DE2701312C2 - Polysaccharid mit gelbildenden Eigenschaften und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

2. Verfahren zur Herstellung des Polysaccharide nach Anspruch 1, durch Kultivierung eines Mikroorganismus in einem Medium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffqusllen enthält, bis sich das Polysaccharid in der Kultur beträchtlich angereichert hat, und Gewinnung des angereicherten Polysaccharide daraus, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas stutzen, FERM 2574 (ATCC 31 258), einsetzt.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden unter Verwendung von Mikroorganismen empfohlen worden. Der größte Teil dieser Verfahren bezieht sich jedoch auf die Herstellung von viskosen Polysacchariden und es sind nur sehr wenige Verfahren bekannt, welche die Herstellung von Polysacchariden mit gelbildenden Eigenschaften betreffen. Beispielsweise wird in Chem. Abstr., Vol. 59 (1963), 15623 h - 15624a ein nicht näher definiertes gelbildendes Polysaccharid genannt, das von einem Bakterienstamm vom Genus Arthrobacter gebildet wird. In Chem. Abstr., Vol. 85 (1976), 74 636 ρ wird ein Poiysaccharid referiert, das neben Glucose und Mannose auch Rhamnose und einen unbekannten Zucker enthalten soll. Die bekannten Polysaccharide mit gelbildenden Eigenschaften wurden bisher unUr Verwendung von Zuckern als Kohlenstoffquelle in dem Nährmedium hergestellt.

Die vorliegende Erfindung beruht nun darauf, daß gefunden wurde, daß

1. bestimmte Mikroorganismen-, die aus verschiedenen Bodentypen isoliert wurden, die Fähigkeit haben, ein Polysaccharid mii geltildenden Eigenschaften zu bilden,

2. diese Mikroorganismen zu dt η Genus Pseudomonas gehören,

3. das gebildete Polysaccharid sich in einer Kulturbrühe anreichert, wenn die Mikroorganismen in dem Nährmedium kultiviert werden, und

4. das abgetrennte (gewonnene) Polysaccharid gelbildende Eigenschaften hat.

Erfindungsgemäß kann ein Polysaccharid mit gelbildenden Eigenschaften hergestellt werden sJurch Kultivierung eines Mikroorganismus in einem Medium, das assimilierbare KohlenstofTquellen und Stickstoffquellen enthält, bis sich das Polysaccharid in dem Kulturmedium beträchtlich angereichert hat, und Gewinnen (Abtrennung) des angereicherten Polysaccharids daraus. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas stutzen, FERM 2574 (ATCC 31 258) einsetzt.

Der Mikroorganismus, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, wurde aus dem Erüboden isoliert. Dieser Summ wurde im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Bezeichnung »FERM-2574«, sowie bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland/ USA, unter der Bezeichnung ATCC 31 258 hinterlegt.

Die mikrobiellen Eigenschaften des Pseudomonas stutzen ATCC 31 258 sind folgende:

mikroskopische Untersuchung:

Größe:

Form:

Gram-Färbung: Sporenbildung: Kultivierung in einem Medium Bouillon-Agar-Plattenkultur:

Bouillon-Agar-Schrägkultur: Bouillonbrühenkultur:

Bouillon-Agar-Stabkultur: Bouillon-Gelatine-Slabkultur:

Wachstum in Lakmus-Milch: Wachstum in einem Kartoffeldextrose-Agar-Mediuni:

0,6-0.8 x 1,2-2,7 μτη

stabförmig

negativ

negativ

fast kreisförmig, faltig, gewellt, halb-transparent,

klebrig (klumpig),

gutes Wachstum, faltig, verlaufend, klebrig (klumpig), ein ringförmiges lläutchen bildendes schwach klebriges

Sediment,

fadenförmig, gutes Wachstum in dem oberen Teil,

Wachstum nur auf der Oberfläche, keine Verflüssigung

(40 Tage lang bei 22°C kultiviert), schwach alkalisch, keine Koagulation.

mäßiges Wachstum, kein Pigment.

Physiologische Eigenschaften:	8-9
optimaler pH-Wert für das Wachstum:	37°C
optimale Temperatur für das Wachstum:	5,5-9,5
pH-Bereich für das Wachstum:	nein
Indolbildung:	ja
H2S-BiIdUTIg:
Bildung von Gas und einer organischen	nein
Säure aus einem Kohlehydrat:	nein
Cellulose-Abbauvermögen:	ja
Hydrolysiervermögen gegenüber Stärke:	ja
Reduktion von Nitrat:	ja
Verwendbarkeit von Zitronensäure:	negativ
Methylrot-Test:	negativ
Voges-Proskauer-Test:	ja
Katalase-Bildung:	ja
Ammoniak-Bildung:	nein (50 Tage lang kultiviert)
Gelatineverflüssigung:
Ve;wendbarkeit von Ammoniumsalz und	ja
Nitratsalz:	positiv
Oxydasetest:	nein
Halophobizität gegenüber SaI?.:	nein
Harnstoffbildung:
Wachstum unter aeroben Bedingungen	nein
Verwendbarkeit von Agar:
Verwendbarkeit	für das Wachstum wurden G
von verschiedenen Kohlenstoffquellen:

4. Verwendbarkeit

für das Wachstum wurden Glucose, Maltose, Glycerin, Glykogen und Äthanol verwendet.

Die Säure- und Gasbildungstests wurden nach dem Verfahren von Hugh und Leifson (R. Hugh und E. Leifson, »J. Bact,«, 66,24 [1953]) durchgeführt. Sowohl unter aeroben Bedingungen als auch unter anaeroben Bedingungen wurden keine Säurebildung und keine Gasbildung festgestellt. AuBerdem wurden bei der Verwendung des Fermentationsrohres in Verbindung mit dem Ayer- und Barsiekov-Medium (J. M. Pelcar: »Manual of Microbiological Methods« [McGraw-Hill] [1957]) keine Säurebildung und keine Gasbildung festgestellt.

Es wurde keine Arabinose, Xylose, Galactose, Mannose, Saccharose, Lactose, Trehalose, Raffsnose, kein SaIicin. Mannit, Inosit und Sorbit verwendet.

Der hier isolierte Stamm wurde als dem Arthrobacter pascens ähnlich angesehen, weil er mit fortschreitendem Wachstum deutlich klebrig (klumpenförmig) wird. Dieser Stamm unterscheidet sich jedoch deutlich von Arthrobacter pascens im Hinblick auf die Wirkung gegenüber Gelatine, im Hinblick auf die Wachstumstemperatur und dgl. Diese Unterschiede zwischen zwei Stämmen sind in der folgenden Tabelle angegeben.

40

Arthrobacter erfindungsgemäß

pascens verwendeter Stamm

Wachstum bei 37°C nein ja »5 Gelatine-Verflüssigung ja nein Wachstum auf der Oberfläche eines flüssigen Mediums nein ja Carbazol-Assimilierung nein ja

Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse wurde dieser Stamm zunächst als neue Art identifiziert, die zum Genus Arthrobacter gehört, und ihm wurde der Name Arthrobacter carbazolum gegeben, um ihn von den bereits bekannten Stämmen zu unterscheiden. Dieser neue Stamm wurde wie vorstehend angegeben hinterlegt, und nunmehr als Pseudomonas stutzen identifiziert.

Erfindungsgemäß können auch künstliche oder natürliche Mutanten des vorstehend angegebenen Stammes verwendet werden.

Bei der Kultivierung dieses Stammes können als Kohlenstoffquelle die üblicherweise verwendeten Substanzen, wie z. B. Saccharide (wie Glucose und Stärke), verwendet werden. Außerdem können als Kohlenstoffquelle auch Essigsäure und petrochemische Derivate, wie Äthanol, Glycerin, Prorjndiol, Butandiol und Äthylenglykol, verwendet werden. Als Stickstoffquelle können z.B. Kaliumnifat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Polypepton und Carbazol verwendet werden. Als anorganische Salze können z. B. Dikaliumhydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrojienphosphat verwendet werden und als Spurenelementmetall können z. 3. Magnesiumsulfat und Eisen{Il)sulfat verwendet werden. Ein durch Zugabe der vorstehend angegebenen Komponenten zu Leitungswasser hergestelltes Medium wird rr.i» dem neuen Stamm inokuliert und unter aeroben Bedingungen durch Hin- und Herschütteln kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung kann da., Polysaccharid, das sich in der Kulturbrühe angereichert hat, nach verschiedenen Verfahren, je nach dem Verwendungszweck, gewonnen werden. So wird beispielsweise ein wasserlösliches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol, Aceton und Tetrahydrofuran, einer

hochviskosen Brühe zugegeben, um das Polysaccharid mit den Zellen auszufällen, und nach dem Trocknen kann dieser Niederschlag als Rohprodukt verwendet werden.

Wenn ein festes Material in der Brühe, wie z.B. Mikrobenzellen, Tür den Verwendungszweck nachteilig ist, wird vor der Raffinierung der Brühe eine geeignete Menge Wasser zugegeben und erhitzt. Danach wird das PoIy-

s saccharid aus der erhaltenen Lösung durch Zentrifugieren der Brühe gewonnen (abgetrennt).

Bei der Raffinierung können übliche Verfahren zur Abtrennung des Polysaccharids von Verunreinigungen, wie z.B. die Kondensation, die Ausfällung mit dem vorstehend angegebenen wasserlöslichen Lösungsmittel, die Ausfällung mit Ammoniumsulfat, das Waschen, das Zentrifugieren, die Säulenchromatographie, die Extraktion mit einem Lösungsmittel und die Dialyse, einzeln oder in Kombination miteinander angewendet werden.

So wird beispielsweise nach der Kultivierung eine geeignete Menge Wasser, vorzugsweise die 3- bis lOfache Menge Wasser, bezogen auf die Menge der Kulturbrühe, der Brühe zugesetzt und auf 45 bis 65⁰C erhitzt. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Zentrifugieren der Brühe gewonnen. Anschließend wird ein aliphatisches quatemäres Ammoniumsalz, wie z. B. Cetyltrimethylammoniumbromid, dieser überstehenden Flüssigkeit zugesetzt, um das Polysaccharid auszufällen. Das abgetrennte Polysaccharid wird mit 85- bis 95%igem Methanol

oder Äthanol, das z. B. mit Natriumchlorid oder Kaliumchlorid gesättigt ist, gewaschen. Danach wird das Polysaccharid durch Zugabe von Wasser zum Aufquellen gebracht. Nach dem Waschen mit z. B. Aceton wird das Polysaccharid getrocknet.

Andererseits kann das Poiysacchafiu auch erhalten werden durch Zugabe der 5- bis IQfachen Menge eines wasserlöslichen Lösungsmittels, wie Aceton, um das Polysaccharid auszufallen, oder durch Sprühtrocknen nach dem Entsalzen der oben genannten überstehenden Flüssigkeit durch Ultrafiltrierung oder mittels eines Ionenaustausche rharzes, wie Amberlite* 1R-120B, Amberlite* IRA-410, und Einengen. Wenn ein Polysaccharid mit einer höheren Reinheit erwünscht ist, können Verfahren, wie z.B. eine Deproteinierung unter Verwendung eines Chloroform/Isoamylalkohol (4/l)-Gemisches oder eine Dialyse, zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Verfahren angewendet werden.

Das dabei erhaltene Polysaccharid wurde auf seine physikalisch-chemischen Eigenschaften hin untersucht und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend zusammengefaßt. Dabei wurde gefunden, daß dieses Polysaccharid den bereits bekannten Verbindungen nicht entspra? > und deshalb eine neue Verbindung darstellt.

1. Elementaranalyse H 5,50%; C 38.02%; N 0%

2. Molekulargewicht

Das Molekulargewicht wurde bestimmt durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Cephalose 2B (Pharmacia Co. Ltd., Schweden). Das erhaltene Polysaccharid wurde in einem Leervolumen eluiert, wobei das Molekulargewicht auf mindestens mehr als 2000000 geschätzt wurde. Außerdem wurde die Grenzviskosität in Gegenwart von Natriumchlorid (1 x 10 ^J Mol) gemessen und es wurde gefunden, daß [»/] bei 25⁰C 29,0 dl/g betrug (Fig. 2). Dieser Wert wurde in die Staudinger-Gleichung eingesetzt. Dadurch wurde ein mittleres MoIekuiargewicht von etwa 8000000 gefunden.

3. Spezifisches Drehvermögen 45 [a]"o = +20° bis +35° (0,l%ige wäßrige Lösung, / = 0,1)

4. Infrarotabsorptionsspektrum

J₀ Das nach deo KBr-Tabletten-Verfahren erhaltene IR-Absorptionsspektrum ist in der Fig. 1 dargestellt

5. Löslichkeit in einem Lösungsmittel

Das Polysaccharid ist nicht löslich in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol. Äthanol, Aceton. Äther, ^s> und es hat die Eigenschaft, in Wasser ein Gel zu bilden.

Es löst sich in Wasser selbst in einer geringen Konzentration (unterhalb 0,1 %) nur schwer auf und bildet eine klebrige, klumpige Lösung, wenn man es erhitzt. Diese Lösung ist farblos und transparent.

6. Klassifizierung durch die Acidität

Der pH-Wert der wäßrigen Lösung des wie oben angegeben gelösten Polysaccharids beträgt 3,0 bis 3,5. Darüber hinaus entsteht bei Zugabe von Ceiyl-trimethylammoniumbromid ein Niederschlag. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Polysaccharid sauer ist.

7. Farbreaktion Bei der Anthron-Rcaktion wird es hlüulich-grün.

8. Farbe des Polysaccharids Im trockenen Zustand ist es farblos und transparent, in Pulverform ist es weiii.

9. Schmelzpunkt

Kein Schmelzpunkt, beim Erhitzen auf etwa 235⁰C tritt eine Verkohlung (Verkokung) auf und bei etwa 28O°C wird er -ollständig verkohlt (verkokt).

10. Viskosität

Durch Messung der spezifischen Viskosität mit dem Ubbelohde-Viskosimeter wurde ermittelt, daß >ι_ψ 13 beträgt (C= 0,1, 3O⁰C).

Die Beziehung zwischen der reduzierten Viskosität und der Konzentration des Polysaccharids, insbesondere der Einfluß des Natriumchlorids auf die reduzierte Viskosität, wurde untersucht und das dabei erhaltene Ergebnis ist in der Fig. 2 dargestellt. Die Messung der Viskosität wurde unter Verwendung eines Ubbelohde-Viskosimeter bei 25 ±0,01⁰C durchgeführt.

Außerdem wurde der Einfluß des pH-Wertes auf die Viskosität untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, daß |

die Viskosität bei etws pH 3 merklich zunimmt und bei einem pH-Wert von 7 den 50fachen Wert erreicht w

(Fig. 3). Die Messung der Viskosität wurde mit einem Rotationsviskosimeter bei 30 UpM bei einer Temperatur 20 |

von 25 ± 0,01°C und einer Probenkonzentration von 0,1 Gew./Vol.-⁰/» durchgeführt. Agar, eine der Proben, jjj

wurde durch 20minütige Behandlung bei 100⁰C gelöst. Die übrigen Proben wurden 10 Minuten lang bei 6O⁰C _v.i

behandelt, um sie zu lösen. Die Einstellung des pH-Wertes erfolgte durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure oder verdünntem Natriumhydroxid. Auch bei der Zugabe von Natriumchlorid wurde eine deutliche Zunahme der Vistosität beobachtet (F i g. 4). Die Versuchsbedingungen waren die gleichen wie bei der Unter- :s suchung des Einflusses des pHWertes. Diese Eigenschaften sind für das erfindungsgemäße Polysaccharid spezifisch.

11. Physikalische Eigenschaften des Polysaccharidgels

Das Polysaccharid bildet bei einer Konzentration von mehr als 0,5% ein Wasser enthaltendes Gel und es hat die Eigenschaften, daß es beim Erhitzen löslich ist und beim Abkühlen koagulierbar ist und es bildet außerdem ein Gel, wenn man es bei Raumtemperatur mit Wasser in Kontakt bringt.

Die weiter unten folgende Tabelle I zeigt die physikalischen Eigenschaften des Polysaccharidgels. Die Messungen wurden wie nachfolgend angegeben durchgeführt.

Einer Pulverprobe wurde Wasser zugegeben und es wurde 30 Minuten lang unter Rühren auf 6O⁰C erhitzt. Nach 1 stündigem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Bruchfestigkeit (Gelfestigkeit) und die Stabilität (Haltbarkeit) des Gels unter Verwendung eines Curd-Meters gemessen.

Tabelle I Einfluß der Polysaccharidkonzentration auf die Gelfestigkeit Probe Konzentration Bruchfestigkeit Stabilität

(%) (N/cm²) (N/cm²)

Agar 0.5 2.25 x 10"' 9.90 X 10"²

1.0 1.08 8.03 x 10"'

2.0 5.56 3.19

Polysaccharid 0.5 <3.0 XlO'' <1.0 x 10'²

1.0 4.43 x 10"² 8.65 x 10"²

2.0 5.78 3.28 x 10"'

Das als Probe verwendete Polysaccharid wurde hergestellt unter Verwendung eines Äthanol und Carbazol als Hauptkomponenten enthaltenden Fermentationsmediums und es wurde mit Äthanol und Aceton gewaschen. Wie in der vorstehenden Tabelle I angegeben, war das Polysaccharidgel weich und viskos im Vergleich zu dem Agar-Gel und es wird angenommen, daß es eine große Elastizität aufweist aufgrund der Tatsache, daß das Gel kaum zu brechen ist. Tatsächlich wurde als Ergebnis der Messung der Textur unter Verwendung eines Rheolometers gefunden, daß die Elastizität des Polysaccharidgels hoch war im Vergleich zu derjenigen von Polyurethan. Wenn das gefrorene Gel aufgetaut wurde, wurde kein Phänomen des Zurückbleibens von Wasser beobachtet und das Gel nahm seinen ursprünglichen Zustand wieder an.

Das erfindungsgemäß erhaltene Polysaccharid hat die Fähigkeil, mit Wasser ein Gel zu bilden, darüber hinaus hat es die spezifische Eigenschaft, auch mit einer ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel in hoher Konzentration enthaltenden Lösung ein Gel zu bilden. Die folgende Tabelle II zeigt das Ergebnis der Messung des Einflusses des Wassergehaltes auf die Gelbildung. Die Messung wurde unter Anwendung des nachfolgend beschriebenen Verfahrens durchgeführt. 15 mg Polysaccharidpulver wurden in ein Teströhrchen gegeben und es wurde 1 ml eines organischen Lösungsmittels in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Nach 30minüti-

gem Erhitzen auf 6O⁰C wurde die Lösung abgekühlt und dann wurde die Oelbildung ja( + ) oder nein(-) bestimmt. Das Zeichen »±« steht für eine gallertartige Form.

Tabelle II
Für die Gelierung eines organischen Lösungsmittels erforderliche Minimalmenge an Wasser

10 20

25 35

40

Lösungsmittel/ -Vasser (Vol./Vol.-Vt)

Methanol

Äthanol

Isopropanol

Aceton

25 + + 4- +

20 + + ±

10 ±

Wie in der vorstehenden Tabelle 11 angegeben, trat in Abwesenheit von Wasser keine Gelbildung auf, in Gegenwart einer geringen Menge Wasser bildete sich jedoch ein Gel. Danach wurde der Einfluß der Äthanolkonzentration auf die Bruchfestigkeit (Gelfestigkeit) untersucht. Das dabei erhaltene Ergebnis ist in der Fig. 5 dargestellt, welche die maximale Festigkeit bei einer Äthanolkonzentration von 50 bis 75% zeigt. In dem Vergleichstest, in dem Agar oder Gelatine verwendet wurde, trat bis zu einer Konzentration von 50% eine Gelbildungauf, diese Proben wurden jedoch bei einer Konzentralion von mehr als 50% ausgefällt. Andererseits bildete sich bei dem erfindungsgemäß erhaltenen Polysaccharid mit 85% Äthanol ein Gel. Die Bedingungen für die Gelbildung sind nachfolgend angegeben. Ein Polysaccharidpulver wurde Äthanol mit variierender Konzentration zugesetzt und es wurde ein Polysaccharidgel hergestellt durch 30minütige Wärmebehandlung bei 6O⁰C. Ein Agargel wurde wie nachfolgend angegeben hergestellt:

Durch lOminütige Wärmebehandlung bei 100⁰C wurde das Pulver gelöst und der Lösung wurde nach dem Abkühlen auf 6O⁰C Äthanol zugesetzt. Das Gelatinegel wurde auf die gleiche Weise wie das Agar-Gel hergestellt, wobei diesmal jedoch die Wärmebehandlung 20 Minuten lang bei 60⁰C durchgeführt wurde. Bei Zugabe von Natriumchlorid (in einer Konzentration von 0,1 % bis 10%) wurde eine Erhöhung der Bruchfestigkeit beobachtet.

Außerdem wurde die Spannungsrelaxation des Polysaccharidgels mit derjenigen des Agargels verglichen. Die Messung wurde unter Verwendung eines Rheolometers bei einer Probenkonzeniraiiün von 2,0 Ge-*./Vo!.-%, eingestellt mit Wasser als Lösungsmittel, durchgeführt.

Tabelle III Spannungsrelaxation

Eigenschaften

Polysaccharid-Gel

Agar-Gel

45 55

Elastizitätsmodul

50 Vjskositätskoeffizient

Relaxationszeit

y	1	1.01	OO	5.38	OO	X	10'	N/cm'	2.27	OO	6.74	OO	X	N/cm'	ΙΟ"1	N. sec./cm2	102	see.
Y	2	3.26	3.75	165.0	X	10 '		1.53	1.13	440.0			10;
Y	3	1.83	20.5				9.88	115.0	X
>l	1		X	10	N. sec./cnr		X
Ί	2
•i	3
T	1			see.
r	2
I	3

60

12. Polysaccharid-Komponenten

Das gereinigte Polysaccharid wurde mit 1 η Schwefelsäure 6 Stunden lang bei 100°C hydrolysiert und durch Zugabe von Bariumcarbonat neutralisiert. Nacii dem Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit papierchromatographisch, als trimethylsilylierte-s Derivat analysiert. Die nachfolgende Tabeiic IV zeigt den fy-Wert des zersetzten Polysaccharids in der Papierchromalographic und die Fig. 6 zeigt das Gaschromatogramm des trirrrsthylsilylierten Derivats. Aus diesen Ergebnissen ergibt sich, daB das erfindungsgemäße Polysaccharid aus Glukose, Mannose, einem unbekannten neutralen Zucker und einem unbekannten sauren Zucker besteht.

Tabelle IV VWert der Komponenten des Polysaccharids in der Papierchromatographie Jestancltcil

l.nlwicMungs-l.osung.smilld

R₁-Wc π

/um Nachweis verwendetes Reagens

Glukose Mannose unbekannter, neutraler Zucker unbekannter saurer Zucker

Glukose Mannose unbekannter neutraler Zucker unbekannter saurer Zucker

Butanol: Essigsaure : Wasser = 4:1:1

Isopropanol: Pyridin : Wasser: Essigsäure =8:8:4:1

0,13 p-Anisidin, Silbernitrat

0.19 p-Anisidin, Silbernilrat

0,46 Siibernitrat

0,55 p-Anisidin, Bromkresol-Griin

0,60 p-Anisidin, Silbernitrat

0,65 p-Anisidin, Silbernitrat

0,81 Siiberniirai

0,75 p-Anisidin, Bromkresol-Griin

Die Strukturaufklärung des unbekannten neutralen Zuckers (nachfolgend mit HA-I bezeichnet) und des unbekannten sauren Zuckers (nachfolgend mit HA-2 bezeichnet) wurde wie folgt durchgeführt:

1. Identifizierung von HA-I

Das Polysaccharid-Hydrolyseprodukt wurde einer Aktivkohle-Säulenchromatographie unterworfen und mit Wasser, 10%igem Äthanol und Äthanol in dieser Reihenfolge eluiert. In der mit Wasser eluierten Fraktion wurden Glucose und Mannose gefunden und in den 10%igem Äthanol bzw. mit Äthanol eluierten Fraktionen wurden die mit HA-I und HA-2 bezeichneten Zucker gefunden.

Die mit 10%igem Äthanol eluierte Fraktion wurde zur Trockne eingeengt und durch Ionenaustausch-Säulenchroma»ographie(Dowex 1 x 8, Borat-Typ) gereinigt und der Zucker H A-1 wurde aus der mit 0,015 Mol Kaliumborat eluierten Fraktion isoliert. HA-I war instabil und schwierig zu kristallisieren, so daß eine Oxydationsreaktion mit Brom durchgeführt wurde. Das heißt,40 mg H A-i wurden in Gegenwart von 240 mg SUuiUiutncarbonat in 2 ml Bromwasser gelöst und bei 30⁰C über Nacht reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung nitriert und das Brom in dem Filtrat wurde unter vermindertem Druck entfernt. Danach wurde das Filtrat mit Silbercarbonat behandelt. Nach der Entfernung des Niederschlags wurde das Reaktionsprodukt einer lonenaustausch-Säulenchromatographie (Dowex 1X8, Acetat-Typ) unterworfen, wobei ein roher Kristall aus der mit 2 Mol Essigsäure eluierten Fraktion erhalten wurde. Der erhaltene rohe Kristall wurde aus Aceton/ Äthylacetat umkristallisiert, wobei man 20 mg eines farblosen, nadeiförmigen Kristalls erhielt. Dieser Krists"* wurde unter Anwendung verschiedener physikalischer Verfahren analysiert und dabei wurden die nachfolgend angegebenen Ergebnisse erhalten. Die F i g. 7 der beiliegenden Zeichnungen zeigt das IR-Absorptionsspektrum dieses Kristalls.

A) Schmelzpunkt: 139-142°C, B) Elementaranalyse (für C₆H₁₀O₅):

ber.: gef.:

C 44,44% 44,59%

H 6,22% 6,14%

O 49,34% ^9,31%

C) Absorptionsbereich in dem IR-Absorptionsspektrum (KBr-Tablettenmethode):

3200-3450 cm'(OH), 2850-3000, 1460, 1360, 1342 cm"'(CH, CH₂, CH,), 1770, 1755 cm"'(C = 0 im Lacton), 1405 cnT'(OH), 1290, 1250, 122C, 1160, 1135, 1078, 1043, 1015 cm'(C-OH, COO, CO in C-O-C), 955 cm"¹, 906 cm'¹, 843 cm"¹, 768 cm"¹.

D) Absorptionsbereich in dem NMR-Spektrum

Ϊ )

^Lösungsmittel CD₃CCD₃J:

8.67 τ(d, J = 6 Hz, CH₃ der Q-Stellung), 6.39 r (d, J = 5.5 Hz, CH₂OH der Cj-Stellung), 5.97 τ(s, OH der C₃-

Stellung), 5.65 r(t, J = 5.5 Hz, CH₂OH der C₃-Stellung), 5.41 r(d, J = 8 Hz, CH der C-Stellung), 5.38 τ (q, J = 6 Hz, CH der C₄-Stellung), 5.00 r (d, J = 8 Hz, OH der C,-Stellung).

Ein Absorpt'onsbereich von HA-I, bei dem es sich um die Verbindung vor der Oxydation mit Brom handelt, in deitti. NMR-Spektrum (Lösungsmittel D₂O) war folgender:

8.76 r(d, J = 6.5 Hz, CH₃ derQ-Stellung),6.40 r(s, CH₂OH derC_rSteIlung}, 5.93 r(d, J = 5 Hz, CH of C₂-Stellung), 5.61 r(q, J = 6.5 Hz, CH der C«-Stellung), 4.70 r (d, J = 5 Hz, CH der C-Stellun?).

Basierend auf der vorstehend beschriebenen Analyse wurde das aus der Oxydation von HA-I stammende Produkt als Dihydrostreptosonsäuremonolacton identifiziert und HA-I wurde als Dihydrostreptose identifiziert. Die chemische Struktur von Dihydrostreptose ist nachfolgend angegeben:

H₃C

OHH

OH

OH

2. Strukturanalyse von HA-2 2.1 Bestimmung der Struktur

Nach dem Einengen der mit Äthanol eluierten Fraktion bei der Aktivkohlen-Säulenchromatographie wurden die Konzentrati: der Ionenaustausch-Säulenchromatographie (Dowex 1 x 8. Acetat-Typ) unterworfen. Aus der mit 5 Mol Essigsäure eluierten Fraktion wurde ein Gemisch des HA-2 vom sauren Typ und vom Lacton-Typ erhalten. Zuerst: wurde zum Isolieren des Lacton-Typs eine Silicagel-Säulenchromatographie durchgeführt und aus dereiuierien Fraktion (Benzol/Äthylacetat = 2/1) wurde ein roher Kristall vom Lacton-Typ erhalten. Dieser rohe Kristall wurde aus Äthylacetat/Hexan umkristallisiert, wobei man 100 mg eines farblosen, nadeiförmigen Kristalls erhielt. Die Ergebnisse der Analyse des Kristalls /on HA-2 vom Lacton-Typ sind nachfolgend angegeben. Die Fig. 8 und 9 der beiliegenden Zeichnungen zeigen das IR-Absorptionsspektrum bzw. das NMR-Spektrum dieses Kristalls.

Schmelzpunkt: 136-137°C Elementatanalyse (für

ber.

C 493% H 6,47% O 44,00%

gef.

49,68%

6,34%

43,87%

C) Absorplionsbereich in dem IR-Absorptionsspektrum (KBr-Tablettenmethode):

3350cm"'(OH),2850-3000,1440,1360-1370,1320-1340cm '(CH.CH,), 1730-1760cm"'(C = OimLacton), 1251:1, 1215, 1085,1005, 1040 cm '(C-OH, COO, C-O in C-O-C), 975 cm '(endständiges CH₃), 918, 780 cm'(Pyranose-Ring). 885 cm"'(CH außer Tür das anomeres CH). 840 cm '(anomeres CH, 810cm'¹.

D) NMR-Spisktrum Lösungsmittel CD₃CCD₃ + D₂O

⁶⁰ 8.74 τ _vi.l. J =6 Hz, 3 H -CH-CH₅

65 8.48 ι \d, J = 7 Hz, 3 H -CH — CH,

5.96-6.20 (m. 3 H. unbekannt)

5.68 r\d-d, J = 10 Hz, I H — CH-CH-CH-)

Hz, \ H —CH-CH

4.90 γ (S, 1 H, anomeres H)

Basierend auf den vorstehend angegebenen Ergebnissen wurde der Kristall von H A-2 vom Lacton-Typ als eine Verbindung identifiziert, in der 6-Desoxyhexose und Milchsäure eine Ätherbrückenbindung bilden und die Carboxylgruppe der Milchsäure mit der Hydroxylgruppe der 6-Desoxyhexose eine Lactonbrückenbindung bildet Zur weiteren Aufklärung der Struktur wurden verschiedene Arten von Derivaten von H A-2 hergestellt und dann wurden diese Derivate durch NMR-Spektrometrie analysiert. Die Verfahren zur Herstellung der Cerivate sind nachfolgend angegeben und die Ergebnisse der NMR-Spektrometrie sind in der weiter unten folgenden Tabelle V angegeben. Als Lösungsmittel zur Messung der NMR-Spektren wurde D₆-Aceton verwendet

Synthese des Acetylderivats von HA-2 (Lacton-Typ) (III)

Ein Kristall von HA-2 vom Lactcn-Typ (34 mg) wurde in 1 ml einer Lösungsmittelmischung (Essigsäureanhydrid/Pyridin = 2/1) gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde eine Silicagel-Säulenchromatographie durchgeführt. Aus der eluierten Fraktion (Benzol/ Äthylacetat = 9/1) wurden 34 mg des Derivats (III) isoliert.

Synthese des Methylglycosidderivats von HA-2 (Lacton-Typ) (IV)

Ein Gemisch von HA-2 vom Säure-Typ und vom Lacton-Typ (47 mg) wurde in 10 ml einer 2,5%igen Chlorwasserstoffsäure/Methanol-Lösung gelöst und die Reaktion wurde 6 Stunden lang unter Sieden unter Rückfluß durchgeführt. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde eine Silicagel-Säulenchromatographie durchgeführt. Aus der eluierten Fraktion (Benzol/Äthylacetat = 5/1) wurden 32 mg des Derivats (IV) isoliert

Synthese des Methylesterderivats von HA-2 (Säure-Typ) (V)

Ein Gemisch von HA-2 vom Säure-Typ und Lacton-Typ (110 mg) wurde in Methanol gelöst und es wurde eine Ätherlösung von Diazomethan zugegeben. Nach der Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht wurde das Lösungsmittel entfernt und dann wurde eine Silicagel-Säulenchromatographie durchgeführt. Aus der eluierten Fraktion (Benzol/Äthylacetat = 7/3) wurden 66 mg des Derivats (V) isoliert.

Synthese des vollständigen Acetylderivats des Methylesters von HA-2 (Säure-Typ) (VI)

24 mg der in der vorstehend beschriebenen Reaktion (III) erhaltenen Verbindung (V) wurden in 1 ml eines Lösungsgemisches (Essigsäureanhydrid/Pyridin =2/1) gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde eine Silicagel-Säulenchromatographie durchgeführt und 20 mg der Verbindung (VI) wurden aus der eluierten Fraktion (Benzol/Äthylacetat = 9/1) isoliert.

Synthese des partiellen Acetylderivats des Methylesters von HA-2 (Säure-Typ) (VII)

23 mg der bei der obigen Reaktion (I) erhaltenen Verbindung (III) wurde eine geringe Menge Wasser zugesetzt, um den Lactonring zu öffnen, und es wurde eine Ätherlösung von Diazomethan zugegeben, danach wurde so über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde eine SiIicagel-Säulenchromatographie durchgeführt und es wurden 17 mg der Verbindung (VII) aus der eluierten Fraktion (Benzol/Äthylacetat = 7/1) isoliert.

Aus den in der folgenden Tabelle V angegebenen Analyseergebnissen wurden die Strukturen von HA-2 (Säure-Typ) (1), von HA-2 (Lacton-Typ) (II) und verschiedenen Arten von Derivaten wie folgt bestimmt:

R,0

= C-O

^or-^h

O OR₂ CH₃-CH-COOR₄

H₃C-CH O OR₆

OR₅ H

15

HA-2 (Säure-Typ) (I) R₁=R₂=R₃=R₄=H

KA-2 (Lacton-Typ) (II) R₅= R₆=H

Derivat (III) R₅=R₆=CH₃CO

Derivat (IV) R₅=CH₃, R₆=H

Derivat (V) R₁=R₂=R₃=H, R₄=CH₃

Derivat (VI) R₁=R₂=R₃=CH₃CO, R₄=CH₃

Derivat (VII) R₁=R₂=CH₃CO, R₃=H, R₄=CH₃

25

30 35 40 45 50 55 60 65

10

Tabelle V NMR-Spektren vom verschiedenen Derivaten von HA-2 (Lösungsmittel: D₆-Aceton)

Proton

Derivat

d-d J3-4, 10 Hz

111

r.

d J.-J 1.95 Hz

Jj-3 3 Hz

IV

r

d J3-4 9Hz

V

d Jl-J 2Hi;

Jj-3 2Hz

Vl

T,

d Jl-J 2Hz

Jj-3 3Hz

VlI

d Jl-v 2Hz

KJ O h-*

11

4.02

r.

d-d Jl-J, 1.95 Hz

J3-4 9-10 Hz

5.36

j

d-d J3-4, 9Hz

4.96 r,

d-d Jl-J, 2 H;e

4.04

r,

d-d Jl-J, 2Hz

J3-4 9Hz

4.08 r,

d-dl

h—»

CH der C,- Stelluog

4.90 ι

d J5-6 6Hz

4.72

1,

d-d J1-J, 3Hz

6.00

T,

d-q J4-5. 9Hz

6.07 r.

J4-5 10 Hz

4.68

r.

d-d Jj-3. 3Hz

J4-3 9Hz

4.72 r.

CH der C2- Stellung

6.02 ι

0 7Hz

5.78

r.

d J3-4 9-10 Hz

6.17

r.

d J5-6 6Hz

6.2-6.4 τ

d-d J3-+1 9Hz

6.12

t.

d-d J3-4. 9Hz

J5-6 8Hz

6.2-6.4 r

d-d;

CH der C3- Stellung

5.96-6.20 r

d 7Hz

5.74 J4-5 10 Hz

r,

q J5-6 6Hz

5.70

r.

q 7Hz

6.54 r, J4-5 9Hz

5.08

I,

d-q J4-5, 9Hz

6.55 r.

CH der C4- Stellung

5.68 i.

5.96

t.

d J5-6 6 Hz

6.28

r.

d 7Hz

6.24 r J5-6 6Hz

d J5-6 6Hz

6.12

/,

d J5-6 8Hz

6.2-6.4 r

d J5-C 6Hz

CH der C5- Slellung

5.96 r

8.74

I,

q 6 Hz

8.74

r.

8.84 r.

q 7Hz

8.88

r,

q 7Hz

8.78 f,

q 6 Hz

CH der C6- Stellung

8.74 t.

5.42

T,

d 6 Hz

5.44

r,

5.70 r.

d 7Hz

5.84

r,

d 7Hz

5.72 r,

d 6Hz

CH des Milch säurerestes

5.41 r.

8.54

8.53

8.68 r,

8.82

8.72 r,

CH3 des Milch säurerestes

8.48 r.

2.2 Identifizierung des Zuckeranteils in HA-2

Die Bestätigung des Zuckeranteils in HA-2 erfolgte nach dem nachfolgend beschriebenen analytischen Verfahren.

30 mg des in der vorstehend beschriebenen Reaktion (3 !erhaltenen Derivats (V) wurden in I mi Wasser gelöst und es wurden IC mg Natriumborhydrid zugegeben. Nach 3stündiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde eine überschüssige Menge eines Kationenaustauscherharzes (Amberlite IR-120 B, M-Typ) zu der Reaktionsmischung zugegeben, um das nicht-umgesetzte Natriumborhydrid zu zersetzen. Die durch Filtrieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde unter vermindertem Druck eingedampft und es wurde Methanol zugegeben. Durch Wiederholung dieser Verdampfung wurde die restliche Borsäure entfernt. Dabei wurden 20 mg Reduktionsprodukt (VlIIl) erhalten.

Ein Teil der Verbindung (VIII) (10 mg) wurde in 20 ml wasserfreiem Methylenehlorid gelöst und dann wurde das Reaktionssintern durch Argongas ersetzt. Nach dem Abkühlen auf -78°C wurden 4 ml Bortrichlorid zugegeben und es wurde über Nacht reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde Methanol zu der Reaktionsmischung zugegeben, um das Bortrichlorid zu zersetzen, und das Lösungsmittel wurde entfernt. Zu dem Rückstand wurde Methanol zugegeben und unter vermindertem Druck eingedampft. Diese Eindampfung wurde wiederholt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und mit einem lonenaustauscherharz entionisiert, eingeengt und getrocknet. Nach diesem Verfahren wurden 7 mg Zuckeralkohol (IX), der aus dem Zuckeranteil von HA-2 stammte, isoliert. Aus dem Ergebnis der Analyse durch Gaschromatographie des Trimethyisiiyi- öder Aceiyiderivats des Zuckeralkohols (IX) ergab sich, daB die Retentionszeit dieser Derivate mit derjenigen von verschiedenen Derivaten von L-Rhamnit, das durch Reduktion von L-Rhamnose hergestellt worden war, übereinstimmte. Außerdem stimmten auch das lR-Absorptionsspektrum und das NMR-Spektrum des Acetylderivats(X) mit demjenigen des Acetylderivats von L-Rhamnit überein. Dementsprechend wurde der Zuckeranteil von HA-2 als L-Rhamnose identifiziert. Die Strukturen der in diesem Identifizierungsverfahren verwendeten verschiedenen Derivate waren folgende:

CH₂OR, Reaktionsprodukt (VIII)

HCOR₂ HCOR₃ R₄OCH R₅OCH i CH₃

R ι = Rj= R4= Rs==^ H R₁=CH₃CHCH₂OH

Zuckeralkohol (IX)

Ri = R₂= R₃= R4= R5= H

Acetyl-dcrivat des Zuckeralkohols (X) R₁=R₂=R₁=R₄=RSr=CHjCO

2.3 Bestätigung des Vorliegens (Ortes) der Ätherbrückenbindung zwischen L-Rhamnose und Milchsäure

10 mg des Reduktionsprodukts (VIII) wurden in 1 ml eines Lösungsgemisches aus Essigsäureanhydrid und Pyridin (2/1) gelöst und es wurde über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Entfernun·■ des Lösungsmittels wurde das Reaktionsprodukt durch Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt und c- .-,urden 10 mg des Acetylderivats (XI) isoliert. Diese Verbindung (XI) wurde einer Gasmassenspektroskopie unterworfen und es wurden Fragmente von M-145 und M-159 gefunden. Dieses Ergebnis bestätigte, daß die Milchsäure eine Äther-Brcskenbindung mit der C !-Position der L-Rhamnose bildete. Die Annahme oezüglich der Fragmente ist nachfolgend angegeben.

145

CH₂OAc

HCOAc

HC-O —

_1S9J

CH₃

CH AcCH₁CO

CH-OAc

AcOCH AcOCH

CH,

Derivat (Xl)

12

Basierend auf den vorstehend angegebenen analytischen Ergebnissen wurde die Struktur von HA-2 als 3-0-(l'-Carboxyäthyl)-L-rhamnose, einem neuen sauren Zucker, wie nachfolgend angegeben, identifiziert:

HO

OH H

O=C-O \ °

Y CH,

OH H

O OH

CH,- CH- COOH Säure-Typ

H₃C-CH O OH

Lacton-Typ

Aus diesen Ergebnissen ergab sich, daß es sich bei den Zuckeranteilen des erfindungsgemäß erhaltenen PoIysäccfcands üüi Glucose, Mannose, Dihydrostreptose und 3-Q-(l'-Carboxyäthyl)-L-rhamnose handelte und daß das Molverhältnis dieses Zuckeranteils in dem Polysaccharid 10:10:1-3:3-8 betrug in Abhängigkeit von dem Ergebnis der Gaschromatographie des Trimethylsilylderivats. Außerdem enthält dieses Polysaccharid eine O-Acetylgnippe und ihr Gehalt betrug 8 bis 14 Gew.-%, berechnet als Essigsäure, als Ergebnis der gaschromatographischen Analyse von Essigsäure, die bei der Inkubation des Polysaccharids mit 1 η Natriumhydroxid für einen Zeitraum von 1 Stunde bei 40⁰C gebildet wurde.

Das erfindungsgemäß erhaltene Polysaccharid ist nicht nur viskos (zäh, klebrig), sondern bildet auch ein Gel mit Eigenschaften, die von denjenigen von Agar verschieden sind. Bei der Gelbildung ist die Erwärmungs- oder Abkühlungsbehandlung nicht immer erforderlich, d. h. das Gel kann auch dadurch gebildet werden, daß man das Polysaccharid lediglich mit Wasser bei Raumtemperatur in Kontakt bringt. Darüber hinaus hat dieses Polysaccharid die Eigenschaft, daß es in einer niedrigen Konzentration ein Gel bildet und außerdem ist die Zugabe eines Vernetzungsmittels und die Einstellung des pH-Wertes zur Bildung eines Gels nicht erforderlich. Darüber hinaus kann dieses Polysaccharid bei einer tiefen Temperatur selbst in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, wie Alkohol, organischer Säuren und Zucker oder wasserlöslicher Verbindungen, wie Salzen, sofort ein Gel bilden. In diesem Falle wird das Gelbildungsvermögen dieses Polysaccharids auch dann nicht beeinflußt, wenn eine wasserlösliche Verbindung in einer gesättigten Konzentration vorliegt. In dem gebildeten Gel ist das Phänomen der Wasserabgabe nicht zu beobachten, wenn das erstarrte Gel auftaut und das Gel hat auch ein ausgezeichnetes Wasserrückhaltevermögen.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid weist eine merkliche Zunahme der Viskosität in einer Verdünnungsmittellösung auf, wie in F i g. 10 dargestellt. Diese Eigenschaft ist für dieses Polysaccharid spezifisch. Außerdem hat die Verdünnungsmittellösung thixotrope Eigenschaften. Das erfindungsgemäße neue Polysaccharid kann auf den verschiedensten Gebieten verwendet werden, auf denen seine spezifischen Eigenschaften ausgenutzt werden, z. B. in der Lebensmittelherstellung als Eindickungsmittel, als klebrigmachendes Reagens, als Gelierungsmittel, als Träger, als Geweberückbildungsreagens, als Koagulans für suspendierte Teilchen, wie Protein, als Gelierungsreagens, als Antisynerese-Reagens, als Stabilisierungsmittel zum Emulgieren, als Fleischbindemittel und als Parfüm-Retentionsmittel; auf dem medizinischen Gebiet z. B. als Träger- oder Hilfsstoff, als Antitumor-Reagens, für künstliche innere Organe, als Stabilierungsmittel und zum Emulgieren; auf dem Gebiet der Landwirtschaft z. B. als Bodenreformierungsmittel, als Dung-Granulierungsmittel, als Futterkomponente für Haustiere, als Komponente für die Serikultur-Beschickung und als Pastierungsmittel für Dünger; auf anderen technischen Gebieten z. B. als Verklebungsmittel, als Ausflockungsmittel, als Gelierungsmittel für explosive Stoffe, als Komponente für die Brandbekämpfung, als Paste, als Komponente für wasserlösliche Anstriche und als Schleifmaterial (Schmirgelmaterial). Bei Verwendung dieses Polysaccharids besteht einer der Vorteile der Erfindung darin, daß das Fermentationsmaterial, insbesondere die Kohlenstoffquelle, unter Berücksichtigung dieses Verwendungszweckes ausgewählt werden kann.

Beispiel 1

Pseudomonas stutzeri (FERM-2574 ATCC 31258) wurde mit einer Platinöse in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben überimpft (inokuliert), der 1,56% Äthanol, 1% Carbazol, 0,2% K₂HPO₄, 0,025% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,001% FeSO₄ ■ 7 H₂O in Leitungswasser (pH 8,0) enthielt, und die Kultivierung wurde 4 Tage lang bei 30³C unter Hin- und Herschütteln durchgeführt.

Nach der Kultivierung wurde die 9fache Menge an heißem Wasser (60³C) der Kulturbrühe zugesetzt und die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt (30 Minuten bei 10000 UpM).

Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde unter Rühren Cetyl-trimethylammoniumbromid (als 2 %ige Lösung) in einer Menge, die einem Drittel des Volumens entsprach, zugegeben, um ein Polysaccharid auszufällen. Das ausgefällte Polysaccharid wurde abfiltriert und zweimal mit 90%igem, mit Natriumchlorid gesättigtem Äthanol gewaschen- Anschließend wurde Wasser in einer Menge, die einem Viertel des Volumens der Kulturbrühe entsprach, zugegeben, um diese zum Aufquellen zu bringen, und dann wurde mit der 5 fachen Menge Aceton gewaschen. Nach dem. Trocknen erhielt man das rohe Polysaccharid (4 g pro Liter). Nach dem Auflösen des rohen Polysaccharids in Wasser (Konzentration 0,1%) wurde das Kation unter Verwendung von Amberlite* 1R-120B

13

entfernt und dann wurde ein Chloroform/lsoamylalkohol (4/l)-Gemisch in einer Menge, die einem Drittel des Volumens entsprach, zugegeben. Nach dem gründlichen Durchmischen wurde durch Zentrifugieren die überstehende Flüssigkeit erhalten. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde 3 Tage lang bei niedriger Temperatur in Wasser dialysiert. Nach der Dialyse wurde im Vakuum getrocknet und auf diese Weise erhielt man ein gereinigtes Poiysaccharid (3,6 g pro Liter).

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei diesmal jedoch das Carbazol, eine der Fermentationsquellen, durch 0,8% Pepton ersetzt wurde. Als Ergebnis erhielt man 1.8 g Polysaccharid pro Liter.

Beispiel 3

Der Versuch des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei diesmal das Carbazol durch 0,2% Kaliumnitrat ersetzt IS wurde, und außerdem wurden 0,01% Maisquellwasser zugegeben und die Kultivierungsdauer betrug 48 Stunden. Als Ergebnis wurden 1,5 g rohes Polysaccharid pro Liter erhalten.

Beispiel 4

Der Versuch des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei diesmal das Äthanol und das Carbazol durch 4% Stärke und 0,8% Pepton ersetzt wurden. Als Ergebnis wurde rohes und gereinigtes Polysaccharid in einer Ausbeute von 4,2 g pro Liter bzw. 3,6 g pro Liter erhalten.

Beispiel 5

Das Verfahren des Beispiels 3 wurde wiederholt, wobei diesmal 1,0% Dinatriumhydrogenphosphat, hydratisiert mit 12 H₂O, und 0,55% Kaliumdihydrogenphosphat anstelle von Dikaliumhydrogenphosphat verwendet wurden, und anstelle von Kaliumnitrat wurden 0,2% Ammoniumnitrat verwendet. Als Ergebnis wurde rohes und gereinigtes Polysaccharid in einer Ausbeute von 6,0 g pro Liter bzw. 5,0 g pro Liter erhalten. Nachfolgend werden die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt: Fig. 1 das IR-Absorptionsspektrum des erfindungsgemäßen Polysaccharids, Fig. 2, 3 und 4 graphische Darstellungen der Viskosität des erfindungsgemäßen Polysaccharids, Fig. 5 den Einfluß der Äthanolkonzentration auf die Gelfestigkeit des erfindungsgemäßen Polysaccharids, Fig. 6 ein Gaschromatogramm eines Trimethylsilylderivats des Hydrolysats des erfindungsgemäßen PoIysaccharide (Meßbedingungen: Säule mit 5% Silicone OV-17 auf Chromosorb W, 2 m lang aus Glas, Temperatur

t r/ΙΑΛν

Fig. 7 das IR-Absorptionsspektrum eines Kristalls des Oxydationsprodukts von HA-I, Fig. 8 das IR-Absorptionsspektrum eines Kristalls von HA-2 vom Lacton-Typ, Fig. 9 das NMR-Spektrum eines Kristalls von HA-2 vom Lacton-Typ und

Fig. 10 graphische Darstellungen der Viskosität der Polysaccharidlösung (Bedingungen: Rotationsviskosimeter vom Typ B, 2i*C, 30 UpM).

In der F i g. 6 stehen die Ziffern 1 und 2 für H A-I, die Ziffer 3 steht für den internen Standard (Xylit), die Ziffern 4 und 5 stehen für Mannose, die Ziffern 6 und 9 für Glucose und die Ziffern 7 und 8 jeweils für HA-2.

⁴⁵ Hierzu 10 Blatt Zeichnungen

14

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Polysaccharid mit gelbildenden Eigenschaften, das nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2 erhältlich ist und

1. aus (A) Glucose, (B) Mannose, (C) Dihydrostreptose und (D) 3-O-(l'-Carboxyäthyl)-L-rhamnose besteht, wobei das Molverhältnis dieser Komponenten (A): (B): (C): (D) = 10:10:1 bis 3:3 bis 8 beträgt,

2. O-Acetylgruppen, berechnet als Essigsäure, in einer Menge innerhalb des Bereichs von 8 bis 14 Gew.-% enthält, und

3. ein mittleres Molekulargewicht von etwa 8 Millionen aufweist.