510. In einer Calciumbromidscheibe zeigt das Calciumsalz Infrarotmaxima
bei etwa 2,93, 3,23, 3,41, 5,78, 6,06, 6,42, 7,06, 7,27, 7,65, 8,02, 8,78, 9,50,
10,70, 11,20 und 11,55 Mikron.
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Beispiel 7 Gereinigtes Polysaccharid, isoliert aus der Kohlechromatographie
wie im Beispiel 1, wird als gemischtes Calcium-Natrium-Salz erhalten und durch die
nachstehende Arbeitsweise in das Natriumsalz umgewandelt. 100 mg Polysaccharid löst
man in 10 ccm Wasser und 1,8 ccm lmolarer Natriumchloridlösung und gibt dann 150
ccm Cetylpyridiniumchlorid in 10 ccm Wasser unter Rühren hinzu. Nach 2 Stunden Stehen
bei Raumtemperatur sammelt man das ausgefallene Produkt durch Zentrifugieren und
wäscht mit 3 ccm Wasser. Das Produkt löst man in 2 ccm Imolarem Natriumacetatpuffer
(pH-Wert 5,6). Die Lösung verdünnt man mit 1 ccm Wasser und gibt unter Rühren und
Erwärmen tropfenweise 30 ccm absoluten Äthanol hinzu, um das Polysaccharid-Natriumsalz
auszufällen. Das Gemisch kühlt man auf Raumtemperatur ab, sammelt das Produkt durch
Zentrifugieren und wäscht dreimal mit Äthanol. Um ein höhergereinigtes Natriumsalz
zu gewinnen, löst man das Produkt wieder in 3 ccm Wasser mit 0,5 ccm Natriumacetatpuffer
und fällt erneut durch Zugabe von 30 bis 35 ccm Äthanol wie zuvor. Das unlösliche
Salz fängt man in einer Zentrifuge auf, wäscht mit Äthanol, löst wieder in Wasser
und dialysiert die Lösung 16 Stunden gegen entionisiertes Wasser. Die nach der Dialyse
zurückbleibende Lösung filtriert man durch ein Filter aus Diatomeenerde und lyo-
philisiert
das Salz, wobei man das Polysaccharid-Natrium-Salz erhält; [a]'03 -80,4" (0,69 0/o
in Wasser) oder [ol]O = -86,5", berechnet als wasserfreies Produkt nach Abtreiben
von 7,35 0/o flüchtigen Bestandteilen bei 50"C. Das getrocknete Produkt ergibt 42,37
0/o Kohlenstoff, 5,86 0/o Wasserstoff, 8,32 0/o Stickstoff 3,5 0/o Natrium (nach
der Flamme), 0,35 0/o Calcium (eine Spur von Verunreinigungen durch die Flamme nachgewiesen)
und 7,93 0/o Asche.
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In einer Kaliumbromidscheibe zeigt das Natriumsalz Infrarotabsorptionsmaxima
bei etwa 2,93, 3,24, 3,41, 5,78, 6,05, 6,43, 6,70, 7,10, 7,27, 7,65, 8,02, 8,85,
9,53, 10,70, 11,20 und 11,57 Mikron.
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Beispiel 8 Das Polysaccharid kann man als freie Säure erhalten, indem
man ein Salz davon einem Ionenaustausch unterwirft. Eine Lösung von 35 mg Polysaccharid-Calciumsalz,
wie im Beispiel 6 erhalten, gibt man in 5 ccm destilliertem Wasser durch eine Säule,
die 2,5 ccm Kationenaustauscherharz (50 bis 100 Maschen) in Form der freien Säure
enthält. Die Säule wird mit einer kleinen Menge destilliertem Wasser gespült, und
die vereinigten Abläufe und Waschwässer werden lyophilisiert, wo beim an dasPolysaccharid
als freie Säure als weißes Pulver erhält; []2D = -79,4" (0,63 0/o in Wasser), trockene
Probe.
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Das Produkt ergibt nach dem Trocknen auf konstantes Gewicht bei 50°
C 44,89 0/o Kohlenstoff, 6,48 O/o Wasserstoff, 8,34 0/o Stickstoff und 40,3 0/o
Sauerstoff als Differenz. Die angegebene empirische Formel ist C,9H33N3O13.
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Eine weitere Probe des Polysaccharids als freie Säure, entstehend
aus dem gemischten Calcium-Natrium-Salz, hatte eine spezifische Drehung von [O;]2D
= 77,20(0,5 °/0 in Wasser). Nach dem Trocknen auf konstantes Gewicht- bei 500 C
ergab dieses Produkt 44,64 0/o Kohlenstoff, 6,27 O/o Wasserstoff, 8,15 0/o Stickstoff
und 40,9 40,9°/0 Sauerstoff als Differenz. Die biologische Untersuchung zeigte 313
000 Mäuseschutzeinheiten je Milligramm.
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Das Polysaccharid als freie Säure zeigt die nachstehenden Infrarotabsorptionsmaxima
in einer Kaliumbromidscheibe: 2,95, 3,22, 3,33, 3,37, 5,37, 6,00, 6,43, 6,96, 7,24,
7,61, 8,04, 8,77, 9,49, 10,83, 11 13 und 11,52 Mikron.
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Das Polysaccharid als freie Säure wird in ein beliebiges gewünschtes
Salz durch Titrieren mit der ausgewählten Base, wie Natriumhydroxyd, Kaliumcarbonat
oder Calciumhydroxyd, umgewandelt.