CH644896A5

CH644896A5 - Polysaccharid, verfahren zur herstellung desselben und dasselbe enthaltendes, den cholesterinspiegel senkendes mittel.

Info

Publication number: CH644896A5
Application number: CH1146078A
Authority: CH
Inventors: Yoshihiro Takayama; Fujio Endo; Tsuneo Nozawa; Yoshiro Masuda; Motokuni Mori; Toshiji Kanayama
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co; Mitsubishi Yuka Pharma
Priority date: 1977-11-08
Filing date: 1978-11-07
Publication date: 1984-08-31
Also published as: MX5649E; US4330533A; US4230800A; JPS608797B2; CA1126184A; JPS5466604A; SE7811491L; DK495478A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Polysaccharid, das als Polysaccharid «M-30-C» bezeichnet wird, auf ein Verfahren zur Herstellung dieses Polysaccharides durch Züchten eines neuen Stammes, der Pseudomonas polysaccharogenes M-30 genannt wird, sowie auf ein Mittel zur Senkung des Cholesterinspiegels, das das genannte Polysaccharid als Wirkstoffe enthält.

Es wurden bisher verschiedene Verfahren zur fermentati-ven Herstellung von Polysacchariden vorgeschlagen; in den meisten dieser Verfahren wurde ein Nährmedium verwendet, das als hauptsächliche Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate bzw. Glykoside enthielt. Andererseits wurden auch Versuche unternommen, als Kohlenstoffquelle Erdölprodukte, wie normales Paraffin, Äthanol, Propanol, Äthylenglycol, organische Säuren und dergleichen anstelle von Kohlenhydraten bzw. Glykosiden zu verwenden (Japanese Patent Provisionai Publication No. 18493/1973). Bei diesen Kohlenstoffquellen bestehen jedoch Probleme hinsichtlich der Wasserlöslichkeit, der Zugänglichkeit und der Kosten der Fermentierungsmateria-lien und dergleichen, ohne dass eine befriedigende Ausbeute an Polysaccharid erzielt würde.

Es wurde nun dem Methanol, das kürzlich als billige Kohlenstoffquelle bezeichnet worden ist, besondere Aufmerksamkeit geschenkt; in diesem Zusammenhang wurden viele Methanol verwertende Bakterien aus Bodenproben, die am 1. Mai 1975 im Shimotsuma-Distrikt der Ibaraki-Präfektur, Japan, gesammelt worden waren, isoliert und dem Screening unterworfen. Dabei ist es gelungen, einen neuen, zur Gattung Pseudomonas gehörenden Stamm zu isolieren, der in einem Nährmedium, das als einzige oder überwiegende Kohlenstoffquelle Methanol enthält, sehr leicht und in hoher Ausbeute ein Polysaccharid, dessen Lösung in Wasser oder heis-sem Wasser viskos ist, zu erzeugen vermag. Weitere Untersuchungen über die von dem neuen Stamm erzeugten Polysaccharide haben ergeben, dass auf diese Weise ein neues Polysaccharid gebildet wird, das als den Cholesterinspiegel senkendes Mittel brauchbar ist.

Die morphologischen Eigenschaften des neuen Stammes Pseudomonas polysaccharogenes M-30, der im folgenden häufig als M-30 bezeichnet wird und für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind im folgenden zusammengefasst. Dieser neue Stamm wurde am 6. Mai 1977 beim Fermentation Reserarch Institute, Agency of Industriai Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305 (Japan) hinterlegt und unter der Ordnungsnummer FERM-P 4054 in die Mikroorganismensammlung dieser Sammelstelle aufgenommen; der neue Stamm wurde auch am 25. Oktober 1978 bei der America Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852/USA unter der Ordnungsnummer ATCC 31414 hinterlegt.

I. Morphologische Eigenschaften

Beobachtet an einer stationären Kulturflüssigkeit, die durch 48stündige Züchtung in einem Bouillon-Methanol (0,5 Vol.-%)-Nährmedium bei 30 °C erhalten wurde.

(1) Form und Grösse der Zellen: stäbchenförmig, 0,3 bis 0,5 x 1,0 bis 2,5 (im.

(2) Kolonien: gewöhnlich Einzelkolonien, aber häufig Doppelkolonien (twin)

(3) Beweglichkeit: beweglich mit einer einzigen Geissei

(4) Sporenbildung: keine

(5) Gramfärbung: negativ

(6) Säurefestigkeit: negativ

II. Wachstumseigenschaften in verschiedenen Kulturmedien

(1) Bouillonkultur: wächst in Bouillon

(1) stationäre Flüssigkeitskultur in Bouillon (bei 30 °C, 5 Tage lang)

Wachstum: reichlich; Häutchenbildung: keine;

Sediment: beobachtet; Trübung: beobachtet

(ii") Bouillon-Agar-Schrägkultur (bei 30 °C, 10 Tage lang) Wachstum: reichlich; Form: fadenförmig;

Oberfläche: glatt, glänzend; Begrenzung: gewellt; Durchsichtigkeit: undurchsichtig; Farbton: orange

(iii) Bouillon-Agar-Plattenkultur (bei 30 °C, 21 Tage lang) Form: ziemlich unregelmässig; Begrenzung: gewellt; Querschnitt: flach; Oberfläche: glatt

(iv) Bouillon-Agar-Stichkultur (bei 30 °C, 7 Tage lang) wächst über die Oberfläche und entlang des oberen Stiches

(2) Bouillon-Methanol (0,5 Vol.-%)-Agar-Plattenkultur (bei 30 °C, 30 Tage lang)

Form: rund; Begrenzung: gewellt; Querschnitt: flach; Oberfläche: glatt; Farbton: tief orange

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(3) Synthetisches, Methanol enthaltendes flüssiges Nährmedium (0,5 g Kaliumnitrat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 10 mg Ferrosulfat-hep-tahydrat, 0,1 g Hefeextrakt und 1 Vol.-% Methanol, gelöst in 1 Liter reinem Wasser und auf pH = 7,0 eingestellt; bei 30 °C, 5 Tage lang)

Wachstum: reichlich; Sediment: beobachtet; Trübung: beobachtet; Häutchenbildung: keine

III. Physiologische Eigenschaften

(1) Nitratreduktion positiv

(2) Denitrifikation negativ

(3) Methylrottest negativ

(4) Voges-Proskauer-Test negativ

(5) Indolbildung negativ

(6) Schwefelwasserstoffbildung negativ

(7) Stärkehydrolyse negativ

(8) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen: Nur Ammoniumsalze und Nitrate werden als Stickstoffquelle verwertet

(9) Pigmentbildung keine

(lO)Urease positiv

(11) Oxydase positiv

(12) Katalase positiv

(13) Sauerstoffbedarf aerob

(14) Gelatineverflüssigung negativ

(15) Lackmusmilch rot gefärbt, •

peptonisiert

(16) Wachstumstemperatur

10 bis 37 °C,

optimale

Wachstums

temperatur 26

bis 31 °C

(17) Wachstums-pH

pH 5 bis 10,

optimaler

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( 18) Verwertung von Methylamin

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( 19) Bildung von Säure (Gas) aus Zuckern: Arabinose, Ado-nit, Inosit, Galactose, Xylose, Glucose, Saccharose, Dulcit, Sorbit, Trehalose, Maltose, Mannit, Mannose, Lactose, Rhamnose, Raffinose, Fructose, Stärke und Glycerin: alle negativ: alle negativ

(20) Verwertung von Kohlenstoffquellen:

(i) Verwertung von Zuckern:

Arabinose, Inosit, Galactose, Xylose, Saccharose, Sorbit, Trehalose, Maltose, Mannit, Mannose, Lactose, Rhamnose, Raffinose, Fructose, Stärke, Dextrin, Inulin, a-Methylglucosid, Ribose, Sorbose, Fucose, Cellobiose, Melibiose und Glycerin: alle negativ Glucose: positiv

(ii) Verwertung von Alkoholen:

Methanol: positiv

Äthanol, n-Propanol, Isoproanol, n-Butanol, n-Amylalkohol, Isoamylalkohol, 1,2-Propandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butan-diol, 2,3-Butandiol, 1,5-Pentandiol, 1,6-Hexandiol, 2,5-Hex-andiol, Äthylenglycol, Diäthylenglycol, 4-Methylcyclohexan: alle negativ

(iii) Verwertung von organischen Säuren: Ameisensäure, Essigsäure, Fumarsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Isozitronensäure, Ketoglutarsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Oxalessigsäure, Glycolsäure, Glyoxyl-säure, Aldohexonsäure: alle negativ

Wenn man in «Bergey's Manual of Determinative Bacte-riology», 8. Auflage, R.E. Buchanon & N.E. Gibbons, Williams & Wilkins Co. (1974) irgendeine geeignete Gattung sucht, auf die die obigen morphologischen Eigenschaften zutreffen,

so stellt man fest, dass der vorliegende Stamm zur Gattung Pseudomonas gehört, da er gram-negativ, stäbchenförmig, beweglich mit einer Geissei und aerob ist und ausserdem Glucose oxydativ zu zersetzen vermag. Obgleich dieser Stamm mit den Klassen der Arten der obigen Gattung verglichen wurde, konnte keine Beschreibung gefunden werden, die zur strengen Identifizierung dieses Stammes genügte.

Überdies haben die Kolonien von Methanol verwertenden Bakterien im allgemeinen Farbtöne von überwiegend rosa oder einer ähnlichen Farbe, während der Farbton der Kolonien des vorliegenden Stammes orange ist; ausserdem verwertet er Methan und Äthanol nicht und erzeugt eine signifikante Menge eines Polysaccharides aus Methanol, während er gleichzeitig andere Eigenschaften hinsichtlich der Erzeugung von Säuren aus verschiedenen Kohlenstoffquellen und der Verwertung derselben hat. Es wird daraus geschlossen, dass der vorliegende Stamm sich von bekannter Arten, wie Pseudomonas methanica, Pseudomonas methylotropha, Pseudomonas rosea, Pseudomonas methylooxidans M-59, Pseudomonas aerogenes, Pseudomonas insueta, Pseudomonas PRL-W4, Pseudomonas AM-1, Pseudomonas M-27, Pseudomonas C und dergleichen unterscheidet.

Wenn man andererseits den vorliegenden Stamm mit bekannten Stämmen, die Methanol zu verwerten und Polysaccharide zu erzeugen vermögen, vergleicht, so unterscheidet er sich von Methylomonas mucosa und Methanomonas polysaccharogenes hinsichtlich der Verwertung von Glucose und ebenfalls von Pseudomonas sp. S46-B1 hinsichtlich des Farbtons der Kolonien und der Erzeugung von Säuren aus verschiedenen Zuckern.

Wenn man ferner den Stamm M-30 mit einer verhältnismässig ähnlichen bekannten Art, nämlich Methanomonas polysaccharogenes 26, vergleicht, so unterscheidet sich der Stamm M-30 von der bekannten Art hauptsächlich hinsichtlich der Reaktion mit Lackmusmilch und der Schwefelwasserstofferzeugung, so dass man schliessen muss, dass er zu einer anderen Art gehört.

Aufgrund der obigen Ausführungen kann der vorliegende Stamm mit guten Gründen als eine neue Art, die zur Gattung Pseudomonas gehört, angesehen werden und wurde demzufolge Pseudomonas polysaccharogenes M-30 genannt, wie bereits erwähnt wurde.

Bei der praktischen Ausführung des erfindungsgemässen Fermentierungsverfahrens erfolgt die Züchtung gewöhnlich unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das Methanol als einzige oder überwiegende Kohlenstoffquelle enthält. Es ist erwünscht, dem Nährmedium nicht mehr als 4 Vol.-% Methanol zuzusetzen. Falls einem Nährmedium kontinuierlich Methanol zugeführt wird, ist es erwünscht, wenn der Methanolgehalt im Nährmedium auf höchstens 1 Vol.-% gehalten wird.

Als anorganische Stickstoffquellen können Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen verwendet werden, während Hefeextrakt, Pepton und dergleichen als natürliche Stickstoffquellen in Frage kommen. Von Stickstoffquellen verschiedene anorganische Komponenten, die ebenfalls verwendet werden können, sind z.B. Dikaliumhy-drogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Ferrosulfat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Natriumchlorid usw.

Vitamine sind nicht speziell erforderlich, aber gewünsch-tenfalls können Biotin, Thiamine, Hefeextrakt, Maisquellwasser und dergleichen zugesetzt werden.

Die Züchtung wird gewöhnlich und vorzugsweise unter aeroben Bedingungen ausgeführt. Z.B. kann die Züchtung in befriedigender Weise bei einer Züchtungstemperatur von 10 bis 37 °C, vorzugsweise 28 bis 32 °C, unter Schütteln oder unter Belüften und Rühren ausgeführt werden. Der Züch-

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tungs-pH liegt in der Regel im Bereich von 5 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8, insbesondere 6,5 bis 7,5; eine Züchtungsdauer von 24 Stunden oder mehr genügt, wobei 48 bis 72 Stunden bevorzugt werden.

Nach der Beendigung der Züchtung kann die Kulturflüssigkeit auf das 10 bis 20fache Volumen verdünnt werden, worauf das Mycel und andere feste Materialien durch kontinuierliches Zentrifugieren, z.B. bei 15000 x g und einer Behandlungsgeschwindigkeit von 20 Liter pro Stunde, oder durch diskontinierliches Zentrifugieren, z.B. eine Stunde lang bei 10000 x g, entfernt werden können. Dann kann man der zentrifugierten Flüssigkeit ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol oder Aceton, in etwa der doppelten Volumenmenge oder ein quaternäres Ammoniumsalz zusetzen, um durch fraktionierte Fällung ein weisses, faseriges, rohes Polysaccharid herzustellen.

Man kann das so hergestellte rohe Polysaccharid in der etwa 5 bis 15fachen Volumenmenge Wasser lösen, die resultierende Lösung der Eiweissabtrennung unterwerfen, z.B. durch Erhitzen auf 70 bis 100 °C, behandeln mit einem Gemisch aus Chloroform und Amylalkohol (z.B. 3:2) oder behandeln mit Trichloressigsäure, kontinuierliches oder diskontinuierliches Zentrifugieren in der gleichen Weise wie beim obigen rohen Polysaccharid, um Proteine zu entfernen, und die resultierende überstehende Flüssigkeit mit annähernd dem doppelten Volumen Methanol, Äthanol oder Aceton versetzen. Man kann den so abgetrennten Niederschlag gründlich mit Äther oder Äthanol waschen, wieder in dem 5 bis 15fachen Volumen Wasser lösen und durch Dialyse gegen strömendes Wasser, Behandlung mit einem Ionenaustauscher oder Gelfiltration und anschliessende Gefriertrocknung ent-mineralisieren, wobei ein gereinigtes Polysaccharid in weisser schwammiger Form erhalten wird.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des so erhaltenen Polysaccharides sind die folgenden :

a) Optische Drehung: [a]o= +48,4° ±3,3° (Lösung von 0,1 Gew.-Teil in 100 Vol.-Teilen Wasser)

b) Gewichtsmittelmolekulargewicht: 2,0 x 105 bis

2,0 x 10"; das Molekulargewicht hängt von der Fermentationsdauer ab.

c) Elementaranalyse: C 37,7% ± 3,0%; H 5,8% ± 0,5%

d) Farbreaktionen: positive Anthronreaktion und Phenol-Schwefelsäure-Reaktion e) Bestimmung von Basizität, Azidität oder Neutralität: saures Polysaccharid

0 Infrarotabsorptionsspektrum : charakteristische Absorptionsbanden bei 3450 cm1 (stark), 2940 cm~1 (mittel), 1620 cm-1 (mittel), 1400 cm-1 (mittel), 1040 cm-1 (stark) und 890 cm-1 (schwach)

g) Löslichkeit: löslich in Wasser, 1-normaler Salzsäure, 1-normaler Schwefelsäure und 1-normaler wässrigem Ammoniak; unlöslich in Äthanol, Äther, Aceton, Chloroform und Dimethylsulfoxyd h) Viskosität: 1000 bis 3000 Centipoise, gemessen an einer Lösung von 1,0 Gew.-Teil in 100 Vol.-Teilen Wasser bei 30 °C mit Hilfe eines Viskosimeters vom Typ BL, hergestellt von der Firma Tokyo Keiki K.K., Japan i) Zuckereinheiten: Flecken von Glucose und Mannose bei der Papierchromatographie nach Hydrolyse und ein Verhältnis der Zuckereinheiten von Glucose: Mannose von 3:2, bestimmt durch Gaschromatographie j) Farbe und Form: als solches weiss und amorph und in wässriger Lösung farblos.

Aus den oben aufgeführten Eigenschaften kann mit guten Gründen geschlossen werden, dass das Polysaccharid, das aus der Kulturflüssigkeit des neuen Stammes Pseudomonas polysaccharogenes M-30 isoliert wurde, eine neue Substanz ist; deshalb wurde ihm der Name «Polysaccharid M-30-C»

gegeben.

Eine wässrige Lösung des Polysaccharides M-30-C hat eine hohe Viskosität, und seine Viskosität wird sogar in Gegenwart von Salzen, z.B. KCl, MgCh, AlCh, (NH4)2SÜ4 oder NaCl, nicht herabgesetzt. Die Viskosität der wässrigen Lösung ändert sich nicht sehr, Wenn der pH-Wert verändert wird. Daher ist das Polysaccharid M-30-C wertvoll als Nahrungsmittelzusatz, Träger für Arzneimittel und Kosmetika oder industrielle Chemikalien, z.B. Bohrschmiermittel.

Bei der medizinischen Untersuchung des Polysaccharides M-30-C wurde festgestellt, dass das Polysaccharid wegen seiner den Cholesterinspiegel senkenden Wirkung als den Cholesterinspiegel senkendes Mittel brauchbar ist.

Die den Cholesterinspiegel senkende Wirkung des Polysaccharides M-30-C wird im folgenden anhand verschiedener Versuchsergebnisse vollständig erklärt.

Der LDîo-Wert des Polysaccharides M-30-C ist bei oraler Verabreichung an männliche und weibliche Mäuse vom Stamm ICR-JCL und an männliche und weibliche Ratten vom Stamm Wistar nicht geringer als 5 g/kg, während der ED5o-Wert der Hemmwirkung auf die Erhöhung des Blutcho-lesterinspiegels im Falle von durch Triton herbeigeführter Hyperlipämie nicht höher als 5 mg pro kg ist. Somit ist der Sicherheitsbereich (LG50/ED50) des Polysaccharides sehr hoch und beträgt das lOOOfache oder mehr. Hinsichtlich der subakuten Toxizität bei lmonatiger Verabreichung wurden bei kontinuierlicher Verabreichung von 500 mg pro kg und Tag keinerlei Abnormalitäten hinsichtlich des Körpergewichtes, des Blutes und der Organe beobachtet; die maximale Sicherheitsdosis im Hinblick auf die subakute Toxizität beträgt 500 mg pro kg. Das Polysaccharid zeigt daher eine hohe Sicherheit als Arzneimittel und ist als Arzneimittel zur Verbesserung des Lipoidstoffwechsels und zur Verhinderung der Entstehung von Atheromatose geeignet.

Das Polysaccharid kann oral, intravenös, sublingual, intramuskulär oder rektal verabreicht werden, aber die orale Verabreichung wird besonders bevorzugt, gewöhnlich bei Erwachsenen in einer einzigen Dosis von 10 bis 1000 mg ein-bis sechsmal täglich. In manchen Fällen kann das Polysaccharid nach geeigneter Spaltung oder Sulfatierung verabreicht werden.

Das Polysaccharid M-30-C kann als Arzneimittel zur Verbesserung des Lipoidstoffwechsels verabreicht werden, um Atherosklerose, Herzinfarkt, Angina pectoris, Hirnerweis-chung, Hirnblutungen, Hypertonie oder Hypercholesterin-ämie, die mit Diabetes verbunden ist, zu lindern oder zu verhindern.

Für die orale Verabreichung können gewöhnlich angewandte Präparate, wie Kapseln, Tabletten oder Granulate, verwendet werden; in manchen Fällen können auch Pulver, Sirupe oder wässrige Lösungen angewandt werden.

Überdies hat das Polysaccharid M-30-C folgende weitere charakteristische Vorteile: Es übt seine Wirkung bei einer niedrigeren Dosis aus als bekannte, den Cholesterinspiegel senkende Mittel, es hat einen breiten Sicherheitsbereich und es entwickelt keine Hepatotoxizität, die typisch für mögliche Nebenwirkungen ist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Kaliumnitrat, 0,5 g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,1 g Hefeextrakt, 10 mg Ferrosulfat-heptahydrat, 2 mg Calcium-chlorid-dihydrat, 2 mg Natriumchlorid und 32 g Methanol wurden in einem Liter reinem Wasser gelöst, um ein Nährmedium herzustellen. Der pH-Wert von 7 Liter dieses Mediums wurde auf 7,0 eingestellt, worauf sie in einen «jar fermenter» mit einem Volumen von 10 Liter gegossen wurden; dieser

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wurde dann 10 Minuten lang bei 120 °C sterilisiert.

Eine Impfkultur von Pseudomonas polysaccharogenes M-30, die auf einem Nährmedium mit der obigen Zusammensetzung in einem Sakaguchi-Kolben gezüchtet worden war, wurde auf den obigen «jar fermenter» geimpft, worauf die Züchtung bei einer Züchtungstemperatur von 30 °C und einer Belüftung mit 0,5 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium und pro Minute ausgeführt wurde.

Nach 72stündiger Züchtung wurde die Kulturflüssigkeit mit Wasser auf 100 Liter aufgefüllt, worauf das Mycel durch kontinuierliches Zentrifugieren mit einer Sharpless-Zentri-fuge bei 20000 Umdrehungen pro Minute und 7 Liter pro Stunde entfernt wurde. Danach wurde die zentrifugierte überstehende Flüssigkeit 15 Minuten lang auf 80 °C erhitzt und ihr pH-Wert mit Salzsäure auf 3,5 bis 4,5 eingestellt, um die Proteine am isoelektrischen Punkt auszufällen; die Proteine wurden dann durch Zentrifugieren entfernt. Die zentrifugierte überstehende Flüssigkeit wurde auf pH = 7,0 eingestellt, auf 25 Liter eingeengt, mit einem Gemisch aus Chloroform und Amylalkohol (3:2) behandelt, um das Eiweiss abzutrennen, und dann mit 50 Liter Aceton versetzt, wodurch eine viskose Substanz in Form einer faserigen Masse erhalten wurde. Die Substanz wurde abfiltriert, gründlich mit Äther und dann mit Äthanol gewaschen, wieder in Wasser gelöst und dialysiert. Wiederum wurde das doppelte Volumen Aceton zugesetzt, um ein Polysaccharid abzutrennen. Das Polysaccharid wurde in 2 Liter reinem Wasser gelöst und dann gefriergetrocknet, wobei 98 g des gereinigten Polysaccharides M-30-C erhalten wurden. Es wurde in einer Menge von 14,0 g pro Liter der Kulturflüssigkeit erhalten.

Das so hergestellte Polysaccharid hatte die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften :

a) Optische Drehung: [ci]d = +48,4° (Lösung von 0,1 Gew.-Teil in 100 Vol.-Teilen Wasser)

b) Gewichtsmittelmolekulargewicht: 1 800 000 durch Gelfiltration und 1 200 000 durch Lichtstreuung c) Elementaranalyse: C 37,7%; H 5,8%

d) Farbreaktionen: positive Anthronreaktion und Phenol-Schwefelsäure-Reaktion e) Bestimmung von Basizität, Azidität oder Neutralität. Durch Zusatz von Cetyltrimethylammoniumbromid oder Cetylpyridiniumchlorid zu einer wässrigen Lösung des Polysaccharides M-30-C bildet sich ein weisser Niederschlag. Das Polysaccharid M-30-C ist somit ein saures Polysaccharid.

0 Infrarotabsorptionsspektrum : Charakteristische Absorptionsbanden treten bei den folgenden Wellenzahlen (cm_l) auf: 3450 (stark), 2940 (mittel), 1620 (mittel), 1400 (mittel), 1040 (stark) und 890 (schwach); siehe auch Fig. 1.

g) Löslichkeit: löslich in Wasser, 1-normaler Salzsäure, 1-normaler Schwefelsäure und 1-normalem wässrigem Ammoniak; unlöslich in Äthanol, Äther, Aceton, Chloroform und Dimethylsulfoxyd h) Viskosität: 1000 bis 3000 Centipoise, gemessen an einer Lösung von 1,0 Gew.-Teil des Polysaccharides M-30-C in 100 Vol.-Teilen Wasser bei 20 °C und 60 Umdrehungen pro Minute mit Hilfe eines Viskosimeters vom Typ BL, hergestellt von der Firma Tokyo Keiki K.K., Japan i) Veränderungen der Viskosität der wässrigen Lösung durch pH-Änderungen: Innerhalb eines pH-Bereiches von 2 bis 11 wird eine etwas höhere Viskosität in der Umgebung des Neutralpunktes beobachtet; die Viskosität bei pH = 2 ist 930 Centipoise, die Viskosität bei pH = 7 ist 1250 Centipoise, und die Viskosität bei pH = 11 ist 1100 Centipoise, gemessen mit Hilfe eines Viskosimeters vom Typ BL mit einem HM-

3-Adapter für kleine Mengen bei 20 °C und 6 Umdrehungen pro Minute an einer Lösung von 0,25 Gew.-Teil in 100 Vol.-Teilen Wasser; siehe auch Fig. 3

j) Veränderung der Viskosität einer wässrigen Lösung unter dem Einfluss der Temperatur: Im Bereich von 20 bis 80 °C nimmt die Viskosität bei Temperaturerhöhung etwas ab; die Viskosität beträgt bei 20 °C 13 500 Centipoise und bei 80 °C 11 100 Centipoise, gemessen mit dem gleichen Viskosi-meter bei der gleichen Konzentration wie oben unter (h) angegeben, wobei die Drehzahl aber 6 Umdrehungen pro Minute ist; siehe auch Fig. 4

k) Veränderung der Viskosität der wässrigen Lösung unter dem Einfluss der Konzentration: Wenn die Konzentrationen einer wässrigen Lösung des Polysaccharides M-30-C im Bereich von 0,2 Gew.-Teilen bis 1,0 Gew.-Teil in 100 Vol.-Teilen Wasser verändert werden, steigt die Viskosität mit steigender Konzentration und beträgt bei 0,2 Gew.-Teilen auf 100 Vol.-Teile 500 Centipoise und bei 1,0 Gew.-Teil auf 100 Vol.-Teile 13 500 Centipoise, gemessen bei einer Temperatur von 20 °C mit dem gleichen Viskosimeter und den gleichen Bedingungen hinsichtlich der Drehzahl wie oben unter j) angegeben; siehe auch Fig. 5

m) Veränderung der Viskosität der wässrigen Lösung unter dem Einfluss von Salzen: In einer Lösung von 5 Gew.-Teilen Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Aluminiumchlorid oder Ammoniumsulfat in 100 Vol.-Teilen Wasser oder in einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung wird keine Verringerung der Viskosität gegenüber einer wässrigen Lösung des Polysaccharides beobachtet.

n) Zuckereinheiten: Das Polysaccharid M-30-C wird mit 2-normaler Schwefelsäure in einem zugeschmolzenem Rohr 9 Stunden lang bei 100 °C hydrolysiert, worauf das Reaktionsprodukt mit Bariumhydroxyd behandelt wird, um die Schwefelsäure zu entfernen, und dann durch eine Säule mit dem Ionenaustauscherharz Dowex 50 (H-Form) (erhältlich von der Firma Dow Chemical Co., USA) geleitet, um überschüssige Bariumionen und feine Bariumsulfatteilchen zu entfernen; der Ablauf wird unter vermindertem Druck eingeengt und das Konzentrat der Papierchromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:5) als Entwicklungslösungsmittel unterworfen, wobei Flecken von Glucose und Mannose erhalten werden; das Konzentrat wird ferner zur Trockene eingedampft und in das entsprechende Trimethylsilylderivat übergeführt, dessen Gaschromatographie ergibt, dass das Verhältnis von Glucose zu Mannose 3:2 beträgt o) Farbe und Form: Das Polysaccharid M-30-C ist weiss und amorph, während seine wässrige Lösung farblos ist p) Farbe und Geruch: Das Polysaccharid M-30-C und seine wässrige Lösung sind geschmacklos und geruchlos q) Vergleich der Viskositäten: Das Polysaccharid M-30-C hat eine höhere Viskosität als Xanthangummi ; die Bedingungen der Bestimmung sind 20 °C, eine Lösung von 1,0 Gew.-Teil in 100 Vol.-Teilen, 60 Umdrehungen pro Minute und das gleiche Viskosimeter wie oben unter h) angegeben; das Polysaccharid M-30-C hat eine Viskosität von 2100 Centipoise, während Xanthangummi eine Viskosität von 1000 Centipoise hat r) Thixotrope Eigenschaften : Das Polysaccharid M-30-C zeigt in wässriger Lösung thixotrope Eigenschaften (siehe «Rheology», Kakutaro Nakagawa et al., S. 97-98, veröffentlicht in der Reihe «Iwanami Complete Books»); die Beziehungen zwischen den Drehzahlen in einem Viskosimeter und den Viskositäten sind in Fig. 2 dargestellt, wobei das gleiche Viskosimeter und die gleichen Bedingungen wie oben unter h) angegeben angewandt werden s) Stringing: Das Polysaccharid M-30-C zeigt in wässriger Lösung wenig die als «stringy» bezeichnete Eigenschaft t) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Um 280 nm wird eine schwache Absorption beobachtet, wie in Fig. 6 dargestellt u) Schmelzpunkt: unbestimmt, zersetzt sich beim Erhitzen und wird dabei verkohlt

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Beispiel 2

Die Züchtung wurde in gleicher Weise wie im obigen Beispiel 1 ausgeführt, um eine Kulturflüssigkeit herzustellen, die das Polysaccharid M-30-C enthielt. Die Kulturflüssigkeit wurde mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (1:1) auf 100 Liter verdünnt und 15 Minuten lang auf 80 °C erhitzt. Dann wurde das Mycel durch kontinuierliches Zentrifugieren bei 7 Liter pro Stunde mit Hilfe einer Sharpless-Zentrifuge entfernt. Der pH-Wert der zentrifugierten überstehenden Flüssigkeit wurde mit Salzsäure auf 3,5 bis 4,5 eingestellt, um die Proteine am isoelektrischen Punkt auszufällen; diese wurden dann durch Zentrifugieren entfernt. Der pH-Wert der zentrifugierten überstehenden Flüssigkeit wurde auf 7,0 eingestellt, worauf eine wässrige Calciumchloridlösung in einer solchen Menge zugesetzt wurde, dass sich eine Konzentration von 0,02 Gew.-Teilen auf 100 Vol.-Teile ergab. Durch weiteres Zentrifugieren wurde ein pastenähnliches Polysaccharid erhalten. Dieses Produkt wurde unter gründlichem Rühren mit 20 Liter Wasser Methanol behandelt, um Salze zu entfernen, worauf es filtriert und das Methanol entfernt wurde, wobei ein Polysaccharid als Paste zurückblieb. Dieses wurde dann in 2 Liter reinem Wasser gelöst und gefriergetrocknet und ergab 84 g des gereinigten Polysaccharides M-30-C. Es wurde in einer Menge von 12,0 g pro Liter der Kulturflüssigkeit erzeugt.

Die folgenden Versuche dienen dazu, die pharmakologischen Eigenschaften des vorliegenden Polysaccharides M-30-C zu beweisen.

Versuch 1

Gruppen von je 10 männlichen Mäusen vom Stamm ICR-JCL wurden intravenös 800 mg Triton pro kg verabreicht. 20 bis 24 Stunden nach der Verabreichung ergab sich ein Spitzenwert des Blutlipoidspiegels; danach blieb die Hyperlip-ämie bei den Tieren 24 Stunden oder länger aufrechterhalten. Auf diese Weise wurden Testtiere mit durch Triton herbeigeführter Hyperlipämie vorbereitet.

Die Testprobe (M-30-C) wurde in destilliertem Wasser gelöst und den Tieren zweimal, nämlich unmittelbar nach der Tritonverabreichung und 20 bis 24 Stunden später, oral verabreicht. 24 Stunden nach der obigen letzten Verabreichung wurde der Serumcholesterinspiegel bestimmt.

Versuch 2

5 Gruppen von je 6 männlichen Mäusen vom Stamm ICR-JCL wurden intravenös 200 mg Streptozotocin pro kg verabreicht. 7 Tage nach der Verabreichung wurde die Hyperlipämie 14 Tage oder länger aufrechterhalten, um Testtiere mit durch Streptozotocin herbeigeführter endogener Hyperlip-io ämie vorzubereiten.

Die Testprobe (M-30-C) wurde in destilliertem Wasser gelöst und den Tieren in einer einzigen täglichen Dosis von 50 mg pro kg 5 Tage lang oral verabreicht, beginnend 7 Tage nach der Verabreichung von Streptozotocin. 24 Stunden nach 15 der obigen letzten Verabreichung wurde der Serumcholesterinspiegel bestimmt.

Versuch 3

Gruppe von je 10 männlichen Ratten vom Stamm Wistar 20 wurden verwendet und in die unten definierten drei Gruppen eingeteilt.

Die «Normal Animal Groups» (Normal Control) bestanden aus Tieren, denen ein herkömmliches Kraftfutter verabreicht wurde. Die «Cholesterol Control Groups» (Positive 25 Control) bestanden aus Tieren, die ein Futter erhielten, das das herkömmliche Kraftfutter, 0,5% Cholesterin und 0,5% Gallensäure enthielt. Die «M-30-C-given Groups» bestanden aus Tieren, die ein Futter erhielten, das das Futter der obigen Cholesterol Control Groups und die Testprobe (M-30-C) ent-30 sprechend einer täglichen Dosis von 50 mg der Probe pro kg enthielt. Die Plasmacholesterinspiegel in allen Gruppen wurden gleichzeitig erhöht, wobei das Futter in einer täglichen Menge von 10 g pro 100 g Körpergewicht verabreicht wurde. Nach 14tägiger Fütterung wurde der Serumcholesterinspiegel 35 bestimmt.

In diesen Versuchen I bis 3 wurde ein im Handel erhältliches, den Cholesterinspiegel senkendes Mittel (CPIB) in ähnlicher Weise zu Vergleichszwecken getestet.

Die Ergebnisse der Versuche 1 bis 3 sind in der folgenden io Tabelle I zusammengefasst.

644 896

Tabelle I: Wirkung von M-30-C auf den Serumcholesterinspiegel*

Normal

Positive

M-30-C-given

Group

Clofibrate**

-given Group

Control

1 mg/kg/

5 mg/kg/

50 mg/kg/

100 mg/kg/

300 mg/kg/

Dosierungs

Tag

Dosierungs

einheit einheit

einheit einheit oder Tag

Versuch 1 Durch Triton herbeigeführte

Hyperlipämie 109,0 + 9,0 401,2+18.0 299,6 ±24,9 247,1 ±21,7

Versuch 2 Durch

Streptozotocin herbeigeführte

Hyperlipämie 128,2+10,3 200,0 ±10,3

Versuch 3 Durch Futter mit hohem

Cholesteringehalt herbeigeführte

Hyperlipämie 72,9 ±3,0 250,2 ±9,9

163,1 ± 14,4

396,0 ±23,0 191,9 ±28,1

191,1 ± 16,7

177,4± 10,3

384,2 ±21,7

* mg/dl; ausgedrückt als Mittelwert ± Standardabweichung

* Im Handel erhältliches, den Cholesterinspiegel senkendes Mittel der Formel: ci ch2

~Ö~°TC

c-c00coh_

I 2 5

ch.

Versuch 4

Gruppen von je 10 bis 14 männlichen Kaninchen vom Stamm Newzealand-White wurden verwendet.

Tiere, die ein herkömmliches stückiges Futter erhielten, wurden als «Normal Group» (Normal Control) eingeteilt; 35 Tiere, die als Futter das herkömmliche Futter und 0,67% Cholesterin erhielten, wurden als «Cholesterol Control Group» (Positive Control) bezeichnet, und Tiere, die als Futter das Futter der Positive Control und die Testprobe (M-30-C) erhielten, wurden als «Test sample-given Group» bezeichnet, w Der Plasmacholesterinspiegel wurde in allen Gruppen gleichzeitig erhöht, wobei 20 Wochen lang täglich 40 g Futter pro kg Körpergewicht verabreicht wurde.

Während dieses Zeitraums wurde der Serumlipoidspiegel bestimmt. Nach 20 Wochen liess man alle Tiere ausbluten 45 und schnitt den hinteren Ast der Aorta heraus, worauf die Wirkungen auf die Atherosklerose untersucht wurden.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabellen II zusam-mengefasst.

Es ist aus der Tabelle ersichtlich, dass das Polysaccharid M-30-C die Erhöhung des Serumlipoidspiegels (gesamtes und freies Cholesterin, Triglycerid, Phospholipid, Lipoprotein, freie Fettsäure) signifikant hemmt; speziell stellt man in dem hintern Ast der Aorta der Positive Control ein Atherosklerose-Verhältnis von 65,9% fest, während bei der M-30-C-given Group eine annäherungsweise 30%- bis 40%ige Hemmung der Atherosklerose beobachtet wird. Femer wird angenommen, dass die den Serumlipoidspiegel senkende Wirkung des Polysaccharides M-30-C auf Hemmwirkungen auf die Resorption und Biosynthese von Cholesterin zurückzuführen ist.

Im Hinblick auf die obige Tatsache, dass das Auftreten von experimenteller Atherosklerose signifikant gehemmt werden kann, darf das Polysaccharid M-30-C als praktisch anwendbares Mittel zur Senkung des Serumlipoidspiegels und zur Verhinderung der Atherosklerose angesehen werden.

Tabelle II

Wochen

Normal

Positive

M-30-C-given Group

Clofibrate-Group

Control

30 mg/kg/Tag

100 mg/kg/Tag

Cholesterin

6

45,5 ±2,7***

1475,4± 153,2

1297,9 ±174,1

947,9 ±81,5**

916,5 ± 218,2*

(mg/dl)

12

58,5 ±4,6***

2003,8 ±421,4

1130,0± 142,1*

917,9 ± 119,2**

1466,8+182,5

18

41,6 ±4,7***

1772,1 ±517,3

909,2 ±99,0*

736,5 ±46,1**

1075,7 ±59,3

Triglycerid

6

54,3 ±6,2***

942,6 ±149,3

876,4 ± 239,1

293,6 + 62,5**

326,0 ±55,3*

(mg/dl)

12

75,6 ±6,6***

721,7 ±390,0

378,1 ±167,1

258,0 ±77,6**

343,1 ±55,3

18

97,0 ±31,6***

655,1 ±187,5

455,5 ±133,6

187,8 ±50,2**

366,9 ± 112,1

Atherosclerose-

Verhältnis (%)

20

0

65,9 ± 7,0

45,1 +9,4

41,5 ±8,4*

58,1 ±7,9

Hemmung (%)

20

0

31,6

37,0

11,8

Atherosclerose-Verhältnis (%) = Atherosclerosefläche/Gesamtfläche (Aorta) x 100 *: t<0,05, **: t <0,01, ***: t<0,001

G

3 Blatt Zeichnungen

Claims

644 896 PATENTANSPRÜCHE

1. Polysaccharid mit den folgenden physikalisch-chemi-schen Eigenschaften:

a) Optische Drehung: [a]5° = +48,4° + 3,3° (Lösung von 0,1 Gew.-Teil in 100 Vol.-Teilen Wasser),

b) Gewichtsmittelmolekulargewicht: 2,0 x 105 bis 2,0 x 106,

c) Elementaranalyse: C 37,7% ± 3,0%: H 5,8% ± 0,5%,

d) Farbreaktion: positive Anthronreaktion und Phenol-Schwefelsäure-Reaktion,

e) Bestimmung von Basizität, Azidität oder Neutralität: saures Polysaccharid,

0 Infrarotabsorptionsspektrum: charakteristische Absorptionsbanden bei 3450 cm ~1 (stark), 2940 cm ~1 (mittel), 1620 cm-1 (mittel), 1400 cm-1 (mittel), 1040 cm-' (stark) und 890 cm1 (schwach),

g) Löslichkeit: löslich in Wasser, 1-normaler Salzsäure, 1-normaler Schwefelsäure und 1-normalem wässrigem Ammoniak; unlöslich in Äthanol, Äther, Aceton, Chloroform und Dimethylsulfoxyd,

h) Viskosität: 1000 bis 3000 Centipoise, bestimmt an einer Lösung von 1,0 Gew.-Teil in 100 Vol.-Teilen Wasser bei 20 °C mit Hilfe eines Viskosimeters vom Typ BL, hergestellt von der Firma Tokyo Keiki K.K., Japan,

i) Zuckereinheiten: Flecken von Glucose und Mannose bei der Papierchromatographie nach Hydrolyse und ein Verhältnis der Zuckereinheiten von Glucose:Mannose von 3:2, bestimmt durch Gaschromatographie,

j) Farbe und Form: als solches weiss und amorph und in wässriger Lösung farblos.

2. Verfahren zur Herstellung des Polysaccharides nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus Pseudomonas polysaccharogenes M-30, mit der Hinterlegungsnummer FERM-P 4054 bzw. ATCC 31414, der zur Gattung Pseudomonas gehört, in einem Nährmedium, das Methanol als einzige oder überwiegende Kohlenstoffquelle enthält, züchtet und das Polysaccharid aus der Kulturflüssigkeit isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung in einem Nährmedium vom pH = 6,5 bis 7,5 bei 28 bis 30 °C 48 bis 72 Stunden lang ausführt, feste Materialien aus der Kulturflüssigkeit entfernt, ein rohes Polysaccharid mit einem zur Fällung dienenden Lösungsmittel ausfällt und abtrennt und das Polysaccharid dann durch Eiweissabtrennung reinigt.

4. Mittel zur Senkung des Cholesterinspiegels, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff das Polysaccharid nach Anspruch 1 enthält.